專利名稱：一種自身抗原表位、其編碼基因及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及免疫化學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和腫瘤免疫學(xué)領(lǐng)域。具體地涉及一種自身抗原 表位、其編碼基因及其用途。更具體地，涉及人組織蛋白酶D(cath印sin D)抗原表位區(qū)及 其編碼基因，以及這種多肽在鑒定胰腺癌患者血清中自身抗體中的用途。
背景技術(shù)：
自身抗體是指抗自身細胞內(nèi)、細胞表面和細胞外抗原的免疫球蛋白，自身抗體可 以是生理性的，也可以是病理性的。生理性自身抗體普遍存在，主要用于清除衰老或死亡的 細胞。當機體免疫功能失調(diào)，自身抗體的滴度超出一定閾值時，就成為病理性的了，例如，自 身免疫疾病就是一種涉及自身抗體的慢性疾病。對于臨床研究和診斷而言，結(jié)合病人的病 史和體檢，自身抗體陽性將有診斷自身免疫病的意義。(滕慶，自身免疫性疾病自身抗體檢 查方法及其評價，中國實用L科雜志，2003，(02))。最近幾年研究人員發(fā)現(xiàn)血清中的自身抗體不是自身免疫病的唯一特征，自身抗體 也可以出現(xiàn)在免疫系統(tǒng)發(fā)生異常改變的其他疾病，如腫瘤(Belousov，P. V.等人，(2008) Biochemistry (Mosc) 73, 562-72)中。目前已經(jīng)在多種人類腫瘤中檢測到自身抗體，包括肺 癌、大腸癌、乳腺癌、前列腺癌、肝癌、卵巢癌、胰腺癌和副腫瘤性神經(jīng)綜合征等。自身抗體識別的抗原物質(zhì)即為自身抗原，自身抗原是自身抗體產(chǎn)生的前提，自身 抗原可以是完全正常的組織成分，也可以是已改變了的細胞成分，比如腫瘤發(fā)生的早期階 段，腫瘤細胞內(nèi)或者血液循環(huán)中就會出現(xiàn)自身抗原，尤其是在腫瘤發(fā)生的早期階段，腫瘤 細胞內(nèi)或者血液循環(huán)中會產(chǎn)生腫瘤相關(guān)抗原，但是其難以被常規(guī)的方法檢測到，但是機體 針對這些自身抗原所產(chǎn)生的自身抗體作為免疫系統(tǒng)對腫瘤存在信號的生物放大而長期 存留在腫瘤細胞內(nèi)或者血液循環(huán)中(Purcell，A等人，(2004)Mol Cell Proteomics 3， 193-208)，這種自身抗體可以識別那些難以直接檢測到的僅發(fā)生了微弱變化的腫瘤相關(guān)抗 原 Ofamish, S. (2003)Nat Biotechnol 21,37-8) 另外一些抗原，例如細胞周期蛋白，不但自身在腫瘤中高表達，并且可以誘導(dǎo)機體 產(chǎn)生針對細胞周期蛋白的自身抗體，這些自身抗體對于腫瘤的診斷具有較好的靈敏度和特 異度(CoVini，G等人，(1997)!tepat0l0gy 25,75-80).因此，基于體液免疫篩選和鑒定的自 身抗體和腫瘤抗原，將有利于挖掘腫瘤早期篩查和診斷的潛在的生物標志物。發(fā)明概述如前所述，自身抗體作為免疫系統(tǒng)對腫瘤或者疾病存在信號的生物放大，相對而 言，可以長期存在于腫瘤細胞內(nèi)或者血液循環(huán)中，利用這種現(xiàn)象，研究人員可以通過檢驗自 身抗體的存在來對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、患病的風(fēng)險等進行評估和預(yù)測，由此可以對疾病相關(guān) 蛋白進行研究，更進一步地，能夠?qū)崿F(xiàn)包括腫瘤在內(nèi)的疾病的早期檢測和預(yù)防。但是目前對于如何捕獲自身抗體尤其是體液中的自身抗體還沒有很滿意的工具， 因為在體液中的一些自身抗體的含量往往非常低，而作為捕獲自身抗體尤其是捕獲腫瘤特 異性的自身抗體的自身抗原來源有限。雖然目前本領(lǐng)域的技術(shù)人員通過CTL識別法、MHC結(jié)合的多肽洗脫法等獲得了一些自身抗原，例如這些自身抗原都可以在網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫中查詢 (http://www2. licr. org/CancerlmmunomeDB/)得到，但是隨著高通量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的不 斷發(fā)展，這些抗原遠遠不能滿足日益增長的高通量操作的需要。而且完整抗原的制備通常需要克隆、過表達、分離以及純化多個步驟。雖然最近 已發(fā)展了高通量的生產(chǎn)和純化目的蛋白的技術(shù)(ZhuH等人，Global analysis of protein activities using proteomechips. Science, 2001, 293 (5537) :2101_5)，但是如何制備高 質(zhì)量并且有功能活性的完整的重組抗原依然是研究人員面臨的主要挑戰(zhàn)。另外，制備完整 抗原的成本非常昂貴(Andresen H等人，F(xiàn)unctional peptide microarrays for specific and sensitiveantibody diagnostics· Proteomics，2006，6(5) :1376_84)0因此，本發(fā)明的目的之一就是提供可以替代完整自身抗原的自身抗原表位，尤其 是具有腫瘤特異性的代表完整自身抗原的自身抗原表位，通過提供這種抗原表位，可以減 少前期投入成本和提高自身抗原在高通量篩選中的利用效率，例如在容量有限的蛋白質(zhì)芯 片中承載更多的有代表性的抗原表位進而實現(xiàn)高通量篩選、鑒別，更高效率地捕獲自身抗 體，進而為疾病尤其是腫瘤的研究提供更好的分子水平的研究工具，對自身抗體進行更好 的研究，進而為研發(fā)抗腫瘤藥物提供新的作用靶點。基于上述動機，申請人進行了深入的研究，考慮到腫瘤相關(guān)抗原通常都是血液中 較高豐度的蛋白質(zhì)，容易被質(zhì)譜分析捕獲和鑒定。同時，過表達的腫瘤相關(guān)抗原容易刺激機 體的免疫系統(tǒng)，產(chǎn)生自身抗體。因此，可以通過質(zhì)譜技術(shù)鑒定腫瘤特異性抗原，合成代表腫 瘤特異性抗原的抗原表位，然后與含有自身抗體的腫瘤患者血清進行免疫雜交，就可以而 鑒定能夠結(jié)合自身抗體的自身抗原表位。按照這一發(fā)明構(gòu)思，本發(fā)明的申請人采用已建立的器官無血清培養(yǎng)體系，收集并 濃縮了來自于正常胰腺和胰腺癌組織的分泌蛋白質(zhì)。隨后分別采用Shotgun LC-MS/MS和 SDS-PAGE HDMS兩種平行的蛋白質(zhì)組學(xué)分析策略，分析了正常胰腺組織和胰腺癌組織的分 泌蛋白質(zhì)組，并確定了胰腺癌組織特異的分泌蛋白質(zhì)組。在Shotgun LC-MS/MS策略中，申請人將胰腺癌及其鄰近正常胰腺，以及正常胰腺 組織各自的多樣本等量混合的分泌蛋白進行胰酶消化，將酶切產(chǎn)物經(jīng)過反相高效液相色譜 分離，線性洗脫獲得的組分直接進行質(zhì)譜鑒定，通過SEQUEST軟件解析質(zhì)譜數(shù)據(jù)，獲得正常 胰腺組織分泌蛋白質(zhì)組或者胰腺癌組織特異的分泌蛋白質(zhì)組。申請人:還采用了平行于Shotgun LC-MS/MS策略的SDS-PAGEHDMS以提高鑒定數(shù)據(jù) 的覆蓋度和可信度。具體地，申請人通過SDS-PAGE HDMS技術(shù)策略對2例胰腺癌、1例正常 胰腺以及3例正常胰腺組織等量混合的分泌蛋白進行分析，之后應(yīng)用Mascot搜索二級質(zhì)譜 離子數(shù)據(jù)庫，獲得正常胰腺組織分泌蛋白質(zhì)組或者胰腺癌組織特異的分泌蛋白質(zhì)組。申請人:將通過Shotgun LC-MS/MS技術(shù)策略三次重復(fù)鑒定得到的蛋白；或經(jīng)過 SDS-PAGE HDMS技術(shù)策略鑒定一次以上的蛋白確定為高可信度胰腺癌組織特異的分泌蛋白 質(zhì)。結(jié)果申請人共確定了包含246個蛋白的正常胰腺組織分泌蛋白質(zhì)組和包含729個蛋白 的胰腺癌分泌蛋白質(zhì)組。經(jīng)過差減分析，發(fā)現(xiàn)159個蛋白同時出現(xiàn)于正常胰腺組織分泌蛋 白質(zhì)組和胰腺癌分泌蛋白質(zhì)組，因而最終確定了包含570個高可信度的蛋白的胰腺癌特異 分泌蛋白質(zhì)組。申請人:將胰腺癌特異性肽段定為胰腺癌自身抗原的“抗原表位庫”，其來自于以上蛋白質(zhì)組質(zhì)譜技術(shù)鑒定的570個胰腺癌組織特異分泌蛋白的所有肽段。之后申請人用Autospot陣列合成儀在活化纖維素膜表面合成上述肽庫所包 含的部分肽段，得到含有部分肽的多肽陣列。采用該陣列對胰腺癌患者血清進行篩選， 終于得到了可以用于檢測自身抗體的一個抗原表位，并意外地發(fā)現(xiàn)該表位是組織蛋白 酶D的第33-50位的氨基酸，其氨基酸序列為:RRTMSEVGGSVEDLIAKG (SEQ ID NO :1)。該 氨基酸的編碼基因序列為5，-CGCCGGACCATGTCGGAGGTTGGGGGCTCTGTGGAGGACCTGATTGCC AAAGGC-3，(SEQ ID NO 12)，在通過P印scan技術(shù)進行深入鑒定時，發(fā)現(xiàn)該抗原表位中 RTMSEVGGSVEDLIA(SEQ ID NO 11)具有相同的抗原表位功能，其編碼序列為5，CGGACCATG TCGGAGGTTGGGGGCTCTGTGGAGGACCTGATTGCC3，(SEQ ID NO 13)，由此提供了胰腺癌特異性的 自身抗原的抗原表位，完成了本發(fā)明。


圖1為SEQ ID NO 1的自身抗體檢測圖，其中㈧為針對12例胰腺癌血清檢測結(jié) 果。(B)為針對8例健康人血清檢測結(jié)果。圖2為采用P印scan技術(shù)驗證人組織蛋白酶D的片段是否具有實施例3獲得的自 身抗原表位的免疫結(jié)合活性的試驗結(jié)果。其中(A)和(B)為與含自身抗原的胰腺癌患者的 血清雜交的結(jié)果，(C)為與健康對照的血清雜交的結(jié)果。發(fā)明詳述本發(fā)明的一個方面，提供了下述內(nèi)容1.抗原表位，其選自下述序列之一(a) SEQ ID NO :1或11所示的氨基酸序列；(b)具有作為組織蛋白酶D的抗原表位的功能的、且由與SEQ IDNO 1或者11所 示的氨基酸序列具有95%以上同源性的氨基酸序列構(gòu)成的氨基酸序列；和(c)具有作為組織蛋白酶D的抗原表位的功能的、且由經(jīng)過取代、缺失或添加一個 或幾個氨基酸的SEQ ID NO 1或11所示的氨基酸序列構(gòu)成的氨基酸序列。2.編碼項目1的抗原表位的基因，其選自下述序列之一(a) SEQ ID NO 12所示的編碼SEQ ID NO 1的核苷酸序列；(b)SEQ ID NO 13所示的編碼SEQ ID NO 11的核苷酸序列；(c)編碼下述氨基酸序列的核苷酸序列所述氨基酸序列是具有作為組織蛋白酶 D的抗原表位的功能的、且由與SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列具有95%以上同源性的氨 基酸序列構(gòu)成的氨基酸序列；(d)編碼下述氨基酸序列的核苷酸序列所述的氨基酸序列是具有作為組織蛋白 酶D的抗原表位的功能、且由經(jīng)過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸的SEQ ID N0:1所示 的氨基酸序列構(gòu)成的氨基酸序列；和(d)因為密碼子簡并性而分別與SEQ ID NO 12和13不同、但是編碼SEQ ID NO 1或11所示氨基酸序列的核苷酸序列。3.含有項目要求2的基因的重組載體。4.用項目4的重組載體轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)染得到的遺傳工程化宿主細胞。5.項目1的抗原表位或項目2的基因的用途，其用于制備下述制劑之一
(a)組織蛋白酶D的抗原表位；(b)組織蛋白酶D的胰腺癌特異的抗原表位；(c)檢測人組織蛋白酶D的抗體；和(d)疫苗。6.項目5的應(yīng)用，其特征在于項目1所述的抗原表位或項目2的基因在制備用于 檢測胰腺癌血清中自身抗體的制劑中的用途。7.項目5的應(yīng)用，其特征在于項目1所述的抗原表位或項目2的基因在制備用于 檢測胰腺癌血清中自身抗體的試劑盒中的用途。8.胰腺癌檢測方法，其包括使用項目1的抗原表位或項目2的基因。由于氨基酸序列的特殊性，任何含有SEQ ID NO 1所示氨基酸序列的多肽片段或 突變體，如其保守性變體、生物活性片段或衍生物，只要該多肽的片段或多肽變體與前述氨 基酸序列同源性在95%以上，均屬于本發(fā)明保護范圍之列。具體地，所述改變可包括氨基酸序列中氨基酸的缺失、插入或替換；其中，對于變 體的保守性改變，所替換的氨基酸具有原氨基酸相似的結(jié)構(gòu)或化學(xué)性質(zhì)，如用亮氨酸替換 異亮氨酸，變體也可具有非保守性改變。所述自身抗原表位可以是重組多肽、天然多肽或合成多肽，可以是天然純化的產(chǎn) 物，或是化學(xué)合成的產(chǎn)物，或使用重組技術(shù)從原核或真核宿主(例如細菌、酵母、高等植 物、昆蟲和哺乳動物細胞)中產(chǎn)生。本發(fā)明的另外一個方面，還涉及編碼SEQ ID NO 1所示的自身抗原表位的基因。 所述基因可含有SEQ ID NO :12所示多核苷酸同源性70-100%的核苷酸序列。由于核苷酸序列的特殊性，任何SEQ ID NO 12所示多核苷酸變體，只要與該多核 苷酸具有95%以上的同源性，均屬于本發(fā)明保護范圍之列。只要所述核苷酸序列沒有從實 質(zhì)上改變其編碼的多肽的序列和功能，均包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。本發(fā)明的一個方面，還涉及一種含有編碼SEQ ID NO=I所示的自身抗原表位的基 因的重組載體，以及用所述的重組載體轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)染得到的遺傳工程化宿主細胞?！拜d體”指本領(lǐng)域熟知的細菌質(zhì)粒、噬菌體、酵母質(zhì)粒、植物細胞病毒、哺乳動物細 胞病毒(如腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒)或其他載體。在本發(fā)明中適用的載體包括但不限于在 細菌中表達的基于T7啟動子的表達載體；在哺乳動物細胞中表達的pcDNA3. 1載體和在昆 蟲中表達的來源于桿狀病毒的PFastBac載體。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以采用熟知的方法構(gòu)建含編碼本發(fā)明的抗原表位的DNA序列 和合適的轉(zhuǎn)錄/翻譯調(diào)控元件的表達載體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)、DNA合成技術(shù)、體內(nèi)重組技術(shù)等。所述的DNA序 列可有效連接到表達載體中的適當啟動子，以指導(dǎo)mRNA合成。這些啟動子的代表性例子 有大腸桿菌的Iac或trp啟動子；噬菌體的PL啟動子；真核啟動子包括CMV早期啟動子、 HSV胸苷激酶啟動子、早期和晚期SV40啟動子、反轉(zhuǎn)錄病毒的LTRs和其他一些已知的可控 制基因在原核細胞或真核細胞或其病毒中表達的啟動子。本發(fā)明的另一個方面，還涉及包含含有編碼SEQ ID NO 1的重組載體的宿主細胞。 在本發(fā)明中，編碼SEQ ID NO :1的自身抗原表位的多核苷酸或含有該多核苷酸的重組載體 可轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)入宿主細胞，以構(gòu)成含有該核苷酸或重組載體的基因工程化宿主細胞。
“宿主細胞”指原核細胞，如細菌細胞；或是低等真核細胞，如酵母細胞；或是高 等真核細胞，如哺乳動物細胞。代表性例子有大腸桿菌，鏈霉菌屬；細菌細胞如鼠傷寒沙 門氏菌；真菌細胞如酵母；植物細胞；昆蟲細胞如果蠅S2或Sf9 ；動物細胞如CHO、COS或 Bowes黑素瘤細胞等。在本發(fā)明中，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以用熟知的常規(guī)技術(shù)將SEQID NO :1的DNA序列 或含有所述DNA序列的重組載體轉(zhuǎn)化宿主細胞。當宿主為原核生物如大腸桿菌時，能吸收DNA的感受態(tài)細胞可在指數(shù)生長期后收 獲，用CaCl2法處理，或者可供選擇的使用MgCl2。如果需要，也可用電穿孔的方法進行轉(zhuǎn) 化。當宿主是真核生物時，可選用包括磷酸鈣共沉淀法，或者常規(guī)機械方法如顯微注射、電 穿孔、脂質(zhì)體包裝等在內(nèi)的DNA轉(zhuǎn)染法。下面通過實施例對本發(fā)明的方法進行詳細的說明，不過本申請所要求保護的范圍 并不局限于所述的實施例。
具體實施例方式實施例1 獲得肽庫胰腺癌及其遠端正常胰腺新鮮組織樣本于手術(shù)離體10分鐘內(nèi)，由外科醫(yī)生各切 取約兩個黃豆粒大小組織塊，分別放入含青鏈霉素的L-15培養(yǎng)基(購自Invitrogen公 司)的無菌瓶中備用。在潔凈工作臺中，取無菌玻璃平皿，加入5mL洗液，將胰腺組織從無 菌瓶中取出放置于平皿中洗凈。用手術(shù)刀將胰腺癌和正常胰腺組織切成2mm3左右的小塊，放入已涂好膠原并劃好 溝槽的平皿中，4°C冰箱放置2-3小時以促進組織塊貼壁。從冰箱取出平皿以后，小心滴加 經(jīng)過改良的LHC-9無血清培養(yǎng)基(購自Irwitrogen公司，含表皮生長因子、轉(zhuǎn)鐵蛋白、胰島 素等)，防止將組織塊沖起。將培養(yǎng)皿放入培養(yǎng)盒中，充入含有50 % N2,45 % O2和5 % CO2的混合氣體，密封培 養(yǎng)盒。將培養(yǎng)盒放在搖床上，搖擺頻率為3-4次/min，36. 5°C,4% CO2孵箱中培養(yǎng)48_72h。 收集并濃縮了來自于正常胰腺和胰腺癌組織的分泌蛋白質(zhì)。隨后分別采用Shotgun LC-MS/MS和SDS-PAGE HDMS兩種平行的蛋白質(zhì)組學(xué)分析 策略，分析了正常胰腺組織和胰腺癌組織的分泌蛋白質(zhì)組，并確定了胰腺癌組織特異的分 泌蛋白質(zhì)組。Shotgun LC-MS/MS鑒定方法樣品為1例胰腺癌及其鄰近正常胰腺，以及3例正 常胰腺等量混合的分泌蛋白。具體地，使用胰酶在37度條件下過夜消化濃縮分泌蛋白。取16 μ g酶切產(chǎn)物經(jīng)過 反相高效液相色譜[GE Ettan MDLC (GEHealthcare, Piscataway, NJ, USA)]分離，線性洗脫 獲得的組分直接進 ESI 離子源系統(tǒng)[LTQ-MS/MS (Thermo Finnigan (San Jose, CA, USA)]進 行質(zhì)譜鑒定，質(zhì)譜數(shù)據(jù)由SEQUEST軟件解析。每個培養(yǎng)基樣本[包含組織分泌蛋白和LHC-9無血清培養(yǎng)基(購自Invitrogen公 司，含表皮生長因子、轉(zhuǎn)鐵蛋白、胰島素等)]重復(fù)分析了三次以確定鑒定方法的可重復(fù)性， 并獲得高可信度的分泌蛋白。結(jié)果三次平行分析后，分別從3例正常胰腺組織分泌上清中鑒定出40余種蛋白(三次分析的結(jié)果分別為45、49和49種蛋白)，定為組1，從1例正常胰腺組織分泌上清中 鑒定出20余種蛋白(三次分析的結(jié)果分別為28、22和21種蛋白)定為組2，在1例胰腺癌 組織分泌上清中鑒定出270余種蛋白(三次分析的結(jié)果分別為277、287和271種蛋白)，定 為組3。3組樣本的三次平均重合率為27%。約有49%的蛋白鑒定到2次以上。為了提高鑒定數(shù)據(jù)的覆蓋度和可信度，申請人還采用了平行于Shotgun LC-MS/MS 策略的SDS-PAGE HDMS技術(shù)策略分析了 2例胰腺癌、1例正常胰腺以及3例正常胰腺組織等 量混合的分泌蛋白。具體地，分泌蛋白經(jīng)SDS-PAGE分離后，依次切下分離膠內(nèi)不同的蛋白 條帶，胰酶酶切后分別經(jīng)過NanoLC-MS/MS on Acquity Nano UPLCsystem和Synapt高精度 質(zhì)譜分析。應(yīng)用Mascot搜索二級質(zhì)譜離子數(shù)據(jù)庫，確定蛋白鑒定結(jié)果。以上組織分泌上清中分別鑒定到179、89、515和252個蛋白。由于HDMS為高精準 度的質(zhì)譜儀器，用該體系鑒定到的蛋白定義為高質(zhì)量蛋白。為了獲得高可信度的正常胰腺以及胰腺癌的分泌蛋白，申請人如下限定了所鑒定 的蛋白，只有所鑒定的蛋白滿足以下條件時才被確定為高可信度蛋白，并可以被納入申請 人建立的分泌蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫=(I)Shotgim LC-MS/MS技術(shù)策略三次重復(fù)鑒定的蛋白；或 (2) SDS-PAGE HDMS技術(shù)策略一次以上鑒定的蛋白。應(yīng)用以上的標準，申請人確定了包含246個蛋白的正常胰腺組織分泌蛋白質(zhì)組和 包含729個蛋白的胰腺癌分泌蛋白質(zhì)組。經(jīng)過差減分析，發(fā)現(xiàn)159個蛋白同時出現(xiàn)于正常 胰腺組織分泌蛋白質(zhì)組和胰腺癌分泌蛋白質(zhì)組，因而最終確定了包含570個高質(zhì)量蛋白的 胰腺癌特異分泌蛋白質(zhì)組。申請人:將質(zhì)譜技術(shù)鑒定的胰腺癌特異性肽段確定為胰腺癌自身抗原“自身抗原表 位庫”，其來自于以上蛋白質(zhì)組質(zhì)譜技術(shù)鑒定的胰腺癌組織特異分泌蛋白(570個)的所有 肽段，總數(shù)約2000-3000個。每個肽段長度為2-20個氨基酸，平均3_6個多肽確定1個蛋 白質(zhì)。在表1中申請人具體列舉了兩種蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)策略中質(zhì)譜鑒定的肽段。申請人:用Autospot陣列合成儀(德國INTAVIS公司，Cologne，Germany)在活化 纖維素膜表面合成上述肽，得到含有全部肽的多肽陣列。
實施例2 含有自身抗體的腫瘤樣品的獲得收集患者血清來自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院腫瘤醫(yī)院腹部外科2006年3 月1日至2008年12月30日間，未合并其它疾病及未進行任何治療的病理確診的胰腺癌患 者血清12例，男7例，女5例，年齡41 70歲，中位年齡61歲；來自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院腫瘤醫(yī)院防癌體檢科2007年8月1日至2008年8月1日間，健康自愿者血清8 例，其中男5例，女3例，年齡30 64歲，中位年齡61歲。所有收集病例均獲患者知情同 意簽署及倫理委員會批準。實施例3 抗原性表位篩選及其序列確定檢測12例病例確診為胰腺導(dǎo)管腺癌患者血清中的自身抗體，以8例健康者血清為 陰性對照，采用免疫印跡法檢測該蛋白的抗原性。將實施例1中的合成多肽的纖維素膜先 后置于100%、75%和50%的乙醇中各5分鐘后，然后實施下述步驟a) _h)a)浸泡于 lXPBS(137mM NaCl，2· 7mM KCl，IOmM Na2HPO4, 2mM KH2PO4, pH 7. 4)中 30分鐘；b)以5%脫脂牛奶封閉纖維素膜，室溫下封閉2小時；c) IXPBST(137mM NaCl, 2. 7mM KCl，IOmM Na2HPO4, 2mMKH2P04,0. 2% Tween-20, pH 7. 4)浸洗纖維素膜1次；d)加入用1 XPBST按照1 1000稀釋的含有自身抗體的待測血清，室溫孵育1小 時；e) IXPBST 洗 10 分鐘 X3 次;f)加入 1 5000 稀釋 HRP 標記羊抗人 IgG 抗體(美國 JacksonImmunoresearch Laboratories 公司產(chǎn)品，批號109-005_003，West Grove, PA, USA)，室溫孵育 1 小時；g) 1 X PBST 洗 10 分鐘 X 3 次；h)用吸水紙去除膜表面液體后，ECL顯色，X光片曝光，顯影、定影、掃描。結(jié)果參見表2，可知12例胰腺癌患者中，5例血清均能與SEQ IDNO 1所示序列 有結(jié)合反應(yīng)，陽性率為41. 7% (5/12) ；1例血清能與SEQ ID NO :3有結(jié)合反應(yīng)，陽性率為 8.3% (1/12) ； 1例血清能與SEQ ID NO :4有結(jié)合反應(yīng)，陽性率為8. 3% (1/12) ； 1例血清能 與SEQ ID NO :8有結(jié)合反應(yīng)，陽性率為8. 3% (1/12)。8例健康對照血清中，1例血清能與 與SEQ ID NO :8有結(jié)合反應(yīng)，陽性率為12. 5% (1/8)(圖1)。如表1所示，SEQ ID N0:1更 容易與胰腺癌患者血清自身抗體結(jié)合，而且健康對照血清中未發(fā)現(xiàn)此種結(jié)合。表 2 通過Genbank檢索，發(fā)現(xiàn)其中SEQ ID NO :1所示序列是人組織蛋白酶D(SEQ ID NO 3)的第33-50位氨基酸所示序列，由此確定人組織蛋白酶D與胰腺癌的自身抗體產(chǎn)生 相關(guān)，同時因為所合成的肽是18肽，無論是生物工程手段還是化學(xué)合成手段，其獲得成本 都相較完整的人組織蛋白酶D低，因此本發(fā)明為通量篩選或者其它公知的用于捕獲、鑒定、 篩選自身抗體的方法提供了很好的自身抗體表位工具肽。實施例4 腫瘤特異性抗原表位的再次確定已知編碼組織蛋白酶D的基因位于染 色體11ρ15，基因全長ll，238bp，編碼蛋白全長412個氨基酸。其氨基酸序列為102030405060MQPSSLLPLA LCLLAAPASA LVRIPLHKFT SIRRTMSEVG GSVEDLIAKG PVSKYSQAVP708090100110120AVTEGPIPEV LKNYMDAQYY GEIGIGTPPQ CFTVVFDTGS SNLffVPSIHC KLLDIACffIH130140150160170180HKYNSDKSST YVKNGTSFDI HYGSGSLSGY LSQDTVSVPC QSASSASALG GVKVERQVFG190200210220230240EATKQPGITF IAAKFDGILG MAYPRISVNN VLPVFDNLMQ QKLVDQNIFS FYLSRDPDAQ250260270280290300PGGELMLGGT DSKYYKGSLS YLNVTRKAYff QVHLDQVEVA SGLTLCKEGC EAIVDTGTSL310320330340350360MVGPVDEVRE LQKAIGAVPL IQGEYMIPCE KVSTLPAITL KLGGKGYKLS PEDYTLKVSQ370380390400410AGKTLCLSGF MGMDIPPPSG PLWIL⑶VFI GRYYTVFDRD NNRVGFAEAA RL應(yīng)用AutoSpot點樣體系，疊瓦式(又成為P印scan技術(shù)，參見Kopecky EM等人，.Mapping of FVIII inhibitor epitopes usingcellulose-bound synthetic peptide arrays [J]. J Immuno IMethods, 2006, 308 (1-2) 90-100)合成人組織蛋白酶 D 完整氨基酸 序列的肽段陣列。具體地，將人組織蛋白酶D蛋白完整氨基酸序列(412個氨基酸)按照18個連續(xù) 氨基酸構(gòu)成一個肽段，前后兩個單元相互交疊15個氨基酸，依次合成133個肽段。將合成的133個肽段單元按照在氨基酸中的連接次序依次點樣到纖維素膜上，其 中橫向按照1-20的序號編排，縱向按照a_g的順序編排，任何一個肽段對應(yīng)的編號為縱排 和橫排編號的組合，例如橫排第1個，縱排第b行，其編號為bl，在該纖維素膜上，從al開始 依次點樣相互交疊最大的肽段，例如all和al2這一鄰接的點樣點中，al2的前15個氨基 酸與all的后15個氨基酸相互重疊。將前述合成的涵蓋人組織蛋白酶D蛋白完整氨基酸序列的133個肽段的點樣點的 纖維素膜分別與5例胰腺癌患者的混合血清、來自上述5例中的單個1例胰腺癌患者的血 清，以及4例健康對照的混合血清共孵育。然后，該纖維素膜先后依次置于100%、75%和 50%的乙醇中各5分鐘，除了所用的待測血清不同外，其余與實施例3中的步驟a)-h)的操 作相同。免疫印跡結(jié)果(參見圖2)顯示，胰腺癌患者的血清與膜雜交后，血清中的自抗體 所識別的序列位于all、al2、cl3 16、gl2和gl3 (圖A和B)等肽段；健康對照血清與NC 膜雜交后，血清自抗體所識別的位點位于cl3 16、gl2和gl3 (圖C)等完全不同的肽段區(qū) 域。產(chǎn)生陽性信號相鄰位點的重疊氨基酸序列即為抗原線性表位?；谝陨弦认侔┖徒】祵φ昭咫s交結(jié)果，共確定了人組織蛋白酶D完整氨基酸 序列中3個抗原線性表位:RTMSEVGGSVEDLIA(SEQID NO 11 人組織蛋白酶D的第34-48 位)，其對應(yīng)的編碼核苷酸序列為 5’ CGGACCATGTCGGAGGTTGGGGGCTCTGTGGAGGACCTGATTGCC 3，(SEQ ID NO 13) ；ASALGGVKV(166-174aa)和 TVFDRDNNRVGFAEAAR(395-41 laa)。其中， RTMSEVGGSVEDLIA肽段(34-48aa)特異性地被胰腺癌外周血自身抗體識別(all和al2陽性 信號位點)，而且該肽段正是位于SEQ ID NO :1(人組織蛋白酶D的第33-50位氨基酸)所 示序列所包含的序列，提示SEQ ID NO :11是胰腺癌特異的抗原表位中非常關(guān)鍵的部分，本 身也可以作為抗原表位。工業(yè)應(yīng)用本發(fā)明的自身抗原表位可應(yīng)用于自身抗體捕獲和自身免疫疾病相關(guān)指標檢測，腫 瘤相關(guān)標志物的檢測等方面。在許多情況下，與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的表位肽的成本更為 低廉、檢測精確度更高。序列表<110>中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所<120>—種自身抗原表位、其編碼基因及其用途<130>IDC090031<160>13<170>PatentIn version 3. 2<210>1
<211>18
<212>PRT<213>人工序列<400>1Arg Arg Thr Met Ser Glu Val Gly Gly Ser Val Glu Asp Leu lie Ala151015Lys Gly<210>2<211>18<212>PRT<213>人工序列<400>2Tyr Ser Gln Ala Val Pro Ala Val Thr Glu Gly Pro lie Pro Glu Val151015Leu Lys<210>3<211>18<212>PRT<213>人工序列<400>3Gln Val Phe Gly Glu Ala Thr Lys Gln Pro Gly lie Thr Phe lie Ala151015Ala Lys<210>4<211>18<212>PRT<213>人工序列<400>4Glu Ala Thr Lys Gln Pro Gly lie Thr Phe lie Ala Ala Lys Phe Asp151015Gly lie<210>5<211>18<212>PRT<213>人工序列<400>5lie Ala Ala Lys Phe Asp Gly lie Leu Gly Met Ala Tyr Pro Arg lie151015Ser Val<210>6
<211>18<212>PRT<213>人工序列<400>6lie Ser Val Asn Asn Val Leu Pro Val Phe Asp Asn Leu Met Gln Gln151015Lys Leu<210>7<211>18<212>PRT<213>人工序列<400>7Asp Pro Asp Ala Gln Pro Gly Gly Glu Leu Met Leu Gly Gly Thr Asp151015Ser Lys<210>8<211>18<212>PRT<213>人工序列<400>8Ala lie Gly Ala Val Pro Leu lie Gln Gly Glu Tyr Met lie Pro Cys151015Glu Lys<210>9<211>18<212>PRT<213>人工序列<400>9Pro Cys Glu Lys Val Ser Thr Leu Pro Ala lie Thr Leu Lys Leu Gly151015Gly Lys<210>10<211>18<212>PRT<213>人工序列<400>10Gly Lys Gly Tyr Lys Leu Ser Pro Glu Asp Tyr Thr Leu Lys Val Ser151015Gln Ala
<210>11<211>15<212>PRT<213>人工序列<400>11Arg Thr Met Ser Glu Val Gly Gly Ser Val Glu Asp Leu lie Ala151015<210>12<211>54<212>DNA<213>人工序列<400>12cgccggacca tgtcggaggt tgggggctct gtggaggacc tgattgccaa aggc54<210>13<211>45<212>DNA<213>人工序列<400>13cggacca tgtcggaggt tgggggctct gtggaggacc tgattgcc4權(quán)利要求
抗原表位，其選自下述序列之一(a)SEQ ID NO1或11所示的氨基酸序列；(b)具有作為組織蛋白酶D的抗原表位的功能的、且由與SEQID NO1或者11所示的氨基酸序列具有95％以上同源性的氨基酸序列構(gòu)成的氨基酸序列；和(c)具有作為組織蛋白酶D的抗原表位的功能的、且由經(jīng)過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸的SEQ ID NO1或11所示的氨基酸序列構(gòu)成的氨基酸序列。
2.編碼權(quán)利要求1的抗原表位的基因，其選自下述序列之一(a)SEQ ID NO 12所示的編碼SEQ ID NO 1的核苷酸序列；(b)SEQID NO 13所示的編碼SEQ ID NO 11的核苷酸序列；(c)編碼下述氨基酸序列的核苷酸序列所述氨基酸序列是具有作為組織蛋白酶D的 抗原表位的功能的、且由與SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列具有95%以上同源性的氨基酸 序列構(gòu)成的氨基酸序列；(d)編碼下述氨基酸序列的核苷酸序列所述的氨基酸序列是具有作為組織蛋白酶D 的抗原表位的功能、且由經(jīng)過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸的SEQ ID NO :1所示的氨 基酸序列構(gòu)成的氨基酸序列；和(d)因為密碼子簡并性而分別與SEQ ID NO :12和13不同、但是編碼SEQ ID NO :1或 11所示氨基酸序列的核苷酸序列。
3.含有權(quán)利要求2的基因的重組載體。
4.用權(quán)利要求4的重組載體轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)染得到的遺傳工程化宿主細胞。
5.權(quán)利要求1的抗原表位或權(quán)利要求2的基因的用途，其用于制備下述制劑之一(a)組織蛋白酶D的抗原表位；(b)組織蛋白酶D的胰腺癌特異的抗原表位；(c)檢測人組織蛋白酶D的抗體；和(d)疫苗。
6.權(quán)利要求5的應(yīng)用，其特征在于權(quán)利要求1所述的抗原表位或權(quán)利要求2的基因在 制備用于檢測胰腺癌血清中自身抗體的制劑中的用途。
7.權(quán)利要求5的應(yīng)用，其特征在于權(quán)利要求1所述的抗原表位或權(quán)利要求2的基因在 制備用于檢測胰腺癌血清中自身抗體的試劑盒中的用途。
8.胰腺癌檢測方法，其包括使用權(quán)利要求1的抗原表位或權(quán)利要求2的基因。
全文摘要
本發(fā)明涉及免疫化學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和腫瘤免疫領(lǐng)域。具體地涉及一種自身抗原表位、其編碼基因及其用途。更具體地，涉及人組織蛋白酶D(cathepsin D)抗原表位區(qū)及其編碼基因，以及這種多肽在鑒定胰腺癌患者血清中自身抗體中的用途。
文檔編號C12N1/21GK101885758SQ20091013634
公開日2010年11月17日 申請日期2009年5月11日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月11日
發(fā)明者何平, 劉芳, 劉飛, 周蘭萍, 孫玉琳, 安懷杰, 張金強, 李潛, 謝鵬, 趙曉航 申請人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所