專利名稱：禽流感病毒原位pcr檢測探針及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種禽流感病毒原位PCR檢測探針及其制備方法。
背景技術(shù)：
禽流感(avian influenza, Al)是由A型禽流感病毒引起的一種禽類從呼吸系統(tǒng)到全身性嚴(yán)重敗血癥等多種癥狀的綜合傳染病，該病是一種毀滅性疾病，高致病性毒株發(fā) 病率和死亡率可達100%，廣泛分布于世界各地，在有記載的禽病史上，每一次嚴(yán)重的爆發(fā) 都給養(yǎng)禽業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失，具有重大的公共衛(wèi)生意義。原位PCR是將PCR的高效率擴增和原位雜交的細胞定位相互結(jié)合，從而在組織細 胞原位檢測微量拷貝的靶DNA或RNA序列，已被廣泛應(yīng)用于艾滋病、口蹄疫和藍耳病等十幾 種病毒的檢測中，取得了較為理想的結(jié)果。本研究采用的間接原位PCR方法，最早見于20 世紀(jì)90年代初，由于其較強的特異性，是目前應(yīng)用最廣的靶核酸序列原位擴增技術(shù)。目前，禽流感的檢測已經(jīng)建立了許多方法，如雞胚病毒分離、血凝和血凝抑制試 驗、瓊擴試驗、ELISA、RT-PCR、熒光RT-PCR和NASBA等，近年來還有學(xué)者對基因芯片等分子 診斷技術(shù)進行了研究，但是對禽流感病毒(avianinfluenza virus, AIV)感染的細胞和組 織進行原位PCR檢測的報道并不多見。本發(fā)明中采用間接原位RT-PCR方法檢測細胞涂片 及動物組織中的禽流感病毒，為動物組織中禽流感病毒的檢測和致病機理研究提供更為敏 感、特異和直觀的方法。目前所用的探針有RNA探針、cDNA探針和DNA探針，可以是雙鏈DNA探針也可以 是單鏈cDNA探針。放射性同位素標(biāo)記物用放射自顯影顯示，放射線的擴散會引起定位不準(zhǔn) 確，放射線會對人體造成傷害，而且曝光時間長，檢測后的標(biāo)本不易保存，因此放射性同位 素逐漸被生物素-地高辛所取代，由于地高辛標(biāo)記相對簡便、流程較短、較為省時，使其逐 漸成為標(biāo)記物中的佼佼者。間接法原位PCR需要特異性標(biāo)記的探針，進行原位雜交，探針是原位PCR檢測成敗 的關(guān)鍵和基礎(chǔ)，在進行原位PCR之前，首先要研制所用探針。本發(fā)明所研制的是用地高辛標(biāo) 記的雙鏈DNA探針。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種特異性好、敏感性 高的禽流感病毒原位PCR檢測探針及其制備方法。本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是一種禽流感病毒原位PCR檢測探針，是利用RT-PCR 法制備，所述檢測探針的特異性引物序列為SEQl和SEQ2 SEQ 1 :5，AAGCGGAGGAAACACCAAC-3，；SEQ2 5，-ATGTCAAAGGAAGGCACGAT-3，。所述檢測探針是以地高辛為標(biāo)記物制得。所述引物擴增長度為270bp。
檢測探針的制備方法所采用的技術(shù)方案為所述制備方法包括以下步驟(1)特異性引物的設(shè)計，根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中AIV NP基因的核苷酸序列設(shè)計引 物，上下游引物序列分別為SEQl和SEQ2 ；(2)病毒RNA的提??；
(3)利用上述的上下游引物，以提取的病毒RNA為模板進行一步法RT-PCR擴增反 應(yīng)，獲得RT-PCR產(chǎn)物并用瓊脂糖凝膠電泳分析；(4) RT-PCR產(chǎn)物的克隆，把RT-PCR產(chǎn)物與克隆載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細 胞，提取重組質(zhì)粒；(5)對上述重組質(zhì)粒進行PCR鑒定和測序，篩選陽性質(zhì)粒；(6)將上述測序正確的DNA作為模板，加入DIG-High Prime制備探針。上述步驟 (3)中一步法RT-PCR反應(yīng)體系為滅菌DEPC 水24. OuLIOXone step RNA PCR Buffer 5. OuLMgCL2 (25mM)10. OuLdNTP Mixture(IOmM)5. OuLRNase Inhibitor (40u /uL)1. OuLAMV RTase XL(5u /uL)1. OuLAMV-Optimized Taq(5u/uL)1. OuL上游引物(IOpM)1. OuL下游引物(IOpM)1. OuL提取的病毒RNA1. OuL上述步驟(3)中一步法RT-PCR反應(yīng)的擴增條件為50°C 3Omin,反轉(zhuǎn)錄；94"C 2min, 1 個循環(huán)；94"C 30s, 55°C 30s, 72°C 30s, 35 個循環(huán)；72°C IOmin, 1 個循環(huán)。上述步驟(6)中以地高辛為標(biāo)記物制備探針的步驟包括(1)在離心管中加入IuL的測序正確的DNA產(chǎn)物，然后加入15uL滅菌的DEPC水；(2)蓋緊離心管蓋，沸水中保持IOmi n，取出后迅速置于冰水浴中5min ；(3)加入4uL輕緩混勻的DIG-High Prime，混勻后，置于37°C溫箱中20h，然后置 于65°C水浴IOmin終止反應(yīng)。本發(fā)明的有益效果是由于本發(fā)明中是從GeneBank下載禽流感病毒NP基因序列， 通過比對選取NP基因中較為保守的片斷，設(shè)計一對引物，通過RT-PCR方法擴增270bp的 目的片段，并用分子克隆方法構(gòu)建重組質(zhì)粒，測序后證實本研究設(shè)計的引物擴增序列與AIV 各亞型NP基因具有較高同源性，可達92%以上，利用地高辛標(biāo)記擴增產(chǎn)物制備探針。該探 針可特異性的檢測禽流感病毒，對于新城疫、傳染性法氏囊等病毒檢測結(jié)果為陰性，具有良 好的特異性，探針可以檢測出約lpg/uL的質(zhì)粒DNA，具有較高敏感性。


圖1是本發(fā)明實施例中特異性引物對NP基因進行RT-PCR電泳結(jié)果；其中M =DNA Marker DL20001 陽性對照2 =NP基因3 空白對照；圖2是本發(fā)明實施例中的引物特異性試驗電泳結(jié)果；其中M :DNA Marker DL20001 陽性對照 2 :NDV A 株，3:NDV B 株，4:NDV C 株，5:NDV D 株，6:NDV E 株，7:NDV F 株，8 =NDI 系，9 :ND II 系，10 :NDC30，11 :IBDV, 12 :IBV, 13 :EDS_76，14 :H5N2A 株，15 :H5N2B 株，16 :H5N2C 株，17 :H5N2D 株，18 :H5N2E 株，19 :H5N2F 株，20 :H9N2A 株，21 :H9N2B 株，22 H9N2C株，23 空白對照；圖3是本發(fā)明實施例中的PCR產(chǎn)物克隆電泳鑒定結(jié)果；其中M:DNA Marker DL20001 陽性對照；2 6 :NP基因的克隆菌；7 空白對照；圖4是本發(fā)明實施例中的探針的敏感性檢測結(jié)果；其中A行1 :10ng/uL ；2 =Ing/ uL ；3 :100pg/u L ；4 :10pg/uL 5 :lpg/uL ；6 0. lpg/uLB 行1 0. 05pg/uL ；2 0. 01pg/uL ；3 空載體質(zhì)粒；圖5是本發(fā)明實施例中的探針的特異性檢測結(jié)果；其中1 :AIV H5N2亞型，2 :AIV H9N1 亞型，3 :NDV,4 =IBDV, 5 =IBV, 6 :EDS_76，7 空白對照。
具體實施例方式下面以具體實施例對本發(fā)明作進一步闡述一、引物設(shè)計從GeneBank下載禽流感病毒NP基因序列，進行序列比對，選取NP基因中較為保 守的片段，利用Primer Premier 5. 0軟件設(shè)計一對引物，由上海英駿生物技術(shù)有限公司合
成，引物序列及長度見下表
引物名稱_引物序歹Ij_擴增長度(bp)
Pl 5'-AAG CGG AGG AAA CAC CAA C -3' P2_5'-ATG TCA AAG GAA GGC ACG AT -3, 270_二、探針的具體制備過程如下1、病毒RNA的提取在1.5mL離心管中，加入600uL RNA提取液與200uL收集的尿囊液，混勻，室溫放 置5分。加入200uL預(yù)冷氯仿，混勻，室溫放置3min。12000r/min4°C離心lOmin，取上清于 另一離心管，加200uL預(yù)冷異丙醇，室溫放置5min。12000r/min 4°C離心lOmin，棄上清，力口 入600uL 75%預(yù)冷乙醇，上下顛倒，12000r/min 4°C離心lOmin，棄上清。室溫近于干燥。加 20uL0. 1% DEPC處理過的水溶解沉淀RNA (所提取的RNA應(yīng)在2小時之內(nèi)盡快使用)。2、一步法 RT-PCR50uL反應(yīng)體系及擴增條件滅菌 DEPC 水24. OuL
IOXone step RNA PCR Buffer 5. OuLMgCL2 (25mM)10. OuLdNTP Mixture(IOmM)5. OuLRNase Inhibitor(40u/uL)1. OuLAMV RTase XL (5u/uL)1. OuLAMV-Optimized Taq(5u/uL)1. OuL上游引物Pl (IOpM)1. OuL下游引物P2 (IOpM)1. OuL提取的病毒RNA1. OuL混勻，啟動以下PCR程序50°C 3Omin,反轉(zhuǎn)錄；94"C 2min, 1 個循環(huán)；94"C 30s, 55°C 30s, 72°C 30s ；35 個循環(huán)，72°C lOmin，1 個循環(huán)RT-PCR結(jié)束后，取PCR產(chǎn)物用1. 0%瓊脂糖凝膠電泳分析(含EB染料)。如圖1 電泳結(jié)果所示，利用特異性引物對NP基因進行RT-PCR，擴增出270bp左右的DNA片段，與陽 性對照的片段大小相符，空白對照呈陰性，與理論預(yù)期結(jié)果相符。3、特異性試驗采用總反應(yīng)體系為50uL，反應(yīng)體系與2中相同，模板RNA分別為6株H5亞型分離毒株，3株H9亞型分離毒株，NDV, IBDV, IBV和EDS-76，反應(yīng)條件按4中的條件。如圖2特異性電泳結(jié)果所示，H5和H9亞型擴增出270bp左右的DNA片段，而NDV，IBDV，IBV, EDS-76用同樣引物進行擴增則為陰性，與理論預(yù)期值相符。4、RT-PCR產(chǎn)物克隆和鑒定將RT-PCR產(chǎn)物與pGEM-T Easy Vector克隆載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞， 經(jīng)氨芐青霉素平板篩選和PCR擴增，初步獲得部分陽性重組質(zhì)粒。將所獲重組質(zhì)粒經(jīng)傳LB 液體進行PCR擴增鑒定，所擴增的PCR產(chǎn)物，取7uL用1.0%瓊脂糖凝膠進行電泳(含EB染 料)，選出含目的條帶的已傳LB液體培養(yǎng)菌液進行測序。如圖3的瓊脂糖凝膠電泳克隆鑒定結(jié)果，獲得270bp左右的目的帶，與預(yù)期理 論相符，說明所擴增的基因片段已正確轉(zhuǎn)入T載體中將測序得到的結(jié)果在NCBI上進行比較分析，發(fā)現(xiàn)測序結(jié)果與GenBank中注冊的多 株禽流感病毒NP基因的同源性在92%以上。與gb I CY028703. 11的同源性可達99%。AGCGGAGGAAACACCAACCAGCAGAGGGCATCTGCAGGACAGATCAGCGTTCAGCCCACTTTCTCGGTACAGAGAAACCTTCCCTTCGAAAGAGCGACCATTATGGCAGCATTTACAGGAAATACTGAGGGCAGAACGTCTGAC
ATGAGGACTGAAATCATAAGAATGATGGAAAGTGCCAGACCAGAAGATGTGTCATTCCAGGGGCGGGGAGTCTTCGAGCTCTCGGACGAAAAGGCAACGAACCCGATCGTGCCTTCCTTTGACAT5、檢測探針的標(biāo)記將測序正確的DNA作為制備探針的模板，在一個0. 5mL離心管中加入IuL的DNA產(chǎn)物，然后加入15uL滅菌的DEPC水，蓋緊離心管蓋，沸水中保持lOmin，取出后迅速置于冰水浴中5min，取4uL已輕緩混勻的DIG-HighP rime?；靹蚝?，置于37°C溫箱中20h，然后置 于65°C水浴IOmin終止反應(yīng)。6、探針標(biāo)記敏感性的測定用滅菌DEPC 水將質(zhì)粒 DNA 依次稀釋成 10ng/uL、Ing/uL、100pg/uL、10pg/uL、lpg/ uL、0. lpg/uL、0. 05pg/uL、0. Olpg/uL,置于沸水IOmin后，迅速放入冰水浴5min，然后分別 取IuL點樣于正電荷尼龍膜上。同時設(shè)立空載體為陰性對照。置于120°C固定30min。將 尼龍膜置于可密閉的容器中，加入已經(jīng)預(yù)熱到雜交溫度的15mL預(yù)雜交液，密封后置于40°C 預(yù)雜交2h。棄去預(yù)雜交液，按照每IOOcm2膜至少需要2. 5mL的量加入已預(yù)熱的雜交緩沖 液，按照每毫升雜交緩沖液需要IOOng新變性的DIG標(biāo)記探針加入雜交容器中，密封后置 于40°C雜交箱雜交16h。雜交完成后，將尼龍膜用2XSSC，0. 1% SDS室溫洗滌15minX2 次，用 0. 1XSSC，0. SDS 在 68°C洗滌 15minX2 次。將尼龍膜在 Buffer 1(5. 8g 馬來 酸，4. 38gNaCL加水溶解。用10mol/L NaOH調(diào)節(jié)PH至7. 5，定容至500mL，高壓滅菌)中漂 洗2min，在Buffer II (探針標(biāo)記試劑盒中的封閉貯存液用Buffer 110倍稀釋)中孵育 30min，取出尼龍膜置于酶標(biāo)DIG抗體工作液中37°C濕盒孵育30min，Washing Buffer洗 膜 5minX2，洗去未結(jié)合的抗體，BufferIII (50mL lmol/L Tris，2. 92gNaCL，5. 09gMgCL2，力口 DEPC水400mL，調(diào)節(jié)PH至9. 5，定容至500mL，高壓滅菌)中平衡3min。然后置于NBT/BCIP 顯色液中暗處顯色16h，DEPC水洗膜5min終止反應(yīng)，觀察結(jié)果并拍照。用探針雜交顯色結(jié) 果顯示，探針可以檢測出約lpg/uL的質(zhì)粒DNA (圖4)。其中Washing Buffer 為 5. 8g 馬來酸，4. 38gNaCL 加水溶解。用 10mol/LNa0H 調(diào)節(jié) PH至7. 5，定容至500mL，高壓滅菌。高壓滅菌后加入1. 5mLTween20,室溫保存。7、探針標(biāo)記特異性的測定分別抽提H5N2亞型、H9m亞型、NDV、IBDV、IBV、EDS-76的核酸，各取IuL點樣于 正電荷尼龍膜上。同時設(shè)立空白對照。置于120°C固定30min。按上述的方法進行雜交和 顯色，結(jié)果顯示(圖5):探針可與!15擬亞型、!19附亞型的1 離雜交顯色，與冊￥、180￥、18￥、 EDS-76病毒的核酸雜交結(jié)果為陰性。SEQUENCE L I ST I NG<110>中華人民共和國珠海出入境檢驗檢疫局<120>禽流感病毒原位PCR檢測探針及其制備方法<130><160>3<170>PatentIn version 3. 3<210>1<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc feature<222>(1). . (19)
<223>上游引物<400>1aagcggaggaaacaccaac19<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc feature<222>(1). . (20)<223>下游引物<400>2atgt caaaggaaggcacgat 20<210>3<211>269<212>DNA<213> 禽流感病毒(Avian Influenza)<400>3agcggaggaa acaccaacca gcagagggca t ctgcaggac agat cagcgt t cagcccact60ttctcggtac agagaaacct tcccttcgaa agagcgacca ttatggcagc atttacagga120aatactgagg gcagaacgtc tgacatgagg actgaaatca taagaatgat ggaaagtgcc180agaccagaag atgtgtcatt ccaggggcgg ggagtcttcg agctctcgga cgaaaaggca240acgaacccgatcgtgccttcctttgacat269
權(quán)利要求
一種禽流感病毒原位PCR檢測探針，其特征在于，運用RT-PCR法制備所述檢測探針的特異性引物序列為SEQ1，SEQ2SEQ15’-AAGCGGAGGAAACACCAAC-3’；SEQ25’-ATGTCAAAGGAAGGCACGAT-3’。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的禽流感病毒原位PCR檢測探針，其特征在于，所述檢測探針是 以地高辛為標(biāo)記物制得。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的禽流感病毒原位PCR檢測探針，其特征在于，所述引物擴增長 度為270bp。
4.一種禽流感病毒原位PCR檢測探針的制備方法，其特征在于，所述制備方法包括以 下步驟(1)特異性引物的設(shè)計，根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中AIVNP基因的核苷酸序列設(shè)計引物，上 下游引物序列分別為SEQ1，SEQ2 ；(2)病毒RNA的提取；(3)利用上述的上下游引物，以提取的病毒RNA為模板進行一步法RT-PCR擴增反應(yīng)，獲 得RT-PCR產(chǎn)物并用瓊脂糖凝膠電泳分析；(4)RT-PCR產(chǎn)物的克隆，把RT-PCR產(chǎn)物與克隆載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞，提 取重組質(zhì)粒；(5)對上述重組質(zhì)粒進行PCR鑒定和測序，篩選陽性質(zhì)粒；(6)將上述測序確定正確的DNA作為模板，加入DIG-HighPrime制備探針。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的禽流感病毒原位PCR檢測探針的制備方法，其特征在于，所述 步驟(3)中一步法RT-PCR反應(yīng)體系為滅菌 DEPC 水24. OuLIOXone step RNA PCR Buffer5. OuL25mM MgCL210. OuLIOmM dNTP Mixture5. OuL40u/uL RNase Inhibitor1. OuL5u/uL AMV RTase XL1. OuL5u/uL AMV-Optimized Taq1. OuLIOpM上游引物l.OuLIOpM下游引物l.OuL提取的病毒RNA1. OuL0
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的禽流感病毒原位PCR檢測探針的制備方法，其特征在于，所述 步驟(3)中一步法RT-PCR反應(yīng)的擴增條件為50 0C 30min，反轉(zhuǎn)錄； 940C 2min, 1 個循環(huán)； 940C 30s, 550C 30s, 72°C 30s，35 個循環(huán)； 72°C 10min，l 個循環(huán)。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的禽流感病毒原位PCR檢測探針的制備方法，其特征在于，所述 步驟(6)中以地高辛為標(biāo)記物制備探針的步驟包括(1)在離心管中加入IuL的測序正確的DNA產(chǎn)物，然后加入15uL滅菌的DEPC水；(2)蓋緊離心管蓋，沸水中保持lOmin，取出后迅速置于冰水浴中5min；(3)加入4uL已輕緩混勻的DIG-HighPrime,混勻后，置于37°C溫箱中20h，然后置于 65°C水浴IOmin終止反應(yīng)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種特異性好、敏感性高的禽流感病毒原位PCR檢測探針及其制備方法。該方法從GeneBank下載禽流感病毒NP基因序列，通過比對選取NP基因中較為保守的片斷，設(shè)計一對引物，通過RT-PCR方法擴增270bp的目的片段，并分子克隆構(gòu)建重組質(zhì)粒測序，測序后證實本研究設(shè)計的引物擴增序列與AIV各亞型NP基因具有較高同源性，可達92％以上，利用地高辛標(biāo)記擴增產(chǎn)物制備探針。該探針用于間接原位RT-PCR檢測方法對細胞內(nèi)的禽流感病毒進行檢測和定位，可特異性的檢測禽流感病毒，而新城疫、傳染性法氏囊等病毒檢測為陰性，具有良好的特異性，探針可以檢測到約1pg/uL的質(zhì)粒DNA，具有高敏感性。
文檔編號C12R1/93GK101818208SQ20091021405
公開日2010年9月1日 申請日期2009年12月22日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月22日
發(fā)明者廖明, 廖秀云, 徐海聶, 楊素, 沙才華, 陳博文 申請人:中華人民共和國珠海出入境檢驗檢疫局