專利名稱：：一種降解黃曲霉毒素的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種降解黃曲霉毒素的方法。
背景技術(shù)：
：黃曲霉毒素(Aflatoxin,AF)，是對(duì)人類和動(dòng)物危害大的真菌毒素之一。大量資料證實(shí)，黃曲霉毒素對(duì)人及動(dòng)物的肝臟組織有很強(qiáng)的毒害作用，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致肝癌，甚至死亡。黃曲霉毒素污染食品比較嚴(yán)重，尤其是對(duì)花生、核桃、玉米及其制品的污染最為嚴(yán)重和普遍。此外，在大豆、稻谷、通心粉、牛奶及其制品、食用油等食品中也經(jīng)常發(fā)現(xiàn)黃曲霉毒素。黃曲霉毒素不僅降低農(nóng)產(chǎn)品和飼料品質(zhì)，使經(jīng)濟(jì)遭受巨大損失，而且還可以通過污染或殘留黃曲霉毒素的肉、乳等動(dòng)物源性食品進(jìn)入人體，給人的健康造成威脅。其中毒性最強(qiáng)的是黃曲霉毒素Bi(CnHu06，分子量312),為氰化鉀的10倍，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式見式I(高橋治男.花生曲霉毒素污染途徑與防除.花生科技.2000.1:37)。目前，物理化學(xué)去毒法對(duì)食品的色、香、味及營(yíng)養(yǎng)成分如維生素、蛋白質(zhì)等均有不同程度破壞和不良影響。生物化學(xué)去毒法成本較高，很難在工業(yè)化水平制備高活性黃曲霉毒素解毒活性物質(zhì)。本發(fā)明的目的是提供一種降解黃曲霉毒素的方法。本發(fā)明所提供的降解黃曲霉毒素的方法，是用電子束輻照含有黃曲霉毒素的樣品得到黃曲霉毒素含量降低的樣品。所述方法中，所述輻照劑量為2-10kGy，優(yōu)選為6-10kGy，最優(yōu)選為8-lOkGy。所述黃曲霉毒素為黃曲霉毒素Bp所述含有黃曲霉毒素的樣品為含有黃曲霉毒素的農(nóng)產(chǎn)品或農(nóng)產(chǎn)品加工得到的制
發(fā)明內(nèi)容3品，如食品、飼料等成品。本發(fā)明的方法用電子束直接對(duì)農(nóng)產(chǎn)品，食品，飼料等成品進(jìn)行輻照，方法操作簡(jiǎn)單，效果明顯，可使黃曲霉毒素Bi降解率達(dá)到71.51%。圖1為黃曲霉毒素B標(biāo)準(zhǔn)品的選擇離子色譜圖圖2為黃曲霉毒素Bi的標(biāo)準(zhǔn)曲線具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)例對(duì)本發(fā)明做詳細(xì)說明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例用的試劑和儀器1)所用試劑甲醇(色譜純Fisher);甲酸(分析純)；正己烷(色譜純，天津市大茂化學(xué)試劑廠)；氯化鈉；超純水。2)所用儀器Agilentll00液相系統(tǒng)(美國(guó)Agilent公司)；API3000三級(jí)四極桿質(zhì)譜系統(tǒng)(美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng))；FW100高速萬能粉碎機(jī)(天津市泰斯特儀器有限公司)；LD4-2低速離心機(jī)(北京醫(yī)用離心機(jī)廠)；固相萃取裝置(美國(guó)Supelco公司)；OasisHLB固相萃取柱(3cc/60mg，Waters公司)。實(shí)施例l、降低染菌花生中黃曲霉毒素B,的方法1、染菌花生中黃曲霉毒素B,檢測(cè)方法的確定現(xiàn)已報(bào)道的對(duì)于黃曲霉毒素B,的檢測(cè)方法多為高效液相色譜-熒光檢測(cè)器檢測(cè)方法，有諸多干擾因素，且衍生易造成實(shí)驗(yàn)誤差。本實(shí)驗(yàn)用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法(即HPLC-MS/MS檢測(cè))測(cè)定黃曲霉毒素B1，并進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證該方法的有效性。1)定性定量測(cè)定儀器和條件的選擇本實(shí)驗(yàn)選擇色譜(保留時(shí)間定性)及質(zhì)譜(待測(cè)物質(zhì)特征離子定性)雙重檢測(cè)(即HPLC-MS/MS檢測(cè))，可完全排除干擾，定性結(jié)果準(zhǔn)確可靠。經(jīng)過色譜條件的優(yōu)化，選用保留時(shí)間為3.30min(如圖1所示。在質(zhì)譜檢測(cè)時(shí)，采用ESI正離子源，選擇穩(wěn)定性較好和豐度大的離子(313.0/241.1、269.1)作為檢測(cè)例子，使用MRM掃描方式，外標(biāo)法定量。2)流動(dòng)相的選擇在液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)中，流動(dòng)相的選擇除了考慮色譜系統(tǒng)分離效果外，必須關(guān)注分離個(gè)組分進(jìn)入質(zhì)譜千離子化的效率，以便獲得最佳的分辨率和最高的靈敏度。由于大多數(shù)真菌毒素易溶于甲醇或乙腈，本實(shí)驗(yàn)分別選擇甲醇和乙腈作為流動(dòng)相。實(shí)驗(yàn)證明，選擇乙腈作流動(dòng)相時(shí)，色譜系統(tǒng)分離效果比甲醇好，但是其離子化程度受到明顯抑制，離子豐度下降，導(dǎo)致靈敏度下降，而甲醇的離子化程度高于乙腈，且離子豐度也較高，本實(shí)驗(yàn)采用甲醇作為流動(dòng)相。3)HPLC-MS/MS檢測(cè)色譜和質(zhì)譜條件如下所述質(zhì)譜條件的選擇本實(shí)驗(yàn)為獲得高靈敏度的檢測(cè)，分別采用ESI+和ESI-兩種不同的電離方式對(duì)黃曲霉毒素B!進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)ESI+條件下，黃曲霉毒素BJ勺離子化效率明顯高于ESI-條件，因此采用ESI+電離方式。對(duì)AFB,在ESI+電離方式下進(jìn)行全離子掃描，獲得母離子(M+H)+為313.0，并確定其二級(jí)離子，豐度最高的碎片離子為241.1、269.1。因此本實(shí)驗(yàn)選擇ESI源，正離子反應(yīng)檢測(cè)模式。前級(jí)離子m/z=313.0，二級(jí)離子m/z二241.1、269.1。具體色譜和質(zhì)譜條件如下所述①色譜條件Agilentll00液相系統(tǒng)，G1312A二元泵系統(tǒng)，G1367A型自動(dòng)進(jìn)樣器。色譜柱AgelaTechnologiesInc.VenusilASB-Cl8，柱內(nèi)徑x柱長(zhǎng)2.1xl50mm，填料直徑5pm。流速200^1/min;流動(dòng)相甲醇水(0.1%甲酸)(此處是體積百分含量為0.1%的甲酸溶液)=7:3;進(jìn)樣體積50|ll。②質(zhì)譜條件API3000三級(jí)四極桿質(zhì)譜系統(tǒng)；掃描方式多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)，正離子分析模式；離子源TurboSpray離子源；前級(jí)離子313.0;二級(jí)離子241.1、269.1。質(zhì)譜參數(shù)設(shè)置霧化氣(NebulizerGas，NEB):氮?dú)猓?0ml/min;窗簾氣(CurtainGas，CUR):氮?dú)猓?2ml/min;電離電壓(IonsprayVoltage,IS):5500V;加熱溫度(Temperature,TEM):500°C;碰撞氣(CollisionGas，CAD):氮?dú)猓?ml/min;去集簇電壓(DeclusteringPotential,DP)70V;聚焦電壓(FocusingPotential,FP):300V;入口電壓(EntrancePotential,EP):10V;碰撞能(CollisionEnergy,CE):45V;碰撞池出口電壓(CollisionCellExitPotential,CXP):9V。4)樣品定容液的選擇樣品定溶液組分直接影響黃曲霉毒素在色譜柱中的分離程度和離子化效率，即質(zhì)譜的靈敏度。通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)，甲醇、乙腈作為定容液，均會(huì)干擾黃曲霉毒素Bi的出峰信號(hào)，分離度差；而甲醇與水的混合液(甲醇與水的體積比為5:5)作為定容液可使黃曲霉毒素B,的豐度較其他定容液均有不同程度的增高，且峰形變好，分離度提高。因此，選用甲醇與水的混合液(甲醇與水的體積比為5:5)作為定容液。5)標(biāo)準(zhǔn)曲線黃曲霉毒素BJ示準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制用甲醇將黃曲霉毒素BJ示準(zhǔn)品(購(gòu)于美國(guó)Sigma-Aldrich公司，純度>97%)配制成100mg/L標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，4'C避光保存。黃曲霉毒素B,標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制用甲醇與水的混合液(甲醇與水的體積比為5:5)稀釋標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制成O.l、0.2、0.5、1、2、5、10、20、50嗎/L黃曲霉毒素Bl標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。準(zhǔn)確吸取O.l、0.2、0.5、1、2、5、10、20、50pg/L黃曲霉毒素Bl標(biāo)準(zhǔn)工作溶液50^1，HPLC-MS/MS分析，得到黃曲霉毒素B,峰面積對(duì)濃度進(jìn)行線性回歸，即得標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖2所示。6)檢測(cè)限和定量限按3倍信噪比計(jì)算，當(dāng)樣品組分的響應(yīng)值等于基線噪聲的3倍時(shí)，該樣品的濃度即可作為最低檢測(cè)限。當(dāng)樣品組分的響應(yīng)值等于基線噪聲的10倍時(shí)，該樣品的濃度即可作為最低定量限。當(dāng)黃曲霉毒素B!濃度為0.03^ig/kg時(shí)，S/N=3.2，故方法的最低檢測(cè)限約為0.03pg/kg;當(dāng)黃曲霉毒素Br濃度為0.1pg/kg時(shí)，S/N=10.2，故方法的最低定量限約為0.1pg/kg。7)回收率及精密度評(píng)價(jià)取同一未染菌花生樣品為本底，添加lpg/kg、25pg/kg、50(Hig/kg黃曲霉毒素B,(AFB。后，HPLC-MS/MS分析測(cè)定其回收率，并計(jì)算精密度，結(jié)果如表1所示。表l.黃曲霉毒素Bi添加回收率和精密度6<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>2、電子束輻照降低黃曲霉毒素B!及其效果驗(yàn)證將黃曲霉菌(^s;"g/〃^/7av^)ATCC11498(購(gòu)自美國(guó)菌種保藏中心ATCC，11498號(hào)菌株)接種于察氏培養(yǎng)基((硝酸鈉2g，磷酸氰二鉀lg，氯化鉀0.5g，硫酸鎂0.5g，硫酸亞鐵O.Olg，蔗糖30g，瓊脂15-20g，水1000ml)斜面，溫度28°C，濕度50%，培養(yǎng)7天，待斜面長(zhǎng)滿黃綠色菌絲，菌絲上略生孢子時(shí)，用無菌水制成孢子懸浮液(107cfii/ml)。將5g花生在紫外燈下照射30min滅菌后，加入5ml無菌水(121°C，20min)，然后加入孢子懸浮液lml混勻，在溫度28。C，濕度50%，培養(yǎng)7天得到感染黃曲霉菌的花生。取6份上述獲得的感染黃曲霉菌的花生樣品，分別置于一個(gè)100ml聚丙烯離心管(材質(zhì)為99.9%生物級(jí)聚丙烯，耐輻射)中密封，放入電子束輻射場(chǎng)(清華大學(xué)SML5520型電子直線加速器)內(nèi)進(jìn)行輻照處理，輻照劑量分別設(shè)定為OkGy(不輻射對(duì)照)，2kGy，4kGy，6kGy，8kGy，10kGy。加速器產(chǎn)生的電子束能量為4.5MeV，束流功率為2.5kW。劑量率為0.1kGy/s。上述實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。4、黃曲霉毒素Bi的含量的檢測(cè)將經(jīng)步驟3處理后的花生樣品檢測(cè)黃曲霉毒素B,的含量，具體方法如下所述1)提取分別在裝有上述輻照后的花生樣品和裝有未輻照花生樣品置于100ml離心管，加入50ml體積百分含量為60X的甲醇的水溶液，5gNaCl，10ml正己烷，搖勻，放入離心機(jī)中離心提取30min。提取后，用定量濾紙過濾，入分液漏斗靜置分層，取5ml下層溶液進(jìn)行如下凈化。2)凈化將OASISHLB固相萃取柱(購(gòu)自Waters,貨號(hào)WAT094226)置于真空固相萃取裝置(購(gòu)自AgelaTechnologies,貨號(hào)M0401001)上，加2ml甲醇活化，待甲醇至OASIS小柱吸附劑(此吸附劑是屬于固相萃取柱自帶)上層時(shí)，再加2ml純水平衡小柱，然后加上述得到的下層溶液5ml過柱，流速為lml/min，加入3ml純水淋洗OASIS小柱兩次，后用2ml體積百分含量為30%的甲醇的水溶液，淋洗OASIS小柱以除去雜質(zhì)，用真空泵抽干。最后以lml甲醇洗脫，洗脫液用純水定容至2ml，待分析。3)LC-MS檢湖!)LC-MS分析分別注入50pL適當(dāng)濃度的黃曲霉毒素Bi標(biāo)準(zhǔn)溶液及步驟2)定容得到的樣品分別于高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀(LC-MS)中，按步驟l所述分析條件進(jìn)行分析，記錄峰面積。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)樣品的保留時(shí)間定性，外標(biāo)法定量。經(jīng)過2kGy，4kGy，6kGy，8kGy或10kGy吸收劑量輻照的染菌花生樣品，經(jīng)提取、凈化、進(jìn)LC-MS分析后樣品中的黃曲霉毒素Bi的峰面積，結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線換算成樣品溶液的濃度，計(jì)算出溶質(zhì)的質(zhì)量，然后除以稱取的花生的質(zhì)量，得到降解后的折合濃度。降解率由不同吸收劑量下的折合濃度與未輻照時(shí)的折合濃度相比得出。己計(jì)算的未輻照的染菌花生中黃曲霉毒素B,的污染濃度為64嗎/kg。上述計(jì)算數(shù)據(jù)為三次重復(fù)的平均值。結(jié)果如表2所示，結(jié)果表明，經(jīng)電子束輻照后，黃曲霉毒素Bi降解率可達(dá)71.51%。我國(guó)GB2761-2005《食品中真菌毒素限量》規(guī)定黃曲霉毒素B,的限量為<20pg/kg;而國(guó)際上關(guān)于總黃曲霉毒素的含量一般都小于15^ig/kg，對(duì)黃曲霉毒素B,的限量要求更低。花生黃曲霉毒素B,污染水平一般為6-400^ig/kg，因此，利用電子束輻照處理8kGy就能夠有效減低花生黃曲霉毒素B,54%左右，10kGy的能夠有效減低花生黃曲霉毒素B口1.5P/。左右，對(duì)出口貿(mào)易具有現(xiàn)實(shí)的應(yīng)用價(jià)值。表2.染菌花生中黃曲霉毒素B,的輻照降解<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>權(quán)利要求1、一種降解黃曲霉毒素的方法，是用電子束輻照含有黃曲霉毒素的樣品得到黃曲霉毒素含量降低的樣品。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述輻照劑量為2-10kGy。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述輻照劑量為6-10kGy。4、根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述輻照劑量為8-10kGy。5、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述黃曲霉毒素為黃曲霉毒素B,。6、根據(jù)權(quán)利要求1-5中任意一項(xiàng)所述的方法，其特征在于所述含有黃曲霉毒素的樣品為含有黃曲霉毒素的農(nóng)產(chǎn)品和/或農(nóng)產(chǎn)品加工得到的制品。全文摘要本發(fā)明公開了一種降解黃曲霉毒素的方法。該方法，是用電子束輻照含有黃曲霉毒素的樣品得到黃曲霉毒素含量降低的樣品。本發(fā)明的方法可以直接對(duì)農(nóng)產(chǎn)品，食品，飼料等成品進(jìn)行輻照，方法操作簡(jiǎn)單，效果明顯，可使黃曲霉毒素B₁降解率達(dá)到71.51％。文檔編號(hào)A23L1/015GK101485408SQ20091007870公開日2009年7月22日申請(qǐng)日期2009年3月2日優(yōu)先權(quán)日2009年3月2日發(fā)明者哈益明,尹青崗,安李,靜楊,鋒王,王志東申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所