專利名稱：重組藻膽蛋白及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體化地說是一種利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)的重組藻膽蛋白及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
藻膽蛋白是原核藻類--藍藻，真核藻類--紅藻、隱藻和某些甲藻所特有的光合作用捕光色素蛋白。天然藻膽蛋白是藻膽蛋白亞基與藻膽色素共價結(jié)合的化合物，并且形成復雜空間結(jié)構(gòu)--藻膽體。根據(jù)與藻膽蛋白亞基相結(jié)合的藻膽色素不同，藻膽蛋白主要分為藻紅蛋白(phycoerythrin，PE)，藻藍蛋白(phycocyanin，PC)和別藻藍蛋白(allophycocyanin，APC)。自20世紀80年代以來，人們發(fā)現(xiàn)藻膽蛋白具有多種生物活性，有著廣闊的運用前景。例如藻膽蛋白能夠刺激機體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生免疫球蛋白，同時能保持或促進正常的細胞功能，全面增強機體的防病、抗病能力，可防止腫瘤或抑制腫瘤的生長和復發(fā)，具有抗腫瘤功效(Schwartz，J.Z.，& Shkiar，G..Growthinhibition and destruction of cancer cells by oral extracts of Spirulina，Proc.Amer.Acad Oral Pathol.1986，4023；張素萍，姚思德等，用脈沖輻解法研究藻膽蛋白與羥自由基反應(yīng)動力學，科學通報，2000，45(1)32)。含有藻膽蛋白的抗腫瘤成分也能用于治療潰瘍和痔瘡出血(Dainipponink andChemicals，Antitumoral agents containing phycobilin.J.Phycology 1983，21658)，能夠促進末端供血和骨髓造血功能。藻膽蛋白能選擇性地富集于病灶，并且有激光激活的細胞毒作用(Morcos N.C.，Bems M.and HenryW.L.Phycocyaninlaser activation，cytotoxic effects，and uptake in humanatherosclerotic plaque.Lasers Surg Med，1988，8(1)10)。美國食品醫(yī)藥局(FDA)已批準將藻膽蛋白用于皮膚癌、乳腺癌的光敏治療(范曉，海藻化學研究的展望，海洋科學，1996，(2)24)。同時藻膽蛋白于用動脈粥樣硬化的光敏治療也已申請專利(US4886831)。此外藻膽蛋白能夠緩解藥物和重金屬對腎臟的毒害，它的抗病毒活性也得到了多方面證實(CN99110831.0，US6346408)。在食品工程方面，藻膽蛋白的必需氨基酸組成十分理想，是一種理想的食品添加劑。藻膽蛋白熒光特性也可用于熒光探針制作以及免疫分析試劑等。
現(xiàn)有獲取藻膽蛋白的技術(shù)，是從藻類中直接提取純化。它主要包括一系列長周期、高成本、復雜的過程。這一過程主要包括藻體的培養(yǎng)、收集，藻體細胞的破碎和蛋白質(zhì)多次抽提。其中蛋白質(zhì)分離純化方法主要有堿性磷酸緩沖液抽提、水提法、酸提法、勻漿法、羥基磷灰石柱層析等，具體方法如藻體細胞用0.05mol/L磷酸鈉緩沖液懸浮，超聲波處理破碎細胞，離心取上清獲得可溶性總蛋白；上清液用硫酸銨分級分離，沉淀物用0.05mol/L磷酸鈉緩沖液溶解后，以DEAE-SepharoseCL-6B透析柱(用氯化鈉洗脫)純化，純化產(chǎn)物用SephadexG-100柱進一步純化和脫鹽，收集得到藻藍蛋白。利用這種技術(shù)得到的藻膽蛋白是色素蛋白復合物，沒有統(tǒng)一的質(zhì)量標準，活性不穩(wěn)定。目前天然藻膽蛋白純品的售價為每克20萬美元(SIGMA公司)，難以大規(guī)模應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
針對上述現(xiàn)有技術(shù)的局限性，本發(fā)明目的在于提供一種結(jié)構(gòu)單一、活性穩(wěn)定的重組藻膽蛋白及其制備方法和應(yīng)用。
本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)本發(fā)明基因重組藻膽蛋白是含有藻膽蛋白亞基氨基酸序列的多肽或其衍生物；其中所述多肽為含有一種或幾種藻膽蛋白亞基的氨基酸序列；所述多肽含有的藻膽蛋白亞基氨基酸序列包含藻膽蛋白亞基全氨基酸序列，或該序列的片段、或與其具有基本序列同源性的氨基酸序列。
其制備方法是利用基因工程技術(shù)，將藻膽蛋白亞基基因轉(zhuǎn)入各類表達體系中異源表達，生產(chǎn)含有藻膽蛋白亞基氨基酸序列的多肽或其衍生物。在本發(fā)明中，藻膽蛋白亞基基因的獲得是通過分子克隆方法從藍藻、紅藻、隱藻、甲藻和原綠球藻等藻類中克隆得到；而后將藻膽蛋白亞基基因亞克隆到各種載體上，如大腸桿菌(E.coli)的pET、pTrx、pMAL、pGEX等載體系列，芽孢桿菌(Bacillus)pE194Ts等載體系列，酵母pPIC，pMET等載體系列，昆蟲細胞pMT，pIB等載體系列，哺乳動物pCDNA，pIND等載體系列；再利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)中的氯化鈣(CaCl2)介導法、聚乙二醇(PEG)法、電激法、超聲波導入法、基因槍法、顯微注射法、農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)化、植物病毒載體介導等物理、化學或生物的轉(zhuǎn)基因技術(shù)等，將藻膽蛋白亞基基因或其重組載體導入各類表達體系中異源表達；運用層析技術(shù)生產(chǎn)含有藻膽蛋白亞基氨基酸序列的多肽或其衍生物。獲得重組體后，利用快速、簡便的生產(chǎn)工藝進行低成本生產(chǎn)，以獲得重組藻膽蛋白，一方面可以直接用作藥物、保健或功能食品、食品添加劑、試劑等；另一方面可以通過酶解、化學修飾等方式獲得衍生物加以應(yīng)用。
本發(fā)明具有如下優(yōu)點1.本發(fā)明為運用基因工程技術(shù)，將藻膽蛋白亞基基因轉(zhuǎn)入目前較為成熟的各類表達體系(如大腸桿菌、芽孢桿菌、酵母、昆蟲細胞、哺乳動物、高等植物、海洋生物)中高效表達，生產(chǎn)含有藻膽蛋白亞基氨基酸序列的多肽，并利用簡便純化工藝獲得大量廉價、穩(wěn)定的重組蛋白，用作藥物、保健或功能食品、食品添加劑、試劑等。與現(xiàn)有技術(shù)相比，這一生產(chǎn)過程避免了藻類養(yǎng)殖這一長周期過程，并且能將藻膽蛋白亞基基因與各類親和標簽(如6×his，GST，Trx等)相融合，利用親和層析減化下游純化過程，降低成本。
2.運用本發(fā)明技術(shù)方案得到重組藻膽蛋白不具有天然藻膽蛋白的藻膽色素基團，是結(jié)構(gòu)單一的多肽。
3.本發(fā)明結(jié)構(gòu)單一多肽與色素蛋白復合物相比，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，從而活性穩(wěn)定，可建立統(tǒng)一質(zhì)量標準，適于大規(guī)模應(yīng)用。


圖1為別藻藍蛋白基因(apc)的克隆及其在大腸桿菌(E.coli)中表達的載體構(gòu)建示意圖。
圖2為藻紅蛋白基因(pe)在大腸桿菌(E.coli)中表達的載體構(gòu)建示意圖。
圖3為別藻藍蛋白基因α亞基(apca)和β亞基(apcβ)分別在大腸桿菌(Ecoli)中表達的載體構(gòu)建示意圖。
圖4為藻膽蛋白基因在畢赤酵母(Pichiapastoris)表達的載體構(gòu)建示意圖。
圖5為藻膽蛋白基因在海帶中表達的載體構(gòu)建示意圖。
具體實施例方式
下面結(jié)合附圖及實施例進一步描述本發(fā)明，但并不限制本發(fā)明的保護范圍。
特別應(yīng)指出的是在下列實施例中，使用的DNA提取，PCR擴增反應(yīng)，表達載體構(gòu)建等技術(shù)是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的，并可在諸如《分子克隆實驗指南》(J.薩姆布魯克等著，金冬雁等譯，科學出版社，1992年第二版)、《PCR技術(shù)實驗指南》(C.W.迪芬巴赫，GS德維克斯勒等著，黃培堂等譯，科學出版社，1998)等參考文獻中找到。
實施例1利用聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)技術(shù)從藍藻中克隆別藻藍蛋白基因(apc)1.模板DNA的提取100ml組囊藻(Anacystis nidulans)UTEX 625培養(yǎng)液經(jīng)3,000g離心15min，收集藻體；藻體用250mmol/LTris-HCl，50mmol/LEDTA，25％蔗糖(pH8.0)懸浮，加入蛋白酶K至終濃度5mg/ml，在65℃保溫30min。以10,000g，4℃離心10min后，取上清液；用等體積于上清液的苯酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1，V∶V∶V)提取兩遍，上清液再用氯仿∶異戊醇(24∶1，V∶V)提取一遍，最后上清液用二倍體積的無水乙醇-20℃沉淀過夜；再經(jīng)13,000g,4℃離心30min，棄上清，沉淀揮干乙醇后溶解于50μlTE緩沖液(10mmol/L Tris-Hcl，1mmol/L EDTA，pH8.0)并加入RNA酶A(終濃度于10μl/ml)37℃保溫30min；最后將所得DNA溶液保存于4℃。
2.PCR反應(yīng)根據(jù)Houmard等(1986)發(fā)表的Synechococcus PCC 6301別藻藍蛋白基因序列設(shè)計引物(Genbank X04716)。正向引物P15′-GAGGGATCCATTAATGAGTATCG-3′(序列表中SEQ ID NO 12)，反向引物P25′-TGGAAGCTTAGCTCAAGCCGGAG-3′(序列表中SEQ ID NO 13)，采用華美生物工程公司DNA擴增系統(tǒng)試劑盒。PCR反應(yīng)體系如下2.5μl TaqBuffer(10×)，3μl Mg2+(25mmol/L)，2μl dNTP(2.5mmol/L)，1μl 2P1(10μmol/L)，1μl 2P2(10μmol/L)，1μl DNA模板(20-40ng/μl)，0.2μl TaqDNA聚合酶(5U/μl)，加水至總體積25μl。PCR擴增程序93℃變性1min，50℃復性1min，72℃延伸3min，重復35個循環(huán)。結(jié)果用1％瓊脂糖電泳鑒定，在瓊脂糖凝膠上出一條符合預期大小的約1kb的條帶。
3.apc的克隆與測序PCR擴增條帶根據(jù)《分子克隆實驗指南》(J.薩姆布魯克等著，金冬雁等譯，科學出版社，1992年第二版)介紹的方法從瓊脂糖凝膠上回收后，按美國Invitrogen公司Zero Blunt PCR克隆試劑盒手冊要求，與pCR-Blunt載體連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，經(jīng)篩選獲得陽性克隆，新質(zhì)粒命名為pCRBapc。按Sanger法進行測序，其核酸序列及其推導的氨基酸序列(序列表中SEQ ID NO 1～3)如下ATG AGT ATC GTC TCG AAG TCC ATC GTC AAC GCT GAC GCC GAG GCG CGT TACMet Ser Ile Val Ser Lys Ser Ile Val Asn Ala Asp Ala Glu Ala Arg TyrCTA AGC CCT GGC GAA CTG GAA CGC ATC AAA ACC TTC GTT GTC GGT GGC GATLeu Ser Pro Gly Glu Leu Glu Arg Ile Lys Thr Phe Val Val Gly Gly AspCGT CGT CTG CGG ATT GCG CAG ACC ATT GCT GAG TCC CGC GAG CGG ATC GTCArg Arg Leu Arg Ile Ala Gln Thr Ile Ala Glu Ser Arg Glu Arg Ile ValAAG CAA GCT GGC AAC CAA CTT TTC CAA AAG CGT CCT GAC GTG GTT TCG CCCLys Gln Ala Gly Asn Gln Leu Phe Gln Lys Arg Pro Asp Val Val Ser ProGGT GGC AAT GCC TAC GGT GAA GAC ATG ACG GCC ACC TGC CTG CGT GAC CTCGly Gly Asn Ala Tyr Gly Glu Asp Met Thr Ala Thr Cys Leu Arg Asp LeuGAC TAC TAC CTG CGT CTT GTG ACC TAC GGT GTA GTT TCG GGC GAC ATC ACCAsp Tyr Tyr Leu Arg Leu Val Thr Tyr Gly Val Val Ser Gly Asp Ile ThrCCG ATT GAA GAA ATC GGC ATT GTC GGT GTC CGC GAA ATG TAC AAA TCG CTAPro Ile Glu Glu Ile Gly Ile Val Gly Val Arg Glu Met Tyr Lys Ser LeuGGA ACC CCC ATC GAA GCT GTC GCT GAA GGC GTC CGT GAG CTG AAA TCG GCTGly Thr Pro Ile Glu Ala Val Ala Glu Gly Val Arg Glu Leu Lys Ser AlaGCA ACC GCC CTA CTG ACT GGT GAA GAC GCT GAC GAA GCA GGC GCT TAC TTTAla Thr Ala Leu Leu Thr Gly Glu Asp Ala Asp Glu Ala Gly Ala Tyr PheGAC TAC GTA ATT GGC GCT CTC AGC TAA TTC AGT CTT TTA AGT CCC TTT GATAsp Tyr Val Ile Gly Ala Leu Ser StopTCG AAC GCG ACT TTT TCA ACG ATT TTA GAA AG ATG CAA GAC GCA ATT ACCMet Gln Asp Ala Ile ThrGCT GTC ATC AAT GCT TCT GAC GTC CAA GGT AAG TAC CTG GAC AGC TCA GCCAla Val Ile Asn Ala Ser Asp Val Gln Gly Lys Tyr Leu Asp Ser Ser Ala
CTG GAT CGT CTC AAG AGC TAC TTC CAA AGT GGC GAA CTG CGC GTC CGT GCTLeu Asp Arg Leu Lys Ser Tyr Phe Gln Ser Gly Glu Leu Arg Val Arg AlaGCA GCC ACC ATC AGT GCC AAG TCG GCT CTG ATC GTC AAA GAA GCA GTG GCTAla Ala Thr Ile Ser Ala Lys Ser Ala Leu Ile Val Lys Glu Ala Val AlaAAA TCG CTG CTC TAC TCA GAC ATC ACC CGT CCC GGC GGC ACC ATG TAC ACCLys Ser Leu Leu Tyr Ser Asp Ile Thr Arg Pro Gly Gly Thr Met Tyr ThrACC CGT CGC TAT GCT GCT TGC ATC CGG GAC TTG GAG TAC TAC CTG CGC TACThr Arg Arg Tyr Ala Ala Cys Ile Arg Asp Leu Glu Tyr Tyr Leu Arg TyrGCC ACC TAT GCC ATG TTG GCT GGC GAT ACC TCG ATC TTG GAT GAG CGC GTGAla Thr Tyr Ala Met Leu Ala Gly Asp Thr Ser Ile Leu Asp Glu Arg ValCTC AAC GGT CTG AAA GAG ACC TAC AAC AGT CTG GGC CTG CCG ATC GGT GCALeu Asn Gly Leu Lys Glu Thr Tyr Asn Ser Leu Gly Leu Pro Ile Gly AlaACC GTC CAA GCG ATC CAA GCA ATC AAA GAA GTC ACT GCT AGC TTG GTC GGCThr Val Gln Ala Ile Gln Ala Ile Lys Glu Val Thr Ala Ser Leu Val GlyCCC GAC GCT GGT CGC GAA ATG GGT GTC TAC CTC GAG TAC ATC AGC TCC GGCPro Asp Ala Gly Arg Glu Met Gly Val Tyr Leu Glu Tyr Ile Ser Ser GlyTTG AGC TAALeu Ser Stop實施例2利用PCR技術(shù)從藍藻中克隆藻藍蛋白基因(pc)1.模板DNA的提取取0.5g鮮重的橢圓螺旋藻(Spirulina fusiformis)藻體細胞，用250mmol/L Tris-Hcl，50mmol/L EDTA，25％蔗糖(pH8.0)懸浮，加入蛋白酶K至5mg/ml，在65℃保溫60min。以10,000g，4℃離心10min后，取上清液；用等體積于上清液的苯酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1，V∶V∶V)提取兩遍，上清液再用氯仿∶異戊醇(24∶1，V∶V)提取一遍，最后上清液用二倍體積的無水乙醇-20℃沉淀2h；再經(jīng)13,000g，4℃離心30min，棄上清，沉淀揮干乙醇后溶解于50μl TE緩沖液(10mmol/L Tris-Hcl，1mmol/L EDTA，pH8.0)并加入RNA酶A(終濃度至10μl/ml)于37℃保溫30min；最后將所得DNA溶液保存于4℃。
2.PCR引物及反應(yīng)根據(jù)Jeamton，W.等發(fā)表的鈍頂螺旋藻(Spirulina platensis)藻藍蛋白基因序列設(shè)計引物(Genbank Y09074)。正向引物PPC15’-GGAGATAAGTCCATGTTTGA-3′(序列表中SEQ ID NO 14)，反向引物PPC25’-TAGCTTAGGGCGTTGATCGC-3′(序列表中SEQ ID NO 15)。于25ul反應(yīng)體系中加入1ul模板DNA(20ng/ul)，1ul Taq(5U/ul)，0.5ul dNTP(10mmol/L)，4ul Mg2+(25mmol/L)，2.5ul 10×Taq緩沖液，兩端引物(10umol/L)各1ul，加超純水補齊(以上試劑均購自上海生工生物工程有限公司)。反應(yīng)條件為93℃預變性5min；然后93℃變性1min，55℃復性1min，72℃延伸3min，共35個循環(huán)；最后72℃延伸8min以補齊未端。擴增產(chǎn)物于1.0％瓊脂糖(購自Promega公司)凝膠中電泳鑒定，結(jié)果擴增出一條大小約1.1kb的條帶，與預計值相符。
3.pc的克隆與測序PCR擴增條帶從瓊脂糖凝膠上回收后，按美國Invitrogen公司ZeroBlunt PCR克隆試劑盒手冊要求，與pCR-Blunt載體連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細菌DH5α。連接、轉(zhuǎn)化以及陽性重組子的篩選和鑒定均參考《分子克隆實驗指南)》(J.薩姆布魯克等著，金冬雁等譯，科學出版社，1992年第二版)介紹的方法。將陽性克隆菌落培養(yǎng)后，由上海基康公司從正反兩個方向分別進行測序。其核酸序列及其推導的氨基酸序列(序列表中SEQ ID NO 4～6)如下ATG TTT GAT GCC TTC ACT AAG GTG GTT TCT CAG GCT GAT ACT CGC GGC GAAMet Phe Asp Ala Phe Thr Lys Val Val Ser Gln Ala Asp Thr Arg Gly GluATG CTG AGT ACA GCT CAA ATC GAT GCT CTG AGC CAA ATG GTT GCT GAA AGCMet Leu Ser Thr Ala Gln Ile Asp Ala Leu Ser Gln Met Val Ala Glu SerAAC AAA CGT TTG GAT GCC GTT AAC CGC ATT ACT AGC AAC GCT TCC ACC ATCAsn Lys Arg Leu Asp Ala Val Asn Arg Ile Thr Ser Asn Ala Ser Thr IleGTT TCT AAT GCT GCT CGT TCT TTG TTT GCA GAG CAG CCC CAA CTG ATT GCTVal Ser Asn Ala Ala Arg Ser Leu Phe Ala Glu Gln Pro Gln Leu Ile AlaCCC GGA GGA AAC GCC TAC ACC AAC CGT CGT ATG GCT GCT TGC TTG CGT GACPro Gly Gly Asn Ala Tyr Thr Asn Arg Arg Met Ala Ala Cys Leu Arg AspATG GAA ATC ATC CTG CGT TAT GTT ACC TAC GCT GTG TTC GCT GGC GAC GCAMet Glu Ile Ile Leu Arg Tyr Val Thr Tyr Ala Val Phe Ala Gly Asp AlaAGT GTT CTC GAA GAT CGT TGC TTG AAC GGT TTG CGT GAA ACT TAC CTG GCTSer Val Leu Glu Asp Arg Cys Leu Asn Gly Leu Arg Glu Thr Tyr Leu AlaTTG GGA ACT CCC GGT TCC TCC GTT GCT GTC GGT GTT GGC AAA ATG AAA GAALeu Gly Thr Pro Gly Ser Ser Val Ala Val Gly Val Gly Lys Met Lys GluGCT GCT CTG GCG ATC GTA AAC GAT CCC GCA GGT ATC ACT CCT GGC GAT TGTAla Ala Leu Ala Ile Val Asn Asp Pro Ala Gly Ile Thr Pro Gly Asp CysAGC GCT TTG GCT TCA GAA ATC GCT AGT TAC TTT GAT CGT GCA TGT GCT GCASer Ala Leu Ala Ser Glu Ile Ala Ser Tyr Phe Asp Arg Ala Cys Ala AlaGTT TCC TAA TCA AGC AGA TCC ATA GCA TAT AAC AAT TGAVal Ser StopAAC AGT TTA GCT GAA GTC TAA GTG ACT GGA CTT CTG TTT GTT ACC TAA TTT
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2.PCR引物及反應(yīng)根據(jù)已知藻紅蛋白基因序列設(shè)計簡并性引物。正向引物PPE15’-AGAATTCAATGCTTGAYGCW-3′(序列表中SEQ ID NO 16)，反向引物PPE25’-CCGTTAGSDTARDGMRTTD-3′(序列表中SEQ ID NO 17)。于25ul反應(yīng)體系中加入1ul模板DNA(20ng/ul)，1ul Taq(5U/ul)，0.5ul dNTP(10mmol/L)，2ul Mg2+(25mmol/L)，2.5ul 10×Taq緩沖液，兩端引物(10umol/L)各1ul，余下體積加超純水補齊(以上試劑均購自上海生工生物工程有限公司)。反應(yīng)條件為94℃預變性5min；然后94℃變性1min，50℃復性1min，72℃延伸1.5min，共30個循環(huán)；最后72℃延伸10min以補齊未端。擴增產(chǎn)物于1.0％瓊脂糖(購自Promega公司)凝膠中電泳鑒定，結(jié)果擴增出一條大小約1.1kb的條帶，與預計值相符。
3.pe的克隆與測序PCR擴增條帶從瓊脂糖凝膠上回收后，按寶生物工程(大連)有限公司pMD18-T克隆試劑盒手冊要求，與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細菌DH5α。連接、轉(zhuǎn)化以及陽性重組子的篩選和鑒定均參考《分子克隆實驗指南》(J.薩姆布魯克等著，金冬雁等譯，科學出版社，1992年第二版)介紹的方法。將陽性克隆菌落培養(yǎng)后，由上?；倒緩恼磧蓚€方向分別進行測序。其核酸序列及其推導的氨基酸序列(序列表中SEQ ID NO 7～9)如下ATG CTT GAC GCA TTT TCT AGA GTT GTA GTG AAT TCA GAC GCA AAA GCT GCTMet Leu Asp Ala Phe Ser Arg Val Val Val Asn Ser Asp Ala Lys Ala AlaTAT GTA AGT GGC AGT GAT TTA CAA GCT CTT AAA ACA TTC ATT TCT GAA GGATyr Val Ser Gly Ser Asp Leu Gln Ala Leu Lys Thr Phe Ile Ser Glu GlyAAC AAA CGT TTA GAT TCA GTA AAC TAT ATC GTA TCT AAC GCA AGC TGC ATCAsn Lys Arg Leu Asp Ser Val Asn Tyr Ile Val Ser Asn Ala Ser Cys IleGTT TCA GAT GCA GTA TCT GGC ATG ATT TGT GAA AAT CCA GGC TTG ATT GCAVal Ser Asp Ala Val Ser Glyr Met Ile Cys Glu Asn Pro Gly Leu Ile AlaCCA GGT GGA AAT TGC TAT ACA AAT CGT AGA ATG GCT GCT TGT TTA CGC GATPro Gly Gly Asn Cys Tyr Thr Asn Arg Arg Met Ala Ala Cys Leu Arg AspGGT GAA ATT ATC TTA CGT TAT GTA TCT TAT GCT TTA CTA TCT GGC GAT GCTGly Glu Ile Ile Leu Arg Tyr Val Ser Tyr Ala Leu Leu Ser Gly Asp AlaTCT GTA TTA GAA GAT CGT TGC TTA AAT GGA CTA AAA GAA ACT TAT ATT GCASer Val Leu Glu Asp Arg Cys Leu Asn Gly Leu Lys Glu Thr Tyr Ile AlaCTT GGT GTA CCA ACT AAT TCA ACA GTA AGA GCA GTA AGC ATT ATG AAA GCGLeu Gly Val Pro Thr Asn Ser Thr Val Arg Ala Val Ser Ile Met Lys AlaGCT GCT GTT GCA TTT GTA ACT AAT ACA GCA TCA CAA CGT ACA GTA GAA GTT
Ala Ala Val Ala Phe Val Thr Asn Thr Ala Ser Gln Arg Thr Val Glu ValGCT GCT GGA GAT TGT AGT GCA ATC GCT TCT GAA GTT GGC GCA TAT TGT GATAla Ala Gly Asp Cys Ser Ala Ile Ala Ser Glu Val Gly Ala Tyr Cys AspAGA GTA GCT GCT GCT GTT TCT TAA TCA ATT TGC AGA GAA CAA TCT ACA AAGArg Val Ala Ala Ala Val Ser StopTAT TGA TAA GCA AAA TAC TTA AAA TTA TTC CTT AAG GAG AAA TATA ATGMetAAA TCA GTT ATT ACT ACT ACT ATC AGT GCT GCT GAT GCT GCT GGT CGT TTTLys Ser Val Ile Thr Thr Thr Ile Ser Ala Ala Asp Ala Ala Gly Arg PheCCT TCA AGC TCT GAT CTA GAA TCA GTA CAA GGC AAC ATC CAA CGT TCT AGTPro Ser Ser Ser Asp Leu Glu Ser Val Gln Gly Asn Ile Gln Arg Ser SerGCA AGA TTA GAA GCG GCT GAA AAA TTA GGA TAC AAC CAT GAA GCA GTT GTAAla Arg Leu Glu Ala Ala Glu Lys Leu Glyr Tyr Asn His Glu Ala Val ValAAA GAA GGC GGA GAT GCT TGT TTT GCA AAA TAT TCT TAC TTA AAA AAC CCALys Glu Gly Gly Asp Ala Cys Phe Ala Lys Tyr Ser Tyr Leu Lys Asn ProGGA GAA GCT GGT GAC AGC ACA GAA AAA ATC AAT AAA TGC TAT AGA GAT GTTGly Glu Ala Gly Asp Ser Thr Glu Lys Ile Asn Lys Cys Tyr Arg Asp ValGAT CAC TAC ATG CGT TTA ATC AAC TAC TCA CTT GTA GTT GGT GGT ACT GGTAsp His Tyr Met Arg Leu Ile Asn Tyr Ser Leu Val Val Gly Gly Thr GlyCCT CTT GAT GAA TGG GGA ATT GCT GGT TCA CGT GAA GTA TAT AGA GCT TTAPro Leu Asp Glu Trp Gly Ile Ala Gly Ser Arg Glu Val Tyr Arg Ala LeuAAT CTT CCT AGT GCT GCT TAT ATT GCT TCT TTT GTA TTT ACT AGA GAT AGAAsn Leu Pro Ser Ala Ala Tyr Ile Ala Ser Phe Val Phe Thr Arg Asp ArgTTA TGT GTA CCT CGT GAT ATG AGC GCT CAA GCT GGA GTA GAA TAC TTA GCTLeu Cys Val Pro Arg Asp Met Ser Ala Gln Ala Gly Val Glu Tyr Leu Ala GCTTTA GAC TAT GTA ATC AAC GCA CTA AGC TAAAla Leu Asp Tyr Val Ile Asn Ala Leu Ser Stop實施例4利用PCR技術(shù)從原綠球藻(Prochlorococcus sp.)中克隆藻紅蛋白基因β亞基基因1.模板DNA的提取取0.05g鮮重的原綠球藻(Prochlorococcus sp.)置于1.5ml離心管中；加入0.5ml緩沖液I(50mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris-Hcl，10mmol/LEDTA，pH8.0)，混合均勻；10,000g離心15min后，棄上清；再依次加入0.5ml緩沖液I和5μl蛋白酶K(20mg/ml)，混勻后于37℃溫育1h，其間多次顛倒管子，充分混勻；而后加入0.5ml的苯酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1，V∶V∶V)并充分混勻，10,000g離心10min后，取上清；再用等體積于上清的苯酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1，V∶V∶V)提取一遍，再取上清，上清液加入2倍體積的無水乙醇，-20℃靜置2h；13,000g 4℃離心15min后，棄上清，用70％乙醇洗滌2次；揮干乙醇后溶解于20μl TE緩沖液(10mmol/L Tris-Hcl，1mmol/L EDTA，pH8.0)；最后將所得DNA溶液保存于4℃。
2.PCR引物及反應(yīng)根據(jù)已知藻紅蛋白β亞基基因序列設(shè)計引物。正向引物PPE35’-AAGCATTGCGTTCTTAGGTCTC-3’(序列表中SEQ ID NO 18)，PPE45’-CATCTAAAGGACCAGTCCCAC-3’(序列表中SEQ ID NO 19)。于25ul反應(yīng)體系中加入1ul模板DNA(20ng/ul)，1ul Taq(5U/ul)，0.5ul dNTP(10mmol/L)，3ul Mg2+(25mmol/L)，2.5ul 10×Taq緩沖液，兩端引物(10umol/L)各1ul，余下體積加超純水補齊(以上試劑均購自上海生工生物工程有限公司)。反應(yīng)條件為94℃預變性2min；然后94℃變性40s，48℃復性40s，72℃延伸1min，共35個循環(huán)；最后72℃延伸10min以補齊未端。擴增產(chǎn)物于1.0％瓊脂糖(購自Promega公司)凝膠中電泳鑒定，結(jié)果擴增出一條大小約500bp的條帶，與預計值相符。
3.pe基因β亞基的克隆與測序PCR擴增條帶從瓊脂糖凝膠上回收后，按上海Promega公司pGEM-T克隆試劑盒手冊要求，與pGEM-T載體連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細菌DH5α。連接、轉(zhuǎn)化以及陽性重組子的篩選和鑒定均參考《分子克隆實驗指南》(J.薩姆布魯克等著，金冬雁等譯，科學出版社，1992年第二版)介紹的方法。將陽性克隆菌落培養(yǎng)后，由上海基康公司從正反兩個方向分別進行測序。其核酸序列及其推導的氨基酸序列(序列表中SEQ ID NO 10～11)如下ATG CTT GAT GCG TTC TCT AGA ACA GTT GTA AGT GCT GAC GCC AAG GGT GCCMet Leu Asp Ala Phe Ser Arg Thr Val Val Ser Ala Asp Ala Lys Gly AlaGCA ATT GGC AGT GAG GAT CTT GCA GAT TTA AGA AAG TAC GTA GCA GATAla Ile Gly Ser Glu Asp Leu Ala Asp Leu Arg Lys Tyr Val Ala AspGCA AAT AAA AGA ATT GAT GCA ACC CTT GCA ATA ACT CAA AAT GTT TCT TGCAla Asn Lys Arg Ile Asp Ala Thr Leu Ala Ile Thr Gln Asn Val Ser CysATA GCT GCA GAT GCT GTA GCA GGA ATG GTT TGC GAA AAT ACT GGA CTT ACAIle Ala Ala Asp Ala Val Ala Gly Met Val Cys Glu Asn Thr Gly Leu ThrCAG CCA GGA GGA CAT TGT TAT CCA ACT CGT CGC ATG GCA GCT TGT TTA AGGGln Pro Gly Gly His Cys Tyr Pro Thr Arg Arg Met Ala Ala Cys Leu ArgGAT GGA GAA ATT ATT TTG AGA TAT GTA AGC TAC GCT CTT CTT GCT GGG GATAsp Gly Glu Ile Ile Leu Arg Tyr Val Ser Tyr Ala Leu Leu Ala Gly AspTCT TCT GTC CTT GAA GAT AGA TGT CTA AAT GGA TTA AAA GAA ACT TAT TTA
Ser Ser Val Leu Glu Asp Arg Cys Leu Asn Gly Leu Lys Glu Thr Tyr LeuGCT CTT GGA GTT CCA ACT TCT AAT GCT ATT CGG GCA GTT GAA ATA ATG AAAAla Leu Gly Val Pro Thr Ser Asn Ala Ile Arg Ala Val Glu Ile Met LysATT GCC ACA GTT GCA ATT ATG ACT GAG ACA AAT ACA GGA AGA AAA ATG TTTIle Ala Thr Val Ala Ile Met Thr Glu Thr Asn Thr Gly Arg Lys Met PheAAG GGA ATT AAT TCT GGC TCA GGA GCT CAG TGT CAA GAT ATA GCG GCG GAGLys Gly Ile Asn Ser Gly Ser Gly Ala Gln Cys Gln Asp Ile Ala Ala GluGCA GCA TCA TAT TTT GAC CTT GTA ATA GAG GCT TTG AGT TGAAla Ala Ser Tyr Phe Asp Leu Val Ile Glu Ala Leu Ser Stop實施例5重組藻膽蛋白在大腸桿菌(E.coli)中的表達1.表達麥芽糖結(jié)合蛋白與藻膽蛋白融合蛋白(MBP-APC，鐳普克)載體的構(gòu)建如圖1所示的設(shè)計將apc基因用限制性內(nèi)切酶EcoR I從質(zhì)粒pCRBapc中切下，按美國New England Biolabs蛋白融合及表達系統(tǒng)試劑盒要求，接到pMAL-p2X載體麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)基因下游EcoR I位點中，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌TB1。按照《分子克隆實驗指南》第二版所述方法，進行篩選找到一個apc方向正確，讀碼框也正確的表達質(zhì)粒pMAL-apc，同時獲得可生產(chǎn)MBP-APC的基因工程菌菌株P(guān)1?；蚬こ叹關(guān)1生產(chǎn)的MBP-APC命名為鐳普克。
2.鐳普克的生產(chǎn)從LB固體(含1.5％瓊脂的LB培養(yǎng)基)平板上挑選基因工程菌菌株P(guān)1單菌落，轉(zhuǎn)接到5ml含100mg/L氨芐青霉素(Amp)的LB(蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L；NaCl 10g/L；pH7.2～7.4)培養(yǎng)基中，于37℃恒溫搖床，220r/min培養(yǎng)過夜；然后將活化的菌液轉(zhuǎn)入1L含100mg/L氨芐青霉素(Amp)2-YT(葡萄糖5g/L，蛋白胨16g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 5g/L，MgSO45g/L；pH7.0)培養(yǎng)基中，于37℃恒溫搖床，220r/min培養(yǎng)8h，作為20L規(guī)模發(fā)酵的種子液。
將制備好的種子液接入16L含100mg/L氨芐青霉素(Amp)2-YT培養(yǎng)基中，在20L發(fā)酵罐中以溫度37℃、轉(zhuǎn)速700r/min和溶解氧為100％的培養(yǎng)條件下發(fā)酵13h，而后溫度降為28℃，通過控制轉(zhuǎn)速和通氣量將溶解氧維持在30％左右，繼續(xù)發(fā)酵7h后收獲菌體。發(fā)酵過程中在開始發(fā)酵5h后補料，補料培養(yǎng)基為葡萄糖400g/L，蛋白胨16g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 5g/L，MgSO45g/L，pH7.0；補料速率為0.054g(L·min)-1，持續(xù)8h后停止。發(fā)酵開始10h后，加入終濃度為0.3mmol/L的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG，Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside)進行誘導，表達鐳普克。
收獲的菌液在5,000g，4℃條件下離心收集菌體；收集的菌體用CBBuffer(10mmol/L Tris·Cl，200mmol/L NaCl，1mmol/L EDTA，pH7.4)洗滌2次后，再用1L CB Buffer重懸；重懸的菌體進行超聲波破碎，具體參數(shù)為功率30W，每破碎15s后間隔5s，共破碎6min 15s；破碎后10,000g，4℃離心取上清。而后根據(jù)美國New England Biolabs蛋白融合及表達系統(tǒng)說明書的說明進行親和層析一步純化，得到電泳級純度的鐳普克。經(jīng)SDS-PAGE電泳，為一條約60kD的單一條帶，每升菌液約能得到鐳普克純品100mg。
這種方法得到的鐳普克，純度大于90％(用SDS-PAGE、PAGE及HPLC法鑒定)，鐳普克在SDS-PAGE上的遷移率為0.452，在HPLC上的保留時間為31min，最大紫外吸收波長240nm(200-900nm全波長掃描)。不同生產(chǎn)批次之間鐳普克性質(zhì)一致，質(zhì)量穩(wěn)定。
3.表達6×His tag-APC(HAPC)載體的構(gòu)建按圖1所示的設(shè)計，將apc用限制性內(nèi)切酶EcoR I從質(zhì)粒pCRBapc中切下，按Novagen公司的pET蛋白表達系統(tǒng)試劑盒要求，插入pET-28a(+)載體多克隆位點中的EcoR I位點上，并轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α。通過篩選找到一個含有正確apc方向，正確讀碼框表達質(zhì)粒pET-apc的菌株，用堿變性法提取出構(gòu)建好的表達質(zhì)粒，再轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌JM109(DE3)，得到能在T7啟動子驅(qū)動下高效表達活性藻膽蛋白的基因工程菌菌株J1。上述連接、轉(zhuǎn)化以及陽性重組子的篩選和鑒定均參考《分子克隆實驗指南》(J.薩姆布魯克等著，金冬雁等譯，科學出版社，1992年第二版)介紹的方法。
4.6×His tag-APC(HAPC)的生產(chǎn)從LB固體(含1.5％瓊脂的LB培養(yǎng)基)平板上挑取基因工程菌菌株J1單菌落于5ml含50μg/ml卡那霉素的液體LB培養(yǎng)基中，在恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(溫度37℃，轉(zhuǎn)速200r/min左右)。將過夜培養(yǎng)物以1∶100的比例接種于5L的2YT培養(yǎng)基(含卡那霉素50μg/ml)中。在恒溫振蕩培養(yǎng)箱中以溫度37℃、轉(zhuǎn)速200r/min的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)至OD600＝0.5～0.7時加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG，Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside)至終濃度為0.4mmol/L進行誘導。加入誘導劑后，在溫度25℃、轉(zhuǎn)速200r/min的培養(yǎng)條件繼續(xù)培養(yǎng)10h后停止。
將收獲的菌液5,000g，離心10min，棄上清液。收集的菌體以SB buffer(20mmol/L磷酸氫二鈉，500mmol/L NaCl，pH7.8)洗滌2次后，將菌體重懸于相當于原培養(yǎng)物1/50體積冰冷的SB buffer。超聲波破碎細胞，功率30W，每破碎15s后間隔5s，總計10min，破碎過程中保持細胞低溫(0℃)。破碎后于4℃以12,000g離心30min，上清液用0.45μm硝酸纖維素膜過濾后，濾液用于上柱純化。
將上述處理獲得的濾液上柱，柱料為預先用SB buffer平衡的固化Ni2+層析樹脂(Pharmacia公司)，上樣量約為8-12mg目的蛋白/ml樹脂，流速為10個柱體積/h；然后依次用10個柱體積的SB buffer，6個柱體積的洗滌緩沖液(20mmol/L磷酸氫二鈉，500mmol/L NaCl，pH6.0)洗柱，直至流過液A280＜0.01；再用10mmol/L咪唑洗脫液洗柱(20mmol/L磷酸氫二鈉，500mmol/L NaCl，10mmol/L咪唑，pH7.0)，直至流過液A280＜0.01；最后用150mmol/L咪唑洗脫液(20mmol/L磷酸鈉，500mmol/L NaCl，10mmol/L咪唑，pH7.0)洗脫目的蛋白，洗脫時監(jiān)測A280，收集洗脫峰，從而得到電泳級純度的HAPC。經(jīng)SDS-PAGE電泳，為二條分別約為21kD與18kD的條帶，即別藻藍蛋白的α與β亞基。該法生產(chǎn)的藻膽蛋白為無色蛋白，溶于水，分子量約為39kD。
5.表達6×His tag-PE載體的構(gòu)建與重組蛋白的生產(chǎn)按圖2所示的設(shè)計將pe用限制性內(nèi)切酶BamH I和Hind III從質(zhì)粒pMD-pe中切下，酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，從膠上回收。按Novagen公司的pET蛋白表達系統(tǒng)試劑盒要求，連接到經(jīng)同樣內(nèi)切酶處理過的pET-28a(+)載體上，16℃連接16h，然后轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α。由于pMD-pe質(zhì)粒中，pe基因5′端位于BamH I下游，3′端位于Hind III上游，這樣pe基因定向插入pET-28a(+)的BamH I和Hind III兩位點間。經(jīng)核苷酸測序，表明構(gòu)建成插入序列與已知pe基因序列相同，并且閱讀框正確的表達質(zhì)粒pET-pe。用堿變性法提取出構(gòu)建好的表達質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌JM109(DE3)，得到能在T7啟動子驅(qū)動下高效表達活性藻膽蛋白的基因工程菌菌株JME1。上述連接、轉(zhuǎn)化以及陽性重組子的篩選和鑒定均參考《分子克隆實驗指南》(J.薩姆布魯克等著，金冬雁等譯，科學出版社，1992年第二版)介紹的方法。
從LB固體(含1.5％瓊脂的LB培養(yǎng)基)平板上挑選基因工程菌菌株JME1單菌落于5ml含50μg/ml卡那霉素的液體LB培養(yǎng)基中，在恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(溫度37℃，轉(zhuǎn)速200r/min左右)。將過夜培養(yǎng)物以1∶100的比例接種于5L含1％葡萄糖LB培養(yǎng)基(含卡那霉素50μg/mL)中。于37℃，220r/min振蕩培養(yǎng)，OD600＝0.6時加入IPTG至終濃度0.4mmol/L，再振蕩培養(yǎng)4h。離心收集菌體，超聲波破碎，親和層析一步純化，得到電泳級純度的藻膽蛋白(分離純化方法同“6×His tag-APC(HAPC)的生產(chǎn)”所述)。經(jīng)SDS-PAGE電泳，為二條分別約為23kD與19kD的條帶，即藻紅蛋白的β與α亞基。該法生產(chǎn)的藻膽蛋白為無色蛋白，溶于水，分子量約為41kD。
實施例6重組藻膽蛋白α亞基在大腸桿菌(E.coli)中的表達
1.表達麥芽糖結(jié)合蛋白和藻膽蛋白α亞基融合蛋白表達載體的構(gòu)建及重組蛋白的生產(chǎn)根據(jù)實施例1的所獲得的apc基因序列設(shè)計引物。正向引物PAP35’-CTGGATCCTTAATGAGTATCG-3’(序列表中SEQ ID NO 20)，反向引物PAP45’-ACGCTGCAGAAAGACTGAAT-3’(序列表中SEQ ID NO 21)。其中正向引物5′端加上了BamH I酶切位點，反向引物5′端加上了Pst I酶切位點(分別以下劃線表示)。以質(zhì)粒pMAL-apc作為PCR反應(yīng)擴增模板。于25ul反應(yīng)體系中加入1ul質(zhì)粒pMAL-apc(20ng/ul)，0.2ul Taq(5U/ul)，0.5ul dNTP(10mmol/L)，3ul Mg2+(25mmol/L)，2.5ul 10×反應(yīng)緩沖液，兩端引物(10umol/L)各1ul，余下體積加超純水補齊(以上試劑均購自上海Promega公司)。反應(yīng)條件為94℃預變性3min；然后94℃變性40s，50℃復性40s，72℃延伸1min，共35個循環(huán)；最后72℃延伸8min以補齊未端。擴增產(chǎn)物于1.2％瓊脂糖(購自北京鼎國生物公司)凝膠中電泳鑒定，結(jié)果擴增出一條大小約500bp的條帶，與預計值相符。
按圖3所示設(shè)計，PCR擴增條帶從瓊脂糖凝膠上回收后，用內(nèi)切酶BamH I和Pst I在37℃消化6h。酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，從膠上回收。連接到經(jīng)同樣酶處理過的pMAL-p2X載體上，16℃連接16h，然后轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α。由于經(jīng)過PCR改造后，apcα亞基基因5′端加上了BamH I酶切位點，3′端加上了Pst I酶切位點，這樣apcα亞基基因定向插入pMAL-p2X的BamH I和Pst I兩位點間。經(jīng)核苷酸測序，表明所克隆apcα亞基基因序列與已知序列相同，并且閱讀框正確，從而得到了表達質(zhì)粒pMAL-apcα。用堿變性法提取出構(gòu)建好的表達質(zhì)粒，按美國NewEngland Biolabs蛋白融合及表達系統(tǒng)試劑盒說明書要求轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌JM109(DE3)，得到能高效表達活性重組藻膽蛋白α亞基的基因工程菌菌株P(guān)α1。上述連接、轉(zhuǎn)化以及陽性重組子的篩選和鑒定均參考《分子克隆實驗指南》(J.薩姆布魯克等著，金冬雁等譯，科學出版社，1992年第二版)介紹的方法。
MBP-APCα的生產(chǎn)方法同實施例1中鐳普克的生產(chǎn)。具體方法參見實施例1相關(guān)步驟。該法得到的重組藻膽蛋白α亞基(MBP-APCα)為電泳純無色蛋白，溶于水，分子量約為60kD。
2.表達6×His tag-APCα(HAPCα)載體的構(gòu)建及重組藻膽蛋白的生產(chǎn)按圖3所示的設(shè)計，用堿變性法從大腸桿菌菌株P(guān)α1中提取質(zhì)粒pMAL-apcα。所提取的質(zhì)粒用內(nèi)切酶BamH I和HindIII在37℃消化6h。酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，從膠上回收500bp的小片段。而后按Novagen公司的pET蛋白表達系統(tǒng)試劑盒要求，將回收的500bp的小片段與同樣經(jīng)過內(nèi)切酶BamH I和HindIII酶切的pET-28a(+)載體相連接，16℃連接16h，然后轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α。通過篩選找到一個含有正確apcα方向，正確讀碼框表達質(zhì)粒pET-apcα的菌株。用堿變性法提取出構(gòu)建好的表達質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌JM109(DE3)，得到能在T7啟動子驅(qū)動下高效表達活性藻膽蛋白α亞基的基因工程菌菌株Jα1。上述質(zhì)粒提取、連接、轉(zhuǎn)化以及陽性重組子的篩選和鑒定均參考《分子克隆實驗指南》(J.薩姆布魯克等著，金冬雁等譯，科學出版社，1992年第二版)介紹的方法。
6×His tag-APCα的生產(chǎn)方法同實施例1中HAPC的生產(chǎn)。具體方法參見實施例1相關(guān)步驟。該法得到的重組藻膽蛋白α亞基(6×His tag-APCα)為電泳純無色蛋白，溶于水，分子量約為21kD。
實施例7重組藻膽蛋白β亞基在大腸桿菌(E.coli)中的表達1.藻膽蛋白β亞基基因的克隆根據(jù)實施例1的所獲得的apc基因序列設(shè)計引物。正向引物PAP55’-TAGGATCCATGCAAGACGC-3’(序列表中SEQ ID NO 22)，反向引物PAP65’-ATTCGGCTTGGAAGCTTAG-3’(序列表中SEQ ID NO 23)。其中正向引物5′端加上了BamH I酶切位點，反向引物則通過點突變在3′端加上了Hind III酶切位點(分別以下劃線表示)。以質(zhì)粒pMAL-apc作為PCR反應(yīng)擴增模板。于25ul反應(yīng)體系中加入1ul質(zhì)粒pMAL-apc(20ng/ul)，0.1ulTaq(5U/ul)，0.5ul dNTP(10mmol/L)，4ul Mg2+(25mmol/L)，2.5ul 10×反應(yīng)緩沖液，兩端引物(10umol/L)各1ul，余下體積加超純水補齊(以上試劑均購自上海Promega公司)。反應(yīng)條件為94℃預變性3min；然后94℃變性40s，55℃復性40s，72℃延伸1min，共35個循環(huán)；最后72℃延伸8min以補齊未端。擴增產(chǎn)物于1.2％瓊脂糖凝膠中電泳鑒定，結(jié)果擴增出一條大小約500bp的條帶，與預計值相符。PCR擴增條帶從瓊脂糖凝膠上回收后，用內(nèi)切酶BamH I和HindIII在37℃消化6h。酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，從膠上回收，溶于30ul無菌超純水，4℃保存?zhèn)溆谩?br> 2.表達麥芽糖結(jié)合蛋白和藻膽蛋白β亞基融合蛋白載體的構(gòu)建及重組蛋白的生產(chǎn)按圖3所示的設(shè)計，pMAL-p2X載體DNA用內(nèi)切酶BamH I和HindIII在37℃消化6h。酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，從膠上回收。與經(jīng)同樣內(nèi)切酶處理過的藻膽蛋白β亞基基因連接，16℃連接16h，然后轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α。由于經(jīng)過PCR改造后，apcβ亞基基因5′端加上了BamHI酶切位點，3′端加上了Hind III酶切位點，這樣apcβ亞基基因定向插入pMAL-p2X的BamH I和HindIII兩位點間。經(jīng)核苷酸測序，表明所克隆apcβ亞基基因序列與已知序列相同，并且閱讀框正確，從而得到了表達質(zhì)粒pMAL-apcβ。用堿變性法提取出構(gòu)建好的表達質(zhì)粒，按美國New EnglandBiolabs蛋白融合及表達系統(tǒng)試劑盒說明書要求轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌JM109(DE3)，得到能高效表達活性重組藻膽蛋白β亞基的大腸桿菌菌株P(guān)β1。上述連接、轉(zhuǎn)化以及陽性重組子的篩選和鑒定均參考《分子克隆實驗指南》(J.薩姆布魯克等著，金冬雁等譯，科學出版社，1992年第二版)介紹的方法。
MBP-APCβ的生產(chǎn)方法同實施例1中鐳普克的生產(chǎn)。具體方法參見實施例1相關(guān)步驟。該法得到的重組藻膽蛋白β亞基(MBP-APCβ)為電泳純無色蛋白，溶于水，分子量約為58kD。
3.表達6×His tag-APCβ(HAPCβ)載體的構(gòu)建及重組蛋白的生產(chǎn)按圖3所示的設(shè)計，pET-28a(+)載體DNA用內(nèi)切酶BamH I和HindIII在37℃消化6h。酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，從膠上回收。與經(jīng)同樣內(nèi)切酶處理過的藻膽蛋白β亞基基因連接，16℃連接16h，然后轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α。經(jīng)過篩選得到表達質(zhì)粒pET-apcβ。用堿變性法提取出構(gòu)建好的表達質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌JM109(DE3)，得到能在T7啟動子驅(qū)動下高效表達活性藻膽蛋白β亞基的大腸桿菌菌株Jβ1。上述質(zhì)粒提取、連接、轉(zhuǎn)化以及陽性重組子的篩選和鑒定均參考《分子克隆實驗指南》(J.薩姆布魯克等著，金冬雁等譯，科學出版社，1992年第二版)介紹的方法。
6×His tag-APCβ的生產(chǎn)方法同實施例1中HAPC的生產(chǎn)。具體方法參見實施例1相關(guān)步驟。該法得到的重組藻膽蛋白β亞基(6×His tag-APCβ)為電泳純無色蛋白，溶于水，分子量約為19kD。
實施例8藻膽蛋白在畢赤酵母(Pichia pastoris)中的高效表達1.apc的定點突變根據(jù)實施例1所獲得apc基因序列設(shè)計引物。正向引物PAP75′-GGAGAGAATTCCATGTTTGA-3’(序列表中SEQ ID NO 24)，反向引物PAP85′-ATTGGTACCGGTAGGGCGTTGATCG-3′(序列表中SEQ ID NO25)。其中正向引物5′端加上了EcoR I酶切位點，反向引物5′端加上了KpnI酶切位點(分別以下劃線表示)。以質(zhì)粒pCRBapc作為PCR反應(yīng)擴增模板。于25ul反應(yīng)體系中加入1ul質(zhì)粒pCRBapc(20ng/ul)，1ul Taq(5U/ul)，0.5ul dNTP(10mmol/L)，2ul Mg2+(25mmol/L)，2.5ul 10×反應(yīng)緩沖液，兩端引物(10umol/L)各1ul，余下體積加超純水補齊(以上試劑均購自上海生工生物工程有限公司)。反應(yīng)條件為93℃預變性5min；然后93℃變性1min，55℃復性1min，72℃延伸3min，共35個循環(huán)；最后72℃延伸8min以補齊未端。擴增產(chǎn)物于1.0％瓊脂糖(購自Promega公司)凝膠中電泳鑒定，結(jié)果擴增出一條大小約1kb的條帶，與預計值相符。PCR擴增條帶從瓊脂糖凝膠上回收后，用內(nèi)切酶EcoR I和Kpn I在37℃消化4h，然后75℃反應(yīng)10min以失活內(nèi)切酶。1.2％瓊脂糖凝膠電泳后回收，連接到經(jīng)同樣酶處理過的pBluescriptSK(+)，16℃連接16h，然后轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α。由于經(jīng)過PCR改造后，apc基因5′端加上了EcoR I酶切位點，3′端加上了KpnI酶切位點，這樣apc定向插入pBluescriptSK(+)的EcoRI和Kpn I兩位點間。經(jīng)核苷酸測序和序列比對分析，表明所克隆apc序列與已知序列相同，且達到終止子失活突變的目的。
2.apc的畢赤酵母(Pichiapastoris)表達載體的構(gòu)建按圖4所示設(shè)計，用內(nèi)切酶EcoR I和Kpn I雙酶切消化已插入大小約1040bp apc的pBluescriptSK(+)載體(pBS-apc)?；厥誥pc片段，連接到用同樣內(nèi)切酶處理過的畢赤酵母表達載體pPIC6αc(美國Invitrogen公司)上，然后轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α。挑選若干轉(zhuǎn)化子，運用堿變性法提取出質(zhì)粒，用內(nèi)切酶EcoR I和Kpn I雙酶切鑒定apc的插入，并用沒有插入apc的pPIC6αc載體作對照。構(gòu)建的載體切出了1kb左右的片段，說明apc基因已正確插入到pPIC6αc的EcoR I和Kpn I位點處。該表達載體命名為pPIC-apc。
3.重組藻膽蛋白在畢赤酵母(Pichia pastoris)中的小規(guī)模表達將pPIC-apc質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶Sac I消化后，回收線性DNA片段，電激法轉(zhuǎn)化畢赤酵母細胞X-33，篩選出具有正確的Blasticidin抗性的轉(zhuǎn)化子。分別提取各轉(zhuǎn)化子基因組DNA，進行PCR鑒定，判斷apc是否整合入Pichia pastoris X-33基因組。將鑒定正確的重組酵母細胞株進行誘導，離心收集甲醇誘導2d的培養(yǎng)上清，親和層析一步純化，得到電泳級純度的重組藻膽蛋白。以上過程具體操作均根據(jù)美國Invitrogen公司pPICα6.Starter Kit使用手冊所述。
實施例9藻膽蛋白基因在海帶中的表達1.表達載體構(gòu)建根據(jù)實施例1所獲得apc基因序列設(shè)計引物。正向引物PAP95′-GACGAATTCATT AAT GAGTATCG-3′(序列表中SEQ ID NO26)，反向引物PAP105′-TGGTCGACTAGCTCAAGCCGGAG-3′(序列表中SEQ IDNO27)。其中正向引物5′端加上了EcoR I酶切位點，反向引物在5′端加上了Sal I酶切位點(分別以下劃線表示)。以質(zhì)粒pMAL-apc作為PCR反應(yīng)擴增模板。于25ul反應(yīng)體系中加入0.5ul質(zhì)粒pMAL-apc(40ng/ul)，0.2ul Taq(5U/ul)，0.5ul dNTP(10mmol/L0，2ul Mg2+(25mmol/L)，2.5ul 10×反應(yīng)緩沖液，兩端引物(10umol/L)各1ul，余下體積加超純水補齊(以上試劑均購自上海Promega公司)。反應(yīng)條件為94℃預變性3min；然后94℃變性1min，58℃復性1min，72℃延伸1.5min，共35個循環(huán)；最后72℃延伸8min以補齊未端。擴增產(chǎn)物于1.2％瓊脂糖凝膠中電泳鑒定，結(jié)果擴增出一條大小約1kb的條帶，與預計值相符。按圖5所示設(shè)計，PCR擴增條帶從瓊脂糖凝膠上回收后，用內(nèi)切酶EcoR I和Sal I在37℃消化6h。酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，從膠上回收，與經(jīng)同樣酶處理過的pSI載體連接，16℃連接16h，然后轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α。由于經(jīng)過PCR改造后，apc基因5′端加上了EcoR I酶切位點，3′端加上了Sal I酶切位點，這樣apc基因定向插入pSI(購自Promega Cat.#E 1721)多克隆位點的EcoR I和SalI兩位點間。篩選得到陽性克隆子后，陽性克隆子經(jīng)核苷酸測序驗證，表明所克隆apc基因序列與已知序列相同，且并閱讀框正確，從而得到了表達質(zhì)粒pSI-apc及含有該質(zhì)粒的菌株L1。由于pSI載體EcoR I位點上游為SV40增強子與SV40啟動子，Sal I位點下游為SV40 late polyA，而SV40啟動子可在海帶中驅(qū)動外源基因表達(姜鵬、秦松等，乙肝病毒表面抗原(HbsAg)基因在海帶中的表達，科學通報，2002，47(14)1095)，因此構(gòu)建成功的pSI-apc可在海帶中表達。
2.轉(zhuǎn)化海帶從LB固體(含1.5％瓊脂的LB培養(yǎng)基)平板上挑選含有表達質(zhì)粒pSI-apc的菌株L1單菌落于20ml含100μg/ml氨芐青霉素的液體LB培養(yǎng)基中，在恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(溫度37℃，轉(zhuǎn)速200r/min左右)培養(yǎng)12h。5,000g，5min離心收集菌體后，采用堿裂解法(《分子克隆實驗指南》(J.薩姆布魯克等著，金冬雁等譯，科學出版社，1992年第二版)提取質(zhì)粒。取0.5μl質(zhì)粒溶液稀釋200倍，用紫外分光光度計測定OD260/OD280值檢驗純度，如果低于1.7或高于1.8，則重新用苯酚、氯仿純化。最后根據(jù)DNA含量用適量無菌超純水調(diào)整濃度至1μg/μl。獲得質(zhì)粒后，參照Heiser W(Heiser W.Optimization of boilistic transformation using thehelium-driven PDS-1000/He system.1992，US/EG Bull，1688.BioRad.Hercules，CA，USA，8)制作基因槍子彈。
基因槍轟擊前一天，取2片無菌載玻片輕柔對磨海帶絲狀雄配子體，使其松動散開并斷裂。顯微鏡鏡檢并用血球計數(shù)板計數(shù)處理后的配子體，每段配子體不超過5個細胞。遮光恢復性培養(yǎng)24h。轉(zhuǎn)化時圓形無菌篩絹(400目，直徑4cm)做為靶細胞的承載體，將配子體均勻平鋪于中央，形成直徑約2cm的圓形有效轟擊范圍。每次轟擊約用1.0×106雄配子體細胞。
整個轟擊過程為無菌操作，超凈工作臺、基因槍(Bio-Rad產(chǎn)品，稱為PDS-1000/He Biolistic particle delivery system，型號PDS-1000/He)。內(nèi)部用70％酒精滅菌，轟擊用可裂膜、DNA載片、阻擋網(wǎng)均用70％酒精浸泡20min，于紫外燈下晾干待用。轟擊參數(shù)樣品室真空度為28(英寸汞柱)，可裂膜為1100psi(pound per square inch)，受體細胞與阻擋網(wǎng)之間距離為6cm，每次轟擊用1.0μg質(zhì)粒DNA。取不進行轟擊雄配子體細胞作為空白對照。用不加質(zhì)粒DNA的金粉分別轟擊雄配子體作為陰性對照。對照組和處理組的群體數(shù)皆約為1×106個細胞。
轟擊后各組加入滅菌含鐵誘導培養(yǎng)基(0.71mmol/L NaNO3，0.032mmol/L KH2PO4，0.0019mmol/L檸檬酸鐵，0.5μg/L VB12)，弱光培養(yǎng)，24h后恢復正常光照(光暗周期為10h/14h，光強為50uE/m2s)。一周后混入相同數(shù)量的雌性配子體，采用含鐵誘導培養(yǎng)基，在光暗周期為10h/14h，光強為50uE/m2s，溫度12.0℃+0.5℃培養(yǎng)條件下誘導雌雄配子受精。二倍體幼孢子體出苗后培養(yǎng)基每周更換1次。
3.apc基因在海帶孢子體中的穩(wěn)定表達轉(zhuǎn)化后3個月對海帶孢子體進行穩(wěn)定表達檢測。轉(zhuǎn)化組隨機挑取100株海帶孢子體，陰性對照組和空白對照組各隨機挑取5株，研磨提取總DNA。具體方法如下每株孢子體取部分組織，用煮沸過的海水洗凈表面粘液，加少量滅菌石英砂分別研磨后，加適量裂解緩沖液(100mmol/LTris-HCl，EDTA 50mmol/L，NaCl 100mmol/L，Tween-201％，KAC 2.5mol/L，蛋白酶K 0.1mg/ml，pH8.0)于室溫下裂解1h，不時輕微顛倒混勻；而后室溫下10,000g離心10min，取上清；各管加與上清等體積的飽和酚(pH8.0)，顛倒混勻，抽提10min，室溫下12,000g離心10min，取上清液；各管再加1/3V無水乙醇，顛倒混勻以沉淀多糖，室溫下12,000g離心15min，取上清；最后各管加2/3V異丙醇，混勻后于-20℃沉淀DNA過夜，于4℃12,000g離心20min，真空抽干乙醇后，用30μl TE溶解DNA。以0.8％瓊脂糖凝膠電泳檢驗并從凝膠上回收海帶孢子體總DNA，用于PCR檢測。
分別以所提取各株海帶孢子體總DNA為模板，以PAP9和PAP10為檢測引物。于25ul反應(yīng)體系中加入1ul DNA(20ng/ul)，0.2ul Taq(5U/ul)，0.5ul dNTP(10mmol/L)，2ul Mg2+(25mmol/L)，2.5ul 10×反應(yīng)緩沖液，兩端引物(10umol/L)各1ul，余下體積加超純水補齊(以上試劑均購自上海Promega公司)。反應(yīng)條件為94℃預變性3min；然后94℃變性1min，58℃復性1min，72℃延伸1.5min，共35個循環(huán)；最后72℃延伸8min以補齊未端。除擴增海帶DNA樣品外，同時設(shè)立系統(tǒng)空白對照(不加模板)與陽性對照(以轉(zhuǎn)化質(zhì)粒pSI-apc為模板)。擴增產(chǎn)物于1.2％瓊脂糖凝膠中電泳鑒定，結(jié)果陽性對照擴增出一條大小約1kb的條帶，空白對照、空白組與陰性對照組海帶DNA樣品均無擴增條帶出現(xiàn)。而100個處理組樣品中則有16個樣品出現(xiàn)陽性條帶，轉(zhuǎn)化率為16％，提示apc基因已整合到這些海帶基因組中。
實施例10重組藻膽蛋白(MBP-APC，鐳普克)的抗腫瘤作用選用18-22克雌性KM小鼠及生長良好的7-11天的S-180瘤種和H22肝癌，分別將瘤組織制成細胞懸液，接種于小鼠右側(cè)腋部皮下，約1-2.5×106細胞/只，接種24h后隨機分籠。第二天開始給藥7天，空白對照組不給藥，陽性對照組給予5-氟尿嘧碇(5-FU)30mg/kg·d(腹腔注射，ip)，處理組給藥方式為口服給藥(p.o.)、腹腔注射(ip)和靜脈注射給藥(i.v.)3種方式，每種方式設(shè)3個劑量給藥組，分別給予鐳普克4.65mg/kg·d、9.3mg/kg·d、18.9mg/kg·d。各組給藥劑量的設(shè)置如表1所示。停藥后24h處死動物，稱體重、瘤重，計算各組平均瘤重，按下列公式求出腫瘤抑制率并進行顯著性檢驗(t檢驗)。
表1表明靜脈注射鐳普克能顯著抑制S-180實體瘤的的生長，劑量變化從4.65到18.6mg/kg·d時，其抑瘤率從7.9％到61.9％。
表1鐳普克對小鼠S-180瘤重的影響劑量組別(mg/kg 給藥小鼠數(shù)鼠重(g)瘤重 抑瘤率 P值·d)途徑開始 結(jié)束開始結(jié)束(g，x±SD)％空白 ----16 16 22.426.91.26±0.73---- ----MBP-4.65 p.o 8 8 22.426.91.16±0.587.9＞0.05APCMBP-9.3p.o 8 8 22.425.50.79±0.3037.3 ＜0.01APCMBP-18.6 p.o 8 8 22.425.01.35±0.56＞NSAPCMBP-4.65 i.p 8 8 22.325.91.12±0.4911.1 ＞0.05APCMBP-9.3i.p 8 8 22.126.31.50±0.54＞NSAPCMBP-18.6 i.p 8 8 22.325.01.05±0.4116.7 ＞0.05APCMBP-4.65 i.v 8 8 22.424.10.75±0.4340.5 ＜0.01APCMBP-9.3i.v 8 8 22.423.90.58±0.2354.0 ＜0.01APCMBP-18.6 i.v 8 8 22.425.00.48±0.1661.9 ＜0.01APC5-FU 30 i.p 8 8 22.324.90.83±0.2434.1 ＜0.05在測試MBP-APC對小鼠H22肝癌的實驗性治療作用中，靜脈注射的劑量為50mg/kg·d時，抑瘤率達62.2％，參見表2。
表2MBP-APC對小鼠H22肝癌的影響組別 劑量 給藥小鼠數(shù)鼠重(g)瘤重 抑瘤率P值(mg/kg·d) 途徑 開始 結(jié)束 開始 結(jié)束(g，x±SD)(％)空白 ---- 202021.4 32.12.30±0.70--------MBP-6.25Iv101021.4 29.41.46±0.3936.5＜0.01APCMBP-12.5Iv101021.3 27.01.23±0.5046.5＜0.01APCMBP-25 Iv101021.4 28.21.23±0.5041.7＜0.01APCMBP-50 Iv101021.3 22.91.34±0.2662.2＜0.01APC5-FU75 Iv101021.5 29.90.71±0.1069.1＜0.01實施例11重組藻膽蛋白(His tag-APC，HAPC)提高白細胞數(shù)量作用1.HAPC對S-180荷瘤小鼠的升白作用ICR小鼠，雄性，18～22g。取腹腔接種S-180瘤株8天的荷瘤小鼠，無菌操作下抽取腹腔瘤液，以滅菌生理鹽水稀釋至鏡檢含瘤細胞數(shù)為6×107個/ml的瘤細胞液，于小鼠右前肢腋部皮下接種0.2ml/鼠。接種后24h稱重，隨機分為4組，空白對照組給予生理鹽水(NS)，陽性對照組給予環(huán)磷酰胺(CY)25mg/kg·d，2個劑量給藥組分別給予HAPC 1.5mg/kg·d、4.5mg/kg·d，容積均為0.1ml/10g體重，連續(xù)10d，給藥方式為灌胃給藥(ig)。末次給藥后24h，小鼠稱重，眼眶取血作白細胞記數(shù)，脫頸椎處死，摘取胸腺、脾臟，剝離肉瘤，電子天平稱重。計算各組小鼠瘤重平均值及其標準差，以給藥組與空白對照組比較，計算瘤重抑制率(％)＝(給藥組平均瘤重-對照組平均瘤重)g/對照線平均瘤重g×100，并作顯著性檢驗(t檢驗，下同)結(jié)果見表3。
表3HPAC對S180荷瘤小鼠的影響(x±SD)鼠 給藥 瘤重抑瘤率 白細胞 體重 胸腺指數(shù)脾指數(shù)組別數(shù)(mg/kg·d) (g) (％) (109/L)(g) (mg/g) (mg/g)空白 1.67±13.41± 26.54± 33.16± 64.59±9 -對照 0.58 2.783.61 11.32 13.31陽性 0.21± 2.84± 21.54± 0.01± 40.45±8 CY 25 87.43對照 0.12***1.69***3.68**0.01***12.39***1.58± 17.56± 25.67±31.29± 84.72±HAPC9 HAPC1.55.390.83*2.49***3.40*16.43*20.48*1.06± 18.30± 27.36± 32.33±63.53±HAPC8 HAPC4.536.530.68*2.87***4.22*11.02*12.08*t檢驗，與空白對照組比，*p＞0.05，**p＜0.05，***p＜0.01由表3可見HAPC對荷瘤小鼠血液白細胞數(shù)有顯著增加作用，對體重、胸腺及脾臟重量無明顯影響。
3.HAPC對環(huán)磷酰胺(CY)抑制白細胞數(shù)量的對抗作用試驗ICR小鼠，雄性，18～22g。稱重后隨機分為4組正常對照組灌胃給藥(ig)無菌生理鹽水，造型對照組灌胃給藥(ig)CY 25mg/kg·d，給藥組除灌胃給藥(ig)CY外，同時灌胃給藥(ig)HAPC 1.5mg/kg·d、4.5mg/kg·d，連續(xù)5d。末次給藥后24h眼眶取血，作白細胞計數(shù)。結(jié)果見表4。
表4HAPC對CY抑制白細胞數(shù)量的影響(x±SD)組別 給藥(mg/kg·d) 鼠數(shù)白細胞計數(shù)(×109/L)正常對照 -11 9.55±2.47造型對照 CY 2511 1.82±1.05***給藥 CY 25+HAPC 1.5 92.01±1.16***△給藥 CY 25+HAPC 4.5 92.58±0.49***△△t檢驗，與空白對照組比，***p＜0.01；與造型對照組比，△p＞0.05，△△p＜0.05由表4可見，CY使小鼠血液白細胞數(shù)量顯著減少，HAPC可對抗CY抑制白細胞的作用，對CY抑制體重及胸腺、脾重量亦有不同程度的對抗作用，4.5mg/kg·d作用顯著。
從上述實施例可以看出，利用基因重組技術(shù)構(gòu)建含有藻膽蛋白亞基氨基酸序列的多肽是本發(fā)明的基本特點。另外重組藻膽蛋白，與天然藻膽蛋白相比，不含有色素基，為新化合物；該重組蛋白及其衍生物可用作藥物、保健或功能食品、食品添加劑、試劑等目的。
SEQUENCE LISTING<110>中國科學院海洋研究所<120>重組藻膽蛋白及其制備方法和應(yīng)用<130>
<160>27<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1028<212>DNA<213>Anacystis nidulans<220>
<221>CDS<222>(1)..(486)<223>
<220>
<221>CDS<222>(543)..(1028)<223>
<400>1atg agt atc gtc tcg aag tcc atc gtc aac gct gac gcc gag gcg cgt48Met Ser Ile Val Ser Lys Ser Ile Val Asn Ala Asp Ala Glu Ala Arg1 5 10 15tac cta agc cct ggc gaa ctg gaa cgc atc aaa acc ttc gtt gtc ggt96Tyr Leu Ser Pro Gly Glu Leu Glu Arg Ile Lys Thr Phe Val Val Gly20 25 30ggc gat cgt cgt ctg cgg att gcg cag acc att gct gag tcc cgc gag144Gly Asp Arg Arg Leu Arg Ile Ala Gln Thr Ile Ala Glu Ser Arg Glu35 40 45cgg atc gtc aag caa gct ggc aac caa ctt ttc caa aag cgt cct gac192Arg Ile Val Lys Gln Ala Gly Ash Gln Leu Phe Gln Lys Arg Pro Asp
50 55 60gtg gtt tcg ccc ggt ggc aat gcc tac ggt gaa gac atg acg gcc acc240Val Val Ser Pro Gly Gly Asn Ala Tyr Gly Glu Asp Met Thr Ala Thr65 70 75 80tgc ctg cgt gac ctc gac tac tac ctg cgt ctt gtg acc tac ggt gta288Cys Leu Arg Asp Leu Asp Tyr Tyr Leu Arg Leu Val Thr Tyr Gly Val85 90 95gtt tcg ggc gac atc acc ccg att gaa gaa atc ggc att gtc ggt gtc336Val Ser Gly Asp Ile Thr Pro Ile Glu Glu Ile Gly Ile Val Gly Val100 105 110cgc gaa atg tac aaa tcg cta gga acc ccc atc gaa gct gtc gct gaa384Arg Glu Met Tyr Lys Ser Leu Gly Thr Pro Ile Glu Ala Val Ala Glu115 120 125ggc gtc cgt gag ctg aaa tcg gct gca acc gcc cta ctg act ggt gaa432Gly Val Arg Glu Leu Lys Ser Ala Ala Thr Ala Leu Leu Thr Gly Glu130 135 140gac gct gac gaa gca ggc gct tac ttt gac tac gta att ggc gct ctc480Asp Ala Asp Glu Ala Gly Ala Tyr Phe Asp Tyr Val Ile Gly Ala Leu145 150 155 160agc taa ttcagtcttt taagtccctt tgattcgaac gcgacttttt caacgatttt 536Seragaaag atg caa gac gca att acc gct gtc atc aat gct tct gac gtc 584Met Gln Asp Ala Ile Thr Ala Val Ile Asn Ala Ser Asp Val165 170 175caa ggt aag tac ctg gac agc tca gcc ctg gat cgt ctc aag agc tac632Gln Gly Lys Tyr Leu Asp Ser Ser Ala Leu Asp Arg Leu Lys Ser Tyr180 185 190ttc caa agt ggc gaa ctg cgc gtc cgt gct gca gcc acc atc agt gcc680Phe Gln Ser Gly Glu Leu Arg Val Arg Ala Ala Ala Thr Ile Ser Ala195 200 205aag tcg gct ctg atc gtc aaa gaa gca gtg gct aaa tcg ctg ctc tac728Lys Ser Ala Leu Ile Val Lys Glu Ala Val Ala Lys Ser Leu Leu Tyr
210 215 220tca gac atc acc cgt ccc ggc ggc acc atg tac acc acc cgt cgc tat776Ser Asp Ile Thr Arg Pro Gly Gly Thr Met Tyr Thr Thr Arg Arg Tyr225 230 235gct gct tgc atc cgg gac ttg gag tac tac ctg cgc tac gcc acc tat824Ala Ala Cys Ile Arg Asp Leu Glu Tyr Tyr Leu Arg Tyr Ala Thr Tyr240 245 250 255gcc atg ttg gct ggc gat acc tcg atc ttg gat gag cgc gtg ctc aac872Ala Met Leu Ala Gly Asp Thr Ser Ile Leu Asp Glu Arg Val Leu Asn260 265 270ggt ctg aaa gag acc tac aac agt ctg ggc ctg ccg atc ggt gca acc920Gly Leu Lys Glu Thr Tyr Asn Ser Leu Gly Leu Pro Ile Gly Ala Thr275 280 285gtc caa gcg atc caa gca atc aaa gaa gtc act gct agc ttg gtc ggc968Val Gln Ala Ile Gln Ala Ile Lys Glu Val Thr Ala Ser Leu Val Gly290 295 300ccc gac gct ggt cgc gaa atg ggt gtc tac ctc gag tac atc agc tcc1016Pro Asp Ala Gly Arg Glu Met Gly Val Tyr Leu Glu Tyr Ile Ser Ser305 310 315ggc ttg agc taa1028Gly Leu Ser320<210>2<211>161<212>PRT<213>Anacystis nidulans<400>2Met Ser Ile Val Ser Lys Ser Ile Val Asn Ala Asp Ala Glu Ala Arg1 5 10 15Tyr Leu Ser Pro Gly Glu Leu Glu Arg Ile Lys Thr Phe Val Val Gly20 25 30
Gly Asp Arg Arg Leu Arg Ile Ala Gln Thr Ile Ala Glu Ser Arg Glu35 40 45Arg Ile Val Lys Gln Ala Gly Asn Gln Leu Phe Gln Lys Arg Pro Asp50 55 60Val Val Ser Pro Gly Gly Asn Ala Tyr Gly Glu Asp Met Thr Ala Thr65 70 75 80Cys Leu Arg Asp Leu Asp Tyr Tyr Leu Arg Leu Val Thr Tyr Gly Val85 90 95Val Ser Gly Asp Ile Thr Pro Ile Glu Glu Ile GlyIle Val Gly Val100 105110Arg Glu Met Tyr Lys Ser Leu Gly Thr Pro Ile Glu Ala Val Ala Glu115 120 125Gly Val Arg Glu Leu Lys Ser Ala Ala Thr Ala Leu Leu Thr Gly Glu130 135 140Asp Ala Asp Glu Ala Gly Ala Tyr Phe Asp Tyr Val Ile Gly Ala Leu145 150 155 160Ser<210>3<211>161<212>PRT<213>Anacystis nidulans<400>3
Met Gln Asp Ala Ile Thr Ala Val Ile Asn Ala Ser Asp Val Gln Gly1 5 10 15Lys Tyr Leu Asp Ser Ser Ala Leu Asp Arg Leu Lys Ser Tyr Phe Gln20 25 30Ser Gly Glu Leu Arg Val Arg Ala Ala Ala Thr Ile Ser Ala Lys Ser35 40 45Ala Leu Ile Val Lys Glu Ala Val Ala Lys Ser Leu Leu Tyr Ser Asp50 55 60Ile Thr Arg Pro Gly Gly Thr Met Tyr Thr Thr Arg Arg Tyr Ala Ala65 70 75 80Cys Ile Arg Asp Leu Glu Tyr Tyr Leu Arg Tyr Ala Thr Tyr Ala Met85 90 95Leu Ala Gly Asp Thr Ser Ile Leu Asp Glu Arg Val Leu Asn Gly Leu100 105 110Lys Glu Thr Tyr Asn Ser Leu Gly Leu Pro Ile Gly Ala Thr Val Gln115 120 125Ala Ile Gln Ala Ile Lys Glu Val Thr Ala Ser Leu Val Gly Pro Asp130 135 140Ala Gly Arg Glu Met Gly Val Tyr Leu Glu Tyr Ile Ser Ser Gly Leu145 150 155 160Ser
<210>4<211>1119<212>DNA<213>Spirulina fusiformis<220>
<221>CDS<222>(1)..(519)<223>
<220>
<221>CDS<222>(631)..(1119)<223>
<400>4atg ttt gat gcc ttc act aag gtg gtt tct cag gct gat act cgc ggc48Met Phe Asp Ala Phe Thr Lys Val Val Ser Gln Ala Asp Thr Arg Gly1 5 10 15gaa atg ctg agt aca gct caa atc gat gct ctg agc caa atg gtt gct96Glu Met Leu Ser Thr Ala Gln Ile Asp Ala Leu Ser Gln Met Val Ala20 25 30gaa agc aac aaa cgt ttg gat gcc gtt aac cgc att act agc aac gct144Glu Ser Asn Lys Arg Leu Asp Ala Val Asn Arg Ile Thr Ser Asn Ala35 40 45tcc acc atc gtt tct aat gct gct cgt tct ttg ttt gca gag cag ccc192Ser Thr Ile Val Ser Asn Ala Ala Arg Ser Leu Phe Ala Glu Gln Pro50 55 60caa ctg att gct ccc gga gga aac gcc tac acc aac cgt cgt atg gct240Gln Leu Ile Ala Pro Gly Gly Asn Ala Tyr Thr Asn Arg Arg Met Ala65 70 75 80gct tgc ttg cgt gac atg gaa atc atc ctg cgt tat gtt acc tac gct288Ala Cys Leu Arg Asp Met Glu Ile Ile Leu Arg Tyr Val Thr Tyr Ala85 90 95gtg ttc gct ggc gac gca agt gtt ctc gaa gat cgt tgc ttg aac ggt336
Val Phe Ala Gly Asp Ala Ser Val Leu Glu Asp Arg Cys Leu Asn Gly100 105 110ttg cgt gaa act tac ctg gct ttg gga act ccc ggt tcc tcc gtt gct384Leu Arg Glu Thr Tyr Leu Ala Leu Gly Thr Pro Gly Ser Ser Val Ala115 120 125gtc ggt gtt ggc aaa atg aaa gaa gct gct ctg gcg atc gta aac gat432Val Gly Val Gly Lys Met Lys Glu Ala Ala Leu Ala Ile Val Asn Asp130 135 140ccc gca ggt atc act cct ggc gat tgt agc gct ttg gct tca gaa atc480Pro Ala Gly Ile Thr Pro Gly Asp Cys Ser Ala Leu Ala Ser Glu Ile145 150 155 160gct agt tac ttt gat cgt gca tgt gct gca gtt tcc taa tcaagcagat 529Ala Ser Tyr Phe Asp Arg Ala Cys Ala Ala Val Ser165 170ccatagcata taacaattga aacagtttag ctgaagtcta agtgactgga cttctgtttg 589ttacctaatt ttttgtaaac caatcgggag ataactcgag a atg aaa acc ccc cta 645Met Lys Thr Pro Leu175acc gaa gca gtt tct atc gct gat tcc caa ggt cgt ttc cta agc agc693Thr Glu Ala Val Ser Ile Ala Asp Ser Gln Gly Arg Phe Leu Ser Ser180 185 190acc gaa atc caa gtg gct ttt ggc cgt ttt cgt caa gcc aaa gct ggt741Thr Glu Ile Gln Val Ala Phe Gly Arg Phe Arg Gln Ala Lys Ala Gly195 200 205ctg gaa gct gct aaa gct ttg acc tct aaa gct gat agt cgt atc agt789Leu Glu Ala Ala Lys Ala Leu Thr Ser Lys Ala Asp Ser Arg Ile Ser210 215 220 225ggt gct gcc caa gca gtg tac aac aag ttc ccc tac acc acc caa atg837Gly Ala Ala Gln Ala Val Tyr Asn Lys Phe Pro Tyr Thr Thr Gln Met230 235 240cag gga cct aac tac gcg gca gac caa cgc ggt aag gac aaa tgt gct885Gln Gly Pro Asn Tyr Ala Ala Asp Gln Arg Gly Lys Asp Lys Cys Ala245 250 255
cgt gac ata ggc tac tac ctg agg atg gta act tat tgc ctg att gct933Arg Asp Ile Gly Tyr Tyr Leu Arg Met Val Thr Tyr Cys Leu Ile Ala260 265 270ggt gga act ggc ccc atg gat gag tac ctg att gcc ggt att gat gaa981Gly Gly Thr Gly Pro Met Asp Glu Tyr Leu Ile Ala Gly Ile Asp Glu275 280 285atc aac cgg act ttc gag ctt tct cca agc tgg tac att gaa gcc ctg1029Ile Asn Arg Thr Phe Glu Leu Ser Pro Ser Trp Tyr Ile Glu Ala Leu290 295 300 305aaa tac atc aaa gct aac cac ggt ttg tct ggt gac gct gct ggt gaa1077Lys Tyr Ile Lys Ala Asn His Gly Leu Ser Gly Asp Ala Ala Gly Glu310 315 320gct aac tcc tac ctc gac tac gcg atc aac gcc cta agc tag1119Ala Asn Ser Tyr Leu Asp Tyr Ala Ile Asn Ala Leu Ser325 330<210>5<211>172<212>PRT<213>Spirulina fusiformis<400>5Met Phe Asp Ala Phe Thr Lys Val Val Ser Gln Ala Asp Thr Arg Gly1 5 10 15Glu Met Leu Ser Thr Ala Gln Ile Asp Ala Leu Ser Gln Met Val Ala20 25 30Glu Ser Asn Lys Arg Leu Asp Ala Val Asn Arg Ile Thr Ser Asn Ala35 40 45Ser Thr Ile Val Ser Asn Ala Ala Arg Ser Leu Phe Ala Glu Gln Pro50 55 60
Gln Leu Ile Ala Pro Gly Gly Asn Ala Tyr Thr Asn Arg Arg Met Ala65 70 75 80Ala Cys Leu Arg Asp Met Glu Ile Ile Leu Arg Tyr Val Thr Tyr Ala85 90 95Val Phe Ala Gly Asp Ala Ser Val Leu Glu Asp Arg Cys Leu Asn Gly100 105 110Leu Arg Glu Thr Tyr Leu Ala Leu Gly Thr Pro Gly Ser Ser Val Ala115 120 125Val Gly Val Gly Lys Met Lys Glu Ala Ala Leu Ala Ile Val Asn Asp130 135 140Pro Ala Gly Ile Thr Pro Gly Asp Cys Ser Ala Leu Ala Ser Glu Ile145 150 155 160Ala Ser Tyr Phe Asp Arg Ala Cys Ala Ala Val Ser165 170<210>6<211>162<212>PRT<213>Spirulina fusiformis<400>6Met Lys Thr Pro Leu Thr Glu Ala Val Ser Ile Ala Asp Ser Gln Gly1 5 10 15Arg Phe Leu Ser Ser Thr Glu Ile Gln Val Ala Phe Gly Arg Phe Arg20 25 30
Gln Ala Lys Ala Gly Leu Glu Ala Ala Lys Ala Leu Thr Ser Lys Ala35 40 45Asp Ser Arg Ile Ser Gly Ala Ala Gln Ala Val Tyr Asn Lys Phe Pro50 55 60Tyr Thr Thr Gln Met Gln Gly Pro Asn Tyr Ala Ala Asp Gln Arg Gly65 70 75 80Lys Asp Lys Cys Ala Arg Asp Ile Gly Tyr Tyr Leu Arg Met Val Thr85 90 95Tyr Cys Leu Ile Ala Gly Gly Thr Gly Pro Met Asp Glu Tyr Leu Ile100 105 110Ala Gly Ile Asp Glu Ile Asn Arg Thr Phe Glu Leu Ser Pro Ser Trp115 120 125Tyr Ile Glu Ala Leu Lys Tyr Ile Lys Ala Asn His Gly Leu Ser Gly130 135 140Asp Ala Ala Gly Glu Ala Asn Ser Tyr Leu Asp Tyr Ala Ile Asn Ala145 150 155 160Leu Ser<210>7<211>1102<212>DNA<213>Ceramium boydenn<220>
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<223>
<220>
<221>CDS<222>(608)..(1102)<223>
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130 135 140aca gca tca caa cgt aca gta gaa gtt gct gct gga gat tgt agt gca480Thr Ala Ser Gln Arg Thr Val Glu Val Ala Ala Gly Asp Cys Ser Ala145 150 155 160atc gct tct gaa gtt ggc gca tat tgt gat aga gta gct gct gct gtt528Ile Ala Ser Glu Val Gly Ala Tyr Cys Asp Arg Val Ala Ala Ala Val165 170 175tct taa tcaatttgca gagaacaatc tacaaagtat tgataagcaa aatacttaaa 584Serattattcctt aaggagaaat ata atg aaa tca gtt att act act act atc agt 637Met Lys Ser Val Ile Thr Thr Thr Ile Ser180 185gct gct gat gct gct ggt cgt ttt cct tca agc tct gat cta gaa tca685Ala Ala Asp Ala Ala Gly Arg Phe Pro Ser Ser Ser Asp Leu Glu Ser190 195 200gta caa ggc aac atc caa cgt tct agt gca aga tta gaa gcg gct gaa733Val Gln Gly Asn Ile Gln Arg Ser Ser Ala Arg Leu Glu Ala Ala Glu205 210 215aaa tta gga tac aac cat gaa gca gtt gta aaa gaa ggc gga gat gct781Lys Leu Gly Tyr Asn His Glu Ala Val Val Lys Glu Gly Gly Asp Ala220 225 230 235tgt ttt gca aaa tat tct tac tta aaa aac cca gga gaa gct ggt gac829Cys Phe Ala Lys Tyr Ser Tyr Leu Lys Asn Pro Gly Glu Ala Gly Asp240 245 250agc aca gaa aaa atc aat aaa tgc tat aga gat gtt gat cac tac atg877Ser Thr Glu Lys Ile Asn Lys Cys Tyr Arg Asp Val Asp His Tyr Met255 260 265cgt tta atc aac tac tca ctt gta gtt ggt ggt act ggt cct ctt gat925Arg Leu Ile Asn Tyr Ser Leu Val Val Gly Gly Thr Gly Pro Leu Asp270 275 280gaa tgg gga att gct ggt tca cgt gaa gta tat aga gct tta aat ctt973Glu Trp Gly Ile Ala Gly Ser Arg Glu Val Tyr Arg Ala Leu Asn Leu
285 290 295cct agt gct gct tat att gct tct ttt gta ttt act aga gat aga tta1021Pro Ser Ala Ala Tyr Ile Ala Ser Phe Val Phe Thr Arg Asp Arg Leu300 305 310 315tgt gta cct cgt gat atg agc gct caa gct gga gta gaa tac tta gct1069Cys Val Pro Arg Asp Met Ser Ala Gln Ala Gly Val Glu Tyr Leu Ala320 325 330gct tta gac tat gta atc aac gca cta agc taa1102Ala Leu Asp Tyr Val Ile Asn Ala Leu Ser335 340<210>8<211>177<212>PRT<213>Ceramium boydenn<400>8Met Leu Asp Ala Phe Ser Arg Val Val Val Asn Ser Asp Ala Lys Ala1 5 10 15Ala Tyr Val Ser Gly Ser Asp Leu Gln Ala Leu Lys Thr Phe Ile Ser20 25 30Glu Gly Asn Lys Arg Leu Asp Ser Val Asn Tyr Ile Val Ser Asn Ala35 40 45Ser Cys Ile Val Ser Asp Ala Val Ser Gly Met Ile Cys Glu Asn Pro50 55 60Gly Leu Ile Ala Pro Gly Gly Asn Cys Tyr Thr Asn Arg Arg Met Ala65 70 75 80Ala Cys Leu Arg Asp Gly Glu Ile Ile Leu Arg Tyr Val Ser Tyr Ala85 90 95
Leu Leu Ser Gly Asp Ala Ser Val Leu Glu Asp Arg Cys Leu Asn Gly100 105 110Leu Lys Glu Thr Tyr Ile Ala Leu Gly Val Pro Thr Asn Ser Thr Val115 120 125Arg Ala Val Ser Ile Met Lys Ala Ala Ala Val Ala Phe Val Thr Asn130 135 140Thr Ala Ser Gln Arg Thr Val Glu Val Ala Ala Gly Asp Cys Ser Ala145 150 155 160Ile Ala Ser Glu Val Gly Ala Tyr Cys Asp Arg Val Ala Ala Ala Val165 170 175Ser<210>9<211>164<212>PRT<213>Ceramium boydenn<400>9Met Lys Ser Val Ile Thr Thr Thr Ile Ser Ala Ala Asp Ala Ala Gly1 5 10 15Arg Phe Pro Ser Ser Ser Asp Leu Glu Ser Val Gln Gly Asn Ile Gln20 25 30Arg Ser Ser Ala Arg Leu Glu Ala Ala Glu Lys Leu Gly Tyr Asn His35 40 45
Glu Ala Val Val Lys Glu Gly Gly Asp Ala Cys Phe Ala Lys Tyr Ser50 55 60Tyr Leu Lys Asn Pro Gly Glu Ala Gly Asp Ser Thr Glu Lys Ile Asn65 70 75 80Lys Cys Tyr Arg Asp Val Asp His Tyr Met Arg Leu Ile Asn Tyr Ser85 90 95Leu Val Val Gly Gly Thr Gly Pro Leu Asp Glu Trp Gly Ile Ala Gly100 105 110Ser Arg Glu Val Tyr Arg Ala Leu Asn Leu Pro Ser Ala Ala Tyr Ile115 120 125Ala Ser Phe Val Phe Thr Arg Asp Arg Leu Cys Val Pro Arg Asp Met130 135 140Ser Ala Gln Ala Gly Val Glu Tyr Leu Ala Ala Leu Asp Tyr Val Ile145 150 155 160Asn Ala Leu Ser<210>10<211>549<212>DNA<213>Prochlorococcus sp.
<220>
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<400>10atg ctt gat gcg ttc tct aga aca gtt gta agt gct gac gcc aag ggt48Met Leu Asp Ala Phe Ser Arg Thr Val Val Ser Ala Asp Ala Lys Gly1 5 10 15gcc gca att ggc agt gag gat ctt gca gat tta aga aag tac gta gca96Ala Ala Ile Gly Ser Glu Asp Leu Ala Asp Leu Arg Lys Tyr Val Ala20 25 30gat gca aat aaa aga att gat gca acc ctt gca ata act caa aat gtt144Asp Ala Asn Lys Arg Ile Asp Ala Thr Leu Ala Ile Thr Gln Asn Val35 40 45tct tgc ata gct gca gat gct gta gca gga atg gtt tgc gaa aat act192Ser Cys Ile Ala Ala Asp Ala Val Ala Gly Met Val Cys Glu Asn Thr50 55 60gga ctt aca cag cca gga gga cat tgt tat cca act cgt cgc atg gca240Gly Leu Thr Gln Pro Gly Gly His Cys Tyr Pro Thr Arg Arg Met Ala65 70 75 80gct tgt tta agg gat gga gaa att att ttg aga tat gta agc tac gct288Ala Cys Leu Arg Asp Gly Glu Ile Ile Leu Arg Tyr Val Ser Tyr Ala85 90 95ctt ctt gct ggg gat tct tct gtc ctt gaa gat aga tgt cta aat gga336Leu Leu Ala Gly Asp Ser Ser Val Leu Glu Asp Arg Cys Leu Asn Gly100 105 110tta aaa gaa act tat tta gct ctt gga gtt cca act tct aat gct att384Leu Lys Glu Thr Tyr Leu Ala Leu Gly Val Pro Thr Ser Asn Ala Ile115 120 125cgg gca gtt gaa ata atg aaa att gcc aca gtt gca att atg act gag432Arg Ala Val Glu Ile Met Lys Ile Ala Thr Val Ala Ile Met Thr Glu130 135 140aca aat aca gga aga aaa atg ttt aag gga att aat tct ggc tca gga480Thr Asn Thr Gly Arg Lys Met Phe Lys Gly Ile Asn Ser Gly Ser Gly145 150 155 160gct cag tgt caa gat ata gcg gcg gag gca gca tca tat ttt gac ctt528Ala Gln Cys Gln Asp Ile Ala Ala Glu Ala Ala Ser Tyr Phe Asp Leu165 170 175
gta ata gag gct ttg agt tga549Val Ile Glu Ala Leu Ser180<210>11<211>182<212>PRT<213>Prochlorococcus sp.
<400>11Met Leu Asp Ala Phe Ser Arg Thr Val Val Ser Ala Asp Ala Lys Gly1 5 10 15Ala Ala Ile Gly Ser Glu Asp Leu Ala Asp Leu Arg Lys Tyr Val Ala20 25 30Asp Ala Asn Lys Arg Ile Asp Ala Thr Leu Ala Ile Thr Gln Asn Val35 40 45Ser Cys Ile Ala Ala Asp Ala Val Ala Gly Met Val Cys Glu Asn Thr50 55 60Gly Leu Thr Gln Pro Gly Gly His Cys Tyr Pro Thr Arg Arg Met Ala65 70 75 80Ala Cys Leu Arg Asp Gly Glu Ile Ile Leu Arg Tyr Val Ser Tyr Ala85 90 95Leu Leu Ala Gly Asp Ser Ser Val Leu Glu Asp Arg Cys Leu Asn Gly100 105 110Leu Lys Glu Thr Tyr Leu Ala Leu Gly Val Pro Thr Ser Asn Ala Ile115 120 125
Arg Ala Val Glu Ile Met Lys Ile Ala Thr Val Ala Ile Met Thr Glu130 135 140Thr Asn Thr Gly Arg Lys Met Phe Lys Gly Ile Asn Ser Gly Ser Gly145 150 155 160Ala Gln Cys Gln Asp Ile Ala Ala Glu Ala Ala Ser Tyr Phe Asp Leu165 170 175Val Ile Glu Ala Leu Ser180<210>12<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>12gagggatcca ttaatgagta tcg 23<210>13<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>13tggaagctta gctcaagccg gag 23<210>14<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>14ggagataagt ccatgtttga 20
<210>15<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>15tagcttaggg cgttgatcgc 20<210>16<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>16agaattcaat gcttgaygcw 20<210>17<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>17ccgttagsdt ardgmrttd 19<210>18<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>18aagcattgcg ttcttaggtc tc 22<210>19<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>19catctaaagg accagtccca c21
<210>20<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>20ctggatcctt aatgagtatc g21<210>21<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>21acgctgcaga aagactgaat 20<210>22<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>22taggatccat gcaagacgc 19<210>23<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>23attcggcttg gaagcttag 19<210>24<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>24ggagagaatt ccatgtttga 20
<210>25<211>25<212>DNA<213>人工序列<400>25attggtaccg gtagggcgtt gatcg25<210>26<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>26gacgaattca ttaatgagta tcg 23<210>27<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>27tggtcgacta gctcaagccg gag 2權(quán)利要求
1.一種基因重組藻膽蛋白，其特征在于含有藻膽蛋白亞基氨基酸序列的多肽或其衍生物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因重組藻膽蛋白，其特征在于所述多肽為含有一種或幾種藻膽蛋白亞基的氨基酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因重組藻膽蛋白，其特征在于所述多肽含有的藻膽蛋白亞基氨基酸序列包含藻膽蛋白亞基全氨基酸序列，或該序列的片段、或與其有基本序列同源性的氨基酸序列。
4.一種基因重組藻膽蛋白的制備方法，其特征在于使用分子克隆方法從藻類中克隆藻膽蛋白基因；利用基因工程技術(shù)，構(gòu)建含藻膽蛋白亞基基因的表達載體并轉(zhuǎn)入各類表達體系中異源表達；運用層析技術(shù)生產(chǎn)含有藻膽蛋白亞基氨基酸序列的多肽或其衍生物。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于所述藻類為藍藻、紅藻、隱藻、甲藻或原綠球藻。
6.一種基因重組藻膽蛋白的應(yīng)用，其特征在于用于藥物、保健或功能食品、食品添加劑或試劑目的。
全文摘要
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體化地說是一種利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)的重組藻膽蛋白及其制備方法和應(yīng)用。基因重組藻膽蛋白是含有藻膽蛋白亞基氨基酸序列的多肽或其衍生物。制備方法是使用分子克隆手段從藻類中克隆藻膽蛋白基因；利用基因工程技術(shù)，構(gòu)建含藻膽蛋白亞基基因的表達載體并轉(zhuǎn)入各類表達體系中異源表達；運用層析技術(shù)生產(chǎn)含有藻膽蛋白亞基氨基酸序列的多肽或其衍生物。本發(fā)明結(jié)構(gòu)單一多肽與天然藻膽蛋白(色素蛋白復合體)相比，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，從而活性穩(wěn)定，可建立統(tǒng)一質(zhì)量標準，適于大規(guī)模應(yīng)用，特別是應(yīng)用于藥物、保健或功能食品、食品添加劑或試劑目的。
文檔編號A61K38/16GK1618803SQ200310105140
公開日2005年5月25日 申請日期2003年11月21日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月21日
發(fā)明者秦松, 林凡, 葛保勝, 唐志紅, 趙方慶 申請人:中國科學院海洋研究所