專利名稱：微生物菌種的存活率及活性的檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種微生物菌種的存活率及活性的檢測(cè)方法，特 別是涉及一種采用實(shí)時(shí)掃描微生物生長(zhǎng)而快速測(cè)定菌種的存活率及活性的方法。
背景技術(shù)：
微生物菌種的保存是一項(xiàng)非常重要的工作，在科研和檢測(cè)過程中有研究?jī)r(jià)值的微 生物菌種都需要保存下來，并且還有很多專業(yè)機(jī)構(gòu)專門從事微生物菌種的保存工作。微生 物菌種采用不同的保護(hù)劑，經(jīng)過不同的方式保存。保存起來后，每隔一段時(shí)間就需要對(duì)菌種 進(jìn)行抽樣，并測(cè)定抽取菌種的存活率及活性，然后根據(jù)存活率及活性情況確定是否可以繼 續(xù)保存，或需要復(fù)壯后重新保存。該項(xiàng)測(cè)定工作，工作量大，并要求實(shí)驗(yàn)重復(fù)性好。微生物菌種存活率測(cè)定，即將微生物菌種復(fù)活后，進(jìn)行計(jì)數(shù)；微生物菌種活性測(cè) 定，通常是將菌種復(fù)活后，培養(yǎng)一段時(shí)間，定期取樣計(jì)數(shù)，測(cè)定其生長(zhǎng)曲線。兩種測(cè)定都需要 進(jìn)行微生物計(jì)數(shù)，目前計(jì)數(shù)方法除了傳統(tǒng)的活菌染色顯微鏡計(jì)數(shù)、平板計(jì)數(shù)等方法外，還有 濁度法和噻唑藍(lán)(MTT)法。前兩種傳統(tǒng)方法，耗時(shí)長(zhǎng)，操作繁瑣，在大規(guī)模、重復(fù)性測(cè)定中更 加顯得很不方便。濁度法，其原理是細(xì)菌生長(zhǎng)，濁度增加。但是，由于濁度的分辨率較低， 且不同微生物數(shù)量與濁度的關(guān)系也不同，因此常常發(fā)生以下兩個(gè)問題一是，菌懸液濁度很 低，但是實(shí)際菌懸液中微生物數(shù)量已經(jīng)大量增值；二是，雖然兩種菌濁度數(shù)值非常相近，但 是實(shí)際菌懸液中兩種菌的數(shù)量相差3個(gè)數(shù)量級(jí)以上，從而造成濁度法計(jì)數(shù)微生物時(shí)出現(xiàn)濁 度與微生物數(shù)量不一致情況，因此在大規(guī)模、重復(fù)性測(cè)定中一般使用得較少。MTT法克服了濁度法的缺點(diǎn)，其原理是在微生物生長(zhǎng)一段時(shí)間后，加入MTT和二甲 基亞砜，終止反應(yīng)，產(chǎn)生藍(lán)色，測(cè)定520nm處吸收，其吸收值與微生物數(shù)量成正比。但，目前 采用的MTT法均采用終點(diǎn)法檢測(cè)，且通過建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量，實(shí)驗(yàn)操作繁瑣，且無法 實(shí)現(xiàn)快速的實(shí)時(shí)檢測(cè)。因此，本領(lǐng)域需要一種更為簡(jiǎn)便、快速的測(cè)定菌種存活率和活性的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種微生物菌種存活率及活性的檢測(cè)方法，應(yīng)用這種方法 可快速、簡(jiǎn)便地檢測(cè)菌種的存活率及活性，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果，如果菌種存活率高、活性好，則該 菌種可以繼續(xù)保存，如果菌種存活率低或活性低，則可以通過復(fù)壯措施提高其存活率和活 性，重新保存。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種微生物菌種的存活率及活性的檢測(cè)方法，其 包括如下步驟A.將微生物菌種溶解在含有噻唑藍(lán)的培養(yǎng)液中，并進(jìn)行稀釋得到菌懸液；B.將不同稀釋梯度的菌懸液加入到培養(yǎng)板的各孔中；和C.實(shí)時(shí)掃描測(cè)定，根據(jù)掃描結(jié)果計(jì)算菌種的存活率、判斷菌種的活性。由于只要有活菌存在，經(jīng)過培養(yǎng)就能使噻唑藍(lán)產(chǎn)生藍(lán)色物質(zhì)，因此可根據(jù)出現(xiàn)吸收峰的孔的情況，確定發(fā)生生長(zhǎng)的最低3個(gè)稀釋度和發(fā)生生長(zhǎng)的孔數(shù)，例如可通過參考大 腸菌群最大可能數(shù)(MPN)檢索表，確定菌種中活菌數(shù)量。將得到的保存菌種中的活菌數(shù)量 除以菌種原先的活菌數(shù)量，可計(jì)算得出存活率。由于吸收值與菌種生長(zhǎng)情況成正比，因此可根據(jù)實(shí)時(shí)掃描獲得的時(shí)間-吸收曲線 形狀判斷微生物菌種生長(zhǎng)活性。生長(zhǎng)曲線可分為三種類型陡峭型、中間型、平緩型。陡峭 型，延滯期短，對(duì)數(shù)期幾乎呈直線上升，穩(wěn)定期維持在較高的吸收值，且持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)；中間 型，延滯期長(zhǎng)，對(duì)數(shù)期緩慢上升，穩(wěn)定期維持在較低的吸收值，且持續(xù)時(shí)間短，很快進(jìn)入衰亡 期；平緩型，整個(gè)曲線呈拋物線型或貼近X軸呈直線，一直維持較低的吸收值?；钚院玫木?種為陡峭型生長(zhǎng)曲線；活性差的菌種為中間型或平緩型生長(zhǎng)曲線。同一菌種不同稀釋度的 各孔的生長(zhǎng)曲線，延滯期長(zhǎng)短有差別，但是此后對(duì)數(shù)期的生長(zhǎng)斜率和穩(wěn)定期的吸收值基本 一致，從而可以根據(jù)生長(zhǎng)曲線的類型確定菌種的活性。本方法計(jì)數(shù)的原理是在含有MTT的培養(yǎng)基中加入多個(gè)(如8個(gè))梯度稀釋(如10 倍梯度稀釋)的菌懸液，每個(gè)菌株重復(fù)數(shù)次(如3次)，培養(yǎng)M小時(shí)后，確定發(fā)生生長(zhǎng)的最 低幾個(gè)(如3個(gè))稀釋度和發(fā)生生長(zhǎng)的孔數(shù)(出現(xiàn)吸收峰的孔表示該稀釋度有生長(zhǎng))，參考 大腸菌群最可能數(shù)(MPN)檢索表，確定菌種中活菌數(shù)量。將本方法得到的保存菌種中的活 菌數(shù)量，除以菌種原先的活菌數(shù)量，可計(jì)算得出存活率。本方法測(cè)定活性的原理是，菌種接種到各孔(如96孔)中后，培養(yǎng)M小時(shí)，隨著 孔中活菌數(shù)量的增加，藍(lán)色逐漸加深，其間實(shí)時(shí)掃描，測(cè)定各孔的吸收值，做時(shí)間-吸收曲 線，用于表征菌種的生長(zhǎng)情況。在高等動(dòng)物細(xì)胞中，MTT被線粒體中的脫氫酶還原成藍(lán)色 Fomazan顆粒，因此在進(jìn)行高等動(dòng)物細(xì)胞數(shù)量和活性測(cè)定時(shí)，必須加入二甲基亞砜，使形成 的i^omazan顆粒能均勻溶解在細(xì)胞懸液中。而在細(xì)菌細(xì)胞中，琥珀酸脫氫酶存在于質(zhì)膜和 間體中，MTT被細(xì)菌活細(xì)胞的琥珀酸脫氫酶利用后產(chǎn)生i^omazan顆粒，很容易擴(kuò)散到菌懸液 中，且在一定范圍內(nèi)，i^mazan顆粒形成的量并與細(xì)菌細(xì)胞脫氫酶活性有關(guān)，也與細(xì)菌細(xì)胞 數(shù)量成正比。因此，在細(xì)菌生長(zhǎng)測(cè)定時(shí)，可以采取實(shí)時(shí)掃描方法，連續(xù)測(cè)定時(shí)間-吸收曲線， 吸收值的高低與細(xì)菌數(shù)量成正比，因此可以用該曲線表示細(xì)菌的生長(zhǎng)情況。根據(jù)本發(fā)明的微生物菌種的存活率及活性的檢測(cè)方法，所述步驟A中的培養(yǎng)液優(yōu) 選為腦心浸液培養(yǎng)液。所述步驟B中的菌懸液的稀釋梯度為10倍梯度。所述步驟C中的 存活率是參考大腸菌群最可能數(shù)檢索表，確定保存菌種中的活菌數(shù)量，再將該活菌數(shù)量除 以菌種開始保存時(shí)的活菌數(shù)量，從而得到存活率。根據(jù)本發(fā)明的檢測(cè)方法的一個(gè)實(shí)施方式，所述檢測(cè)方法包括以下步驟將噻唑藍(lán)用PBS配置成5 士0. 5%的儲(chǔ)備液，滅菌，冰箱保存；將噻唑藍(lán)儲(chǔ)備液加入 腦心浸液培養(yǎng)液中，使其終濃度達(dá)到0. 1 士0. 05%，滅菌，冰箱保存?zhèn)溆?；將含有噻唑藍(lán)的 腦心浸液加入到培養(yǎng)板的各孔中；將菌種用腦心浸液培養(yǎng)液溶解后，用無菌水進(jìn)行10倍梯 度系列稀釋；將各稀釋度的菌懸液加入微孔中；將微孔板放入酶標(biāo)儀中，將培養(yǎng)溫度設(shè)定 為36°C，測(cè)定波長(zhǎng)為520nm，使用動(dòng)力學(xué)測(cè)定模式，每隔一段時(shí)間測(cè)定一次，連續(xù)測(cè)定一定 時(shí)間；根據(jù)掃描結(jié)果計(jì)算菌種的存活率、判斷菌種的活性。根據(jù)本發(fā)明的檢測(cè)方法的一個(gè)實(shí)施方式，所述檢測(cè)方法包括以下步驟將噻唑藍(lán) 用PBS配置成5士0. 5%的儲(chǔ)備液，滅菌，4°C冰箱保存；將噻唑藍(lán)儲(chǔ)備液加入腦心浸液培養(yǎng) 液中，使其終濃度達(dá)到0. 1 士0. 05%，滅菌，4°C冰箱保存?zhèn)溆?；將含有噻唑藍(lán)的腦心浸液加入到96孔培養(yǎng)板的各孔中；將菌種用腦心浸液培養(yǎng)液溶解后，用無菌水進(jìn)行10倍梯度系列 稀釋到10_8 ；將KT1-KT8稀釋度的菌懸液加入微孔中；將微孔板放入酶標(biāo)儀中，將培養(yǎng)溫度 設(shè)定為36°C，測(cè)定波長(zhǎng)為520nm，使用動(dòng)力學(xué)測(cè)定模式，每隔30分鐘測(cè)定1次，連續(xù)測(cè)定M 小時(shí)；以測(cè)定時(shí)間為X軸，以吸收值為Y軸，作每孔的時(shí)間-吸收曲線；根據(jù)曲線判斷菌種活 性；參考大腸菌群最可能數(shù)檢索表，確定保存菌種中的活菌數(shù)量，再將該活菌數(shù)量除以菌種 開始保存時(shí)的活菌數(shù)量，得到菌種的存活率。對(duì)于本發(fā)明所述的微生物菌種存活率及活性的檢測(cè)方法，在測(cè)定菌種存活率時(shí)， 可將MPN法與噻唑藍(lán)顯色相結(jié)合，用于測(cè)定菌種中的活菌數(shù)量。與濁度法相比，具有更好的 特異性；與傳統(tǒng)方法相比，操作更簡(jiǎn)便，使用的試劑更少更經(jīng)濟(jì)。此外，可利用掃描儀通過實(shí) 時(shí)掃描獲得微生物曲線，通過曲線的形狀可判斷微生物活性，與傳統(tǒng)的微生物活性檢測(cè)方 法相比具有更簡(jiǎn)便、更經(jīng)濟(jì)的優(yōu)點(diǎn)。也就是說，本發(fā)明提供的微生物菌種存活率及活性的測(cè)定方法是通過實(shí)時(shí)掃描監(jiān) 控菌種在培養(yǎng)液中的生長(zhǎng)情況，從而定量測(cè)定其中的活菌數(shù)量，定性判斷活菌的活性。本發(fā)明尤其適宜于微生物菌種存活率及活性的快速測(cè)定，如發(fā)現(xiàn)菌種存活率高， 活性好，則可以繼續(xù)保存，如發(fā)現(xiàn)菌種存活率低，活性差，可通過菌種復(fù)壯手段，重新保存菌 種。按照本發(fā)明所述的檢測(cè)方法的一個(gè)實(shí)施方式，該方法采用以下簡(jiǎn)單過程微生物 菌種溶解在腦心浸液培養(yǎng)基中一將菌懸液進(jìn)行10倍梯度稀釋一將含有MTT的腦心浸 液培養(yǎng)基加入到96孔培養(yǎng)板——將不同稀釋梯度的菌懸液加入到各孔中——實(shí)時(shí)掃描測(cè) 定——根據(jù)出現(xiàn)吸收峰的情況查MPN表，計(jì)算菌種中的活菌數(shù)；根據(jù)時(shí)間-吸收曲線形狀， 判斷菌種的活性情況。微生物菌種溶解到腦心浸液培養(yǎng)液中(除了少部分營(yíng)養(yǎng)要求特殊的 微生物，絕大多數(shù)微生物菌種都能在營(yíng)養(yǎng)豐富的腦心浸液培養(yǎng)液中生長(zhǎng)繁殖)，隨著微生物 的生長(zhǎng)繁殖，產(chǎn)生琥珀酸脫氫酶，分解MTT，產(chǎn)生藍(lán)色的i^omazan。在520nm波長(zhǎng)下測(cè)定光強(qiáng) 度，作微生物時(shí)間-吸收生長(zhǎng)曲線，根據(jù)出現(xiàn)吸收峰的孔的情況，確定發(fā)生生長(zhǎng)的最低3個(gè) 稀釋度和發(fā)生生長(zhǎng)的孔數(shù)，參考大腸菌群最可能數(shù)(MPN)檢索表，確定菌種中活菌數(shù)量，將 本方法得到的保存菌種中的活菌數(shù)量，除以菌種原先的活菌數(shù)量，可計(jì)算得出存活率；根據(jù) 時(shí)間-吸收曲線形狀判斷微生物菌種生長(zhǎng)活性。如發(fā)現(xiàn)微生物菌種存活率與上次檢測(cè)結(jié)果 相比驟降，或者存活率低于50%，或生長(zhǎng)曲線呈中間型和平緩型，則微生物菌種存活率和活 性出現(xiàn)問題，需要通過菌種復(fù)壯手段，復(fù)壯菌種后重新保存；如發(fā)現(xiàn)微生物菌種存活率高于 50%，且與上次檢測(cè)結(jié)果相比變化不顯著，且生長(zhǎng)曲線呈陡峭型，則微生物菌種存活率和活 性高，可繼續(xù)保存。本發(fā)明雖然也采用MTT指示微生物生長(zhǎng)，但是使用了多孔板培養(yǎng)微生物，并實(shí)時(shí) 掃描測(cè)定含有MTT的培養(yǎng)液的吸光值變化，從而簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)操作，提高了檢測(cè)效率。使用本 微生物菌種存活率及活性實(shí)時(shí)掃描測(cè)定方法，能夠便捷、快速和高效地定期檢測(cè)保存的菌 種的存活率及活性。


圖1為經(jīng)過1年保存的阪崎腸桿菌菌種實(shí)時(shí)生長(zhǎng)圖譜。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明，但本發(fā)明并不限于這些實(shí)施 例。實(shí)施例本實(shí)施例以舉例說明的方式對(duì)一些菌種進(jìn)行了實(shí)時(shí)掃描測(cè)定，但本發(fā)明的范圍并 不限于本實(shí)施例。將噻唑藍(lán)用PBS配置成5%的儲(chǔ)備液，滅菌，4°C冰箱保存。將噻唑藍(lán)儲(chǔ)備液加入腦 心浸液培養(yǎng)液，使其終濃度達(dá)到0. 1 %，滅菌，4°C冰箱保存?zhèn)溆?。?80 μ 1含有噻唑藍(lán)的腦 心浸液加入到96孔培養(yǎng)板的每一孔中。打開菌種管，將菌種用腦心浸液培養(yǎng)液溶解后，用 無菌水進(jìn)行10倍梯度系列稀釋到10_8。按列加入KT1-KT8稀釋度的菌懸液20 μ 1到微孔 中，每個(gè)稀釋度重復(fù)3次，即1株菌種3列；每塊微孔板12列，可實(shí)現(xiàn)4株菌種的檢測(cè)。蓋 上微孔板蓋子，將微孔板放入酶標(biāo)儀中，將培養(yǎng)溫度設(shè)定為36°C，測(cè)定波長(zhǎng)為520nm，使用 動(dòng)力學(xué)測(cè)定模式，每隔30分鐘測(cè)定1次，連續(xù)測(cè)定M小時(shí)。以測(cè)定時(shí)間為X軸，以吸收值 為Y軸，作每孔的時(shí)間-吸收曲線。如有相應(yīng)軟件，可直接采用軟件，制作生長(zhǎng)曲線。由于 只要有活菌存在，經(jīng)過培養(yǎng)就能使噻唑藍(lán)產(chǎn)生藍(lán)色物質(zhì)，因此可根據(jù)出現(xiàn)吸收峰的孔的情 況，確定發(fā)生生長(zhǎng)的最低3個(gè)稀釋度和發(fā)生生長(zhǎng)的孔數(shù)，參考大腸菌群最可能數(shù)(MPN)檢索 表，確定菌種中活菌數(shù)量。將本方法得到的保存菌種中的活菌數(shù)量，除以菌種原先的活菌數(shù) 量，可計(jì)算得出存活率。由于吸收值與菌種生長(zhǎng)情況成正比，因此可根據(jù)時(shí)間-吸收曲線形 狀判斷微生物菌種生長(zhǎng)活性。生長(zhǎng)曲線可分為三種類型陡峭型、中間型、平緩型。陡峭型， 延滯期短，對(duì)數(shù)期幾乎呈直線上升，穩(wěn)定期維持在較高的吸收值，且持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)；中間型，延 滯期長(zhǎng)，對(duì)數(shù)期緩慢上升，穩(wěn)定期維持在較低的吸收值，且持續(xù)時(shí)間短，很快進(jìn)入衰亡期；平 緩型，整個(gè)曲線呈拋物線型或貼近X軸呈直線，一直維持較低的吸收值?；钚院玫木N為陡 峭型生長(zhǎng)曲線；活性差的菌種為中間型或平緩型生長(zhǎng)曲線。同一菌種不同稀釋度的各孔的 生長(zhǎng)曲線，延滯期長(zhǎng)短有差別，但是此后對(duì)數(shù)期的生長(zhǎng)斜率和穩(wěn)定期的吸收值基本一致。從 而可以根據(jù)生長(zhǎng)曲線的類型確定菌種的活性。如發(fā)現(xiàn)微生物菌種存活率與上次檢測(cè)結(jié)果 相比驟降，或者存活率低于50%，或生長(zhǎng)曲線呈中間型和平緩型，則微生物菌種存活率和活 性出現(xiàn)問題，需要通過菌種復(fù)壯手段，復(fù)壯菌種后重新保存；如發(fā)現(xiàn)微生物菌種存活率高于 50%，且與上次檢測(cè)結(jié)果相比變化不顯著，且生長(zhǎng)曲線呈陡峭型，則微生物菌種存活率和活 性高，可繼續(xù)保存。按照本實(shí)施例描述的方法對(duì)表1所列菌種進(jìn)行實(shí)時(shí)掃描測(cè)定，菌種的存活率示于 表1中；一些菌種的實(shí)時(shí)生長(zhǎng)圖譜示于附圖中。圖1為經(jīng)過1年保存的阪崎腸桿菌菌種實(shí)時(shí)生長(zhǎng)圖譜變化情況，其中圖IA為保 存前的實(shí)時(shí)生長(zhǎng)圖譜(其中Al、Bi、Cl A6、B6、C6，DU D2、D3分別為IQCC10403-20、 IQCC10424、IQCC10434、IQCC10439、IQCC10456、IQCC10481、IQCC10486)，圖 IB 為保存 1 年 后的生長(zhǎng)圖譜(其中 Al、Bi、Cl A6、B6、C6, DU D2、D3 分別為 IQCC10424、IQCC10434、 IQCC10439、IQCC10456、IQCC10481、IQCC10486、IQCC10403-20)。比較圖 A 和圖 B 中阪崎腸 桿菌的生長(zhǎng)曲線，發(fā)現(xiàn)延滯時(shí)間，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期斜率和穩(wěn)定生長(zhǎng)期吸收值均差異不顯著，因此 判定該菌種經(jīng)過一年的保存活性沒有受到影響。表1保存1年后菌種的存活率
菌種名稱菌種編號(hào) (IQCC)存活率％菌種名稱菌種編號(hào) (IQCC)存活率％阪崎腸桿菌10403-1100都柏林沙門氏菌10523>10阪崎腸桿菌10403-2100鴨沙門氏菌10509100阪崎腸桿菌10403-3100病牛沙門氏菌10510100阪崎腸桿菌10403-4100波斯坦沙門氏菌10538100阪崎腸桿菌10403-5100甲型副傷寒沙門氏菌10518100阪崎腸桿菌10403-6100山夫頓堡沙門氏菌10520100阪崎腸桿菌10403-7100明尼蘇打沙門氏菌10519100阪崎腸桿菌10403-8100旺茲沃恩沙門氏菌10515100阪崎腸桿菌10403-9>10阿德萊德沙門氏菌10505100阪崎腸桿菌10403-10>10亞利桑那沙門氏菌10508100阪崎腸桿菌10403-11>10達(dá)喀爾沙門氏菌10521100阪崎腸桿菌10403-12>10伊思特本沙門氏菌10522100阪崎腸桿菌10403-13100邁阿密沙門氏菌10524100阪崎腸桿菌10403-14100雞沙門氏菌10525100阪崎腸桿菌10403-15100火雞沙門氏菌10526100阪崎腸桿菌10403-16100丙型副傷寒沙門氏菌10527100阪崎腸桿菌10403-17100阿蒙德奈斯沙門氏菌10541>10
權(quán)利要求
1.一種微生物菌種的存活率及活性的檢測(cè)方法，其包括如下步驟A.將微生物菌種溶解在含有噻唑藍(lán)的培養(yǎng)液中，并進(jìn)行稀釋得到菌懸液；B.將不同稀釋梯度的菌懸液加入到培養(yǎng)板的各孔中；和C.實(shí)時(shí)掃描測(cè)定，根據(jù)掃描結(jié)果計(jì)算菌種的存活率、判斷菌種的活性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述步驟A中的培養(yǎng)液為腦心浸液培 養(yǎng)液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述步驟B中的菌懸液的稀釋梯度為 10倍梯度。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述步驟C中的存活率是參考大腸菌 群最可能數(shù)檢索表，確定保存菌種中的活菌數(shù)量，再將該活菌數(shù)量除以菌種開始保存時(shí)的 活菌數(shù)量，從而得到存活率。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述檢測(cè)方法包括以下步驟將噻唑藍(lán)用PBS配置成5士0. 5%的儲(chǔ)備液，滅菌，冰箱保存；將噻唑藍(lán)儲(chǔ)備液加入腦 心浸液培養(yǎng)液中，使其終濃度達(dá)到0. 1 士0. 05%，滅菌，冰箱保存?zhèn)溆?；將含有噻唑藍(lán)的腦 心浸液加入到培養(yǎng)板的各孔中；將菌種用腦心浸液培養(yǎng)液溶解后，用無菌水進(jìn)行10倍梯度 系列稀釋；將各稀釋度的菌懸液加入微孔中；將微孔板放入酶標(biāo)儀中，將培養(yǎng)溫度設(shè)定為 36 °C，測(cè)定波長(zhǎng)為520nm，使用動(dòng)力學(xué)測(cè)定模式，每隔一段時(shí)間測(cè)定1次，連續(xù)測(cè)定一定時(shí) 間；根據(jù)掃描結(jié)果計(jì)算菌種的存活率、判斷菌種的活性。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述檢測(cè)方法包括以下步驟將噻唑 藍(lán)用PBS配置成5士0. 5%的儲(chǔ)備液，滅菌，4°C冰箱保存；將噻唑藍(lán)儲(chǔ)備液加入腦心浸液培 養(yǎng)液中，使其終濃度達(dá)到0. 1 士0. 05%，滅菌，4°C冰箱保存?zhèn)溆?；將含有噻唑藍(lán)的腦心浸液 加入到96孔培養(yǎng)板的各孔中；將菌種用腦心浸液培養(yǎng)液溶解后，用無菌水進(jìn)行10倍梯度系 列稀釋到10_8 ；將KT1-KT8稀釋度的菌懸液加入微孔中；將微孔板放入酶標(biāo)儀中，將培養(yǎng)溫 度設(shè)定為36°C，測(cè)定波長(zhǎng)為520·，使用動(dòng)力學(xué)測(cè)定模式，每隔30分鐘測(cè)定1次，連續(xù)測(cè)定 24小時(shí)；以測(cè)定時(shí)間為X軸，以吸收值為Y軸，作每孔的時(shí)間-吸收曲線；根據(jù)曲線判斷菌 種活性；參考大腸菌群最可能數(shù)檢索表，確定保存菌種中的活菌數(shù)量，再將該活菌數(shù)量除以 菌種開始保存時(shí)的活菌數(shù)量，得到菌種的存活率。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種微生物菌種的存活率及活性的檢測(cè)方法，其包括如下步驟A.將微生物菌種溶解在含有噻唑藍(lán)的培養(yǎng)液中，并進(jìn)行稀釋得到菌懸液；B.將不同稀釋梯度的菌懸液加入到培養(yǎng)板的各孔中；和C.實(shí)時(shí)掃描測(cè)定，根據(jù)掃描結(jié)果計(jì)算菌種的存活率、判斷菌種的活性。利用本發(fā)明的檢測(cè)方法可便捷、快速和高效地定期檢測(cè)保存的微生物菌種的存活率及活性。
文檔編號(hào)C12R1/01GK102051404SQ200910174930
公開日2011年5月11日 申請(qǐng)日期2009年11月3日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月3日
發(fā)明者張菲菲, 徐寶梁, 楊海榮, 袁飛, 趙勇勝, 趙貴明, 陳穎 申請(qǐng)人:中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院, 袁飛