專利名稱：豬藍(lán)耳病病毒rt-pcr快速檢測試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及獸醫(yī)生物技術(shù)領(lǐng)域的診斷技術(shù)，具體是一種檢測豬藍(lán)耳病病毒的診斷方法和 專用試劑盒。
背彔技術(shù)
豬藍(lán)耳病，也稱為豬繁殖與呼吸綜合征(porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS)是由豬藍(lán)耳病病毒(PRRSV)引起的一種豬的傳染病，其臨診特征為各種年齡的豬均 可感染，病豬厭食、嗜睡、體溫升高，妊娠母豬發(fā)生早產(chǎn)、流產(chǎn)、死胎、弱胎和木乃伊胎， 種公豬性功能下降，仔豬和育肥豬呼吸障礙。其特征性病理變化為間質(zhì)性肺炎，皮膚發(fā)紺。 l訴7年該病首次報(bào)道于美國，隨后迅速蔓延北美、歐洲及亞洲各國，目前也是我國最主要的 豬群疫病之一。PRRS與其它引起豬繁殖障礙的疾病存在著非常類似的臨診癥狀，沒有示病性 臨床癥狀，根據(jù)臨床癥狀進(jìn)行診斷及鑒別診斷比較困難。實(shí)驗(yàn)室診斷方面，國內(nèi)外已建立了 一些常規(guī)的檢測方法，如病毒的分離與鑒定、間接ELISA、 IPMA、 IFA及Dot - ELISA等血 清學(xué)方法用于該病診斷。在這些診斷方法中，特異性、敏感性、操作技術(shù)等方面存在各種各 樣的問題,不能滿足生產(chǎn)需要。由于該病特殊的免疫機(jī)理，疫苗免疫效果的不確定性，對養(yǎng)豬 業(yè)的威脅將時(shí)長期存在，因此，淘汰病原學(xué)陽性豬是該病防疫中主要措施，建立病原學(xué)快速 檢測技術(shù)非常重要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明根據(jù)豬藍(lán)耳病病毒(PRRSV)美洲型標(biāo)準(zhǔn)毒株((ATCC VR—2332)的ORF6及部分 ORF7的序列，設(shè)計(jì)一對豬藍(lán)耳病病毒特異性擴(kuò)增引物，結(jié)合先進(jìn)的病毒核酸提取技術(shù)和高 效RT-PCR商品試劑，經(jīng)實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化，組合而成的一種成熟的一步法RT-PCR檢測試劑盒。 該試劑盒能對待檢組織進(jìn)行直接檢測，檢測過程簡單，抗污染性強(qiáng)。從病料處理到獲得結(jié)果 只需4小時(shí)，結(jié)果準(zhǔn)確且靈敏度高、特異性好，是目前豬藍(lán)耳病病毒檢測方法非常好的一種 替代方法。
本發(fā)明的主要技術(shù)方案有
1.引物設(shè)計(jì)根據(jù)豬藍(lán)耳病病毒(PRRSV)美洲型標(biāo)準(zhǔn)毒株((ATCCVR-2332)的ORF6及 部分ORF7的序列，設(shè)計(jì)一對豬藍(lán)耳病病毒特異性擴(kuò)增引物，引物詳細(xì)為
Primer PI: 5，一 CACTACGGTCAACGGCACAT—3，
Primer P2: 5，一 CCACAGTGTAACTTATCCTCCCT—3，
其中PrimerPl/P2引物對在豬藍(lán)耳病病毒核酸中特異性擴(kuò)增出402bp的產(chǎn)物。
2. 待檢病料的核酸提取采用RNA快速提取方法提取待檢組織樣品的RNA核酸。
3. RT-PCR體系A(chǔ)MV/Tfl 5xReaction Buffer 2.5/xL， 25mM/L MgS04 1/*L， 10mM/L dNTP
0. 5.tL， AMV Rever Transcriptase 2.5u， Tfl DNA Polymerase 2,5u 20uM/L Primer PI l/tL， 20uM/L Primer P2 1/iL,待檢RNA模板5/iL,加水至總體積25/iL。
4. RT-PCR程序45r逆轉(zhuǎn)錄45min; 94X:預(yù)變性2min; 94"30s、 55"C45s、 68XM5s， 35個(gè)循環(huán)；最后68^C延伸8min。 4匸保存。
本發(fā)明試劑盒組成及保存
Sloution R2 6mL x 1管 室溫儲存
Wash buffer 12mLxi管 室溫儲存
Elution buffer lmLx 1管 室溫儲存 Spin columns 10個(gè) 室溫儲存
RNaseFree離心管20個(gè) 室溫儲存 RT-PCR體系 20pLxlO管-20X:儲存，避免反復(fù)凍融。
陽性對照 lipLxl管 -20匸儲存，避免反復(fù)凍融。
RNase Free H20lmL x 1管 -20"儲存 本試劑盒有效期6個(gè)月。 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)
1. 操作簡單，抗污染性強(qiáng)，耗時(shí)短。本方法采用了先進(jìn)的病毒核酸提取技術(shù)，操作 簡單，可操作性強(qiáng)，并省去了以往抽提核酸過程中的多步驟、多試劑抽提，從而減 少了污染，保證了檢測結(jié)果的準(zhǔn)確度；同時(shí)，采用的高效RT-PCR商品試劑，實(shí)現(xiàn)了 一步法檢測，比常用的二步法RT-PCR省時(shí)省力，同時(shí)也避免了二步法RT-PCR過程 中加樣所造成的PCR污染。
2. 特異性強(qiáng)、重復(fù)性好、靈敏度高。本試劑盒僅對豬藍(lán)耳病病毒的核酸有擴(kuò)增產(chǎn)物， 對豬偽狂犬病病毒、圓環(huán)病毒、乙型腦炎、豬瘟病毒、未接種PRRSV的正常細(xì)胞培 養(yǎng)液的核酸無擴(kuò)增產(chǎn)物；對豬藍(lán)耳病弱毒疫苗株和豬藍(lán)耳病病毒陽性病料的檢測結(jié) 果重復(fù)性100%;對經(jīng)104倍稀釋的臨床陽性病料的核酸提取液有穩(wěn)定準(zhǔn)確的檢測結(jié) 果。


圖1、引物Primer PI 、 PrimerP2的序列
圖2、試劑盒同時(shí)對豬偽狂犬病病毒(l泳道)、圓環(huán)病毒(2泳道)、乙型腦炎(3泳道)、豬 瘟病毒(4泳道)、未接種PRRSV的正常細(xì)胞培養(yǎng)液(5泳道)、PRRSV弱毒疫苗株(6 泳道)、滅菌水(7泳道)進(jìn)行檢測的電泳結(jié)果，M泳道為DNADL2000Marker (2000bp、 1000bp、 750bp、 500bp、 250bp、 100bp)
圖3、本試劑盒對部分樣品的檢測結(jié)果圖
本發(fā)明的
具體實(shí)施例方式
1. 樣品制備
1.1組織樣品剪取待檢組織0.5g置研磨器中剪碎并研磨，加入L5mLPBS (pH7.2)繼續(xù)研 磨；將研磨好的待檢組織液，置1.5mL滅菌離心管中，5000rpm離心l~2min，取上清100/iL 進(jìn)行核酸提取。
1.2血清樣品直接取100/tL進(jìn)行核酸提取。 1.3陽性對照直接取100ML進(jìn)行核酸提取。 1.4陰性對照直接取100j^LRNase Free H20進(jìn)行核酸提取。
2. 操作步驟
2.1在100/iL處理好的樣品中，加入Sloution R2溶液600/*L，充分顛倒混勻，室溫靜置3~5min。 2.2吸取上清液至Spin column, Spin column要套上離心管，12000rpm離心30s。 2.3棄去外套管中的液體，向Spin column中加入600/*L Wash buffer, 12000rpm離心30s。 2.4重復(fù)2.3。 12000rpm離心2min。
2.5將Spin column移入新的RNase Free離心管內(nèi)，在膜中央加入Elution buffer 3O~50/iL，室
溫靜置2 3min, 12000rpm離心2min，獲得樣品總RNA。
2.6取5/iL樣品RNA，加入至RT-PCR體系中，混勾，6000rpm離心30s。
2.7置于PCR儀中，進(jìn)行如下程序45C逆轉(zhuǎn)錄45min; 94"C預(yù)變性2min; 94*C30s、 55"45s、
68XM5s， 35個(gè)循環(huán)；最后68X:延伸8min。 4'C保存。
2.8取8/iLPCR產(chǎn)物，混合1^L上樣緩沖液，1 1.5。/。的瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物，以 DNA分子量Marker為參考。
2.9在陰性對照無產(chǎn)物、陽性對照有明顯402bp條帶的前提下，樣品出現(xiàn)402bp大小條帶定 為PRRSV核酸陽性。
權(quán)利要求
1.一對豬藍(lán)耳病病毒(豬繁殖與呼吸綜合征病毒，porcine reproductive and respiratorysyndrome virus，PRRSV)特異性檢測引物Primer P1/P2，其序列為Primer P15’-CACTACGGTCAACGGCACAT-3’Primer P25’-CCACAGTGTAACTTATCCTCCCT-3’其中Primer P1/P2引物對在豬藍(lán)耳病病毒核酸中特異性擴(kuò)增出402bp的產(chǎn)物。
2. 利用權(quán)利要求1所述引物組成的豬藍(lán)耳病病毒快速檢測試劑盒，其特征為采用RNA快速提取方法提取待檢組織樣品的RNA核酸，按如下RT-PCR反應(yīng)體系和擴(kuò)增 程序，用Primer Pl/P2引物對進(jìn)行豬藍(lán)耳病病毒的RT-PCR擴(kuò)增檢測。RT-PCR體系A(chǔ)MV/Tfl 5xReaction Buffer 2.5/iL, 25mM/L MgS04 1/iL, 10mM/L dNTP 0,5/xL， AMV Rever Transcriptase 2.5u, Tfl DNA Polymerase 2.5u, 20uM/L Primer PI l;iiL, 20uM/L Primer P2 l^L,待檢RNA模板5;xL，加水至總體積25/iL。RT-PCR擴(kuò)增程序:45。C逆轉(zhuǎn)錄45min; 94'C預(yù)變性2min; 94'C30s、 55。C45s、 68。C45s， 35個(gè)循環(huán)；最后68t:延伸8min。 4'C保存。電泳檢測取8ptLPCR產(chǎn)物，混合1mL上樣緩沖液，1 1.5%的瓊脂糖凝膠電泳分析pcr 產(chǎn)物，以DNA分子量Marker為參考。結(jié)果判斷在陰性對照無條帶、陽性對照有明顯402bp條帶的前提下，樣品出現(xiàn)402bp大 小條帶定為豬藍(lán)耳病病毒核酸陽性，否則判為陰性。
全文摘要
本發(fā)明根據(jù)豬藍(lán)耳病病毒(PRRSV)美洲型標(biāo)準(zhǔn)毒株(ATCC VR-2332)的ORF6及部分ORF7的序列，設(shè)計(jì)一對豬藍(lán)耳病病毒特異性擴(kuò)增引物，結(jié)合先進(jìn)的病毒核酸提取技術(shù)和高效RT-PCR商品試劑，經(jīng)實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化，組合而成的一種成熟的一步法RT-PCR檢測試劑盒。該試劑盒能對待檢組織進(jìn)行直接檢測，檢測過程簡單，抗污染性強(qiáng)。從病料處理到獲得結(jié)果只需4小時(shí)，結(jié)果準(zhǔn)確且靈敏度高、特異性好，是目前豬藍(lán)耳病病毒檢測方法非常好的一種替代方法。
文檔編號C12Q1/68GK101343669SQ200810032140
公開日2009年1月14日 申請日期2008年8月25日 優(yōu)先權(quán)日2008年8月25日
發(fā)明者何世成, 劉道新, 李曉成, 范仲鑫, 談志祥, 邱伯根, 邱立新, 杰 陳, 魯杏華 申請人:湖南省獸醫(yī)總站