專利名稱：犬S100β蛋白的體外表達(dá)及其多克隆抗體的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種犬siooe蛋白的體外表達(dá)及其多克隆抗體的制備方法。
背景技術(shù)：
S100蛋白家族是廣泛分布于不同組織的一類分子量(10-13 kDa)較 小的酸性鈣結(jié)合蛋白，具有EF手型(螺旋-環(huán)-螺旋)鈣離子結(jié)合區(qū)，目 前發(fā)現(xiàn)至少包含21個成員。S100e就是S100蛋白家族最經(jīng)典的一員。
siooe蛋白特異性地存在于腦組織的膠質(zhì)細(xì)胞胞質(zhì)中，包括星形神經(jīng)膠 質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞等，也存在于神經(jīng)元的亞群和膠質(zhì)
以及外周神經(jīng)系統(tǒng)的雪旺氏細(xì)胞(Schwanncell)中。研究顯示S100P作 為鈣傳感器蛋白，具有廣泛的生物學(xué)活性，如①調(diào)節(jié)蛋白激酶C和 鈣調(diào)蛋白的磷酸化及RNA的合成，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的能量代謝；②作為 細(xì)胞內(nèi)正常成分參與細(xì)胞內(nèi)外鈣離子水平的調(diào)節(jié)；③增強ATP酶的活 性；④通過神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的旁分泌和自分泌，作用于神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì) 細(xì)胞，從而促進神經(jīng)的生長和損傷后修復(fù)；⑤激活腦果糖1, 6 -二磷酸 醛縮酶和葡萄糖磷酸變位酶，促進神經(jīng)的生長和損傷后的修復(fù)；⑥作用
于光感受器外膜上的鳥苷酸環(huán)化酶。由此可見，siooe在細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞
外都具有廣泛的生物學(xué)效應(yīng)。市場上多是針對人、小鼠及大鼠S100I3的 抗體，這些抗體與牛、羊、豬、兔、貓、猴等有一定的交叉反應(yīng)，但針對犬的S100(3蛋白高特異性、高滴度的抗體目前還沒有。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種方法易操作，能制備出抗犬siooe蛋
白抗體的犬siooe蛋白的體外表達(dá)及其多克隆抗體的制備方法。
本發(fā)明的技術(shù)解決方案是
一種犬S1OO0蛋白的體外表達(dá)方法，其特征是包括下列步驟
1) 取正常畢格犬坐骨神經(jīng)，用Trizol試劑提取坐骨神經(jīng)總RNA;
2) RT-PCR擴增用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及總RNA進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，合 成cDNA第一鏈，再以合成的cDNA為模板，進行犬S100 3基因的PCR 擴增；
3) 連接用克隆載體試劑盒，將PCR產(chǎn)物連接到克隆載體中；
4) 犬S100P cDNA序列的測定將己克隆在克隆載體中的S100 3 cDNA進行測序，測序結(jié)果其序列與基因庫中的序列完全一致；
5) 設(shè)計S100e表達(dá)載體的引物，構(gòu)建S100P重組原核表達(dá)質(zhì)粒 以上述測序正確的質(zhì)粒為模板，PCR擴增SIOOP基因片斷；用限制性 內(nèi)切酶屈o I 、 SamH I消化S100 3的PCR產(chǎn)物和PGEX-4T-1質(zhì)粒 載體，并進行酶切產(chǎn)物的膠回收；用T4 DNA連接酶將PCR酶切回收 產(chǎn)物和PGEX-4T-1質(zhì)粒載體酶切回收產(chǎn)物連接；
6) 感受態(tài)細(xì)胞的制備及重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化用無菌接種棒從感受態(tài) 細(xì)胞菌株蘸菌液劃無氨芐青霉素LB瓊脂板，37C培養(yǎng)過夜后挑取單個 克隆接種于5mlLB培養(yǎng)基中，細(xì)菌培養(yǎng)搖床中37。C、 200轉(zhuǎn)/分震蕩培 養(yǎng)20小時；取0.5ml該菌液接種于無氨節(jié)青霉素100ml LB液體培養(yǎng)基中，37。C振蕩培養(yǎng)2-2.5小時，至OD6o。為0.4-0.5時，放置于4。C冰箱 冷卻l-2小時；將培養(yǎng)液分入兩個50ml離心管中，4"C離心，4000gxl0 分鐘，棄去上清，用冰浴的0.1M MgCl2 25ml懸浮30分鐘；再4。C離 心，4000gxl0分鐘，棄去上清，加入冰浴的0.1M CaCl2-甘油溶液lml 懸浮。以100^1/管分裝入1.5ml離心管中，-70卩凍存?zhèn)溆?；?filDNA 連接產(chǎn)物加入lOOpl感受態(tài)細(xì)胞中，旋轉(zhuǎn)使DNA分散均勻，冰浴30分 鐘，42。C水浴中熱休克90秒，繼續(xù)冰浴2-3分鐘后加入LB培養(yǎng)基20(^1， 于37t:緩搖孵育45分鐘，將培養(yǎng)物涂于1.5%含氨節(jié)青霉素的瓊脂LB 平板，待膠表面沒有液體流動時，37'C溫箱倒置培養(yǎng)12-16小時；
7) 、重組克隆的篩選及酶切鑒定從上述培養(yǎng)板中挑取6個克隆接 種于5ml含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37C震蕩培養(yǎng)過夜，以堿裂解 法提取質(zhì)粒DNA，限制性內(nèi)切酶消化l小時，電泳鑒定DNA目的片斷 是否正確構(gòu)建于表達(dá)載體中；
8) 用鑒定正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，挑取含重組質(zhì)粒的菌 體單斑至2ml LB培養(yǎng)基中37"C振蕩培養(yǎng)過夜，其中LB培養(yǎng)基中含氨 芐青霉素量為50mg/L;將lml菌液加入到含50ml LB培養(yǎng)基的1000ml 培養(yǎng)瓶中，37'C振蕩培養(yǎng)至OD,為0.6，取lml菌液作為未誘導(dǎo)的對 照組，余下菌液中加入異丙基-P-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至終濃度分 別為0. 1 mmol/L， 37"C誘導(dǎo)4小時；同時以轉(zhuǎn)化了 pGEX-4T-l載體的 感受態(tài)細(xì)胞作陰性對照；將誘導(dǎo)、末誘導(dǎo)的含pGEX-4T-l載體的BL21 菌液菌液各lml，室溫10000g離心1分鐘，棄去上清，0.01MPBS 500W 重懸，加入等體積2 x SDS電泳上樣緩沖液，10(TC煮沸5分鐘，然后膠中各加入20ix 1懸 液，電泳結(jié)束后凝膠經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色、脫色后檢測融合蛋白表達(dá)情況。 感受態(tài)細(xì)胞為DH5 a或BL21 。
一種犬S100e蛋白的多克隆抗體的制備方法，其特征是包括下
列步驟
將20ml轉(zhuǎn)化了 pGEX-4T-S100P的感受態(tài)細(xì)胞接種到1000ml LB培 養(yǎng)基中進行擴大培養(yǎng)，37"C震蕩培養(yǎng)至0De。。為0.6左右，加入異丙基 - 3 -D-硫代半乳糖苷至終濃度為0. 1 mmol/L， 37。C誘導(dǎo)4小時，菌液 離心，超聲破碎后，吸附、洗脫GST-SIOOP融合蛋白；將洗脫液放入預(yù) 處理的透析袋中，夾緊，放入去離子水中，4"C透析24小時，收集透析 后的液體;用12% SDS聚丙烯酰胺凝膠檢測經(jīng)過洗脫、透析后的GST-S100 3融合蛋白；收集上述蛋白質(zhì)后，第一次用弗氏完全佐劑與抗原乳化后 免疫大耳兔，3周后用弗氏不完全佐劑與抗原乳化后加強免疫，4次免 疫后，兔放血，收集抗血清；其中轉(zhuǎn)化了pGEX-4T-S100e的感受態(tài)細(xì)胞
的制備方法與犬sioo e蛋白的體外表達(dá)方法中相同。
吸附、洗脫GST-S1OO0融合蛋白的具體方法是用GE healthcare 公司的glutathione s印harose吸附GST-S100 0融合蛋白，再用10 mM 的還原型GSH洗脫glutathione s印harose。
本發(fā)明所述制備的抗體，包括在兔、羊、鼠等動物體內(nèi)制備相應(yīng)動
物來源的抗犬siooe蛋白多克隆抗體，這些多克隆抗體在體內(nèi)外均可 特異性的與犬sioo e蛋白相結(jié)合。
本發(fā)明的優(yōu)越性在于以PGEX-4T-1為基礎(chǔ)所構(gòu)建的體外S100e表達(dá)系統(tǒng)在BL21中能高效地表達(dá)目的蛋白，進一步以成熟的方法進行 純化，可方便地獲得大量的GST-S100e融合蛋白。另外，經(jīng)此蛋白免
疫大耳兔所制備的兔抗犬siooe血清滴度高、特異好，完全可以滿足
相關(guān)實驗的需要。


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下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作迸一步說明。
圖1是目的基因S1003的測序結(jié)果示圖。
圖2是原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T-S100e構(gòu)建示圖。
圖3是細(xì)菌裂解產(chǎn)物電泳后考馬斯亮藍(lán)染色結(jié)果示圖。
圖4是GST-S100P融合蛋白經(jīng)glutathione sepharose純化后電泳示圖。
圖5是制備的抗體與細(xì)菌表達(dá)的S100P融合蛋白Western Blot結(jié)果示圖。
圖6是制備的抗體與犬坐骨神經(jīng)中的S100p蛋白Western Blot結(jié)果示圖。
圖7是制備的抗體與犬坐骨神經(jīng)中的S100P蛋白免疫組化結(jié)果示圖。
具體實施例方式
實施例1:
一種犬SIOOP蛋白的體外表達(dá)方法，包括下列步驟
步驟1)、取正常畢格犬坐骨神經(jīng)，用Trizol試劑提取坐骨神經(jīng)總步驟2)、RT-PCR擴增用Qiagen公司逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及2 u g總RNA 進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，合成cDNA第一鏈，再以合成的cDNA為模板，進行 犬S100 3基因的PCR擴增；
步驟3)、連接用Promega公司的pGEM-T Vector試劑盒，將PCR 產(chǎn)物連接到克隆載體pGEM-T Vector中；
步驟4)、犬3 cDNA序列的測定將已克隆在克隆載體 pGEM-T Vector中的S100e cDNA進行測序，測序結(jié)果其序列與基因 庫中的序列完全一致；
1 ATGTCGCAGCTGGAGAAGGCGGCGCTGGCCCTGCTCGACGTGTTCCAGCA 51 GTACTCGGCGCGGGCGGGTGGTGGGCGCAGGCTGAGGAAGGCCGACGTCA
151 CAGGAGGTCGTGGACAAGGTCATGGAGACACTGGACAGTGACGGAGACGG 201 CGAGTGCGACTTCCAGGAGTTCGTGGCCTTCGTGGCTATGGTCACCACCG 251 CCTGCCACGAGTTCTTCGAGCACGAGTGA
步驟5)、設(shè)計S100e表達(dá)載體的引物，構(gòu)建S100e重組原核表達(dá) 質(zhì)粒以上述測序正確的質(zhì)粒為模板，PCR擴增S100e基因片斷。用 限制性內(nèi)切酶，o 1、BawH I消化S100e的PCR產(chǎn)物和PGEX-4T-1 原核表達(dá)質(zhì)粒載體，并進行酶切產(chǎn)物的膠回收。用T4 DNA連接酶將 PCR酶切回收產(chǎn)物和PGEX-4T-1原核表達(dá)質(zhì)粒載體的酶切回收產(chǎn)物連 接；
步驟6)、感受態(tài)細(xì)胞的制備及重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化用無菌接種棒從-70 。C保存的DH5 a菌株中蘸少許菌液劃無氨芐青霉素LB瓊脂板，37°。培 養(yǎng)過夜后挑取單個克隆接種于5ml LB培養(yǎng)基中，置細(xì)菌培養(yǎng)搖床中于 37°C、 200轉(zhuǎn)/分震蕩培養(yǎng)20小時。取0.5ml該菌液接種于無氨芐青霉
10素100ml LB液體培養(yǎng)基中，37。C震蕩培養(yǎng)2-2.5小時，至OD,為0.4-0.5 時，放置于4"C冰箱冷卻l-2小時。將培養(yǎng)液分入兩個50ml離心管中， 4T:離心，4000gxl0分鐘，棄去上清，用冰浴的0.1MMgCl2 25ml懸浮 30分鐘。4。C離心，4000gxl0分鐘，棄去上清，加入冰浴的0.1MCaCl2-甘油溶液lml懸浮。以10(Hd/管分裝入1.5ml離心管中，-7(TC凍存?zhèn)溆谩?取5|Lil DNA連接產(chǎn)物加入10(^1感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕旋轉(zhuǎn)數(shù)次使DNA 分散均勻，冰浴30分鐘，42。C水浴中熱休克90秒，繼續(xù)冰浴2-3分鐘 后加入LB培養(yǎng)基200)Li1，于37t:緩搖孵育45分鐘，將培養(yǎng)物適量涂于 1.5%瓊脂LB平板(含氨芐青霉素)，待膠表面沒有液體流動時，37°C 溫箱倒置培養(yǎng)12-16小時；
步驟7)、重組克隆的篩選及酶切鑒定從上述培養(yǎng)板中挑取6個 克隆接種于5ml含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37匸震蕩培養(yǎng)過夜，以 堿裂解法小量提取質(zhì)粒DNA，限制性內(nèi)切酶消化1小時，電泳鑒定DNA 目的片斷是否正確構(gòu)建于表達(dá)載體中；
步驟8)、目的蛋白的表達(dá)BL21感受態(tài)細(xì)胞的制備(方法同上述 DH5a感受態(tài)細(xì)胞的制備)。用鑒定正確的pGEX-4T-S100e重組質(zhì)粒 轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細(xì)胞，挑取含重組質(zhì)粒的菌體單斑至2ml LB培養(yǎng)基 (含氨芐青霉素50mg/L)中37'C震蕩培養(yǎng)過夜。將lml菌液加入到含 50mlLB培養(yǎng)基的1000ml培養(yǎng)瓶中，37"震蕩培養(yǎng)至OD6(X)為0.6左右， 取lml菌液作為未誘導(dǎo)的對照組，余下菌液中加入異丙基-(3-D-硫代半 乳糖苷(IPTG)至終濃度為O. 1 mmol/L， 37'C誘導(dǎo)4小時。同時以轉(zhuǎn) 化了 pGEX-4T-l載體的BL21細(xì)菌作陰性對照。將誘導(dǎo)、末誘導(dǎo)的pGEX-4T-l載體的BL21菌液各lml，室溫lOOOOg離心1分鐘，棄去上 清，0.01MPBS 500jil重懸，加入等體積2xSDS電泳上樣緩沖液，100 。C煮沸5分鐘，然后以12000g離心1分鐘，在12% SDS聚丙烯酰胺凝 膠中各加入20iU懸液，電泳結(jié)束后凝膠經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色、脫色后檢 測融合蛋白表達(dá)情況。 實施例2:
一種犬S100P蛋白的多克隆抗體的制備方法，包括下列步驟在 經(jīng)實施例1步驟，證實有目的蛋白表達(dá)后，將20ml轉(zhuǎn)化了 pGEX-4T-S100 3的BL21細(xì)菌接種到1000mlLB培養(yǎng)基中進行擴大培養(yǎng)，37"C震蕩培 養(yǎng)至OD6oc為0.6左右，加入異丙基-P-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至終濃 度為0. 1 mmol/L， 37匸誘導(dǎo)4小時。菌液離心，超聲破碎后，用GE healthcare公司的glutathione sepharose吸附GST-S100P融合蛋白。用 10 mM的還原型GSH洗脫glutathione sepharose，將洗脫液放入預(yù)處理 的透析袋中，夾緊，放入去離子水中，4"C透析24小時，收集透析后的 液體。用12% SDS聚丙烯酰胺凝膠檢測經(jīng)過洗脫、透析后的GST-S100 P融合蛋白。參照BCA蛋白濃度測定試劑盒說明書，定量透析后蛋白 質(zhì)的濃度。收集足夠量的蛋白質(zhì)后，第一次用弗氏完全佐劑與抗原乳化 后免疫大耳兔，3周后用弗氏不完全佐劑與抗原乳化后加強免疫，4次 免疫后，兔放血，收集抗血清。利用protein G法純化抗血清，并利用 ELISA方法確定純化后抗體的滴度。再用純化后的抗體對細(xì)菌目的蛋白 條帶和動物組織中的S100P蛋白進行檢測，確定抗體的特異性。
結(jié)果1、目的蛋白獲得了高效的表達(dá)。2、以Western方法證明獲得的抗體能識別細(xì)菌表達(dá)的和犬坐骨神經(jīng)中的S100e蛋白。3、以免疫 組化的方法證明得到的抗體能有效地識別犬坐骨神經(jīng)中的S100P蛋白。 (見圖5、圖6、圖7)。
權(quán)利要求
1、一種犬S100β蛋白的體外表達(dá)方法，其特征是包括下列步驟1)取正常畢格犬坐骨神經(jīng)，用Trizol試劑提取坐骨神經(jīng)總RNA；2)RT-PCR擴增用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及總RNA進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，合成cDNA第一鏈，再以合成的cDNA為模板，進行犬S100β基因的PCR擴增；3)連接用克隆載體試劑盒，將PCR產(chǎn)物連接到克隆載體中；4)犬S100βcDNA序列的測定將已克隆在克隆載體中的S100β cDNA進行測序，測序結(jié)果其序列與基因庫中的序列完全一致；5)設(shè)計S100β表達(dá)載體的引物，構(gòu)建S100β重組原核表達(dá)質(zhì)粒以上述測序正確的質(zhì)粒為模板，PCR擴增S100β基因片斷；用限制性內(nèi)切酶Xho I、BamH I消化S100β的PCR產(chǎn)物和PGEX-4T-1質(zhì)粒載體，并進行酶切產(chǎn)物的膠回收；用T4 DNA連接酶將PCR酶切回收產(chǎn)物和PGEX-4T-1質(zhì)粒載體酶切回收產(chǎn)物連接；6)感受態(tài)細(xì)胞的制備及重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化用無菌接種棒從感受態(tài)細(xì)胞菌株蘸菌液劃無氨芐青霉素LB瓊脂板，37℃培養(yǎng)過夜后挑取單個克隆接種于5ml LB培養(yǎng)基中，細(xì)菌培養(yǎng)搖床中37℃、200轉(zhuǎn)/分震蕩培養(yǎng)20小時；取0.5ml該菌液接種于無氨芐青霉素100ml LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)2-2.5小時，至OD600為0.4-0.5時，放置于4℃冰箱冷卻1-2小時；將培養(yǎng)液分入兩個50ml離心管中，4℃離心，4000g×10分鐘，棄去上清，用冰浴的0.1M MgCl2 25ml懸浮30分鐘；再4℃離心，4000g×10分鐘，棄去上清，加入冰浴的0.1M CaCl2-甘油溶液1ml懸浮。以100μl/管分裝入1.5ml離心管中，-70℃凍存?zhèn)溆?；?μl DNA連接產(chǎn)物加入100μl感受態(tài)細(xì)胞中，旋轉(zhuǎn)使DNA分散均勻，冰浴30分鐘，42℃水浴中熱休克90秒，繼續(xù)冰浴2-3分鐘后加入LB培養(yǎng)基200μl，于37℃緩搖孵育45分鐘，將培養(yǎng)物涂于1.5％含氨芐青霉素的瓊脂LB平板，待膠表面沒有液體流動時，37℃溫箱倒置培養(yǎng)12-16小時；7)、重組克隆的篩選及酶切鑒定從上述培養(yǎng)板中挑取6個克隆接種于5ml含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃震蕩培養(yǎng)過夜，以堿裂解法提取質(zhì)粒DNA，限制性內(nèi)切酶消化1小時，電泳鑒定DNA目的片斷是否正確構(gòu)建于表達(dá)載體中；8)用鑒定正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，挑取含重組質(zhì)粒的菌體單斑至2ml LB培養(yǎng)基中37℃振蕩培養(yǎng)過夜，其中LB培養(yǎng)基中含氨芐青霉素量為50mg/L；將1ml菌液加入到含50ml LB培養(yǎng)基的1000ml培養(yǎng)瓶中，37℃振蕩培養(yǎng)至OD600為0.6，取1ml菌液作為未誘導(dǎo)的對照組，余下菌液中加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至終濃度分別為0.1mmol/L，37℃誘導(dǎo)4小時；同時以轉(zhuǎn)化了pGEX-4T-1載體的感受態(tài)細(xì)胞作陰性對照；將誘導(dǎo)、末誘導(dǎo)的含pGEX-4T-1載體的BL21菌液菌液各1ml，室溫10000g離心1分鐘，棄去上清，0.01M PBS 500μl重懸，加入等體積2×SDS電泳上樣緩沖液，100℃煮沸5分鐘，然后以12000g離心1分鐘，在12％SDS聚丙烯酰胺凝膠中各加入20μl懸液，電泳結(jié)束后凝膠經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色、脫色后檢測融合蛋白表達(dá)情況。
2、根據(jù)權(quán)利要求l所述的犬S100e蛋白的體外表達(dá)方法，其特征 是感受態(tài)細(xì)胞為DH5a或BL21。
3、 一種犬S100 3蛋白的多克隆抗體的制備方法，其特征是包括 下列步驟將20ml轉(zhuǎn)化了 pGEX-4T-S100 g的感受態(tài)細(xì)胞接種到1000ml LB培 養(yǎng)基中進行擴大培養(yǎng)，37t:震蕩培養(yǎng)至OD咖為0.6左右，加入異丙基 -e-D-硫代半乳糖苷至終濃度為O. 1 ranol/L， 37。C誘導(dǎo)4小時，菌液 離心，超聲破碎后，吸附、洗脫GST-S1OO0融合蛋白；將洗脫液放入預(yù) 處理的透析袋中，夾緊，放入去離子水中，4。C透析24小時，收集透析 后的液體;用12% SDS聚丙烯酰胺凝膠檢測經(jīng)過洗脫、透析后的GST-S100 P融合蛋白；收集上述蛋白質(zhì)后，第一次用弗氏完全佐劑與抗原乳化后 免疫大耳兔，3周后用弗氏不完全佐劑與抗原乳化后加強免疫，4次免 疫后，兔放血，收集抗血清；其中轉(zhuǎn)化了pGEX-4T-S100P的感受態(tài)細(xì)胞的制備方法與犬siooe蛋白的體外表達(dá)方法中相同。
4、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的犬siooe蛋白的多克隆抗體的制備方法，其特征是吸附、洗脫GST-S100e融合蛋白的具體方法是用GE healthcare公司的glutathione s印harose吸附GST-S100 P融合蛋白， 再用10 mM的還原型GSH洗脫glutathione s印harose。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種犬S100β蛋白的體外表達(dá)及其多克隆抗體的制備方法，包括提取犬坐骨神經(jīng)總RNA、RT-PCR擴增、連接、犬S100βcDNA序列的測定、設(shè)計S100β表達(dá)載體的引物構(gòu)建S100β重組原核表達(dá)質(zhì)粒、感受態(tài)細(xì)胞的制備及重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化、重組克隆的篩選及酶切鑒定、目的蛋白的表達(dá)及多克隆抗體制備等步驟。本發(fā)明以PGEX-4T-1為基礎(chǔ)所構(gòu)建的體外S100β表達(dá)系統(tǒng)在BL21中能高效地表達(dá)目的蛋白，進一步以成熟的方法進行純化，可方便地獲得大量的GST-S100β融合蛋白。另外，經(jīng)此蛋白免疫大耳兔所制備的兔抗犬S100β血清滴度高、特異好，完全可以滿足相關(guān)實驗的需要。
文檔編號C12N15/12GK101451136SQ20081019669
公開日2009年6月10日 申請日期2008年9月17日 優(yōu)先權(quán)日2008年9月17日
發(fā)明者斐 丁, 梅 劉, 炎 劉, 堅 吳, 蔣茂榮, 顧曉松 申請人:南通大學(xué)