專利名稱：：一種雙歧桿菌新菌株及其發(fā)酵制備方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及微生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體地說(shuō)是一株新的、可產(chǎn)細(xì)菌素或抑菌物質(zhì)的雙歧桿菌亞種菌株，本發(fā)明還涉及該菌株的發(fā)酵制備方法以及和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：近年來(lái)，由于食品安全的需要，微生態(tài)制劑的研究和開(kāi)發(fā)得以較快發(fā)展，但目前使用的菌種大都為乳酸桿菌、酵母菌和芽胞桿菌，卻很少使用雙歧桿菌。原因在于通常雙歧桿菌營(yíng)養(yǎng)要求非常高，生長(zhǎng)條件須嚴(yán)格厭氧，高昂的培養(yǎng)成本和嚴(yán)格的生產(chǎn)條件使目前大部分雙歧桿菌不能符合研發(fā)乃至實(shí)際生產(chǎn)的要求。但雙歧桿菌在微生態(tài)制劑的研究方面仍備受親睞，除了它具有常見(jiàn)益生菌的生理功能如促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收利用、生物屏障和生物拮抗作用、免疫調(diào)節(jié)作用外，還具有一般益生菌所沒(méi)有的優(yōu)良特性。國(guó)內(nèi)外有研究表明雙歧桿菌能產(chǎn)生結(jié)合膽酸水解酶、抑制內(nèi)毒素產(chǎn)生(解毒)、產(chǎn)生細(xì)菌素和廣譜抗菌作用；雙歧桿菌具有提高機(jī)體抗體水平，促進(jìn)巨嗜細(xì)胞的吞噬能力和消化能力，提高機(jī)體抗感染力和預(yù)防、殺傷腫瘤細(xì)胞的作用；雙歧桿菌能通過(guò)降低腸道pH值或通過(guò)雙歧桿菌對(duì)有害菌在空間、營(yíng)養(yǎng)上的屏蔽竟?fàn)幾饔?，抑制其在腸道的定植和生長(zhǎng)；促進(jìn)各種礦物質(zhì)如Ca、Fe、Mg、Zn的吸收利用，降低血清膽固醇和甘油三酯的水平；雙歧桿菌還具有消除自由基、羥自由基、過(guò)氧脂質(zhì)以及腐敗細(xì)菌產(chǎn)生的吲哚、胺、酚類，降低腸道氣味等作用，進(jìn)而可顯著改善伺養(yǎng)環(huán)境；雙歧桿菌能合成維生素B1、維生素B2、維生素B6、維生素B12、煙酸和葉酸等多種維生素，補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)，并能控制內(nèi)毒素血癥；還可以降低亞硝酸鹽等有害物質(zhì)的形成進(jìn)而改善動(dòng)物產(chǎn)品品質(zhì)。以上種種優(yōu)良特性使其在替代和減少抗生素使用、減少動(dòng)物疫病的發(fā)病率和死亡率、保證畜產(chǎn)品安全綠色和公共健康等方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。在益生菌的選育方面，國(guó)內(nèi)外眾多學(xué)者均指出，益生菌必需具備耐酸、耐膽鹽及對(duì)腸上皮細(xì)胞具有粘附性等特點(diǎn)，且菌株最好來(lái)源于本種動(dòng)物，這樣更有利于其在腸道中的定植。目前，大多數(shù)研究者熱衷于動(dòng)物源的益生菌菌種的篩選工作，但是很少有系統(tǒng)研究已得菌株抗逆性(耐酸、耐膽鹽等)、生物學(xué)特性(抑菌活性、粘附特性等)、發(fā)酵特性和后加工工藝(即制劑)。在畜禽生產(chǎn)中，應(yīng)用微生物飼料添加劑已有很多研究，也有很好的應(yīng)用效果，但目前使用菌種主要是乳酸桿菌、芽胞桿菌和酵母等微生物。如張?jiān)豢〉?2005)給16周齡肉仔雞日糧添加乳酸桿菌、芽胞桿菌和酵母組成的復(fù)合微生物飼料添加劑可顯著降低雞空腸和直腸中大腸桿菌數(shù)量(p<0.05),能顯著提高日增重和飼料轉(zhuǎn)化效率b<0.05)。國(guó)內(nèi)對(duì)雙歧桿菌制劑的研究起步較晚，在動(dòng)物上的應(yīng)用較少，僅見(jiàn)到一些試驗(yàn)研究報(bào)告，特別是在動(dòng)物科學(xué)領(lǐng)域中關(guān)于其抗逆性、發(fā)酵特性、產(chǎn)品制劑的應(yīng)用效果以及對(duì)畜產(chǎn)品品質(zhì)的影響報(bào)道較少。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的第一個(gè)目的在于提供一株短雙歧桿菌新菌株BB2。本發(fā)明的第二個(gè)目的在于提供短雙歧桿菌BB2的發(fā)酵方法。本發(fā)明的第三個(gè)目的在于提供短雙歧桿菌凍干制劑在畜禽生產(chǎn)上的用途。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明首先提供一株短雙歧桿菌新菌株BB2，其具有對(duì)逆環(huán)境耐受性強(qiáng)、粘附性強(qiáng)、生長(zhǎng)快、發(fā)酵液酸度高、生物量大、抑菌活性好等優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明從雞腸道中分離、經(jīng)定向初篩和復(fù)篩得到一株雙歧桿菌。其細(xì)胞形狀呈短棒狀，在改良PTYG培養(yǎng)基上，菌落為針尖大小淺乳白色圓形凸起，革蘭氏染色陽(yáng)性；不生孢子，無(wú)鞭毛，不運(yùn)動(dòng)；兼性厭氧；不需要營(yíng)養(yǎng)極其豐富的培養(yǎng)基；發(fā)酵分解糖代謝，乙酸、乳酸物質(zhì)的量之比近3:2;接觸酶陰性，生長(zhǎng)溫度25-39。C。菌株BB2通過(guò)法國(guó)生物梅里埃公司API20A微生物鑒定系統(tǒng)鑒定97.1%(該系統(tǒng)中，待鑒定的菌種特征與某已知菌種的符合率〉95%時(shí)為高鑒別準(zhǔn)確率)為短雙歧桿菌A)^o^cten'wm萬(wàn)wve2。BB2生化特征和形態(tài)特征以及API20A鑒定結(jié)果分別見(jiàn)表1和表2。表lBB2生化特征及形態(tài)特征<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>利用改良PTYG液體培養(yǎng)基(具體配方見(jiàn)后部分的發(fā)酵方法)，用通用常規(guī)方法對(duì)雞源短雙歧桿菌BB2進(jìn)行了耐酸、耐膽汁酸鹽、耐胃蛋白酶試驗(yàn)、發(fā)酵試驗(yàn)和抑菌活性測(cè)定[1，2，3，4]。BB2對(duì)不同酸度耐受存活率及多重比較結(jié)果見(jiàn)表3，BB2耐膽酸鹽、耐胃蛋白酶及其生長(zhǎng)曲線和發(fā)酵特性分別見(jiàn)圖1~4。_表3BB2對(duì)不同酸度耐受存活率、活菌數(shù)及多重比較_<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>60min3.8X1084.8x1085.1x1085.3x108處理56.89±3.25Jj82.22±2.67EFGfg85.33±2.51DEFGdef90.67±2.51BCDbed90min3.2x1084.6x1084.8x1085.1xIO8處理42.22±3.94Kk78.67±4.20GHgh80.89±3.08FGHfg86.67±2.24CDEFdef120min2.4x1084.4x1084.6x1084.9x108注數(shù)據(jù)右側(cè)含有不同小寫(xiě)字母(a,b,c，d，e,f)的表示差異顯著(p0.05)，含有不同大寫(xiě)字母(A,B,C，D，E，F(xiàn))的數(shù)據(jù)表示差異極顯著(p<0.01)從表3可見(jiàn)，酸度越低，BB2活菌數(shù)下降越大。在pH2.5pH3.5環(huán)境下，處理120min,存活率在80%左右(處理前活菌數(shù)5.65x108CFU/mL),表明BB2具有良好的耐酸性。該結(jié)果好于王建業(yè)等(2000)[5]pH3.5條件下保溫2h其存活率在40%以上的結(jié)果。即使在pH1.5條件下，處理120min，BB2的存活率降低到42.22%,其活菌數(shù)仍高達(dá)2.4x108CFU/mL(處理前活菌數(shù)5.65x108CFU/mL)，因而仍然能夠保證有足夠多的BB2活菌通過(guò)胃部進(jìn)入腸道。膽酸鹽耐受試驗(yàn)中，接種后培養(yǎng)基中的初始活菌數(shù)是6.8x106CFU/mL。從圖1可見(jiàn)，培養(yǎng)基中的活菌數(shù)隨著膽酸鹽濃度的增加而逐漸降低。當(dāng)牛膽酸鹽濃度在02.0mg/mL時(shí)，BB2活菌數(shù)較初始值均有不同程度的增加，lmg/mL時(shí)的活菌數(shù)增加了12倍多?？梢?jiàn)，BB2具有良好的耐膽鹽特性。耐胃蛋白酶試驗(yàn)結(jié)果如圖2。在含胃蛋白酶2.5，5,7.5mg/mL的改良PTYG液體培養(yǎng)基中作用2h后，存活率分別為81.82%,72.12%和43.64%;當(dāng)濃度為10mg/mL時(shí)，驟降至3.03%,但是各試驗(yàn)組活菌數(shù)均在107CFU/mL(處理前活菌數(shù)4.13x108CFU/mL)以上，5mg/mL胃蛋白酶作用2h后，BB2的活菌數(shù)仍高達(dá)2.975xl08CFU/mL，說(shuō)明BB2具有良好的耐胃蛋白酶特性。圖3為BB2的生長(zhǎng)曲線圖。550nm和600nm波長(zhǎng)下的吸光值(該指標(biāo)反映了BB2發(fā)酵時(shí)的生物量或總菌量)以及活菌數(shù)是雙歧桿菌生長(zhǎng)情況常用檢測(cè)指標(biāo)。由圖3可見(jiàn)，BB2生長(zhǎng)沒(méi)有明顯的遲滯期，從接種開(kāi)始便有一定幅度的增長(zhǎng)，從2h即進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，直到4h達(dá)到最大生長(zhǎng)量，然后進(jìn)入平臺(tái)期，最大活菌數(shù)達(dá)到5xl()SCFU/mL(對(duì)數(shù)值為8.7)，與其他種屬雙歧桿菌相比表現(xiàn)出生長(zhǎng)快和生物量大的優(yōu)點(diǎn)。在改良PTYG液體培養(yǎng)基中發(fā)酵015h的pH、葡萄糖消耗量、乳酸產(chǎn)量和對(duì)白痢沙門(mén)抑菌活性的變化規(guī)律見(jiàn)圖4。可見(jiàn)，發(fā)酵液pH在2h后迅速下降，在6h末已由初始的6.76下降為4.09，之后略有下降，9h后穩(wěn)定在3.63.7之間；乳酸的產(chǎn)量從2h10h有較大幅度增加，之后穩(wěn)定在18.6mmol/L，因此具有發(fā)酵液酸度高的優(yōu)點(diǎn)；BB2對(duì)雞白痢沙門(mén)耐藥菌株的抑菌效果05h略有增加，5h后迅速增加直到9h末，之后進(jìn)入平穩(wěn)期，其最大抑菌圈直徑為15.9mm，具有強(qiáng)抑菌能力。抑菌特性研究表明，BB2的抑菌活性與菌體生物量成正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)W為0.6635,乳酸產(chǎn)量和抑菌活性存在很強(qiáng)的相關(guān)性(相關(guān)系數(shù)f為0.9505)。使用150^1的發(fā)酵上清液(乳酸含量為18.64mmol/L)以及150|ilpH3.5的乳酸(生理鹽水稀釋)進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，指示菌為白痢沙門(mén)氏菌[(S.戶〃oramCVCC79301)G-，中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所菌種保藏中心]。結(jié)果如圖5和圖6所示，BB2的上清液能產(chǎn)生(15.90士0.36mm)的抑菌圈，而乳酸僅能產(chǎn)生較小而模糊的抑菌圈。這表明，BB2抑菌活性主要是抗菌活性物質(zhì)作用的結(jié)果，而不是乳酸。BB2對(duì)于常見(jiàn)病原菌及動(dòng)物腸道常見(jiàn)菌的抑菌范圍測(cè)試結(jié)果見(jiàn)表4，結(jié)果顯示，BB2對(duì)革蘭氏陰性菌和部分革蘭氏陽(yáng)性菌等有抑菌表現(xiàn)，是一具有廣譜抑菌活性的優(yōu)秀菌株。表4BB2的抑菌譜指示菌金黃色葡萄球菌(iS鄉(xiāng)/z盧COCCUSaw"wssi/fo/.1.801)金黃色葡萄球菌0Sa//^foawrew5sw力平1.879)金黃色葡萄球菌(&a//yfococcusCICC10001)金黃色葡萄球菌(5"鄉(xiāng)/zy/ococcusflwrezw^4wrew5CVCC1885)銅綠假單胞菌am/g/waaCICC20236)革蘭氏染原發(fā)酵上清色特性液(mtn)G+12.57±0.37G+13.11±0.42G+13.07±0.25G+12.20士0.42G_13.43±0.15中國(guó)普通微生物菌種保藏中心(CGMCC)中國(guó)普通微生物菌種保藏中心(CGMCC)中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏中心(CICC)中國(guó)獸醫(yī)微生物菌種保藏中心(cvcc)中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏中心(CICC)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>由上述可見(jiàn)，本發(fā)明短雙歧桿菌BB2具有對(duì)逆環(huán)境耐受性強(qiáng)、生長(zhǎng)快、發(fā)酵液酸度高、生物量大、有良好的抑菌活性等眾多優(yōu)點(diǎn)。BB2的粘附特性是通過(guò)以下途徑實(shí)現(xiàn)的取間歇攪拌培養(yǎng)10-15h的短雙歧桿菌發(fā)酵液分別作稀釋或濃縮等不同處理，以植物乳桿菌、糞腸球菌和乳酸乳球菌為對(duì)照進(jìn)行培養(yǎng)和粘附試驗(yàn)。細(xì)胞培養(yǎng)釆用人結(jié)腸癌細(xì)胞Caco-2細(xì)胞(人結(jié)腸腺癌細(xì)胞系Caco-2細(xì)胞株，ATCCHTB-37,美國(guó)ATCC全球生物資源中心)，Caco-2細(xì)胞具有與小腸上皮細(xì)胞相同的微絨毛結(jié)構(gòu)和緊密連接。使用DMEM高糖細(xì)胞培養(yǎng)液(商用培養(yǎng)基)，在37°C、5%032~95%空氣的二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱中恒溫孵育，待細(xì)胞生長(zhǎng)至鋪滿板面約80%用0.25。/。Trypsin/EDTA消化液消化，以10VmL傳代，每2d更換培養(yǎng)液。在6孔細(xì)胞培養(yǎng)板(coming)中放入洗凈無(wú)菌的蓋玻片，每孔接入lmL調(diào)整好濃度的細(xì)胞懸液，每24d更換培養(yǎng)液，以無(wú)菌PBS洗滌3次，每孔加入12mL的BB2各種處理液與12mL的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液(商用培養(yǎng)基)的混合液，37~40"€,5%(:02~95%空氣中孵育30180min。取出蓋玻片用無(wú)菌PBS洗滌三次，再用甲醇固定813min，革蘭氏染色，顯微鏡下隨機(jī)挑選20個(gè)視野，計(jì)數(shù)50個(gè)細(xì)胞上粘附的細(xì)菌數(shù)，每個(gè)處理作3個(gè)重復(fù)。BB2疏水性及時(shí)間、濃度對(duì)BB2粘附的影響見(jiàn)表5-表5不同菌株疏水性測(cè)定結(jié)果的比較-7。<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>注數(shù)字右側(cè)標(biāo)不同字母(a、b)表示差異顯著(P〈0.05)表5說(shuō)明，BB2和植物乳桿菌的疏水性顯著好于糞腸球菌和乳酸乳球菌。表6BB與Caco-2細(xì)胞作用不同時(shí)間的粘附性<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>注數(shù)字右側(cè)標(biāo)不同字母(A、B、C)表示差異極顯著(P〈0.01)表6說(shuō)明，BB2菌的隨著與Caco-2細(xì)胞作用時(shí)間的增加，其粘附性極顯著增加，表明其具有極好的粘附性。表7不同濃度BB2發(fā)酵液對(duì)Caco-2細(xì)胞粘附的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>注數(shù)字右側(cè)標(biāo)不同字母(A、B、C、D)表示差異極顯著(P〈0.01)表7說(shuō)明，隨著B(niǎo)B2菌濃度的增加，BB2菌對(duì)Caco-2細(xì)胞的粘附性極顯著增加，表明其具有極好的粘附性，且與濃度相關(guān)。疏水性是決定細(xì)菌非特異性粘附到各種生物和非生物表面及界面的最重要?jiǎng)恿χ?。一般而言，疏水性?qiáng)的菌株對(duì)腸上皮細(xì)胞有著較強(qiáng)的粘附力。從表5可看出，BB2與植物乳桿菌的疏水性較高且無(wú)顯著差異，而顯著高于糞腸球菌和乳酸乳球菌，表明BB2的粘附力最強(qiáng)，其次為植物乳桿菌。從表6和表7可看出，BB2的粘附特性對(duì)孵育時(shí)間和菌液濃度有依賴性。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為只有活菌才有粘附能力，但BB2菌于IOO'C水洛10min后粘附數(shù)與不處理組相比沒(méi)有顯著差異，而65'C水浴30min后粘附數(shù)與IO(TC水洛10min在統(tǒng)計(jì)學(xué)上也沒(méi)有顯著差異，這說(shuō)明IO(TC滅活的BB2雖無(wú)活性，但菌體上的粘附位點(diǎn)活性仍然存在。BB2經(jīng)紫外線照射30min后對(duì)Caco-2細(xì)胞的粘附數(shù)與未照射相比無(wú)顯著差異，說(shuō)明紫外線照射滅活對(duì)BB2的粘附性能無(wú)明顯影響，也說(shuō)明在其發(fā)酵液中可能存在著一種粘附物質(zhì)。由此可見(jiàn)，BB2具有很強(qiáng)的腸道粘附特性，并且這種粘附性能不受高溫和紫外線影響。BB2的安全性是通過(guò)以下途徑實(shí)現(xiàn)的用小鼠和AA肉雞作為模型動(dòng)物，來(lái)試驗(yàn)BB2的安全性。準(zhǔn)備18~22g小鼠40只，公母各半，隨機(jī)分為四個(gè)處理組，每組10只，馴養(yǎng)7天后，釆用腹腔注射的方式進(jìn)行攻毒試驗(yàn)，試驗(yàn)期21天。試驗(yàn)分為4個(gè)處理組，對(duì)照組注射生理鹽水lml，B組注射BB2發(fā)酵液(l()SCFU/mL)lmL，C組注射大腸桿菌(107/mL)lmL,D組注射0.5mL的BB2的發(fā)酵液和0.5mL的大腸桿菌。灌服后觀察其中毒癥狀，看是否出現(xiàn)呼吸困難、抽搐、肢體麻痹等。準(zhǔn)備80只AA肉雞，隨機(jī)分為四組，每組20只，育雛一周后在甸料中拌入BB2發(fā)酵液和/或大腸桿菌發(fā)酵液，濃度和各組處理同上。小鼠和肉雞安全性試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表8和表9。_表8BB2對(duì)小鼠的安全性試驗(yàn)結(jié)果_小鼠馴養(yǎng)A組B組C組D組天數(shù)(生理鹽水)(BB2發(fā)酵(大腸桿菌組)(BBZ發(fā)酵液和大腸桿液)菌)8健活健活健活健活9健活健活健活健活12健活健活精神萎靡食欲不振健活15健活健活死亡1只健活18健活健活死亡1只食欲不振21健活健活健活精神萎靡未死亡表9BB2對(duì)肉雞的安全性試驗(yàn)結(jié)果肉雞飼養(yǎng)A組B組C組D組天數(shù)(生理鹽水)(BB2發(fā)酵(大腸桿菌組)(BB2發(fā)酵液和大腸桿液)菌)7健活健活死亡1只精神萎靡食欲不振10健活健活死亡1只死亡1只14健活健活精神萎靡食欲不振死亡1只21健活健活死亡1只食欲不振28健活健活精神萎靡未死亡精神萎靡未死亡35健活健活食欲不振健活42健活健活健活健活從表8和表9可明顯看出，BB2對(duì)于小鼠和肉雞是安全的，所有受試小鼠和肉雞均健活；D組的情況總體好于C組。從各組隨機(jī)選取5只小鼠、5只肉雞進(jìn)行解剖，B組與對(duì)照組相比，各臟器未見(jiàn)異樣，D組臟器病變明顯弱于C組。由此可見(jiàn)BB2能緩解大腸桿菌給小鼠和肉雞帶來(lái)的不良影響，一定程度上減少了死亡率。綜上所述，一系列試驗(yàn)證明BB2具有對(duì)逆性環(huán)境(不良生存環(huán)境)耐受性強(qiáng)、粘附性強(qiáng)、生長(zhǎng)快、發(fā)酵液酸度高、生物量大、抑菌活性好等眾多優(yōu)點(diǎn)，并且對(duì)小鼠、肉雞等無(wú)任何毒害作用，有極高的應(yīng)用價(jià)值。該雞源短雙歧桿菌BB2已于2009年7月22日保藏于《中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心》(地址北京巿朝陽(yáng)區(qū)大屯路甲3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵編100101),其建議分類命名為雙歧桿菌(5折fifo6a"ehwww.)，保藏號(hào)為CGMCCNo.3200。本發(fā)明還提供短雙歧桿菌BB2的發(fā)酵方法。發(fā)酵培養(yǎng)基配制為葡萄糖0.72.1%、大豆蛋白胨0.21.0%、胰蛋白胨0.2~1.0%、大豆肽0.3~1.0%、玉米渣0.5~1.5%、檸檬酸銨0.3~1.2%、混合鹽溶液0.4%(無(wú)水CaCl20.2g，KH2PO41.0g,K2HPO41.0g，MgSO4.7H2O0.48g，NaHCO310.0g,NaCl2.0g，蒸餾水1000mL。)、消泡劑M0.05~0.1%，pH為6.2~7.4。經(jīng)121。C高溫蒸汽消毒2030min，降溫至2540。C時(shí)，向其中接種菌齡1530h的種子液1.5~3.5%(v/v，種子液含菌量為108CFU/mL)，在254(TC溫度下，每間隔23h進(jìn)行100~130rpm攪拌，持續(xù)510min。接種1015h為發(fā)酵終點(diǎn)，可放罐。將BB2發(fā)酵液，經(jīng)離心收集菌泥加入冷凍干燥保護(hù)劑，再經(jīng)冷凍干燥即得短雙歧桿菌BB2菌劑。將本發(fā)明短雙歧桿菌BB2應(yīng)用于肉雞蛋雞生產(chǎn)，結(jié)果表明，其能明顯促進(jìn)和刺激胃腸道中有益菌的生長(zhǎng)；并能顯著抑制大腸桿菌和其他一些好氧菌(如沙門(mén)氏菌)的生長(zhǎng)繁殖，極顯著降低了腹瀉率、同時(shí)它的使用顯著提高了動(dòng)物生產(chǎn)性能、改善了畜舍環(huán)境和水產(chǎn)動(dòng)物水質(zhì)，提高了動(dòng)物免疫力或抗病力。因此可將本發(fā)明菌株或其發(fā)酵液制成菌劑用于家禽、牲畜以及水產(chǎn)的飼養(yǎng)，例如單獨(dú)或與適當(dāng)?shù)钠渌煞种瞥娠暳咸砑觿?，或者是直接添加到飼料中制成含有該成分的詢料，?lái)提高生產(chǎn)能力。也可以將本發(fā)明菌株或其發(fā)酵液制成生物獸藥部分代替抗生素提高動(dòng)物的抗病力。因此本發(fā)明具有很高的社會(huì)效益、經(jīng)濟(jì)效益和生態(tài)效益。本申請(qǐng)中涉及到的百分號(hào)"％"，若未特別說(shuō)明，是指質(zhì)量百分比；溶液的百分比，除另有規(guī)定外，是指溶液100mL中含有溶質(zhì)若干克；液體之間的百分比，是指在20'C(常溫)時(shí)容量的比例。本發(fā)明提供的短雙歧桿菌BB2，具有對(duì)逆環(huán)境耐受性強(qiáng)、生長(zhǎng)快、發(fā)酵液酸度高、生物量大、有抑菌活性等優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明提供的發(fā)酵方法適合BB2的大規(guī)模培養(yǎng)。本發(fā)明短雙歧桿菌制劑可以部分替代抗生素，消除藥物殘留，提高畜禽產(chǎn)品品質(zhì)；可以提高動(dòng)物生產(chǎn)性能、提高免疫力或抗病力、降低動(dòng)物死淘率、減少腹瀉率；還可以凈化畜舍環(huán)境。本發(fā)明具有很高的社會(huì)效益、經(jīng)濟(jì)效益和生態(tài)效益。說(shuō)明書(shū)附圖圖1顯示的是不同濃度膽鹽對(duì)BB2的影響；圖2顯示的是不同濃度胃蛋白酶對(duì)BB2的影響；圖3顯示的是BB2生長(zhǎng)曲線；圖4顯示的是BB2015h發(fā)酵特性變化曲線；圖5顯示的是BB2發(fā)酵液上清液對(duì)雞白痢沙門(mén)氏菌的抑菌作用；圖6顯示的pH乳酸對(duì)雞白痢沙門(mén)氏菌的抑菌作用。具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對(duì)本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。實(shí)施例l發(fā)酵方法A1用葡萄糖0.7%、大豆蛋白胨0.6%、胰蛋白胨0.4%、大豆肽0.3%、玉米渣1.2%、杼檬酸銨0.5%(以上均為質(zhì)量體積比m/V)、混合鹽溶液0.4%(V/V)、消泡劑M0.05%(V/V)(北京化工集團(tuán)，型號(hào)2118)按比例配制成發(fā)酵培養(yǎng)劑。經(jīng)12rC高溫蒸汽消毒20min，降溫至37'C時(shí)，向其中接種菌齡15h的種子液1.5%,在35。C溫度下，每間隔23h進(jìn)行100rpm攪拌，持續(xù)10min。接種15h為發(fā)酵終點(diǎn)，可放罐，得到短雙歧桿菌BB2活菌數(shù)為4.76x108CFU/mL。經(jīng)離心收集菌泥加入冷凍干燥保護(hù)劑(水蘇糖1.8%、谷氨酸鈉0.3%、半乳糖0.6%、脫脂奶粉12%)，再經(jīng)冷凍干燥即得短雙歧桿菌BB2菌劑，活菌數(shù)約為125億/g。其中，所述的混合鹽溶液的成分為CaCl20.2g，MgS04'7H200.48g,K2HPO41.0g,KH2PO41.0g,NaHCO310.0g，NaC12.0g，加蒸餾水定容至1000mL，混勻。實(shí)施例2發(fā)酵方法A2用葡萄糖1.2%、大豆蛋白胨0.3%、胰蛋白胨0.7%、大豆肽0.5%、玉米渣1.0%、檸檬酸銨0.6%(以上均為質(zhì)量體積比m/V)、加入實(shí)施例1所用的混合鹽溶液0.5%(V/V)、消泡劑M0.05。/。(V/V)按比例配制成發(fā)酵培養(yǎng)劑。經(jīng)12rC高溫蒸汽消毒20min，降溫至37。C時(shí)，向其中接種菌齡25h的種子液2.5%，在35。C溫度下，每間隔23h進(jìn)行1OOrpm攪拌，持續(xù)10min。接種15h為發(fā)酵終點(diǎn)，可放罐，得到短雙歧桿菌BB2活菌數(shù)為5.19x108CFU/mL。經(jīng)離心收集菌泥加入冷凍干燥保護(hù)劑(水蘇糖1.8%、谷氨酸鈉0.3%、半乳糖0.6%、脫脂奶粉12%),再經(jīng)冷凍干燥即得短雙歧桿菌BB2菌劑，活菌數(shù)約為131億/g。實(shí)施例3發(fā)酵方法A3用葡萄糖1.5%、大豆蛋白胨0.5%、胰蛋白胨0.7%、大豆肽0.4%、玉米渣0.6%、檸檬酸銨0.8%(以上均為質(zhì)量體積比m/V)、加入實(shí)施例1所用的混合鹽溶液0.3%(V/V)、消泡劑M0.05。/。(V/V)按比例配制成發(fā)酵培養(yǎng)劑。經(jīng)121'C高溫蒸汽消毒20min,降溫至37'C時(shí)，向其中接種菌齡12h的種子液2.0°/。，在35。C溫度下，每間隔2~3h進(jìn)行120rpm攪拌，持續(xù)10min。接種l化為發(fā)酵終點(diǎn)，可放罐，得到短雙歧桿菌BB2活菌數(shù)為6.47x108CFU/mL。經(jīng)離心收集菌泥加入冷凍干燥保護(hù)劑(水蘇糖1.8%、谷氨酸鈉0.3%、半乳糖0.6%、脫脂奶粉12%),再經(jīng)冷凍干燥即得短雙歧桿菌BB2菌劑，活菌數(shù)約為150億/g。實(shí)施例4發(fā)酵方法A4用葡萄糖2.1%、大豆蛋白胨0.2%、胰蛋白胨1.0%、大豆肽1.0%、玉米渣0.5%、梓檬酸銨0.3%(以上均為質(zhì)量體積比m/V)、加入實(shí)施例1所用的混合鹽溶液0.45%(V/V)、消泡劑M0.05。/。(V/V)按比例配制成發(fā)酵培養(yǎng)劑。經(jīng)12rC高溫蒸汽消毒20min，降溫至37'C時(shí)，向其中接種菌齡12h的種子液2.0。/。，在35。C溫度下，每間隔23h進(jìn)行130rpm攪拌，持續(xù)5min。接種14h為發(fā)酵終點(diǎn)，可放罐，得到短雙歧桿菌BB2活菌數(shù)為6.23x108CFU/mL。經(jīng)離心收集菌泥加入冷凍干燥保護(hù)劑(水蘇糖1.8%、谷氨酸鈉0.3%、半乳糖0.6%、脫脂奶粉12%),再經(jīng)冷凍干燥即得短雙歧桿菌BB2菌劑，活菌數(shù)約為146億/g。實(shí)施例5發(fā)酵方法A5用葡萄糖1.8%、大豆蛋白胨1.0%、胰蛋白胨0.2%、大豆肽0.5%、玉米渣1.5%、檸檬酸銨1.2%(以上均為質(zhì)量體積比m/V)、加入實(shí)施例1所用的混合鹽溶液0.35%(V/V)、消泡劑M0.05。/。(V/V)按比例配制成發(fā)酵培養(yǎng)劑。經(jīng)12rC高溫蒸汽消毒20min,降溫至37。C時(shí)，向其中接種菌齡12h的種子液2.0。/。，在35。C溫度下，每間隔23h進(jìn)行l(wèi)lOrpm攪拌，持續(xù)10min。接種14h為發(fā)酵終點(diǎn)，可放罐，得到短雙歧桿菌BB2活菌數(shù)為5.81x108CFU/mL。經(jīng)離心收集菌泥加入冷凍干燥保護(hù)劑(水蘇糖1.8%、谷氨酸鈉0.3%、半乳糖0.6%、脫脂奶粉12%)，再經(jīng)冷凍干燥即得短雙歧桿菌BB2菌劑，活菌數(shù)約為139億/g。實(shí)施例6雙歧桿菌制劑在蛋雞生產(chǎn)中的應(yīng)用選用349~377日齡的海蘭灰蛋雞600羽，分為兩個(gè)處理組空白對(duì)照組不添加任何成分；試驗(yàn)組添加0.1%的本發(fā)明實(shí)施例2短雙歧桿菌BB2制劑。每個(gè)處理6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)50只雞。飼養(yǎng)后屠宰，觀察分析蛋雞腸道不同腸段雙歧桿菌和乳酸菌總量、大腸桿菌和總好氧菌的變化情況。試驗(yàn)結(jié)果列于表12。表12蛋雞腸道菌群分離計(jì)數(shù)結(jié)果[logK)(菌數(shù)CFU/g內(nèi)容物)]<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>注同行樣品間凡標(biāo)有不同大寫(xiě)字母者為差異極顯著(pO.01);同行樣品間凡標(biāo)有不同小寫(xiě)字母者為差異達(dá)顯著水平(/K0.05)。從表12可以看出添加0.1%活性雙歧桿菌制劑，嗉囊中的雙歧和乳酸數(shù)量總和比空白對(duì)照組增加了IO倍以上，其他部位的雙歧桿菌和乳酸菌數(shù)量總和也顯著高于空白對(duì)照組，大腸桿菌和總好氧菌數(shù)量也顯著下降而得到抑制。實(shí)施例7雙歧桿菌制劑在肉雞生產(chǎn)中的應(yīng)用選用128日齡公母混養(yǎng)的AA肉雞300只，隨機(jī)分成3個(gè)處理，即空白對(duì)照組、抗生素對(duì)照組(金霉素100g/t)和0.15%本發(fā)明實(shí)施例3雙歧桿菌制劑，每個(gè)處理100只。育雛l周后，每個(gè)處理分成5個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)20只。飼養(yǎng)后屠宰，觀察分析肉雞腸道內(nèi)不同腸段雙歧、乳酸總和、大腸桿菌、沙門(mén)氏菌和好氧菌總數(shù)的變化情況(即菌相變化)。試驗(yàn)結(jié)果列于表13。_表13肉雞腸道菌群分離計(jì)數(shù)結(jié)果[logK)(菌數(shù)CFU/g內(nèi)容物)]_組別測(cè)定微生物回腸l腸——結(jié)直腸..............舉壁，大腸桿菌8.539士0,221Ab12.817士0.257Aa10,201士0.312Aa空白對(duì)照組沙門(mén)氏菌8.764±0.038Aa12.091±0.300Aa10.065±0.209Aa14.45士0.15A雙歧、乳酸總和8.438士0.203Cc9.051士0.219Cd9.102土0.245Cc抗生素對(duì)照組0.15%BB2制劑好氧菌總數(shù)大腸桿菌沙門(mén)氏菌雙歧、乳酸總和好氧菌總數(shù)大腸桿菌沙門(mén)氏菌雙歧、乳酸總和好氧菌總數(shù)10.629土0.115Bb8.604±0.239Ab8.749±0.223Aa8.476土O.匿c10.989士0.170Aa7.563±0.118Bc7.448士0,202Bc0.311土0,208Aa9.609土0.333Cc12.779±0.104Aa11.353±0.056Cc11.673土0.118Bb9.206土0.059Cc11.557土0.107Bb11.239土0.209Cd10.633士O.匿d10.322土0.115Aa10.377土0,211Cd11.112±0.243Aa9.834±0.242Bb9.433土0.165Cc9.569±0.187Bc10.809±0.198Bb7.551土O.跳d8.329±0.207Cd10.447±0.230Aa8.009土0.302Cc5.99土0.21B2.29土0.16C注同行樣品間凡標(biāo)有不同大寫(xiě)字母者為差異極顯著(pO.01);同行樣品間凡標(biāo)有不同小寫(xiě)字母者為差異達(dá)顯著水平(p0.05)。從表13可以看出，添加本發(fā)明的雙歧桿菌制劑可以使回腸中雙歧桿菌和乳酸桿菌的數(shù)量比空白對(duì)照組增加IO倍以上，并降低了大腸桿菌和沙門(mén)氏菌的濃度IO倍以上，其他部位也有類似結(jié)果。同時(shí)，添加0.15%雙歧桿菌制劑組的腹瀉率極顯著低于空白對(duì)照組和抗生素對(duì)照組(pO.Ol)。試驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明提供的雙歧桿菌制劑應(yīng)用于肉雞蛋雞生產(chǎn)時(shí)能明顯促進(jìn)和刺激胃腸道中有益菌的生長(zhǎng)；并能顯著抑制大腸桿菌和其他一些好氧菌(如沙門(mén)氏菌)的生長(zhǎng)繁殖，調(diào)節(jié)腸道菌群平衡，提高肉雞抗病力，腹瀉率極顯著下降。實(shí)施例8雙歧桿菌制劑對(duì)蛋雞生產(chǎn)性能、蛋品質(zhì)、死淘率和抗體水平的影響用日齡相同的產(chǎn)蛋后期海蘭蛋雞9000只，分三組，每幢一組3000只，分3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)1000只。分組情況如下A組，空白對(duì)照組，伺喂蛋雞基礎(chǔ)日糧；B組，在蛋雞基礎(chǔ)日糧中添加抗生素，80g/t;C組，在蛋雞基礎(chǔ)日糧中添加雙歧桿菌制劑0.18%。前7天為預(yù)試期，后28天為試驗(yàn)期，并按上述分組重復(fù)試驗(yàn)3次，測(cè)定雞舍內(nèi)NH3、H2S濃度、雞蛋破損率、哈夫單位、產(chǎn)蛋率、蛋重、死淘率、蛋殼光潔度、抗體水平等指標(biāo)。結(jié)果列于表14。表14對(duì)蛋雞生產(chǎn)性能、蛋品質(zhì)、死淘率的影響ABC空白對(duì)照組抗生素對(duì)照組雙歧桿菌制劑組氨氣(ppm)16.712.710.3硫化氫(ppm)8.436.785.89雞蛋破損率(％)5.64.94.8后期產(chǎn)蛋率(％)80.283.582.9哈夫單位78.182.282.6蛋重(g)64.365.865.7蛋殼光潔度++++++++死淘率(％)3.91.91.7雞瘟病毒抗體(ELISA,OD值)0.770.751.23注蛋殼光潔度用+的多少表示，越多代表光潔度越好。從表14可以看出，雖然添加了雙歧桿菌制劑一組的蛋重、產(chǎn)蛋率等指標(biāo)不如抗生素組好，但卻顯著降低了雞舍的氨氣、硫化氫等有害氣體、降低死淘率、抗體水平也得到了較大的提高，有著良好的經(jīng)濟(jì)效益和生態(tài)效益，同時(shí)解決了藥物殘留問(wèn)題，提高了食品的安全性。實(shí)施例9雙歧桿菌制劑在仔豬、肉仔雞和草魚(yú)養(yǎng)殖中的應(yīng)用效果使用實(shí)施例4中的菌劑，分別應(yīng)用于仔豬、肉仔雞以及草魚(yú)的養(yǎng)殖，均設(shè)為空白對(duì)照組、抗生素組和BB2實(shí)驗(yàn)組，每組3個(gè)重復(fù)。其中，空白對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)日糧；抗生素組在基礎(chǔ)日糧中添加金霉素(80g/t);BB2實(shí)驗(yàn)組添加實(shí)施例4的菌劑，具體添加量如表15所示。表15雙歧桿菌制劑在仔豬、肉仔雞和草魚(yú)養(yǎng)殖中的應(yīng)用效果處理(組別)試驗(yàn)方式試驗(yàn)規(guī)模試驗(yàn)結(jié)果A、空白對(duì)照(陰性對(duì)照)B、抗生素組(陽(yáng)性對(duì)照)C、BB2制劑0.20%A、空白對(duì)照B、抗生素組每組30頭仔豬雙歧桿菌組較空白對(duì)照組和抗生3個(gè)重復(fù)90頭素組日采食量提高2.9-3.6%,曰增重提高3.2-4.1%,飼料轉(zhuǎn)化率改善4.5-5.2%,腹瀉率降低49-54%每組300只肉仔雞雙歧桿菌組較抗生素雞體內(nèi)蛋白3個(gè)重復(fù)卯O只質(zhì)沉積明顯增加(p0.05),明顯降18C、BB2制劑0.16%低腸道pH(pO.05),顯著抑制大腸桿菌繁殖和減少禽舍中氨氣濃度(p<0.05)A、空白對(duì)照B、抗生素組C、BB2制劑0.11%每組2000尾育成期草魚(yú)雙歧桿菌組飼料系數(shù)比抗生素對(duì)3個(gè)重復(fù)6000尾照組提高4.87%,日增重比對(duì)照組提髙8.3%,成活率提高14.5%,且整齊度高，抗病力強(qiáng)。同時(shí)，很好地控制了水質(zhì)。從表15可以看出，在仔豬，肉仔雞和育成期草魚(yú)日糧中添加本發(fā)明的雙歧桿菌制劑，各項(xiàng)指標(biāo)均明顯好于抗生素對(duì)照組和空白對(duì)照組。說(shuō)明本發(fā)明提供的雙歧桿菌制劑能有效防治畜禽和水產(chǎn)動(dòng)物疾病、顯著提高生產(chǎn)性能、改善畜舍環(huán)境和水產(chǎn)動(dòng)物水質(zhì)，說(shuō)明其具有良好的經(jīng)濟(jì)效益和生態(tài)效益。實(shí)施例10雙歧桿菌制劑對(duì)肉仔雞免疫力(包括細(xì)胞免疫和體液免疫)的影響試驗(yàn)選用AA肉雞1日齡300羽，分3組，每組100只肉雞，分5個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)20只雞，喂以3種不同的日糧，即A組為空白對(duì)照組，B組為抗生素組，C組為添加雙歧桿菌制劑0.15%組。分別在7曰齡和14日齡注射牛血清白蛋白抗原，以備檢測(cè)免疫學(xué)指標(biāo)。試驗(yàn)期7周，3周齡時(shí)檢測(cè)淋巴細(xì)胞增殖活力、牛血清白蛋白抗體水平，結(jié)果見(jiàn)表16和表17。表16雙歧桿菌制劑對(duì)雞血淋巴細(xì)胞增殖活力(細(xì)胞免疫)的影響添加物空白對(duì)照(不添加)抗生素對(duì)照雙歧桿菌制劑0.15%T細(xì)胞活力(OD值)1.5621.2122.481表17雙歧桿菌制劑對(duì)雞血牛血清白蛋白抗體滴度(體液免疫)的影響添加物空白對(duì)照(不添加)抗生素對(duì)照雙歧桿菌制劑0.15%抗體滴度(OD值)1.3141.0352.018從表16、表17可以看出，本發(fā)明提供的雙歧桿菌制劑添加到甸料中可以明顯增強(qiáng)T細(xì)胞活力，也可以明顯增強(qiáng)抗體滴度水平。說(shuō)明本發(fā)明提供的雙歧桿菌制劑可明顯提高動(dòng)物的細(xì)胞免疫功能和體液免疫功能。參考文獻(xiàn)1.Gilliland，S.E.，Staley，T,E.andBush,L.J.，ImportanceofbiletoleranceofLactobacillusacidophilususedasadietaryadjunct,JDairySci，1984，67(12):3045-3051.2.Overdahl,B.J.andZottola，E.A.，RelationshipbetweenbiletoleranceandthepresenceofarutheniumredstaininglayeronstrainsofLactobacillusacidophilus,JDairySci，1991，74(4):1196-1200,3.Prasad,J,，Gill,H.,Smart,J.andGopal，R.K.,SelectionofcharacterisationofLactobacillusandBifidobacteriumstrainsforuseasprobiotics，IntDairyJournal,1998，8(12):993-1002.4.Erkkila，S.andPetaja,E.，ScreeningofcommercialmeatstarterculturesatlowpHandinthepresenceofbilesaltsforpotentialprobioticuse,MeatScience,2000，55:297-300.5.王建業(yè)，王永坤，朱國(guó)強(qiáng)等，豬源雙歧桿菌篩選及生物特性參數(shù)測(cè)定，揚(yáng)州大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2000,3:23-27.6.張日俊，潘淑媛等，綠色高效微生物飼料添加劑一益生康對(duì)肉仔雞營(yíng)養(yǎng)代謝與免疫功能的調(diào)控機(jī)理，中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2005.10(3):40-4權(quán)利要求1、雙歧桿菌(Bifidobacteriumsp.)BB2，保藏號(hào)為CGMCCNo.3200。2、權(quán)利要求1所述雙歧桿菌BB2的發(fā)酵培養(yǎng)方法，其特征在于，按1.5~3.5%的接種量向發(fā)酵培養(yǎng)基中接入1530h菌齡的所述雙歧桿菌種子液，發(fā)酵條件為溫度25~40°C，每間隔2~3h攪拌510min，轉(zhuǎn)速為100130rpm，培養(yǎng)10~15h;所述發(fā)酵培養(yǎng)基的配置為葡萄糖0.7~2.1%、大豆蛋白胨0.2~1.0%、胰蛋白胨0.21.0%、大豆肽0.3~1.0%、玉米渣0.5~1.5%、梓檬酸銨0.3~1.2%、混合鹽溶液0.4°/。、消泡劑M0.05~0.1%,pH為6.27.4。3、含有權(quán)利要求1所述雙歧桿菌BB2的菌劑。4、如權(quán)利要求3所述的菌劑，其特征在于，該菌劑通過(guò)如下方法制得按照權(quán)利要求2所述的方法對(duì)雙歧桿菌BB2進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)得到發(fā)酵菌液，離心收集菌泥，加入保護(hù)劑凍干得菌劑。5、含有權(quán)利要求1所述雙歧桿菌BB2的飼料添加劑。6、含有權(quán)利要求1所述雙歧桿菌BB2的飼料。7、含有權(quán)利要求1所述雙歧桿菌BB2的生物獸藥。8、權(quán)利要求1所述雙歧桿菌BB2、權(quán)利要求3所述菌劑、權(quán)利要求5所述的飼料添加劑或權(quán)利要求6所述的伺料在家禽、牲畜和水產(chǎn)詞養(yǎng)中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明涉及一種分離自健康肉仔雞消化道的、可產(chǎn)細(xì)菌素或抑菌物質(zhì)的雙歧桿菌BB2，保藏號(hào)為CGMCCNo.3200。該菌株具有抗逆性強(qiáng)、生長(zhǎng)快、發(fā)酵液酸度高、生物量大、有抑菌或抗菌活性等優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明還涉及該菌株的大規(guī)模發(fā)酵培養(yǎng)方法，將發(fā)酵液離心回收菌泥，加入保護(hù)劑凍干后能夠得到活菌數(shù)為120～150億/g的菌劑。本發(fā)明的雙歧桿菌亞種BB2制劑可以部分替代抗生素，消除藥物殘留，提高畜禽產(chǎn)品品質(zhì)；可以提高動(dòng)物生產(chǎn)性能、提高免疫力或抗病力、降低動(dòng)物死淘率、減少腹瀉率；還可以凈化畜舍環(huán)境。本發(fā)明具有很高的社會(huì)效益、經(jīng)濟(jì)效益和生態(tài)效益。文檔編號(hào)C12N1/20GK101671638SQ200910093779公開(kāi)日2010年3月17日申請(qǐng)日期2009年9月28日優(yōu)先權(quán)日2009年9月28日發(fā)明者張日俊,李桂霞,梁曉明,燕黃申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)