一種硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體基因AtNRT1.5及其編碼蛋白與應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于植物分子生物學(xué)領(lǐng)域。具體為擬南芥硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體基因AtNRT1.5的功能驗(yàn)證。本發(fā)明利用AtNRT1.5基因T-DNA插入突變體CS870797的純合株系研究該基因在植物氮素高效利用方面的功能。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，突變體在高氮(MS)培養(yǎng)基上生長受抑，根系顯著短于野生型；在低氮條件下，兩者根系生長沒有差異；但突變體干重低于野生型。含氮量的測定結(jié)果表明，突變體根系含氮量高于野生型，而地上部含氮量則極顯著低于野生型，在高氮(MS)培養(yǎng)基上差異更為明顯。說明ATNRT1.5基因突變后，根系吸氮能力并未受到明顯影響，而氮素由根系向地上部轉(zhuǎn)運(yùn)的能力顯著降低。預(yù)計(jì)該基因的過量表達(dá)可提高植物的氮素利用能力并在植物氮素營養(yǎng)高效分子育種中具有較大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。
【專利說明】—種硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體基因AtNRT1.5及其編碼蛋白與應(yīng)用
所屬【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于植物分子生物學(xué)與轉(zhuǎn)基因相關(guān)【技術(shù)領(lǐng)域】。具體為擬南芥硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體(Nitrate transporters, NRTs)家族關(guān)鍵基因ATNRT1.5在低氮脅迫下的反應(yīng)和作用機(jī)理，以及該基因在營養(yǎng)高效植物新品種培育中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]氮是植物必需的營養(yǎng)元素之一，是植物體內(nèi)蛋白質(zhì)、核酸、葉綠素、酶等的組成成分。氮素供應(yīng)不足會(huì)影響植物的生長發(fā)育，限制農(nóng)作物的產(chǎn)量；而氮肥施用過量則使氮素利用率下降，不僅造成資源浪費(fèi)，而且引起環(huán)境污染。通過挖掘植物自身遺傳潛能，克隆耐低氮和氮素營養(yǎng)高效的基因，并利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育氮素利用效率提高的新品種是解決這一問題的重要途徑之一。
[0003]擬南芥(Arabidopsis thaliana)屬十字花科、蕓薹屬植物，它不僅是第一個(gè)完成基因組序列測定的模式植物(Athanasios Theologis.et al., Nature, 2000,408:791-826)，而且具有植株小，生長周期短，種子數(shù)量多，基因組小且易于進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，自花授粉而又易于雜交等優(yōu)點(diǎn)。因此在植物分子生物學(xué)及轉(zhuǎn)基因相關(guān)【技術(shù)領(lǐng)域】中，擬南芥被作為模式植物廣泛加以研究和應(yīng)用。
[0004]硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體是一類專司硝態(tài)氮吸收、運(yùn)輸?shù)霓D(zhuǎn)運(yùn)蛋白。研究發(fā)現(xiàn)擬南芥中存在一個(gè)由53個(gè)成員組成的NRTl基因家族。已有的研究證明ATNRT1.5為低親和性硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體基因，參與硝酸鹽從根部到 地上部的轉(zhuǎn)運(yùn)(Shan-Hua Lin et al., Plant Cell, 2008,20:2514-2528)。但至今還沒有該基因在不同氮素條件下調(diào)控植株生長發(fā)育的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明提供一個(gè)擬南芥低親和性硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體基因，以及該基因?qū)Φ偷{迫的反應(yīng)和生理機(jī)制。
[0006]所提供的低親和性硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體基因?yàn)锳TNRT1.5 (AT1G32450)。
[0007]上述基因具有SEQ ID N0.1的堿基序列。
[0008]上述基因編碼的蛋白質(zhì)具有SEQ ID N0.2的氣基酸序列。
[0009]ATNRT1.5基因的T-DNA插入突變體CS870797是從ABRC(Arabidopsis BiologicalResource Center)定購獲得。通過PCR鑒定獲得純合插入突變體，通過RT-PCR在mRNA水平上鑒定基因的敲除情況。
[0010]通過上述鑒定，獲得ATNRT1.5基因T-DNA插入突變體CS870797的純合株系，并以之為材料進(jìn)行低氮處理，觀察表型并拍照。然后對低氮處理后的擬南芥幼苗進(jìn)行耐低氮相關(guān)指標(biāo)的測定，包括:主根長測量，地上部干重測量，根部和地上部含氮量統(tǒng)計(jì)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0011]圖1顯示野生型和突變體PCR和RT-PCR檢測的電泳結(jié)果，結(jié)果表明所獲ATNRT1.5基因T-DNA插入突變體株系CS870797為純合插入株系，其轉(zhuǎn)錄本被敲除。
[0012]圖2顯示野生型和突變體在不同氮素濃度培養(yǎng)基上處理7天的表型照片，結(jié)果表明在正常氮素濃度(MS)培養(yǎng)基上，突變體生長比野生型弱，表現(xiàn)高氮利用缺陷的表型，尤其是根長顯著短于野生型；而在低氮(含0.2mM NO3O條件下，突變體生長與野生型沒有差異，二者根長一致。
[0013]圖3顯示野生型和突變體在不同氮素濃度培養(yǎng)基上處理7天后的根系長度的測量結(jié)果，結(jié)果表明在MS培養(yǎng)基上突變體根長顯著低于野生型(P = 0.035);而在低氮(含
0.2mM NO3-)培養(yǎng)基上，突變體根長與野生型沒有差異(P = 0.8922)。
[0014]圖4顯示野生型和突變體在不同氮素濃度培養(yǎng)基上處理7天后地上部干重的差異，結(jié)果表明在MS培養(yǎng)基上突變體地上部干重顯著低于野生型，而在低氮(含0.2mM NO3O培養(yǎng)基上突變體地上部干重極顯著地低于野生型(P = 0.031)。
[0015]圖5顯示不同氮素處理后野生型和突變體根部和地上部含氮量差異，結(jié)果表明在無外源氮培養(yǎng)條件下突變體根部含氮量顯著高于野生型(P = 0.02)，而地上部含氮量則極顯著低于野生型(P = 0.0001);在IOmM硝酸鹽培養(yǎng)條件下兩只根部含氮量無差異，而地上部含氮量極顯著低于野生型(P = 0.0001)，。
【具體實(shí)施方式】
[0016]下面結(jié)合實(shí)驗(yàn)方法和數(shù)據(jù)進(jìn)一步闡述本發(fā)明。
[0017]1.擬南芥幼苗培養(yǎng):
[0018]野生型和突變體種子分別用0.5%次氯酸鈉溶液浸泡消毒lOmin，消毒后的種子放入4°C冰箱春化2天后點(diǎn)布于 含I %瓊脂的MS (Murashige and Skoog)固體培養(yǎng)基上,置于22°C光照培養(yǎng)箱中萌發(fā)生長。
[0019]2.純合突變體的鑒定
[0020]DNA提取:所用實(shí)驗(yàn)藥品均購自中科瑞泰生物工程有限公司。取約0.5g擬南芥新鮮葉片，研磨成糊狀，加 400 μ I SDS 提取液(0.5% SDS(ff/V) ；200mMTris-Hcl, PH = 8.0 ；250mM NaCl ；25mM EDTA) ; 12，OOOr/min,離心3min ;取上清,加等體積異丙醇輕輕搖晃,靜置30min ；13, OOOr/min,離心5min ;棄上清,用lml95%乙醇沖洗1-2次后，自然風(fēng)干,加去離子水30 μ 1，4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0021]RNA提取:所用實(shí)驗(yàn)藥品均購自中科瑞泰生物工程有限公司。所用研缽、槍頭、離心管等一應(yīng)物品事先用I % DEPC水浸泡過夜后高溫高壓滅菌備用。取新鮮幼苗約Ig左右，于液氮中研磨成粉狀，加Iml TRIZOL提取液混勻，靜置IOmin ;4°C下12，OOOr/min離心IOmin ;取上清加300 μ I氯仿混勻，靜置IOmin后4°C下12, OOOr/min離心15min,樣品分為3層，RNA位于上層水相中；取500 μ I水相轉(zhuǎn)移到新離心管中，加等體積異丙醇沉淀 10-20min ；12, OOOr/min 離心 IOmin,棄上清；用 75% 酒精洗漆 1-2 次,7, OOOr/min 離心2min,晾干Imin左右，加60 μ I無RNase水，輕輕震蕩使RNA溶解，_70°C冰箱保存?zhèn)溆谩?br> [0022]RT-PCR:所用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(#kl621)購自 Fermentas。First strand cDNAsynthesis:管中加入 RNAl μ I, oligo (dT) 18primerl μ I, RNase-free water I μ 1,65 °C處理 5min 后迅速冰浴冷卻；然后再加 5XReaction buffer4 μ I, RibolockTMRNaseinhibitor(20u/μ I)I μ I,IOmM dNTP Mix2μ I, RevertAidTM H Minus M-MuLV ReverseTranscriptase (200u/μ I) I μ 1，42°C反應(yīng) 60min ;70°C終止反應(yīng) 5min，產(chǎn)物于 _20°C冰箱保
存?zhèn)溆谩?br> [0023]PCR檢測:所用實(shí)驗(yàn)藥品均購自中科瑞泰生物工程有限公司，引物由上海生工生物工程有限公司合成。我們設(shè)計(jì)了 2對引物，I對用于T-DNA插入檢測(LPl:5 ' -GGGTTTTCTTTTTGGTTTGATG-3 '，RPl:5 ' -TATCTCGGTGTTCCAACAAGG-3 ')并結(jié)合T-DNA 左邊界通用引物 LBl:5/ -AACGTCCGCAATGTGTTATTAAGTTGTC-3'，通過 PCR 鑒定獲得純合插入突變體。另外I對引物用于RT-PCR檢測(LP2:5/ -CGTTAGCAAATGGACAGGGAC-3'；RP2:5 ' -CCTCTTCACT CTCGGTGTCATAGT-3 ' )。PCR 反應(yīng)體系如下:10Xbuffer2 μ 1，dNTP0.8 μ I，Primer LP/RP 各 I μ I，DNAl μ I，dH2014 μ I，Taq 酶 0.2 μ I。PCR 程序如下:94°C，3min ； (94°C，45sec ；58°C，45sec ；72°C, 60sec) X 30cycles ；72°C, 5min。產(chǎn)物采用 I %(W/V)瓊脂糖凝膠電泳分離，恒壓100V電泳20min，用BIO-RAD凝膠成像掃描儀拍照記錄檢測結(jié)果。
[0024]PCR和RT-PCR檢測的結(jié)果表明我們鑒定到AtNRT 1.5基因T-DNA插入突變體CS870797的純合插入株系，其轉(zhuǎn)錄本被敲除。
[0025]3.不同濃度氮素處理:
[0026]在含1%瓊脂的固體MS培養(yǎng)基上生長5天的幼苗，分別轉(zhuǎn)移到含有0mM、0.2mM或IOmMNCV的培養(yǎng)基上，野生型和突變體各轉(zhuǎn)5-6株；除不同氮素含量外，培養(yǎng)基中還包括 ImM KH2P04,ImM MgS04,0.25mM CaC12,0.1mMNa-Fe-ethylenediamine tetraaceticacid(EDTA), ImM KCl,30mM H3BO3, 5mMMnS04, ImM ZnSO4, ImM CuSO4,0.7mM Na2MoO4,用 NaOH調(diào)PH值至5.7-5.75。22°C培養(yǎng)14天后拍照，統(tǒng)計(jì)根長、地上部干重和含氮量等指標(biāo)。
[0027]主根長測量結(jié)果表明，在MS培養(yǎng)基上生長的突變體根長極顯著低于野生型(P =
0.035);而在含有0.2mM N03_的培養(yǎng)基上，突變體根長與野生型沒有差異(P = 0.8922)。說明AtNRTl.5作為低親和性的硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體，功能缺失后限制了高氮水平下的植株生長，對根系的影響更甚。這一現(xiàn)象及其機(jī)理之前未見報(bào)道。
[0028]地上部干重測量結(jié)果表明，突變體地上部干重顯著低于野生型，在低氮條件下表現(xiàn)更為明顯(P = 0.031)，說明ATNRT1.5基因敲除后，突變體植株從根系向地上部分轉(zhuǎn)運(yùn)氮素的能力減弱，使得地上部的生長受到抑制。
[0029]根部和地上部含氮量的測定結(jié)果也表明，在不同氮素濃度下，突變體根系含氮量高于野生型，而地上部含氮量則極顯著低于野生型(P = 0.0001)，在高氮(MS)培養(yǎng)基上差異更為明顯。說明ATNRT1.5基因敲除后，對根系吸氮能力影響不大，而更主要地是影響了氮素向?qū)Φ厣喜康霓D(zhuǎn)運(yùn)。
【權(quán)利要求】
1.擬南芥硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體基因AtNRTl.5，其堿基序列如SEQ ID N0.1。
2.權(quán)利要求1所述的硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體基因AtNRTl.5編碼的蛋白質(zhì)，其氨基酸序列如SEQID N0.2。
3.權(quán)利要求1所述的硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體基因AtNRTl.5敲除突變體的氮素處理方法及條件。
4.權(quán)利要求1所述的硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體基因AtNRTl.5敲除突變體在不同氮素處理?xiàng)l件下所獲得的表型及其相關(guān)試驗(yàn)數(shù)據(jù)。
5.權(quán)利要求1所述的硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體基因AtNRTl.5及其同源序列在制備氮素營養(yǎng)高效轉(zhuǎn)基因植物中 的應(yīng)用。
【文檔編號】C07K14/415GK103436535SQ201310125026
【公開日】2013年12月11日 申請日期:2013年4月3日 優(yōu)先權(quán)日:2013年4月3日
【發(fā)明者】徐江, 徐小棟, 東方陽, 魯黎明, 王西瑤, 張少斌, 麻艷超, 遲志海, 洪雪, 付金東, 趙明, 丁在松 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所