專利名稱：一種抗氧化活性肽及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種抗氧化活性肽，本發(fā)明還涉及一種該抗氧化活性肽的制備 方法。
背景技術(shù)：
玉米蛋白粉(Corn Gluten Meal縮寫CGM)俗稱玉米黃粉，是玉米濕法生 產(chǎn)淀粉的副產(chǎn)物之一，約含60%的蛋白質(zhì)，抽樣檢測(cè)其蛋白質(zhì)組成為玉米醇溶 蛋白(zein)占68%、谷蛋白(glutelin)占22%，其余為球蛋白(globulins) 和白蛋白(albumin)。玉米蛋白粉是一種資源豐富、成本低廉的天然植物蛋白 原料，但就其氨基酸組成而言，由于賴氨酸和色氨酸的含量都不高，所以玉米 蛋白是一種非全營養(yǎng)蛋白。另外，玉米蛋白粉所含的蛋白質(zhì)難溶于水，組成復(fù) 雜，口感粗糙，因此，無論是在食品領(lǐng)域還是在飼料行業(yè)都很少有人予以重視， 有些工廠甚至將其與其它副產(chǎn)物一起不加回收就自然排放掉了，這不僅是對(duì)糧 食資源的一種浪費(fèi)，同時(shí)也對(duì)生態(tài)環(huán)境造成了一定程度的污染。
再者，由于人類生存環(huán)境和生活方式、尤其是飲食結(jié)構(gòu)的改變，體內(nèi)環(huán)境 也在發(fā)生著潛移默化的改變。以基礎(chǔ)物質(zhì)代謝為例，越來越多的過氧化物質(zhì)和 有害自由基正在人們體內(nèi)源源不斷的生成，嚴(yán)重地威脅著人們的健康。對(duì)此， 絕大多數(shù)人都缺少認(rèn)知。雖然醫(yī)學(xué)專業(yè)人員為解決這一問題做了很多的研究， 但是目前真正能夠起到預(yù)防氧化、有效抑制體內(nèi)自由基形成的高活性抗氧化物 質(zhì)還不很多，這就需要我們相關(guān)專業(yè)的技術(shù)人員進(jìn)一步做出更多的努力。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的第一個(gè)技術(shù)問題是提供一種抗氧化活性肽，由于生產(chǎn)該產(chǎn) 品的主要原料是玉米蛋白粉，首先為這種長(zhǎng)期被冷落、被遺棄的天然資源提供 了一種有效的利用途徑，同時(shí)還開發(fā)出了一種具有防治疾病、抗衰老等功能， 可以做為醫(yī)藥、化妝品等產(chǎn)品添加劑使用的抗氧化活性肽。本發(fā)明要解決的另 一個(gè)技術(shù)問題是提供一種該抗氧化活性肽的制備方法。
本發(fā)明產(chǎn)品抗氧化活性肽的分子量在20，100-31，000之間，N端5個(gè)氨基酸 序列為K-V-T-Y-H，抗氧化活力為236.68U/mL。
本發(fā)明產(chǎn)品抗氧化活性肽的制備方法以微生物納豆芽孢桿菌(Bac,7/附 為菌種，以玉米蛋白粉為原料，采用液態(tài)培養(yǎng)方式，獲得具有抗氧化活 性的多肽混合物，再通過離子交換層析、凝膠層析、反相色譜逐級(jí)收集高活性 且分子量〉5，000Da部分，最后通過凝膠電泳獲得。
在上述技術(shù)方案中所使用的納豆芽孢桿菌(J fl"7/"simrto)可以采用現(xiàn)有品 種，該菌種目前已經(jīng)很容易得到。本發(fā)明最優(yōu)選的菌種是本課題組于日本傳統(tǒng) 食品納豆中分離、篩選得到的，保藏號(hào)為00]\1<:€]\0.2236的菌株。該菌種最 突出的特性就是其分泌蛋白酶的活力較現(xiàn)有菌株至少要高出2.66%。
本發(fā)明產(chǎn)品制備的具體方法
1、發(fā)酵液的制備
以納豆芽孢桿菌(5""7/"s"a/to)為發(fā)酵菌種，將lmL種子培養(yǎng)液接入裝 有初始pH7.0的30mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，于34°C 、 200r/min條 件下振蕩培養(yǎng)32h后5000 r/min離心10min，在沸水浴中滅酶活10min，所得 液體為抗氧化活性肽的混合物。2、 DEAE-Sepharose Fast Flow弱陰離子交換層析
將第一步所得的混合物10000r/min離心15min，取上清液過0.22pm的微 孔濾膜，濾液進(jìn)行弱陰離子交換層析((p2.6*20cm)。起始緩沖液25mmol/L pH 9.0Tris-HCl ，洗脫液含lmol NaCl的25mmol/L pH 9.0 Tris-HCl，流速 1.5mL/min, UV280nm處檢測(cè)。測(cè)定各管收集液的抗氧化活力，收集高活性部 分備用。
3、 Sephadex G-25凝膠過濾層析
① 將DEAE-S印harose Fast Flow的高活力樣品冷凍抽干濃縮后，用洗脫液 25mmol/L pH 9.0 Tris-HCl溶解后進(jìn)行凝膠層析脫鹽((pl.6*50)，流速2.0mL/ min， UV280nm處檢測(cè)。測(cè)定各管收集液的抗氧化活力，收集高活性部分備用。
② 將Q- Sepharose HP的高活力樣品冷凍抽干濃縮后，用洗脫液雙蒸水溶 解后10000r/min離心10min，取上清液進(jìn)行凝膠層析脫鹽(cpl.6*50),流速 2.0mL/min， UV280nm處檢測(cè)，測(cè)定各管收集液的抗氧化活力，收集高活性且 分子量〉5，000Da部分備用。
4、 Q-SepharoseHP強(qiáng)陰離子交換層析色譜
將進(jìn)行過①Sephadex G-25脫鹽后的活性部分進(jìn)行Q-Sepharose HP分離。 起始緩沖液25mmol/L pH 9.0 Tris-HCl，洗脫液:含lmolNaCl的25mmol/L pH 9.0Tris-HCl，流速2.0mL/min， UV280nm處檢測(cè)，測(cè)定各管收集液的抗氧化 活力，收集高活性且分子量〉5，000Da部分備用。
5、 CM-S印harose Fast Flow弱陽離子交換層析
將進(jìn)行過②Sephadex G-25脫鹽后的活性部分進(jìn)行CM-Sepharose Fast Flow色譜分離。起始緩沖液lmmol/L pH 3.0 Gly-HCl，洗脫液含lmol NaCl的0.001mol/LpH3.0Gly-HCl，流速2.0mL/min， UV280nm處檢測(cè)，測(cè)定各 管收集液的抗氧化活力，收集活性部分備用。
6、 反相色譜
RESOURCE RPC (3mL)反相色譜分離
將經(jīng)過②Sephadex G-25脫鹽后活性部分進(jìn)行RESOURCE RPC 3mL反 相色譜分離。洗脫液A: 0.065%TFA， 2%乙腈；洗脫液B: 0.05%TFA, 80% 乙腈；流速1.0mL/min， UV280nm處檢測(cè)。測(cè)定各管收集液的抗氧化活力， 收集活性部分作下一步色譜分離用。
② 第一次SymmetryShield TMRP 18 ( 5jim)反相色譜
將進(jìn)行過CM-Sepharose Fast Flow的高活力樣品，進(jìn)行Symmetry Shield TMRP18反相色譜分離。洗脫液A: 0.065%TFA ， 2%乙腈；洗脫液B: 0.05%TFA， 80%乙腈；流速1.0mL/min， UV280nm處檢測(cè)。測(cè)定各管收集 液的抗氧化活力，收集活性部分進(jìn)行第二次SymmetryShield TMRP 18反相色譜
③ 第二次SymmetryShield RP 18 (5jim)反相色譜 將第一次進(jìn)行SymmetryShield TMRP 18反相色譜分離的高活力部分冷凍抽
干后進(jìn)行第二次SymmetryShield RP 18分離。洗脫液A: 0.065%TFA， 8% 乙腈；洗脫液B: 0.05%TFA， 60%乙腈；流速1.0mL/min, UV280nm處檢 測(cè)，測(cè)定各管收集液的抗氧化活力，收集活性部分進(jìn)行蛋白質(zhì)電泳。
7、 酸、堿性PAGE凝膠電泳垂直板電泳槽中灌注交聯(lián)度為2.6%，濃度 為10% (w/v)分離膠和5% (w/v)濃縮膠。堿性電泳濃縮膠部分恒壓40v，分離膠部分恒壓70v，電泳2.0h左右。酸性電泳濃縮膠部分恒壓100v，分離膠部 分恒壓200v，電泳4.0h。
本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明設(shè)計(jì)的產(chǎn)品具有很高的抗氧化活力，經(jīng)測(cè)定 為236.68U/mL。純品可滿足對(duì)抗氧化活性肽結(jié)構(gòu)、物性測(cè)定，活性、毒理實(shí) 驗(yàn)，乃至于治療、培育等大規(guī)模應(yīng)用的要求。同時(shí)抗氧化活性物質(zhì)對(duì)超氧陰離 子自由基和羥基自由基有強(qiáng)烈的清除作用，并能顯著抑制紅細(xì)胞和肝臟、心臟、 腦組織脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的發(fā)生，具有防治疾病、抗衰老等功能，所以本發(fā)明產(chǎn) 品可進(jìn)一步開發(fā)成醫(yī)藥、化妝品等產(chǎn)品添加劑使用。
本發(fā)明中優(yōu)選的納豆芽孢桿菌(^"7/附/m加)菌株已由本申請(qǐng)人于2007 年10月30日向中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC) 提供了保藏，保藏號(hào)為CGMCCNo.2236。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1:
1、 菌種納豆芽孢桿菌(5fl"7/附wfl加)菌株，保藏號(hào)為CGMCC No.2236。
2、 斜面培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件
斜面培養(yǎng)基牛肉膏O.Sg,蛋白胨lg， NaC10.5g，瓊脂2g，水100mL， pH7.0-7.2， 37。C培養(yǎng)12h。
實(shí)施例2:
1、 菌種、斜面培養(yǎng)同實(shí)施例1
2、 種子培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件
種子培養(yǎng)基蛋白胨lg，葡萄糖2g, K2HPO40.1g， MgSO40.05g，水100mL， pH7.0-7.2， 37°C、 200r/min條件下振蕩培養(yǎng)12h。實(shí)施例3:
1、 菌種、斜面培養(yǎng)同實(shí)施例1
2、 種子培養(yǎng)同實(shí)施例2
3、 主要檢測(cè)方法
(1) 蛋白含量測(cè)定Folin-酚法
(2) 抗氧化活力測(cè)定鄰苯三酚自氧化法
4、 發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵條件
發(fā)酵培養(yǎng)基玉米蛋白粉與水按一定比例配制。
取lmL種子培養(yǎng)液接入裝有初始pH7.0的30mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL三 角瓶中，34°C、 200r/min條件下振蕩培養(yǎng)32h。
實(shí)施例4:
1、 斜面培養(yǎng)同實(shí)施例1
2、 種子培養(yǎng)同實(shí)施例2
3、 發(fā)酵條件同實(shí)施例3
4、 抗氧化活性肽的分離純化
將發(fā)酵液10000r/min離心15min后，取上清液用0.22jim微孔濾膜過濾， 濾液進(jìn)行弱陰離子交換層析，收集活性髙的部分用Sephadex G-25凝膠層析脫 鹽。脫鹽后的活性部分進(jìn)行Q-SepharoseHP色譜分離，收集活性髙的部分用 Sephadex G-25凝膠層析進(jìn)行脫鹽。脫鹽后的收集的活性部分再次進(jìn)行弱陰離子 交換層析分離并脫鹽。收集活性部分進(jìn)行Symmetry Shield TMRP 18反相色譜分 離，收集高活性部分第二次經(jīng)SymmetryShieldTMRP18反相色譜分離，收集活 性部分進(jìn)行蛋白質(zhì)電泳，并印跡至PVDF膜上。實(shí)施例5:
1、 斜面培養(yǎng)同實(shí)施例1
2、 種子培養(yǎng)同實(shí)施例2
3、 發(fā)酵條件同實(shí)施例3
4、 抗氧化活性肽的分離純化同實(shí)施例4
5、 抗氧化活性肽的氨基酸序列的測(cè)定
將印跡到PVDF膜上的肽送到上海生化蛋白質(zhì)組學(xué)研究分析中心用PE公 司的ABI491A氨基酸序列分析儀進(jìn)行氨基酸序列測(cè)定。
實(shí)施例6
本發(fā)明產(chǎn)品抗氧化活力的測(cè)定，采用的方法是改進(jìn)的鄰苯三酚自氧化法， 采用4.5mL體系對(duì)各組分進(jìn)行鄰苯三酚自氧化的測(cè)定。Tris-HCl (pH8.2， 0.05mol/L) 4.5mL， 25。C水浴保溫20min,對(duì)照管中加O.01mol/L HC1 10jiL和 4.5mL Tris-HCl，空白管中加入25°C預(yù)熱的45mmol/L的鄰苯三酚10jiL和4.5mL Tris-HCl混勻，開始計(jì)時(shí)，反應(yīng)30s后，于325nm處作時(shí)間掃描，反應(yīng)4min， 空白最佳的自氧化速率控制為0.070±0.002A/min,取玉米蛋白水解液10pL加入 到Tris-HCl緩沖液4.5mL中，同25。C預(yù)熱的45mmol/L的鄰苯三酚lOpL混勻， 30s后，于325nm處掃描，最后計(jì)算抗氧化活力。
計(jì)算酶活力(U/mL) = ( ODA-ODB) /ODaX100。/。/50。/。xV N/V2 其中Vr反應(yīng)液總體積，mL
Vr測(cè)定樣品的體積，mL N-樣品稀釋倍數(shù) ODA-鄰苯三酚自氧化法速率ODB-樣品光密度值變化速率 經(jīng)測(cè)定其抗氧化活力為236.68U/mL。
實(shí)施例7
本發(fā)明產(chǎn)品氨基酸序列的測(cè)定，所采用的方法是Edman降解法，測(cè)定該 抗氧化活性肽的氨基酸序列結(jié)果是該肽N端5個(gè)氨基酸序列為K-V-T-Y-H。
權(quán)利要求
1、一種抗氧化活性肽，其特征是該產(chǎn)品的分子量在20,100--31,000之間，N端5個(gè)氨基酸序列為K-V-T-Y-H，抗氧化活力為236.68U/mL。
2、 一種如權(quán)利要求1所述抗氧化活性肽的制備方法，其特征是該產(chǎn)品 是以玉米蛋白粉為原料，使用納豆芽孢桿菌(5fl"7/附/iWto)為發(fā)酵菌種，采用 液態(tài)培養(yǎng)方式，獲得具有抗氧化活性的多肽混合物，再通過離子交換層析、凝 膠層析、反相色譜，逐級(jí)收集高活性并分子量〉5，000Da部分，最后通過電泳分 離獲得。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的抗氧化活性肽的制備方法，其特征是所述的 納豆芽孢桿菌(5fl"7/"s/m"o)菌種為本申請(qǐng)人于2007年10月30日在中國微 生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏號(hào)為CGMCC No.2236的菌株。
4、 一種如權(quán)利要求2或3所述抗氧化活性肽的制備方法，其特征是所述 的液態(tài)培養(yǎng)方式如下；取發(fā)酵菌種納豆芽孢桿菌(^1"7/附《^似)菌株，將lmL 種子培養(yǎng)液接入裝有初始pH7.0的30mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，于 34。C 、 200r/min條件下振蕩培養(yǎng)32h后5000 r/min離心10min,在沸水浴中滅 酶活10min，所得液體為抗氧化活性肽混合物。
5、 一種如權(quán)利要求4所述抗氧化活性肽的制備方法，其特征是所述的 離子交換層析包括弱陰離子交換層析，具體;r序?yàn)槭褂玫娜蹶庪x子為DEAE 一SepharoseFastFlow，具體步驟是將抗氧化活性肽混合物10000r/min離心 15min ，取上清液過0.22jim微孔濾膜，濾液進(jìn)行弱陰離子交換層析((p2.6*20cm );起始緩沖液25mmol/L pH 9.0 Tris-HCl ,洗脫液含lmol NaCl的25mmol/L pH9.0Tris-HCl，流速1.5mL/min， UV280nm處檢測(cè)，測(cè)定各管收集液的抗 氧化活力，收集高活性部分備用。
6、 一種如權(quán)利要求5所述抗氧化活性肽的制備方法，其特征是所述的凝 膠層析采用Sephadex G-25,具體步驟是① 將DEAE-Sepharose Fast Flow的高活力樣品冷凍抽干濃縮后，用洗脫液 25mmol/L pH 9.0 Tris-HCl溶解后進(jìn)行凝膠層析脫鹽(q>1.6*50)，流速為 2.0mL/min， UV280nm處檢測(cè)；測(cè)定各管收集液的抗氧化活力，收集高活性部 分備用；② 將Q- S印harose HP的高活力樣品冷凍抽干濃縮后，用洗脫液雙蒸水溶 解后10000r/min離心lOmin，取上清液進(jìn)行凝膠層析脫鹽(<pl.6*50)，流速 2.0mL/min， UV280nm處檢測(cè)，測(cè)定各管收集液的抗氧化活力，收集高活性并 分子量〉5，000Da部分備用。
7、 一種如權(quán)利要求6所述抗氧化活性肽的制備方法，其特征是所述的反 相色譜包括強(qiáng)陰離子交換層析色譜，采用的是Q-SepharoseHP，具體步驟是 將進(jìn)行過Sephadex G-25脫鹽后的活性部分進(jìn)行Q-S印harose HP分離，起始緩 沖液25mmol/L pH 9.0 Tris-HCl，洗脫液:含ImolNaCI的25mmol/L pH 9.0 Tris-HCl,流速2.0mL/min， UV280nm處檢測(cè)，測(cè)定各管收集液的抗氧化活 力，收集高活性并分子量〉5，000Da部分備用。
8、 一種如權(quán)利要求7所述抗氧化活性肽的制備方法，其特征是所述的離 子交換層析還包括弱陽離子交換層析，使用的是CM-Sepharose Fast Flow,具 體步驟是將進(jìn)行過Sephadex G-25脫鹽后的活性部分進(jìn)行CM-Sepharose FastFlow色譜分離；起始緩沖液lmmol/LpH3.0Gly-HCl，洗脫液含lmolNaCl 的0.001mol/LpH3.0Gly-HCl，流速2.0mL/min， UV280nm處檢測(cè)，測(cè)定各 管收集液的抗氧化活力，收集活性部分備用。
9、 一種如權(quán)利要求8所述抗氧化活性肽的制備方法，其特征是所述的反 相色譜分離步驟包括 RESOURCE RPC (3mL)反相色譜分離將經(jīng)過②S印hadex G-25脫鹽后活性部分進(jìn)行RESOURCE RPC 3mL反 相色譜分離；洗脫液A: 0.065%TFA， 2%乙腈；洗脫液B: 0.05%TFA, 80% 乙腈；流速1.0mL/min， UV280nm處檢測(cè)；測(cè)定各管收集液的抗氧化活力， 收集活性部分作下一步色譜分離用；② 第一次SymmetryShield TMRP 18 ( 5jun)反相色譜將進(jìn)行過CM-Sepharose Fast Flow的高活力樣品，進(jìn)行Symmetry Shield TMRP18反相色譜分離；洗脫液A: 0.065%TFA , 2%乙腈；洗脫液B: 0.05%TFA， 80%乙腈；流速1.0mL/min， UV280nm處檢測(cè)；測(cè)定各管收集 液的抗氧化活力，收集活性部分進(jìn)行第二次SymmetryShield TMRP 18反相色譜③ 第二次SymmetryShield TMRP 18 (5jim)反相色譜 將第一次進(jìn)行SymmetryShield TMRP 18反相色譜分離的高活力部分冷凍抽干后進(jìn)行第二次SymmetryShield TMRP 18分離；洗脫液A: 0.065%TFA， 8% 乙腈；洗脫液B: 0.05%TFA， 60%乙腈；流速1.0mL/min， UV280nm處檢測(cè)，測(cè)定各管收集液的抗氧化活力，收集活性部分進(jìn)行蛋白質(zhì)電泳。
10、 一種如權(quán)利要求9所述抗氧化活性肽的制備方法，其特征是所述的 酸、堿性PAGE凝膠電泳垂直板電泳槽中灌注交聯(lián)度為2.6%，濃度為10% (w/v)分離膠和5% (w/v)濃縮膠；堿性電泳濃縮膠部分恒壓40v，分離膠部分 恒壓70v，電泳2.0h;酸性電泳濃縮膠部分恒壓100v，分離膠部分恒壓200v，電 泳4.0h。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種抗氧化活性肽及其制備方法，產(chǎn)品是以微生物納豆芽孢桿菌(Bacillus natto)為菌種，玉米蛋白粉為原料，經(jīng)液態(tài)培養(yǎng)，再通過離子交換層析、凝膠層析、反相色譜和電泳法對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行分離制備而成；該產(chǎn)品的分子量在20,100-31,000之間，N端5個(gè)氨基酸序列為K-V-T-Y-H，抗氧化活力為236.68U/mL；本發(fā)明產(chǎn)品具有較高的抗氧化活力，純品可滿足對(duì)抗氧化活性肽結(jié)構(gòu)、物性測(cè)定，活性、毒理實(shí)驗(yàn)，乃至于治療、培育等大規(guī)模應(yīng)用的要求；由于抗氧化活性物質(zhì)對(duì)超氧陰離子自由基和羥基自由基有強(qiáng)烈的清除作用，并能顯著抑制紅細(xì)胞和肝臟、心臟、腦組織脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的發(fā)生，具有防治疾病、抗衰老等功能，可進(jìn)一步開發(fā)成醫(yī)藥、化妝品等產(chǎn)品添加劑使用。
文檔編號(hào)C12R1/07GK101284872SQ20081006429
公開日2008年10月15日 申請(qǐng)日期2008年4月9日 優(yōu)先權(quán)日2008年4月9日
發(fā)明者劉曉蘭, 杰 林, 王曉杰, 鄭喜群 申請(qǐng)人:齊齊哈爾大學(xué)