專(zhuān)利名稱(chēng)：：一種用gdf5基因預(yù)示和鑒定秦川牛體尺大小的分子標(biāo)記方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于動(dòng)物分子遺傳學(xué)領(lǐng)域，特別是涉及一種用GDF5基因預(yù)示和鑒定秦川牛體尺大小的分子標(biāo)記方法，該方法能夠檢測(cè)秦川牛體長(zhǎng)和腰角寬，為培育肉牛新品種提供了新的方法。
背景技術(shù)：
：秦川牛產(chǎn)于陜西省渭河流域關(guān)中平原地區(qū)，因"八百里秦川"而得名。以東起渭南、蒲城，西至扶風(fēng)、歧山等15個(gè)縣市為主產(chǎn)區(qū)，為中國(guó)五大良種黃牛之一。秦川牛以其抗逆性強(qiáng)、耐粗飼、肉質(zhì)好而聞名于世，被譽(yù)為"國(guó)之瑰寶"。體尺大小是決定品種優(yōu)劣和生產(chǎn)性能高低的重要指標(biāo)，而且研究牛體尺大小已經(jīng)成為一個(gè)突出的問(wèn)題。在長(zhǎng)期的選育過(guò)程中，隨著秦川牛從役用到現(xiàn)在的肉役兼用，一部分體形較小的個(gè)體已經(jīng)遭到淘汰，但選育較大體形秦〗11牛個(gè)體仍是秦j11牛肉用選育的重要目標(biāo)。生長(zhǎng)分化因子5(Growthdifferentiatefactor5，GDF5)，也被稱(chēng)為軟骨形態(tài)發(fā)生蛋白1(cartilage-derivedmorphogeneticprotein1，CDMP1)，是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子b(transforminggrowthfactor-b，TGF-b)基因家族中的一員，其作用與骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bonemorphogeneticproteins,BMPs)緊密相關(guān)(Miyamoto等，2007)。在人和小鼠上許多研究證實(shí)(Luyten等，1997;Francis-West等，1999;Edwards等，2001;Mikic等，2004;Nickel等，2005;Harada等，2007;Asuya等，2007)，GDF5主要作用于機(jī)體內(nèi)骨、軟骨、腱、關(guān)節(jié)內(nèi)韌帶發(fā)生和生長(zhǎng)及以后的維持，對(duì)于機(jī)體形態(tài)大小具有決定左右。、體尺大小是一個(gè)復(fù)雜的性狀，它受到基因和不同環(huán)境因素(包括日常進(jìn)食和出生前環(huán)境)共同影響，通過(guò)遺傳力估計(jì)，大約80%以上在體尺大小的變異由遺傳學(xué)決定。GDF5基因被發(fā)現(xiàn)在人的身高、坐高及其他體形指標(biāo)方面有著明顯的作用(Weedon等2008;Sanna等，2008;Lettre等，2008;Southam等，2007)，它與成人、幼兒、胚胎及組織的骨骼形成和生長(zhǎng)有著緊密聯(lián)系(Chang等，1994;Chujo等，2006)。2006年，Chujo等研究發(fā)現(xiàn)通過(guò)增加臨時(shí)細(xì)胞基質(zhì)來(lái)保持和修復(fù)脊椎骨長(zhǎng)度，從而在兔子上建立了脊椎骨長(zhǎng)度退化模型。1994年，Chang等研究發(fā)現(xiàn)GDF5在長(zhǎng)骨的原始軟骨中顯著表達(dá)，而在椎骨和肋骨中很少表達(dá)；少量的表達(dá)將會(huì)導(dǎo)致四肢骨的生長(zhǎng)受阻，影響機(jī)體的體形大??；進(jìn)而減少了GDF5基因的轉(zhuǎn)錄，影響脊椎骨、四肢骨及連接關(guān)節(jié)等的生長(zhǎng)，造成身材變小。同年，Voight等研究報(bào)道GDF5和UQCC基因己經(jīng)被發(fā)現(xiàn)作為身高等體形指標(biāo)的重要候選基因。綜上所述，國(guó)內(nèi)外大量的研究報(bào)道都證實(shí)了GDF5基因可以用來(lái)預(yù)示和鑒定人的身高和坐高，鑒于此，申請(qǐng)人在GDF5基因作為預(yù)示和鑒定秦川牛體長(zhǎng)和腰角寬的候選基因方面進(jìn)行了研究。以下是和本申請(qǐng)相關(guān)的參考文獻(xiàn)MiyamotoY.，MabuchilA.，ShiD.Q.，KuboT.，TakatoriY.，SaitoS.，F(xiàn)ujiokaM.，SudoA.，UchidaA.，YamamotoS.，OzakiK.，TakigawaM.，TanakaT.，NakamuraY.，JiangQ.，IkegawaS.(2007)Afunctionalpolymorphisminthe5，UTRofGDF5isassociatedwithsusceptibilitytoosteoarthritis.Nat.Genet.，39，529-533。LuytenF.P.(1997)Cartilage-derivedmorphogeneticprotein-1.Int.J.Biochem.CellBiol.，29，1241-1244。Francis-WestP.H.，AbdelfattahA.，ChenP.，AllenC.，ParishJ.，LadherR.，AllenS.，MacPhersonS.，LuytenF.P.，ArcherC.W.(1999)MechanismsofGDF-5actionduringskeletaldevelopment.Development.，126，1305-1315。EdwardsC丄，F(xiàn)rances-WestP.H.(2001)Bonemorphogeneticproteinsinthedevelopmentandhealingofsynovialjoints.SeminArthritisRheu.,31，33-42。MikicB.(2004)MultipleeffectsofGDF5deficiencyonskeletaltissues,implicationsfortherapeuticbioengineering.Ann.Biomed.Eng.,32，466-476。NickelJ.，KotzschA.，Se固W.，MuellerT.D.(2005)AsingleresidueofGDF5definesbindingspecificitytoBMPreceptorIB.J.Mol.Biol.，349，933-947。HaradaM.，TakaharaM.，ZheP.，OtsujiM.，IuchiY.，TakagiM.，OginoT.(2007)Developmentalfailureoftheintra-articularligamentsinmicewithabsenceofgrowthdifferentiationfactor5.OsteoarthrilisCartilage,j_J^468-474。MasuyaH.，NishidaK.，F(xiàn)uruichiT.，TokiH.，NishimuraG.，KawabataH.，YokoyamaH.，YoshidaA.，TominagaS.，NaganoJ.(2007)Anoveldominant-negativemutationinGdf5generatedbyENUmutagenesisimpairsjointformationandcausesosteoarthritisinmice.HumMolGenet.，16，2366-2375。WeedonM.N.，LangoH.，LindgrenC.M.，WallaceC.，EvansD.M.，ManginoM.，F(xiàn)reathyR.M.，PerryJ.R.B.，StevensS.，HallA.S.，SamaniN.J.，ShieldsB.，ProkopenkoI.，F(xiàn)arrallM.，DominiczakA.，JohnsonT.，BergmannS.，BeckmannJ.S.，VollenweiderP.，WaterworthD.M.，MooserV.，PalmerC.N.A.，MorrisA.D.，OuwehandW.H.，CaulfieldM.，MunroeP.B.，HattersleyA.T.，McCarthyM丄，F(xiàn)raylingT.M.(2008)Genome-wideassociationanalysisidentifies20locithatinfluenceadultheight.Nat.Genet.，40，575-583。SannaS.，JacksonA.U.，NagarajaR.，WilierC.J.，ChenW.M，BonnycastleL丄.，ShenH.Q.，TimpsonN.，LettreG.，UsalaG.，ChinesP.S.，StringhamH.M.，ScottL.J.，DeiM.，LaiS.，AlbaiG.，CrisponiL.，NaitzaS.，DohenyK.F.,PughE.W.，ShlomoY.B.，EbrahimS.，LawlorD.A.，BergmanR.N.，WatanabeR.M.，UdaM.，TuomilehtoJ.，CoreshJ.，HirschhomJ.N.，ShuldinerA.R.，SchlessingerD.，CollinsF.S.，SmithG.D.，BoerwinkleE.，CaoA.，BoehnkeM.，AbecasisG.R.，MohlkeK丄.(2008)CommonvariantsintheGDF5-UQCCregionareassociatedwithvariationinhumanheight.Nat.Genet.,40，198-203。[11]LettreG.A.，JacksonA.U.，GiegerC.，SchumacherF.R.，BemdtS丄,SannaS.,EyheramendyS.，VoightB.F.，ButlerJ丄.，GuiducciC.，IlligT.,HackettR.，HeidI.M.，JacobsK.B.，LyssenkoV.,UdaM.，BoehnkeM.,ChanockS丄，GroopL.C,,HuF.B.，IsomaaB.,KraftP.，PeltonenL,SalomaaV.，SchlessingerD.，HunterD丄，HayesR.B.，AbecasisG.R.，WichmannH.E.,MohlkeK.L.，HirschhomJ.N.(2008)Identificationoftenlociassociatedwithheighthighlightsnewbiologicalpathwaysinhumangrowth.Nat.Genet.,40，584-591。SouthamL.，Rodriguez-lopezJ.,WilkinsJ.M.，Pombo-suarezM.，SnellingS.，Gomez-reinoJ丄,CharpmanK.，GonzalezA.,LoughlinJ.(2007)AnSNPinthe5-UTRofGDF5isassociatedwithosteoarthritissusceptibilityinEuropeansandwithinvivodifferencesinallelicexpressioninarticularcartilage.Hum.Mol,Genet.,16，2226~2232。ChangS.C.,HoangB.，ThomasJ.T.，VukicevicS.，LuytenF.P.，RybaN丄，KozakC.A.，ReddiA.H,，MoosM.(1994)Cartilage-derivedmorphogeneticproteins.Newmembersofthetransforminggrowthfactor-bsuperfamilypredominantlyexpressedinlongbonesduringhumanembryonicdevelopment.J.Biol.Chem.，269，28227-28234。ChujoT.，AnhowardS.，AkedaK.，MiyamotoK.,MuehlemanC.，AttawiaM.，AnderssonG.，MasudaK.(2006)Effectsofgrowthdifferentiationfactor-5ontheintervertebraldisc—invitrobovinestudyandinvivorabbitdiscdegenerationmodelstudy-Spine.，31，2909-2917。VoightB.F.，KudaravalliS.，WenX.,PritchardJ.K.(2006)Amapofrecentpositiveselectioninthehumangenome,PLoSBioL,4，1-12。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的主要目的是提供一種分子生物學(xué)技術(shù)，即采用PCR-RFLP方法來(lái)檢測(cè)秦川?；蛐?，從而預(yù)示和鑒定秦川牛體尺大小的分子標(biāo)記方法。本發(fā)明的目的是按照以下步驟實(shí)現(xiàn)的步驟一，根據(jù)牛GDF5基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物GDFF和GDFR:GDFF:5TGTCCGATGCTGACAGAAAGG3，(如序列表中序列2所示)GDFR:5'GAGTGAGGTTAATCCCAGATACCA3，(如序列表中序列3所示)步驟二，利用該引物對(duì)牛的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到由GDFF和GDFR表示的引物擴(kuò)增的第一外顯子區(qū)和第一內(nèi)含子區(qū)的擴(kuò)增片段，該擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度為235bp;步驟三，利用限制性內(nèi)切酶MvaI消化擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物；步驟四，使用2.5%的瓊脂糖凝膠對(duì)消化后的PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳分離，檢測(cè)出GDF5基因外顯子1的586位點(diǎn)處的T/C變異位點(diǎn)；步驟五，通過(guò)T/C變異位點(diǎn)檢測(cè)堿基的突變，并根據(jù)基因多態(tài)性部位分成以下3種基因型當(dāng)牛GDF5基因外顯子1的586位點(diǎn)處的變異位點(diǎn)為C堿基時(shí)，會(huì)產(chǎn)生限制性內(nèi)切酶MvaI的酶切位點(diǎn)(CCATGG),MvaI消化PCR產(chǎn)物后會(huì)產(chǎn)生的2個(gè)片段(181bp和54bp)，將其命名為CC基因型；當(dāng)牛GDF5基因外顯子1的586位點(diǎn)處的變異位點(diǎn)為T(mén)堿基(CTTGG)時(shí)，則不存在MvaI酶切位點(diǎn)，MvaI消化PCR產(chǎn)物后只有1個(gè)片段(235bp)，將其命名為T(mén)T基因型或野生型；當(dāng)牛GDF5基因外顯子1的586位點(diǎn)處的變異位點(diǎn)為T(mén)/C雜合時(shí)，MvaI消化PCR產(chǎn)物后會(huì)產(chǎn)生3個(gè)片段(235bp、181bp和54bp)，將其命名為T(mén)C基因型。本發(fā)明分析基因多態(tài)性的方法所帶來(lái)的技術(shù)效果是1、通過(guò)檢測(cè)堿基的突變而分類(lèi)的基因型。2、其中用于分析基因多態(tài)性的部位是外顯子。3、其中用于分析基因多態(tài)性的序列片段是由GDFF和GDFR表示的引物擴(kuò)增的第一外顯子區(qū)和第一內(nèi)含子區(qū)。4、其中分析多態(tài)性的位點(diǎn)選擇已知的牛GDF5基因如下序列中第54位的T-C的堿基突變GGCGGGGTGGCTGGGGCACGGCTCAGAGGGAGGGGCATCTGCATGCATGG150AGGGGGCTTTAGAGCCCAGACACTGCACTGGGGGGAGATGGTGTGTGCTT200CTGGCCCGGGGTGGTATCTGGGATTAACCTCACTC5、秦川牛的體尺大小包括體長(zhǎng)和腰角寬。6、用于消化PCR產(chǎn)物的限制性內(nèi)切酶是MvaI。經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明，具有TT基因型個(gè)體的體長(zhǎng)和腰角寬明顯低于具有CC基因型個(gè)體的體尺大小(P<0.05)。在申請(qǐng)人所研究的2個(gè)群體中，具有TT基因型個(gè)體的體長(zhǎng)比CC基因型個(gè)體的體長(zhǎng)低5.64cm6.87cm;具有TT基因型個(gè)體的腰角寬比CC基因型個(gè)體的腰角寬低3.46cm4.00cm。本發(fā)明巧妙地采用PCR—RFLP的方法檢測(cè)秦川牛GDF5基因外顯子1中T/C變異位點(diǎn)。本發(fā)明操作簡(jiǎn)單、費(fèi)用低、精確度高，可進(jìn)行快速檢測(cè)。使用本發(fā)明的標(biāo)記基因型對(duì)秦〗11牛體尺進(jìn)行選擇時(shí)，將使決定秦711牛胴體大小最主要兩個(gè)性狀體長(zhǎng)和腰角寬分別提高6.2cm和3.7cm左右。我國(guó)現(xiàn)有150多萬(wàn)頭秦川牛及其改良牛，如果每頭牛體長(zhǎng)和腰角寬分別提高57cm和34cm，則每頭牛將會(huì)增加體積約1500cm3，秦川?？傮w增加2000多噸的牛肉，對(duì)于培育肉用秦川牛來(lái)說(shuō)無(wú)疑是一個(gè)極大的優(yōu)勢(shì)，而且可以帶來(lái)顯著的經(jīng)濟(jì)效益。如果將其推廣至其他中國(guó)良種黃牛，將為中國(guó)養(yǎng)牛業(yè)帶來(lái)廣闊的發(fā)展前景和利潤(rùn)空間。總之，該研究發(fā)現(xiàn)的標(biāo)記可以用于秦川牛生長(zhǎng)性狀的標(biāo)記輔助選擇，有著重要的生產(chǎn)意義，為培育肉牛新品種提供了新的方法。圖1是牛GDF5基因MvaI酶切位點(diǎn)的凝膠電泳分析圖，圖中，TT基因型僅表現(xiàn)235bp條帶；TC基因型，表現(xiàn)235bp、181bp和54bp條帶；CC基因型表現(xiàn)181bp和54bp條帶。54bp條帶在2.5X凝膠中沒(méi)有表現(xiàn)，但不影響整個(gè)分型。以下結(jié)合具體實(shí)驗(yàn)和發(fā)明人給出的具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作更詳細(xì)的描述。具體實(shí)施例方式一、實(shí)驗(yàn)材料1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和性狀測(cè)定本實(shí)驗(yàn)選取陜西省秦川肉牛良種繁育中心、陜西渭南山川集團(tuán)秦川牛良種養(yǎng)殖場(chǎng)和陜西秦寶牧業(yè)有限公司秦川牛養(yǎng)殖場(chǎng)提供的成年秦川牛393頭和秦川改良牛240頭，共計(jì)633頭個(gè)體實(shí)驗(yàn)牛。實(shí)驗(yàn)牛均由頸靜脈采血10mL，加ACD搖勻抗凝(血液:ACD-6:1)，-20°C凍存，并測(cè)定實(shí)驗(yàn)牛體長(zhǎng)和腰角寬指標(biāo)。牛體長(zhǎng)指牛肩端前緣到臀端后緣的直線距離。牛腰角寬指牛兩腰角外緣的距離。2.藥品和酶三羥甲基氨基甲垸(Tris)，Tris飽和酚和十二烷基磺酸鈉(SDS)均為北京鼎國(guó)生物技術(shù)發(fā)展中心產(chǎn)品；蛋白酶K(ProteinaseK)、10xPCRbuffer、dNTPs、100bpmarker和TaqDNA聚合酶為大連寶生物公司產(chǎn)品；瓊脂糖購(gòu)自北京普博生物技術(shù)有限公司；內(nèi)切酶MvaI為美國(guó)MBI公司產(chǎn)品。3.主要儀器GradientCyclerPTC-200基因擴(kuò)增儀、TFM-40紫外可見(jiàn)光成像系統(tǒng)、SZX-ZP超凈工作臺(tái)、DYY-m型電泳儀及配套電泳槽、Eppendorf5810R臺(tái)式高速室溫離心機(jī)(德國(guó))、BECKMAN冷凍離心機(jī)、AB204-E型電子天平、MiLLi-Q超純水儀和、日本松下微波爐及Eppendorf移液器等。二、實(shí)驗(yàn)方法1、緩沖液與常規(guī)試劑的配制(1)10%SDS:10gSDS溶入90mL水中，加熱至60。C助溶，加幾滴濃HCl調(diào)節(jié)pH至7.2，定容至100mL。(2)1mol/LTris'HCl(pH8.0):12.114gTris溶入80mL水中，用濃HCl調(diào)pH至8.0，加水定容至100mL，高壓滅菌。(3)0.5mol/LEDTA(pH8,0):18.61gNa2EDTA'2H20溶入80mL水中，加NaOH2g左右調(diào)pH至8.0，定容至100mL，高壓滅菌。(4)2mol/L的NaCl:11.688g溶于水，定容至100mL，高壓滅菌。(5)DNA提取液(100mL):1mol/LTris'Cl(pH8.0)lmL，0.5mol/LEDTA(pH8.0)20mL，2mol/L的NaCl5mL，定容至100mL。(6)20mg/mL蛋白酶K:20mg蛋白酶K溶入1mL滅菌超純水中，按200nL分裝儲(chǔ)存于-20'C。(7)3mol/L乙酸鈉40.81g三水乙酸鈉(NaAc'3H20)溶于70mL水中用冰乙酸調(diào)pH至5.2，加水定容至100mL，高壓滅菌。(8)50xTAE(忙存液)242gTris堿，57.1mL冰醋酸，100mL0.5mol/LEDTA(pH=8.0),加雙蒸水定容至1L。工作液為"TAE。(9)抗凝劑ACD:檸檬酸0.48g、檸檬酸鈉1.32g、葡萄糖1.47g，定容100mL水中，高壓滅菌。每6mL的血液中加入lmL的ACD液。(10)PBS:在800mL蒸餾水中溶解8gNaCl、0.2gKCl、1.44gNa2HP04和0.24gKH2PO4，用HCl調(diào)節(jié)pH值到7.4，加水定容到1000mL，高壓滅菌20min,室溫保存。2、引物的設(shè)計(jì)與合成以下引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成GDFF:5'TGTCCGATGCTGACAGAAAGG3，GDFR:5，GAGTGAGGTTAATCCCAGATACCA3'3、?；蚪MDNA的小量提取(1)冷凍血樣室溫解凍，吸取lmL血液于2mL滅菌離心管中，加入等體積的磷酸緩沖液(PBS)混勻，溫和搖動(dòng)10min，4°C，12000r/min離心10min，棄上清液，重復(fù)上述步驟至上清液透明、沉淀呈透明色。(2)離心管中加入DNA抽提緩沖液lmL，輕輕吹打使血細(xì)胞沉淀脫離離心管壁。(3)加蛋白酶K至終濃度為60pg/mL，混勻，55X:水浴中消化過(guò)夜(12-16h)至絮狀沉淀不見(jiàn)，溶液澄清。(4)反應(yīng)液冷卻至室溫，加入等體積Tris飽和酚，溫和搖動(dòng)10min，使其充分混勻，4°C，12000r/min離心10min，將上層水相轉(zhuǎn)入另一滅菌離心管，重復(fù)上述步驟l次。(5)加入等體積Tris飽和酚氯仿異戊醇(25:24:1)，溫和搖動(dòng)10min，使其充分混勻，4°C,12000r/min離心10min，將上層水相轉(zhuǎn)入另一滅菌離心管。(6)加入等體積氯仿，溫和搖動(dòng)10min，使其充分混勻，4°C，12000r/min離心10min，將上層水相轉(zhuǎn)入另一滅菌離心管。(7)加入2倍體積預(yù)冷無(wú)水乙醇(-20。C)，在-20。C放置30min后，輕輕顛倒試管使DNA呈絮狀沉淀。4°C，12000r/min離心8min，棄去乙醇。(8)加入預(yù)冷的70%乙醇lmL，溫和搖動(dòng)10min，4°C，12000r/min離心5min漂洗DNA沉淀，4°C，12000r/min離心10min，棄上清液，重復(fù)該步驟2次。室溫下使乙醇揮發(fā)干凈。(9)加入200nLTE溶解DNA，4。C保存直至DNA完全溶解。4、PCR反應(yīng)(1)以牛DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，15pL反應(yīng)體系中包含以下溶液或試劑10xPCRbuffer1.5dNTPMixture(各2.5mM)0.8pL引物1(20pM)0.5nL引物2(20pM)0.5nLTaqDNA聚合酶(5U爾L)0.15基因組DNA(100ng/pL)1.0pL加滅菌蒸餾水至15(2)將上述溶液混合并按以下條件進(jìn)行PCR反應(yīng)。95°C，預(yù)變性5min;94°C，變性30sec，60°C，復(fù)性30sec，72。C延伸30sec，32個(gè)循環(huán)；72。C延伸10min。(3)反應(yīng)結(jié)束后，取PCR反應(yīng)液(5nL)進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)PCR產(chǎn)物。5、PCR-RFLP反應(yīng)體系及條件酶切體系如下Mval內(nèi)切酶(lOU/pL)0.4pL10xbuffer0.6PCR產(chǎn)物4.0pL加滅菌蒸餾水至10)LiL將上述反應(yīng)混合液混勻，于37"C培養(yǎng)箱中消化810小時(shí)。6、瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)將消化之后的全部反應(yīng)液進(jìn)行2.5%瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)PCR產(chǎn)物酶切片段多態(tài)性。7.統(tǒng)計(jì)模型建立根據(jù)群體特點(diǎn)，構(gòu)建線性模型如下Y=//+G;+S/+Bp*+Ma,+s碑，Y^—性狀觀察值，//一群體平均值，G,—基因型固定效應(yīng)，S,—性別固定效應(yīng)，BpA—種場(chǎng)群固定效應(yīng)，Ma,—測(cè)量年齡效應(yīng)，e^—隨機(jī)誤差。使用統(tǒng)計(jì)軟件SAS中的GLM程序，使用最小二乘方法檢驗(yàn)基因型與性狀間的相關(guān)程度。以下是發(fā)明人給出的實(shí)施例。實(shí)施實(shí)例1:牛GDF5基因多態(tài)性與秦川牛群體體尺性狀的相關(guān)利用本發(fā)明的引物(GDFF和GDFR)對(duì)秦川牛群體393個(gè)個(gè)體的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并利用MvaI限制性內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物，然后進(jìn)行2.5%瓊脂糖凝膠電泳分析。在秦川牛群體中共檢測(cè)到3種基因型，當(dāng)牛GDF5基因外顯子1中變異位點(diǎn)為C堿基時(shí)，會(huì)產(chǎn)生限制性內(nèi)切酶MvaI的酶切位點(diǎn)(CCATGG)，MvaI消化PCR產(chǎn)物后會(huì)產(chǎn)生2個(gè)片段(181bp和54bp)，將其命名為CC基因型；該位點(diǎn)為T(mén)堿基(CTTGG)時(shí)，則不存在MvaI酶切位點(diǎn)，MvaI消化PCR產(chǎn)物后只有l(wèi)個(gè)片段(235bp)，將其命名為T(mén)T基因型(野生型)；該位點(diǎn)為T(mén)/C雜合時(shí)，MvaI消化PCR產(chǎn)物后會(huì)產(chǎn)生3個(gè)片段(235bp、181bp和54bp)，將其命名為T(mén)C基因型(附圖)。分析多態(tài)性的位點(diǎn)選擇己知的牛GDF5基因如下序列中第54位的T-C的堿基突變GGCGGGGTGGCTGGGGCACGGCTCAGAGGGAGGGGCATCTGCATGCATGG150CACTGCACTGGGGGGAGATGGTGTGTGCTT200CTGGCCCGGGGTGGTATCTGGGATTAACCTCACTC235對(duì)GDF5基因T/C變異位點(diǎn)產(chǎn)生的3種基因型與秦川牛群體393個(gè)個(gè)體的體長(zhǎng)和腰角寬進(jìn)行分析，結(jié)果表明基因型對(duì)秦川牛群體的體長(zhǎng)和腰角寬有顯著影響(P<0.05)，TT基因型個(gè)體的體長(zhǎng)和腰角寬顯著低于TC和CC基因型個(gè)體的體長(zhǎng)和腰角寬(P<0.05)，具有TT基因型個(gè)體的的體長(zhǎng)和腰角寬比CC基因型個(gè)體的體長(zhǎng)和腰角寬分別低6.87cm和4.00cm(表1)。表1GDF5基因不同基因型對(duì)秦川牛群體體長(zhǎng)和腰角寬性狀的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>均值比較時(shí)同一列無(wú)相同字母者差異顯著(abP<0.05)a=(TT—CC)/2;d=TC—(TT+CC)/2;D:顯性度，D=d/a實(shí)施實(shí)例2:牛GDF5基因多態(tài)性與秦川牛改良群體體尺性狀的相關(guān)利用本發(fā)明的引物(GDFF和GDFR)對(duì)秦川牛改良群體240個(gè)個(gè)體的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并利用MvaI限制性內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物，然后進(jìn)行2.5%瓊脂糖凝膠電泳分析。在秦川牛改良群體中共檢測(cè)到3種基因型，當(dāng)牛GDF5基因外顯子1中變異位點(diǎn)為C堿基時(shí)，會(huì)產(chǎn)生限制性內(nèi)切酶MvaI的酶切位點(diǎn)(CCATGG)，MvaI消化PCR產(chǎn)物后會(huì)產(chǎn)生2個(gè)片段(181bp和54bp),將其命名為CC基因型；該位點(diǎn)為T(mén)堿基時(shí)(CTTGG)，則不存在MvaI酶切位點(diǎn)，MvaI消化PCR產(chǎn)物后只有l(wèi)個(gè)片段(235bp)，將其命名為T(mén)T基因型(野生型)；該位點(diǎn)為T(mén)/C雜合時(shí)，MvaI消化PCR產(chǎn)物后會(huì)產(chǎn)生3個(gè)片段(235bp、181bp和54bp),將其命名為T(mén)C基因型(附圖)對(duì)GDF5基因T/C變異位點(diǎn)產(chǎn)生的3種基因型與秦川牛改良群體240個(gè)個(gè)體的體長(zhǎng)和腰角寬進(jìn)行分析，結(jié)果表明基因型對(duì)秦川牛改良群體的體長(zhǎng)和腰角寬有顯著影響(P<0.05)，TT基因型個(gè)體的體長(zhǎng)和腰角寬顯著低于TC和CC基因型個(gè)體的體長(zhǎng)和腰角寬(P<0.05),具有TT基因型個(gè)體的體長(zhǎng)和腰角寬比CC基因型個(gè)體的體長(zhǎng)和腰角寬分別低5.64cm和3.46cm(表2)。表2GDF5基因不同基因型對(duì)秦川牛改良群體體長(zhǎng)和腰角寬性狀的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>核苷酸序列表<110>西北農(nóng)林科技大學(xué)<120>—種用GDF5基因預(yù)示和鑒定秦川牛體尺大小的分子標(biāo)記方法<140><141><160>3<210>1<211>235<212>DNA<213>家牛屬普通牛(BostaurusdomesticusGmelin)<220><221〉misc一feature<222>(54)<223>N=T或C<400>1TGTCCGATGCTGACAGAAAGGGAGGCAACAGCAGCGTGAAGTTGGAGGCT50GGCNTGGCCAACACCATCACCAGCTTTATTGACAAAGGGCAAGGTGAGGG100GGCGGGGTGGCTGGGGCACGGCTCAGAGGGAGGGGCATCTGCATGCATGG150AGGGGGCTTTAGAGCCCAGACACTGCACTGGGGGGAGATGGTGTGTGCTT200CTGGCCCGGGGTGGTATCTGGGATTAACCTCACTC235<210>2<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223><400>2TGTCCGATGCTGACAGAAAGG21<210>3<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223><400>3GAGTGAGGTTAATCCCAGATACCA2權(quán)利要求1、一種用GDF5基因預(yù)示和鑒定秦川牛體尺大小的分子標(biāo)記方法，其特征在于，包括下列步驟步驟一，根據(jù)牛GDF5基因(GenBank登錄號(hào)NC_007311)序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物GDFF和GDFRGDFF5’TGTCCGATGCTGACAGAAAGG3’(如序列表中序列2所示)GDFR5’GAGTGAGGTTAATCCCAGATACCA3’(如序列表中序列3所示)步驟二，利用該對(duì)引物GDFF和GDFR對(duì)牛的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到由GDFF和GDFR表示的引物擴(kuò)增的第一外顯子區(qū)和第一內(nèi)含子區(qū)的擴(kuò)增片段，該擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度為235bp；步驟三，利用限制性內(nèi)切酶MvaI消化擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物；步驟四，用濃度為2.5％的瓊脂糖凝膠對(duì)消化后的PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳分離，檢測(cè)出GDF5基因外顯子1的586位點(diǎn)處的T/C變異位點(diǎn)；步驟五，通過(guò)T/C變異位點(diǎn)檢測(cè)堿基的突變，并根據(jù)基因多態(tài)性部位分成下面3種基因型當(dāng)T/C變異位點(diǎn)為C堿基時(shí)，會(huì)產(chǎn)生限制性內(nèi)切酶MvaI的酶切位點(diǎn)即CC^TGG，MvaI消化PCR產(chǎn)物后會(huì)產(chǎn)生的2個(gè)片段即181bp和54bp，將其命名為CC基因型；當(dāng)T/C變異位點(diǎn)為T(mén)堿基即CTTGG時(shí)，則不存在MvaI酶切位點(diǎn)，MvaI消化PCR產(chǎn)物后只有1個(gè)片段即235bp，將其命名為T(mén)T基因型或野生型；當(dāng)T/C變異位點(diǎn)為T(mén)/C雜合時(shí)，MvaI消化PCR產(chǎn)物后會(huì)產(chǎn)生3個(gè)片段即235bp、181bp和54bp，將其命名為T(mén)C基因型。2、如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的GDF5基因外顯子的序列片段是由GDFF和GDFR表示的引物擴(kuò)增的第一外顯子區(qū)和第一內(nèi)含子區(qū)。3、如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的基因多態(tài)性部位的位點(diǎn)為己知的牛GDF5基因如下序列中第54位的T-C的堿基突變TGTCCGATGCTGACAGAAAGGGAGGCAACAGCAGCGTGAAGTTGGAGGCT50AGGGGGCTTTAGAGCCCAGACACTGCACTGGGGGGAGATGGTGTGTGCTT200CTGGCCCGGGGTGGTATCTGGGATTAACCTCACTC。4、如權(quán)利要求1-3所述的方法，其特征在于，其中秦川牛的體尺大小包括體長(zhǎng)和腰角寬。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了一種用GDF5基因預(yù)示和鑒定秦川牛體尺大小的分子標(biāo)記方法，該方法根據(jù)牛GDF5基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物；利用該引物對(duì)牛的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增；并利用限制性內(nèi)切酶MvaI消化擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物；然后使用2.5％的瓊脂糖凝膠對(duì)消化后的PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳分離，檢測(cè)出GDF5基因外顯子1的586位點(diǎn)處的T/C變異位點(diǎn)；分別對(duì)牛GDF5基因外顯子1中變異位點(diǎn)為C堿基、T堿基及T/C雜合堿基進(jìn)行命名。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，具有TT基因型個(gè)體的體長(zhǎng)比CC基因型個(gè)體的體長(zhǎng)低5.64～6.87cm；具有TT基因型個(gè)體的腰角寬比CC基因型個(gè)體的腰角寬低3.46～4.00cm。該方法操作簡(jiǎn)單、費(fèi)用低、精確度高，可進(jìn)行快速檢測(cè)。文檔編號(hào)C12Q1/68GK101525662SQ20091002182公開(kāi)日2009年9月9日申請(qǐng)日期2009年4月2日優(yōu)先權(quán)日2009年4月2日發(fā)明者劉永峰,昝林森,楚秋霞申請(qǐng)人:西北農(nóng)林科技大學(xué)