專利名稱：前列腺癌分子標(biāo)記的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及到診斷前列腺癌的診斷的方法，尤其是診斷低危(LG)前列腺癌，即， 預(yù)后良好的個(gè)體；高危的(HG)前列腺癌，即；預(yù)后不良的原發(fā)腫瘤個(gè)體；PrCa Met，S卩，預(yù)后不良且轉(zhuǎn)移的個(gè)體；和去勢(shì)難治性前列腺癌(CRPC)，S卩，內(nèi)分泌治療下為進(jìn)行性并且遭受侵入性局部病變的預(yù)后不良個(gè)體。本發(fā)明進(jìn)一步涉及使用指定基因的表達(dá)用于診斷前列腺癌及用于診斷前列腺癌的試劑盒部分。
背景技術(shù)：
在西方男性人群中，前列腺癌已變成一個(gè)主要的公共健康問題。在許多發(fā)展國(guó)家， 它不僅是最常見的確診惡性腫瘤，前列腺癌也是第二大導(dǎo)致男性癌癥相關(guān)死亡的原因。因?yàn)榍傲邢侔┑陌l(fā)病率隨年齡增加，新診斷病例數(shù)隨著一般人群的人口預(yù)期壽命延長(zhǎng)而持續(xù)上升。在美國(guó)，每年約有193，000個(gè)男性，在歐洲每年約有183，000個(gè)男性，被新診斷出患有前列腺癌。流行病學(xué)研究表明前列腺癌是一種無痛疾病，并且，更多男性帶著前列腺癌死亡， 而不是因?yàn)榛记傲邢侔┧劳?。然而，腫瘤的一個(gè)明顯部分是表現(xiàn)為侵入性，其結(jié)果每年大約 35，800個(gè)美國(guó)男性和大約80，000的歐洲男性死于該病。缺乏有效的治療方法用于轉(zhuǎn)移性前列腺癌治療的結(jié)果是高的死亡率。有轉(zhuǎn)移病變的男性一般選擇去除雄性激素的治療方法。最初，70%到80%的重病患者對(duì)治療出現(xiàn)反應(yīng)， 但是隨著時(shí)間發(fā)展，觀察大多數(shù)腫瘤變?yōu)樾奂に胤且蕾囆?，并被命名為去?shì)抗性階段(正式命名為激素抗性階段)。結(jié)果，大多數(shù)病人發(fā)展為進(jìn)行性疾病。目前，仍沒有有效的治療方式用于前列腺癌去勢(shì)抗性階段。多于70%的去勢(shì)抗性患者遭受骨轉(zhuǎn)移的疼痛，骨轉(zhuǎn)移也是發(fā)病的主要原因。根治性前列腺切除術(shù)和放射療法是治療前列腺癌有效的治療選擇，但這些治療的潛力受限于解剖上的局部病變。因此，當(dāng)這種疾病限于前列腺時(shí)的前列腺癌的早期檢測(cè)極其重要。自從在20多年前被發(fā)現(xiàn)，前列腺特異性抗原(PSA)已經(jīng)成為前列腺癌的檢測(cè)、疾病分期和監(jiān)測(cè)的最有價(jià)值工具。盡管作為前列腺癌標(biāo)記被廣泛接受，但是眾所周知前列腺特異性抗原(PSA)為前列腺組織-而不是前列腺癌-特異性。據(jù)報(bào)道，良性前列腺增生癥 (BPH)和前列腺炎的男性PSA水平增高。在帶有良性的前列腺疾病和前列腺癌的男性之間， 血清中PSA值大量重疊，是促成PSA作為前列腺癌分子標(biāo)記限定性使用的主要因素。進(jìn)而，PSA的單一讀數(shù)不能用于區(qū)別無痛性腫瘤中的侵入性腫瘤。監(jiān)測(cè)血漿PSA值大于3ng/ml以上，常規(guī)的診斷方法是傳統(tǒng)的六分儀經(jīng)直腸超聲檢查引導(dǎo)的活體前列腺活組織檢查。然而，血漿PSA的低特異性，導(dǎo)致70%到80%的活組織檢查為陰性。在一些病例中，活組織檢查標(biāo)本可能不具有代表性，歸于沒能檢測(cè)出某些癌癥，或換句話說，錯(cuò)誤的陰性診斷。目前，大多數(shù)學(xué)術(shù)中心推薦診斷集擴(kuò)展到10個(gè)活組織檢查，從而接受診斷更多的無痛性癌癥的風(fēng)險(xiǎn)。在血清PSA水平持續(xù)上升的情況下，重復(fù)活組織檢查被提出，其至少有10%的指示癌癥的可能性。此外，如果結(jié)合使用PSA，DRE和TRUS活組織檢查指出臨床上定義的癌癥，發(fā)現(xiàn)這些男性中40%已有額外囊狀病變迫近根治性前列腺切除術(shù)。因此，無損傷的分子檢測(cè)，鑒別那些在早期階段患者的能力，迫切需要臨床上集中的前列腺癌，從而通過早期自由基的干預(yù)提供延長(zhǎng)的存活率和生活質(zhì)量。在組織分子標(biāo)記鑒定可以作為用于新的以體液為基礎(chǔ)的前列腺癌分子測(cè)試新的靶點(diǎn)。分子生物領(lǐng)域最新的發(fā)展，已經(jīng)提供通往發(fā)現(xiàn)許多新的有希望的前列腺癌生物標(biāo)記的工具。這些生物標(biāo)記也許可作為發(fā)展有高度特異性的前列腺癌診斷和/或預(yù)后的新試驗(yàn)的手段。一個(gè)合適的生物標(biāo)記優(yōu)選能滿足以下兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)1)它必須可重現(xiàn)(在組內(nèi)和組間)并且2)它必須對(duì)臨床治療有影響。此外，對(duì)診斷為目的的，生物標(biāo)記在涉及到組織特異性和辨別前列腺癌、正常的前列腺和BPH的能力，其可被檢測(cè)到是很重要的。而且，可以預(yù)見到(多重的)以生物標(biāo)記為基礎(chǔ)的檢測(cè)，加強(qiáng)癌癥診斷的特異性。鑒于上述情況，在指示癌癥和臨床結(jié)果的生物學(xué)行為的分子預(yù)后生物標(biāo)記領(lǐng)域有迫切的需要。對(duì)前列腺癌的新候選標(biāo)記的鑒定，研究惡性和良性前列腺組織的表達(dá)模式是優(yōu)化的，更優(yōu)選與其他醫(yī)學(xué)數(shù)據(jù)相關(guān)。在分子生物領(lǐng)域最新的發(fā)展，提供了能全面并且快速的評(píng)價(jià)前列腺樣品中基因組改變和蛋白質(zhì)改變的工具。例如，識(shí)別染色體異常，像細(xì)胞中染色體數(shù)目的改變、易位、缺失、重排和重復(fù)， 可以使用熒光原位雜交(FISH)分析研究。比較基因組雜交(CGH)也能篩選完全基因組中大量的DNA序列拷貝數(shù)改變或者缺失的巨堿基大于10對(duì)的情況。差異顯示分析法 (Differential display analysis)，基因表達(dá)系列分析(SAGE)，寡核苷酸陣列和cDNA陣列表征基因表達(dá)譜。這些技術(shù)經(jīng)常結(jié)合使用組織微陣列(TMA)，用于識(shí)別在特定生物過程起重要作用的基因?？紤]遺傳變異經(jīng)常導(dǎo)致蛋白突變或改變，細(xì)胞的信號(hào)通路也會(huì)受到影響。最后，因此可以導(dǎo)致癌細(xì)胞的生存優(yōu)勢(shì)，或者提高存活率。蛋白組學(xué)研究了識(shí)別改變的蛋白，以結(jié)構(gòu)，數(shù)量，和翻譯后修飾的方式。相關(guān)疾病的蛋白可以被直接被測(cè)序，并使用基質(zhì)輔助的激光解吸-電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-T0F)法，在未受損的整個(gè)組織切片中識(shí)別。此外，表面增強(qiáng)激光解析電離飛行時(shí)間(SELDI)-TOF質(zhì)譜(MQ能提供組織細(xì)胞和體液如血清或尿中的快速蛋白表達(dá)圖譜。在過去的幾年，這些分子工具已經(jīng)用于識(shí)別被認(rèn)為與前列腺癌發(fā)展相關(guān)的數(shù)百個(gè)基因。這些發(fā)現(xiàn)不僅使得了解更多前列腺癌的起始和進(jìn)展，而且其還表明前列腺癌是一個(gè)真正的異質(zhì)性疾病。因?yàn)樵摬《嗖≡畹奶攸c(diǎn)，若干前列腺腫瘤可以出現(xiàn)在一個(gè)患者的前列腺。這些腫瘤各自都能在基因表達(dá)和與變化預(yù)后相關(guān)的行為方面顯示顯著的不同。因此，預(yù)測(cè)該病的結(jié)果，更可能是一系列不同的標(biāo)記將有臨床價(jià)值。生物標(biāo)記可被分成四種不同的前列腺癌特異性事件基因組改變，前列腺癌特異性生物病變，后天修飾和基因在前列腺癌中的獨(dú)特表達(dá)。前列腺癌最強(qiáng)大的流行病學(xué)的風(fēng)險(xiǎn)因素之一是陽性的家族史。在對(duì)丹麥、瑞典和芬蘭44，788對(duì)雙胞胎的研究表明，42%的前列腺癌病例是歸因于遺傳。一直以來觀察到受侵入病人的兄弟之間比同一病人的兒子患病風(fēng)險(xiǎn)高。這樣導(dǎo)致形成一個(gè)假說，有X連鎖的或隱性的遺傳組分涉及到患前列腺癌的風(fēng)險(xiǎn)。對(duì)受侵入家庭基因組掃描涉及到至少7 個(gè)前列腺癌易感性基因座，命名為 HPCl (Iq24)，CAPB (Ip36), PCAP (Iq42)，ELAC2 (17pll)， HPC20 (20ql3)，8p22_23和HPCX (Xq27_28)。3個(gè)候選的遺傳前列腺癌基因已被繪制成這些基因座，染色體lqM-邪上HPC1/2' -5'-寡腺苷酸依賴的核糖核酸酶L (RNASEL)，定位在染色體8p22-23的巨噬細(xì)胞清道夫1基因(MSRI)，和染色體17pll上的HPC2/ELAC2。據(jù)推測(cè)前列腺癌易感基因很可能只能解釋10%的遺傳性前列腺癌的病例。另外 30%的家族性前列腺癌很有很能與共享的環(huán)境因子或者更多的常見遺傳性變異或多態(tài)性相關(guān)。這些變異在受影響的人群中可能高頻發(fā)生，所以他們對(duì)患前列腺癌風(fēng)險(xiǎn)的影響是實(shí)質(zhì)性的。在編碼雄激素受體(AR)，5CC-還原酶型II (SRD5A2)，CYP17，CYP3A，維他命D受體， PSA，GST-T1，GST-Ml，GST-Pl，IGF-I，和IGF結(jié)合蛋白3的基因中的多態(tài)性被研究用來來評(píng)價(jià)，是否它們能預(yù)測(cè)在前列腺活組織檢查中因PSA水平多于3ng/ml的病人有前列腺癌的存在。發(fā)現(xiàn)在雄激素受體，SRD5A2，CYP17，CYP3A4，維他命D受體，GST-Ml，GST-Pl，和IGF結(jié)合蛋白3基因型與前列腺癌風(fēng)險(xiǎn)沒有相關(guān)性。發(fā)現(xiàn)僅GST-Tl和IGF-I多態(tài)性與前列腺癌風(fēng)險(xiǎn)有適當(dāng)?shù)年P(guān)系。不同于家族性結(jié)腸癌中的腺瘤性結(jié)腸息肉病(APC)基因，上述任何的前列腺癌易感性基因和基因座，本身均不是引起最大比例的前列腺癌的主要原因。流行病學(xué)研究支持該想法，大多數(shù)的前列腺癌是歸因于如種族，生活方式，和飲食的因素。在原發(fā)的前列腺癌中，已知的致癌基因和腫瘤抑制基因中基因突變的作用可能非常小。例如，在原發(fā)前列腺癌中P53變異的頻率據(jù)報(bào)道是低的，但在接近50%的晚期前列腺癌中被觀察到。用于篩選男性中癌癥特異性基因突變的存在或多態(tài)性是費(fèi)時(shí)和昂貴的。此外，在普遍的男性人群中檢測(cè)原發(fā)前列腺癌是非常無效的。因此，它不能用于前列腺癌的篩選試驗(yàn)。線粒體DNA在每個(gè)細(xì)胞中大約有1，000到10，000拷貝。因?yàn)檫@些數(shù)量，線粒體 DNA突變被用作分析來自前列腺癌患者血漿和血清中DNA的靶點(diǎn)。在在他們的原發(fā)腫瘤中具有相同線粒體DNA突變的三名前列腺癌患者中檢測(cè)出三個(gè)線粒體DNA突變。必須去研究不同的泌尿腫瘤樣本，且需要更大量的病人群體去定義該方法整體的診斷敏感性。基因表達(dá)上關(guān)鍵的變異可導(dǎo)致前列腺癌的進(jìn)展。微衛(wèi)星(Microsatellite)改變是多態(tài)的重復(fù)的DNA序列，經(jīng)常表現(xiàn)為雜合子丟失(LOH)或者微衛(wèi)星不穩(wěn)性。在前列腺癌中已知有限定的微衛(wèi)星改變。到目前為止在臨床上的效用是可以忽略(neglible)的。最初使用整個(gè)基因組和SNP陣列被認(rèn)為是強(qiáng)大的發(fā)現(xiàn)工具。DNA改變，在沒有改變序列中堿基對(duì)的順序時(shí)，經(jīng)常導(dǎo)致基因表達(dá)的改變。這些后天修飾如同DNA甲基化和組蛋白乙酰化或去乙?；瘉砀淖?。許多基因啟動(dòng)子包含富含GC 的區(qū)也被認(rèn)為是CpG島。CpG島異常的甲基化導(dǎo)致基因轉(zhuǎn)錄到mRNA變少。研究表明DNA甲基化狀態(tài)可以在生命早期受到環(huán)境暴露的影響，像營(yíng)養(yǎng)因素或者壓力，并且這將導(dǎo)致成人患癌癥的風(fēng)險(xiǎn)增加。DNA甲基化改變的模型在許多人類腫瘤中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)。為了啟動(dòng)子超甲基化的檢測(cè)，使用指定的甲基化特異性PCR(MSP)的技術(shù)。相比較微衛(wèi)星或者LOH分析，該技術(shù)需要腫瘤僅是正常比例的0. 1-0.001%。這意味著使用該技術(shù)，來自腫瘤DNA的超甲基化等位基因檢測(cè)到存在多于正常等位基因IO4-IO5的量。因此，DNA甲基化在癌癥檢測(cè)中能作為一個(gè)有用的標(biāo)記。最近，有許多關(guān)于在人類前列腺癌中超甲基化基因的報(bào)道。其中兩個(gè)基因是RASSFlA(ras結(jié)構(gòu)域家族蛋白質(zhì)亞型A) 和 GSTPl。RASSF1A超甲基化在乳腺癌，腎癌，肝癌，肺癌和前列腺癌中是常見現(xiàn)象。在 60-70%的前列腺癌中，已發(fā)現(xiàn)了 RASSF1A超甲基化，顯現(xiàn)與侵入性的前列腺癌的明顯關(guān)聯(lián)。在正常的前列腺癌組織中沒有檢測(cè)到RASSF1A超甲基化。這些發(fā)現(xiàn)表明RASSF1A超甲基化可以從無痛腫瘤中區(qū)別出更多的侵入性腫瘤。需要進(jìn)一步的研究去評(píng)估它的診斷價(jià)值。在前列腺癌中最常見的后天遺傳改變是谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶Pl (GSTPl)啟動(dòng)子超甲基化。GSTPl屬于對(duì)抗毒性作用的細(xì)胞保護(hù)機(jī)制，且這種酶涉及到許多異生物質(zhì)的解毒。報(bào)道，GSTPl超甲基化存在于大約6%的增生性炎癥萎縮(PIA)損傷和在70%的 PIN損傷。它表明一些PIA損傷直接合并PIN和早期癌損傷，盡管需要額外的研究去證實(shí)這些發(fā)現(xiàn)。GSTPl超甲基化可在90%以上的前列腺癌檢測(cè)到，然而在BPH和正常的前列腺癌組織中沒有觀察到超甲基化。在另一項(xiàng)研究中，在前列腺癌病人50%的精液中可檢測(cè)到GSTPl基因的超甲基化，但在患有BPH的男性中，卻檢測(cè)不到。因從前列腺癌癥患者獲得精液并不總是容易的事實(shí)，對(duì)前列腺癌患者進(jìn)行前列腺按摩后得到的尿沉淀，進(jìn)行GSTPl超甲基化測(cè)定。在77%的沉淀中，檢測(cè)出癌癥。此外，在以下病人的前列腺按摩后的尿沉淀里，發(fā)現(xiàn)有GSTPl超甲基化，68%的早期受限的病人，78%的有局部重病的病人，四％患有PIN的病人和2%患有BPH的病人。這些發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致98%的特異性和73%的靈敏度。該檢測(cè)陰性的預(yù)測(cè)值為80%，這顯示了減少不必要的活組織檢查的極大的潛力。從剛接受前列腺活組織檢查的病人獲得的40%到50%尿沉淀中檢出GSTPl超甲基化。在陰性活組織檢查病人(33% )和非典型或者重度PIN病人(67% )的尿沉淀檢測(cè)出GSTPl超甲基化。因?yàn)镚STPl超甲基化有高度的前列腺癌特異性，表明這些病人可能有隱性的前列腺癌。這表明該檢測(cè)也可用于第二次活組織檢查的指示劑。其他癌癥相關(guān)的基因例如APC和Cox2，也被認(rèn)為被甲基化。微陣列研究對(duì)識(shí)別在相比良性前列腺組織的前列腺癌中一直正調(diào)節(jié)或者負(fù)調(diào)節(jié)的基因是有用的和有益的。這些基因能夠提供前列腺癌特異的分子標(biāo)記，和提供疾病的病因調(diào)查。前列腺癌的分子診斷，在前列腺癌中相比于低表達(dá)或正常表達(dá)，能高危正調(diào)節(jié)的基因具有特殊的意義。該基因能用于檢測(cè)正常細(xì)胞大量的底數(shù)中的一個(gè)腫瘤細(xì)胞，并且因此能用于前列腺癌檢測(cè)中的診斷標(biāo)記。在前列腺癌LNCAP細(xì)胞系中cDNA微陣列分析能導(dǎo)致發(fā)現(xiàn)絲氨酸蛋白酶TMPRSS2， 其被認(rèn)為是通過雄激素正調(diào)節(jié)。原位雜交法研究表明TMPRSS2能在正常的前列腺組織的基底細(xì)胞和腺癌細(xì)胞高表達(dá)。發(fā)現(xiàn)TMPRSS2在結(jié)腸、肺、腎，和胰腺中低表達(dá)。492氨基酸蛋白一直用于預(yù)測(cè)TMPRSS2。該預(yù)測(cè)蛋白是一個(gè)II型的內(nèi)在膜蛋白，最接近于絲氨酸蛋白酶(h印sin)家族。這些蛋白對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和維持細(xì)胞形態(tài)很重要?，F(xiàn)認(rèn)為TMPRSS2可能是一個(gè)激活物，以前體PSA和hK2的形式和TMPRSS2，如同其它的絲氨酸蛋白酶一樣，可能在致前列腺癌中起到作用。因?yàn)門MPRSS2有低前列腺癌特異性，它不能用于尿沉淀中的前列腺癌細(xì)胞的檢測(cè)。在染色體5pl3上編碼的CC-甲酰-輔酶A消旋酶(AMACR)的基因被發(fā)現(xiàn)在前列腺癌中一直正調(diào)節(jié)。該酶對(duì)來自乳制品和牛肉的支鏈脂肪酸分子的過氧化物酶氧化中起到重要作用。有意思的是，乳制品和牛肉的消耗與增加的前列腺癌風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)。在臨床的前列腺癌組織，相比正常的前列腺組織發(fā)現(xiàn)AMACR mRNA是9倍的過表達(dá)。免疫組化(IHC)研究和蛋白質(zhì)印跡分析確認(rèn)在蛋白水平正調(diào)節(jié)AMACR。此外，88%的前列腺癌病例與未處理的轉(zhuǎn)移和去勢(shì)抗性的前列腺癌對(duì)AMACR有強(qiáng)烈的陽性。AMACR表達(dá)不僅在萎縮的腺，基底細(xì)胞增生和泌尿道上皮細(xì)胞或者組織變形中未檢測(cè)到。ICH研究也表明 AMACR表達(dá)在針吸活組織檢查中對(duì)于前列腺癌檢測(cè)，有97%的敏感性和100%特異性。結(jié)合p63染色法，基底細(xì)胞標(biāo)記不存在于前列腺癌中，AMACR極大的促進(jìn)惡性前列腺細(xì)胞的識(shí)別。它的高表達(dá)和癌細(xì)胞的特異性顯示AMACR也可以是發(fā)展以下分子探針的候選，該分子探針使用非侵入圖形模式來促進(jìn)前列腺癌的識(shí)別。用cDNA微陣列分析，表明h印sin，II型跨膜絲氨酸蛋白酶，對(duì)比正常前列腺組織和BPH組織，是前列腺癌中最大差異的過表達(dá)基因之一。使用實(shí)時(shí)(real-rime)定量的PCR 分析，可知h印in基因在90%的前列腺癌組織中過表達(dá)。這種過表達(dá)在59%的前列腺癌中是超過10倍的。并且，在h印sin的正調(diào)節(jié)和腫瘤-級(jí)別之間有一個(gè)重要的關(guān)聯(lián)。必須進(jìn)一步的研究確定h印sin的組織特異性和這種絲氨酸蛋白酶作為一個(gè)新的血清標(biāo)記的診斷價(jià)值。既然hepsin在晚期腫瘤和更多侵入性腫瘤中正調(diào)節(jié)，表明作為確定腫瘤的侵入性的預(yù)后組織標(biāo)記的作用。端粒酶，一種核糖核蛋白，參與合成和修復(fù)在真核生物染色體末端起著封蓋和保護(hù)作用的端粒。人類的端粒包括TTAGGG序列的銜接重復(fù)和若干不同的結(jié)合蛋白。在細(xì)胞分裂中，端粒不能被完全復(fù)制，并且會(huì)變短。端粒酶能延長(zhǎng)端粒長(zhǎng)度并且因此阻止這些結(jié)構(gòu)變短。在細(xì)胞分裂中，缺乏端粒酶活性，將導(dǎo)致端粒變短。結(jié)果，細(xì)胞的壽命受到限制并，這將導(dǎo)致細(xì)胞衰老和壞死。在腫瘤細(xì)胞里，包括前列腺癌細(xì)胞，端粒的長(zhǎng)度顯著的比正常細(xì)胞短。在端粒短的癌細(xì)胞中，為避免衰老和不斷的生長(zhǎng)，需要端粒酶活性。在90%的前列腺癌中發(fā)現(xiàn)高端粒酶活性，并且與正常的前列腺組織中不存在高端粒酶活性。在36個(gè)小樣本的研究中，端粒酶活性用于檢測(cè)空白的尿液或者前列腺按摩后尿道洗滌物中前列腺癌細(xì)胞。該測(cè)試有58%的敏感度和100%的特異性。該測(cè)試陰性的預(yù)測(cè)值為55%。盡管它是一個(gè)小的初步研究，低的陰性預(yù)測(cè)值表明，在尿液樣品中測(cè)定的端粒酶活性在減少不必要的活組織檢查數(shù)量方面不是很有前景。定量端粒酶的催化亞基，hTERT，相比正常的前列腺組織，在前列腺癌組織中hTERT mRNA表現(xiàn)中等的6倍過表達(dá)。不用Gleason評(píng)分，發(fā)現(xiàn)在hTERT表達(dá)和腫瘤分期之間有顯著的關(guān)聯(lián)。使用實(shí)時(shí)PCR的hTERT定量，表明hTERT能很好的從良性腫瘤組織中區(qū)分前列腺癌組織。然而，hTERTmRNA在白細(xì)胞(其通常存在體液中如血液或尿液)中表達(dá)。它可引起假陽性。像這樣，在體液中定量測(cè)定hTERT作為前列腺癌的診斷工具不是很有前景。
前列腺特異性膜抗原(PSMA)是一種跨膜糖蛋白，它在前列腺上皮細(xì)胞表達(dá)。PSMA 的表達(dá)表現(xiàn)為受前列腺的限制，并且顯示相對(duì)比良性的前列腺組織，PSMA在前列腺癌中是正調(diào)控。在BPH和前列腺癌之間PSMA表達(dá)沒有重疊，表明PSMA是一個(gè)有前景的診斷標(biāo)記。顯示在前列腺癌病例中PSMA高表達(dá)與腫瘤分級(jí)，病理期，非整倍性，和生化循環(huán)相關(guān)。此外，在原發(fā)前列腺腫瘤和轉(zhuǎn)移中PSMA mRNA表達(dá)增加與PSMA蛋白過表達(dá)相關(guān)聯(lián)。 作為前列腺癌的診斷或者預(yù)測(cè)標(biāo)記的臨床應(yīng)用因缺乏這種蛋白敏感的免疫測(cè)定法而受阻。然而，蛋白質(zhì)芯片陣列和SELDI-TOF MS結(jié)合提供了采用蛋白質(zhì)生物芯片免疫測(cè)定法用于定量血清PSMA的說明。顯示前列腺癌病人平均血清PSMA水平相對(duì)于那些具有BPH 的病人和健康對(duì)照的男性顯著的升高。這些發(fā)現(xiàn)表明血清PSMA有從前列腺癌患者中辨別有BPH男性的作用，但是需要進(jìn)一步的研究去評(píng)估它的診斷價(jià)值。RT-PCR研究表明PSMA結(jié)合它的剪接變體PSMA'，可以作為前列腺癌的預(yù)后標(biāo)記使用。在正常的前列腺中，PSMA'表達(dá)高于PSMA表達(dá)。在前列腺癌組織PSMA表達(dá)是更為主要。因此，PSMA的比率超過PSMA'，高度表明了疾病進(jìn)展。設(shè)計(jì)定量PCR分析去辨別2 個(gè)PSMA形式之間，可以產(chǎn)生PSMA在前列腺癌的診斷和預(yù)后中的另外一個(gè)應(yīng)用。δ—連環(huán)蛋白(pl20/CAS)，一個(gè)粘附連接結(jié)合蛋白(adhesive junction-associated protein)，表明能高度的區(qū)別BPH和前列腺癌。原位雜交結(jié)果表明， S -連環(huán)蛋白轉(zhuǎn)錄子在前列腺的腺癌中為最高表達(dá)并在BPH組織中低到不表達(dá)。相比BPH 在前列腺癌中S--連環(huán)蛋白平均的過表達(dá)值為15.7倍。PCR定量和原位雜交分析都不能表示δ -連環(huán)蛋白和Gleason評(píng)分之間的關(guān)系。 需要進(jìn)一步的研究去評(píng)價(jià)S -連環(huán)蛋白的組織特異性和和診斷價(jià)值，但當(dāng)作為前列腺的預(yù)后標(biāo)記時(shí)明顯它有局限。使用差異顯示分析法識(shí)別DD3PGA3。在Northern印跡分析法中相比同一病人的正常前列腺組織在前列腺癌中DD3PCA3高度過表達(dá)。DD3pcas在95%以上的原發(fā)前列腺癌樣本和前列腺癌轉(zhuǎn)移是高度過表達(dá)。而且，DD3reA3的表達(dá)限于前列腺組織，S卩，發(fā)現(xiàn)在其他正常人的組織中不表達(dá)。編碼DD3rcA3的基因定位在染色體9q21. 2上。DD3rcA3mRNA包含一個(gè)高密度終止-密碼子。因此，它缺乏一個(gè)開放讀碼框，導(dǎo)致RNA不編碼。最近，時(shí)間分辨定量RT-PCR檢測(cè) (使用一個(gè)內(nèi)標(biāo)和外部校準(zhǔn)曲線)已經(jīng)形成。相比正常前列腺組織，在前列腺癌組織中此法準(zhǔn)確定量的能力顯示中等的66倍DD3reA3的正調(diào)節(jié)。此外，在含有少于10%的前列腺癌細(xì)胞的前列腺組織中發(fā)現(xiàn)11倍的中等的正調(diào)節(jié)。這表明DD3peA3能在大量正常細(xì)胞底數(shù)中檢測(cè)到少量的癌細(xì)胞。使用定量RT-PCR分析空白尿樣品測(cè)試了這種假說。在正常的前列腺細(xì)胞PSA mRNA表達(dá)表現(xiàn)了相對(duì)恒定，并且據(jù)報(bào)道在前列腺癌細(xì)胞中PSA表達(dá)只有微弱的向負(fù)調(diào)節(jié) (-1.5倍)。因此，PSA mRNA被用作“持家基因”去校正尿沉淀中前列腺癌細(xì)胞數(shù)量，這些尿沉淀是在從108個(gè)其前列腺活組織檢查檢測(cè)出整個(gè)血清PSA的值多于3ng/ml名的男性進(jìn)行廣泛前列腺按摩后獲得的。該測(cè)試有67%的敏感性和83%的特異性，使用前列腺活組織檢查作為有腫瘤存在的金指標(biāo)。此外，該測(cè)試有90%的陰性預(yù)測(cè)值，表明在廣泛前列腺按摩后獲得的尿沉淀中定量測(cè)定DD3rcA3轉(zhuǎn)錄在縮減侵入的TRUS引導(dǎo)的活組織檢查男性人群的數(shù)量有極大的潛力。
在前列腺癌組織中特異性和高過度表達(dá)，表明DD3rcA3是至今描述最多的前列腺癌特異性基因。因此，驗(yàn)證DD3reA3分析法在檢測(cè)血清或者血漿中擴(kuò)散的前列腺癌細(xì)胞變得有價(jià)值。使用驗(yàn)證DD3rcA3分析法的多中心研究在臨床泌尿外科實(shí)踐中可提供分子診斷的第一 ■石出。細(xì)胞質(zhì)蛋白HSP-27和PKC同工酶家族成員，尤其是I3KC- β和I3KC- ε的調(diào)控表達(dá)， 與前列腺癌發(fā)展相關(guān)。調(diào)控表達(dá)能清晰的識(shí)別那些侵入性-癌癥和由此需要緊急處理的那些癌癥，不論其形態(tài)。盡管還沒有廣泛的應(yīng)用，這些蛋白的抗體已被驗(yàn)證，且可用于商業(yè)，并且它們的應(yīng)用和說明簡(jiǎn)單，尤其結(jié)合其它反應(yīng)物像二重-染色標(biāo)本。這組標(biāo)記的重要性在于能精確的區(qū)別侵入型表型的前列腺癌。對(duì)比非腫瘤的前列腺組織，調(diào)節(jié)侵入性癌癥的表達(dá)，這些惡性腫瘤高水平表達(dá)HSP27或PKCii，不可避免地表現(xiàn)為弱的臨床結(jié)果。該關(guān)聯(lián)機(jī)制使說明和驗(yàn)證正當(dāng)。E2F轉(zhuǎn)錄因子，包括定位在染色體6ρ22上的E2F3，可直接的調(diào)節(jié)ΕΖΗ2表達(dá)。ΕΖΗ2 基因的過表達(dá)在人類前列腺癌的發(fā)展上非常重要。在去勢(shì)抗性和轉(zhuǎn)移的前列腺癌中驗(yàn)證ΕΖΗ2基因過表達(dá)，并且，比那些不表達(dá)的蛋白，臨床上具有表達(dá)ΕΖΗ2的局部前列腺癌的患者可有較差的進(jìn)展。使用組織微陣列，核E2F3高水平表達(dá)在前列腺癌人群發(fā)生的比例高，但在非新生物的前列腺上皮很罕見。這些數(shù)據(jù)，與其他公開的信息一起，表明PRB-E2F3-EZH2控制軸在調(diào)節(jié)個(gè)體前列腺癌的侵入性中起到關(guān)鍵作用。分子診斷的最初挑戰(zhàn)是識(shí)別臨床上不重要的前列腺癌，S卩，從無痛腫瘤中分離生物侵入性癌癥。此外，迫切需要標(biāo)記預(yù)測(cè)和監(jiān)控治療反應(yīng)的標(biāo)記。在目前臨床環(huán)境里，過度的診斷和過度治療變得越來越明顯，進(jìn)一步需要能提供準(zhǔn)確辨別病人需要還是不需要治療的生物標(biāo)記。AMACR免疫組化廣泛的應(yīng)用于鑒定前列腺的惡性進(jìn)展從而促成前列腺癌的診斷。 不幸的是，引進(jìn)在組織中的分子標(biāo)記作為預(yù)后工具尚未用于驗(yàn)證所討論的任何標(biāo)記。過去二十年的經(jīng)驗(yàn)已顯示轉(zhuǎn)化分子標(biāo)記為臨床應(yīng)用的現(xiàn)實(shí)和邏輯的復(fù)雜性?？紤]到這些問題，目前正在進(jìn)行許多前瞻性的努力以建立許多標(biāo)記的臨床應(yīng)用。明顯地，良好記錄樣板的組織生物數(shù)據(jù)庫，包括臨床隨訪數(shù)據(jù)，在驗(yàn)證過程起到關(guān)鍵作用。以GSTPl超甲基化和基因DD3reA3為基礎(chǔ)的新的體液測(cè)試，在前列腺癌中高度過表達(dá)，能檢測(cè)非侵入性獲得的體液如尿液或精液中的前列腺癌。新技術(shù)的應(yīng)用顯示大量的基因在前列腺癌中正調(diào)節(jié)。相比正常前列腺或者BPHJi 于非侵入性的篩選試驗(yàn)，僅有那些在前列腺癌組織中95%以上過表達(dá)的基因非常重要。而且，相比在正常前列腺，這些基因在前列腺癌的腫瘤中正調(diào)節(jié)應(yīng)大于10%，能從體液如尿或者精液中大量的正常細(xì)胞底數(shù)中檢測(cè)到單個(gè)前列腺癌細(xì)胞。盡管上文所述的標(biāo)記，至少部分，表明用于腫瘤標(biāo)記尤其是前列腺腫瘤標(biāo)記領(lǐng)域的必要，持續(xù)的需要可靠的(前列腺癌)腫瘤標(biāo)記和特別是指示臨床過程和疾病結(jié)果的標(biāo)記。

發(fā)明內(nèi)容
在其它目的中，本發(fā)明的目的，如果不能完全，至少部分滿足在該領(lǐng)域的上述應(yīng)用，即，提供腫瘤標(biāo)記(該腫瘤標(biāo)記提供識(shí)別組織樣本中前列腺癌的可信賴的方法)，尤其是提供可信賴的臨床過程和疾病結(jié)果的預(yù)測(cè)值。該腫瘤標(biāo)記會(huì)提供工具，該工具幫助訓(xùn)練有素的醫(yī)生使用該腫瘤標(biāo)記或任何其他的指征診斷，對(duì)前列腺癌確定合適的治療方案。根據(jù)本發(fā)明內(nèi)容，在其它目的中的上述目的，通過提供如在附加權(quán)利要求中描述的新的腫瘤標(biāo)記和方法來滿足。尤其是，上述目的，在其它目的中，通過用于確定人類個(gè)體有或者沒有前列腺癌的方法來滿足，該方法包含a)測(cè)定來自所述人類個(gè)體的樣本中選自由H0XC6、SFRP2、HOXD10, RORB, RRM2、 TGM4和SNAI2組成的組中的一個(gè)或多個(gè)基因表達(dá)，b)確定正調(diào)節(jié)，或負(fù)調(diào)節(jié)所述一個(gè)或多個(gè)基因的表達(dá)，相對(duì)于以下樣品中所述一個(gè)或多個(gè)基因的各自表達(dá)，所述樣品來自所述不包含前列腺癌細(xì)胞或前列腺癌組織的人類個(gè)體，或者源自沒患前列腺癌的個(gè)體；和c)根據(jù)所述的一個(gè)或多個(gè)基因的確定的正調(diào)節(jié)或負(fù)調(diào)節(jié)，來確定有或沒有前列腺癌。根據(jù)本發(fā)明，確定有或沒有前列腺癌優(yōu)選包括診斷，預(yù)后和/或預(yù)測(cè)疾病存活率。根據(jù)本發(fā)明，表達(dá)分析包括確定增加的或降低的基因表達(dá)，相對(duì)于以下樣品中所述一個(gè)或多個(gè)基因的各自表達(dá)，所述樣品來自所述不包含前列腺癌細(xì)胞或前列腺癌組織的人類個(gè)體，或者源自沒患前列腺癌的個(gè)體。換句話說，根據(jù)本發(fā)明的基因表達(dá)的增加或者減少是基因表達(dá)相對(duì)于無疾病標(biāo)準(zhǔn)的量度器。例如，相比在非前列腺癌的條件下各自的基因表達(dá)，確定H0XC6和/或RRM2增加表達(dá)，和/或R0RB、H0XD10、SFRP2、SNAI2和/或TGM4降低表達(dá)，根據(jù)本發(fā)明，可以確定有或者沒有前列腺癌，尤其是診斷、預(yù)后和/或預(yù)測(cè)疾病的存活率。H0XC6 基因的同源框亞家族，和HOX亞家族包含在發(fā)展通過在空間和時(shí)間表達(dá)模式中，涉及控制和協(xié)調(diào)復(fù)雜功能的轉(zhuǎn)錄因子。人類有39個(gè)經(jīng)典的HOX基因構(gòu)成A，B，C和D 四個(gè)基因簇。已證明H0XC6在響應(yīng)激素信號(hào)對(duì)上皮細(xì)胞的發(fā)育和擴(kuò)增中起決定性作用。SFRP2 分泌的卷曲相關(guān)蛋白(SFRP2)屬于SFRPs的大家族，這關(guān)系到Wnt信號(hào)級(jí)聯(lián)放大。一些研究表明SFRP2是一個(gè)Wnt- β -連環(huán)蛋白通路抑制劑。SFRP2調(diào)控涉及到血管發(fā)生的細(xì)胞進(jìn)程，包括上皮細(xì)胞遷移，血管形成，和保護(hù)缺氧誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，并且在血管肉瘤形成中是必需的。H0XD10 同源框(Hox)基因是主要的調(diào)節(jié)基因，直接參與器官發(fā)生和維持不同組織的功能。H0XD10通過抑制涉及重塑細(xì)胞外基質(zhì)和細(xì)胞遷移的基因表達(dá)來有助于維持在內(nèi)皮細(xì)胞的靜止的，分化表型。RORB 類維生素相關(guān)的孤兒受體(RORs) α、β、和γ包含單核的孤兒受體基因亞家族。RORs作為單體結(jié)合到特異的ROR反應(yīng)元件(ROREs)。通過RORs的RORE-依賴轉(zhuǎn)錄激活是細(xì)胞型特性并通過與核的輔助因子相互作用來介導(dǎo)。RAR相關(guān)的孤兒受體B (RORB) 的表達(dá)是非常受限的。RORB在神經(jīng)成像內(nèi)分泌系統(tǒng)不同的部分(松果體，視網(wǎng)膜，和視交叉上核)都高度表達(dá)，表明其控制生理節(jié)律的作用。RORci和ROR β兩者對(duì)在視網(wǎng)膜的光感受器的變異是必須。在許多的生理過程調(diào)節(jié)中RORs起到重要的作用。RRM2 核糖核苷酸還原酶(RNR)在DNA合成和修復(fù)必須的核苷酸還原作用中起到重要的作用。RNR包括2個(gè)亞單位RRM1和RRM2。RNR的活性及因此DNA合成和細(xì)胞擴(kuò)增， 通過合成和降解RRM2亞單位在細(xì)胞周期受到控制。TGM4 人類前列腺特異性轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(hTGP)是前列腺分泌的一種交聯(lián)酶。轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶4(TGM4)基因編碼hTGP。hTGP的表達(dá)受前列腺嚴(yán)格的限制。該基因的結(jié)構(gòu)與其他的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(TGase)基因驚人的相似。SNAI2 =SNAIl(Snail)禾Π SNAI2(Slug),是 Snail 家族因子 2 個(gè)主要成員，是上皮一間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)變的重要介質(zhì)并與腫瘤進(jìn)展有關(guān)。SNAIl在腫瘤生長(zhǎng)、侵入和轉(zhuǎn)移中起主要作用。當(dāng)注射入裸鼠中時(shí)，SNAI2與SNAIl共同作用來減少任一癌細(xì)胞系腫瘤的生長(zhǎng)勢(shì)。數(shù)據(jù)表明SNAIl為主要的局部侵入調(diào)節(jié)劑，支持在轉(zhuǎn)移過程中兩個(gè)因子的分級(jí)參與。 SNAIl (Snail)，SNAI2(Slug)，SNAI3, ZEBl，ZEB2 (SIPl)，KLF8, TWISTl，和 TWIST2 為抑制編碼E-鈣粘蛋白的CDHl基因的EMT調(diào)節(jié)劑。根據(jù)本發(fā)明方法優(yōu)選的實(shí)施方案，測(cè)定以下表達(dá)，該表達(dá)包括測(cè)定所述一個(gè)或者多個(gè)基因的mRNA表達(dá)?；趍RNA的表達(dá)分析是本領(lǐng)域已知的且在世界范圍內(nèi)的診斷實(shí)驗(yàn)室常規(guī)實(shí)踐。 例如，用于mRNA分析的適合技術(shù)為Northern印跡雜交和基于擴(kuò)增的技術(shù)如PCR，尤其是實(shí)時(shí) PCRdP NASBA。根據(jù)特別優(yōu)選的實(shí)施方案，表達(dá)分析包括高通量DNA陣列芯片分析，其不僅可以同時(shí)分析多個(gè)樣品還能自動(dòng)分析加工處理。根據(jù)本發(fā)明方法另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，測(cè)定以下表達(dá)，該表達(dá)包括測(cè)定基因的蛋白水平。適合的技術(shù)為，例如，基于基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-T0F)的技術(shù)，ELISA和/或免疫組化。根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明的方法優(yōu)選使用兩個(gè)以上，優(yōu)選三個(gè)以上，更優(yōu)選四個(gè)以上， 甚至更優(yōu)選五個(gè)以上，最優(yōu)選六個(gè)以上選自由以下組成的組的基因的表達(dá)分析來進(jìn)行 H0XC6, SFRP2, HOXD10, RORB, RRM2, TGM4，和 SNAI2。根據(jù)本發(fā)明特別優(yōu)選的實(shí)施方案，本發(fā)明的方法通過H0XC6，SFRP2，H0XD10，RORB, RRM2, TGM4，和SNAI2基因的表達(dá)分析來進(jìn)行。優(yōu)選地，在人類個(gè)體中有或者沒有前列腺癌的，進(jìn)一步包含識(shí)別，建立和/或診斷低危的 PrCa (LG)，高危的 PrCa (HG)，PrCa Met 和 / 或 CRPC。LG顯示低危的I^rCa(Gleason評(píng)分小于等于6)并且表示病人預(yù)后良好。HG顯示高危的I^rCa (Gleason評(píng)分7以上)并且表示病人預(yù)后不良。I^rCa Met表示病人預(yù)后不良。 最后，CRPC表明去勢(shì)抗性前列腺癌并且表示病人有侵入性的局部疾病。根據(jù)本發(fā)明方法的特別優(yōu)選的實(shí)施方案，本發(fā)明提供識(shí)別，建立和/或診斷CRPC。考慮到本發(fā)明的基因作為前列腺癌生物或者分子標(biāo)記的診斷價(jià)值，本發(fā)明還涉及選自由H0XC6、SFRP2、H0XD10、R0RB、RRM2、TGM4、和SNAI2組成的組中的一個(gè)或多個(gè)基因的表達(dá)分析，用于確立人類個(gè)體有或者沒有前列腺癌的用途。還考慮到本發(fā)明的基因作為前列腺癌生物或者分子標(biāo)記的診斷價(jià)值，本發(fā)明還涉及用于確立人類個(gè)體有或者沒有前列腺癌的試劑盒部分，該試劑盒部分包含-表達(dá)分析方法，用于測(cè)定選自由H0XC6、SFRP2、HOXD10、RORB、RRM2、TGM4、和 SNAI2組成的組中的一個(gè)或多個(gè)基因的表達(dá)；
-使用說明。根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方案，本發(fā)明的試劑盒部分包含mRNA表達(dá)分析方法，尤其是通過例如PCR，rtPCR和/或r NASBA而適用于表達(dá)分析的方法。根據(jù)特別優(yōu)選的實(shí)施方案，本發(fā)明的試劑盒部分包含用于表達(dá)分析兩個(gè)以上，三個(gè)以上，四個(gè)以上，五個(gè)以上，六個(gè)以上，或者七個(gè)本發(fā)明所述基因的方法。本發(fā)明說明書中，通過提及他們?nèi)我庵付ǖ拿Q，對(duì)適合作為前列腺癌生物-或者分子標(biāo)記的基因給出說明。盡管本領(lǐng)域技術(shù)人員能基于表明的名稱，容易地識(shí)別和使用本發(fā)明的基因，但附加圖形提供了這些基因的CDNA序列作為它們的登錄號(hào)，從而允許本領(lǐng)域技術(shù)人員以本領(lǐng)域熟知的分析技術(shù)為基礎(chǔ)去開發(fā)表達(dá)分析測(cè)定法。該分析技術(shù)，例如，可以基于該基因的基因組序列，提供的cDNA或者氨基酸序列。該序列信息能從提供的序列得出，或者從公開的數(shù)據(jù)容易地獲得，例如通過使用提供的登錄號(hào)。


本發(fā)明在以下本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案的實(shí)施例中被進(jìn)一步闡明。在實(shí)施例中，對(duì)附圖給出說明，圖1-7 表明以下各基因的cDNA和氨基酸序列H0XC6基因(NM_004503. 3， NP_004494. 1) ；SFRP2 基因(ΝΜ_003013· 2，ΝΡ_003004· 1) ；H0XD10 基因(ΝΜ_002148· 3， ΝΡ_002139·2) ;R0RB 基因(ΝΜ_006914· 3，ΝΡ_008845· 2) ;RRM2 基因(ΝΜ_001034· 2， ΝΡ_001025. 1) ；TGM4 基因(ΝΜ_003241· 3，ΝΡ_003232. 2)；和 SNAI2 基因(ΝΜ_003068· 3， ΝΡ_003059· 1 ；其中，圖1 人類同源框C6(H0XC6)，轉(zhuǎn)錄變體1圖2 人類的分泌的卷曲相關(guān)蛋白2(SFRP2)圖3 人類同源框 DlO (H0XD10)圖4 人類的RAR相關(guān)孤兒受體B (RORB)圖5 人類的核糖核苷酸還原酶M2 (RRM2)圖6 人類的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶4 (前列腺)(TGM4)圖7 人類的螺狀同系物2 (果蠅)(SNAI2)圖8-14:表明根據(jù)以下各基因的LG(低危的)，HG(高危的)，CRPC(去勢(shì)難治性前列腺癌)和I^rCa Met(前列腺癌轉(zhuǎn)移)組的TLDA數(shù)據(jù)的箱線圖H0XC6基因 (NM_004503. 3) ； SFRP2 基因(ΝΜ_003013· 2) ；HOXD10 基因(ΝΜ_002148· 3) ；RORB 基因 (ΝΜ_006914. 3，) ；RRM2 基因(ΝΜ_001034· 2) ；TGM4 基因(ΝΜ_003Μ1· 3)；禾Π SNAI2 基因 (ΝΜ_003068. 3)的。NP表明沒有前列腺癌，也就是，正常的或標(biāo)準(zhǔn)的表達(dá)水平。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1為了識(shí)別侵入性前列腺癌標(biāo)記，前列腺癌病人樣品的基因表達(dá)譜(基因芯片⑧人外顯子1. OST陣列，Affymetrix公司)，使用以下分類-LG:低危的I^rCa(Gleason評(píng)分等于或小于6)。該組表示病人預(yù)后良好。
-HG 高危的I^rCa(Gleason評(píng)分7以上)。該組表示病人預(yù)后不良；樣本類型，mRNA 來自原發(fā)性腫瘤。-PrCa Met.該組表示病人預(yù)后不良；樣本類型；mRNA來自I^rCa轉(zhuǎn)移。-CRPC 去勢(shì)難治性前列腺癌；mRNA來自接受內(nèi)分泌治療的侵入性病人的原發(fā)性腫瘤材料。該組表示病人有侵入性局部病變。依照標(biāo)準(zhǔn)的程序進(jìn)行表達(dá)分析。簡(jiǎn)單地說，在根治性前列腺切除術(shù)或TURP后，從前列腺癌(屬于前面提到的四個(gè)類別之一)患者獲得組織。速凍該組織并且冷凍切片，用 H.E.染色用于病理分類。切開腫瘤部分并用TRIzol anvitrogen公司，卡爾斯巴德，加利福尼亞州，美國(guó)) 按照制造商說明萃取總RNA。用Qiagen RNeasy Mini試劑盒^liagen公司，瓦倫西亞，加州，美國(guó))純化總RNA。通過用Agilent 2100生物分析儀的電泳來測(cè)定RNA的完整性。從純化的總RNA里取1微克用于基因芯片全部轉(zhuǎn)錄(GeneChip Whole Transcript, WT)意義革巴點(diǎn)標(biāo)記分析(Sense Target Labeling Assay) (Affymetrix 公司， 圣克拉拉市，加州，美國(guó))。根據(jù)該分析的規(guī)程，使用RiboMinus人/鼠轉(zhuǎn)錄子組分離試劑盒 anvitrogen公司，Carlskid，加利福尼亞州，美國(guó))去除了大多數(shù)核糖體RNA。使用隨機(jī)六聚體結(jié)合T7啟動(dòng)子，合成雙鏈cDNA。通過體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)從雙鏈cDNA模板生成了 cRNA，并使用Affymetrix樣品清理模板來純化cDNA。使用含dUTP的dNTP混合物，通過隨機(jī)引物逆轉(zhuǎn)錄作用再生成單鏈cDNA。用RNA酶H水解RNA并純化cDNA。用尿嘧啶-DNA糖苷酶(尿嘧啶DNA轉(zhuǎn)葡糖基酶)和APEl (去嘌呤的/脫嘧啶核酸核酸內(nèi)切酶1)限制性內(nèi)切酶混合物共孵育切割cDNA，并且，最后，通過末端轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)結(jié)合生物素化的雙脫氧反應(yīng)進(jìn)行末端標(biāo)記。5. 5 μ g片段的生物素化的cDNA添加到雜交混合物，裝載上人外顯子1. OST基因芯片并在45°C，60轉(zhuǎn)/分下雜交16h。利用基因芯片 人類外顯子1. OST段陣列(Affymetrix公司)，用外顯子分析間接測(cè)量基因，測(cè)量可結(jié)合轉(zhuǎn)錄本群測(cè)量。在陣列上有超過30萬的轉(zhuǎn)錄簇，其中90，000多個(gè)包含一個(gè)以上外顯子。這90，000中超過17，000為高可信度(CORE)基因，該基因用于缺失分析。每個(gè)陣列總共有超過550萬個(gè)特性。雜交后，根據(jù)Affymetrix規(guī)程洗滌并染色陣列。染色的序列使用Affymetrix基因芯片掃描儀3000在532nm下掃描，生成每個(gè)陣列的CEL文件。外顯子水平的表達(dá)值來自CEL文件探針?biāo)诫s交強(qiáng)度，其使用基于模版的RMA算法，如同在Affymetrix ConsoleTM軟件中完成。RMA (強(qiáng)大的多陣列平均)執(zhí)行歸一化，背景校正和數(shù)據(jù)匯總。在各條件之間的差異表達(dá)基因使用Anova(變量分析)和兩組以上的 T測(cè)試來計(jì)算。因?qū)εR床上明確定義的風(fēng)險(xiǎn)人群進(jìn)行了分析，所以目標(biāo)識(shí)別是偏移的。該標(biāo)記根據(jù)其在癌癥生物學(xué)作用來分類。為了識(shí)別標(biāo)記，用“HG”和“LG”比較了 Met組。基于獲得的表達(dá)分析，基于30個(gè)腫瘤來識(shí)別生物標(biāo)記；在表1中提供生物標(biāo)記的表達(dá)譜。表1 基于分析30個(gè)明確定義的樣本，特征化前列腺癌侵入轉(zhuǎn)移表型的7個(gè)靶點(diǎn)的表達(dá)特征
基因名稱基因定位在 PrCaMet 中的表達(dá)Met-LG分級(jí)Met-HG分級(jí)Met-CRPCPTPRNM_003625￡15.8948.28411.63EPHA6NM_001080448正15.3559.2528.00PIakophilin 1NM_000299正5.28284.9285.46HOXC6NM_004503正5.35273.34433.51HOXD3NM_006898正1.976202.162381.40sFRP2NMJXBO13負(fù)-6.06102-13.9315-3.53HOXDlONM_002148負(fù)-3.71276-3.89238-5.28實(shí)施例2以一組70個(gè)樣本重復(fù)實(shí)施例1的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。結(jié)果見表2.表2 在70個(gè)腫瘤樣本中的驗(yàn)證的7個(gè)靶點(diǎn)的表達(dá)特征
基因名稱基因定位在 PrCaMet ■ 中的表達(dá)Met-LG分級(jí)Met-HG分級(jí)Met-CRPC分級(jí)PTPRΝΜ_003625E6,9212,97113,662ΕΡΗΑ6ΝΜ_001080448芷4,3543,9733,183PlakophilLn 1ΝΜ_000299IE3,18124,0024,115HOXC6ΝΜ_004503 :1,772711,752081,446HOXD3ΝΜ—006898IE1,625021,662921,247sFRP2ΝΜ_003013負(fù)-6,2846-10,2010-5,861HOXDlOΝΜ—002148負(fù)-2,48364-2,55327-2,464由表1和表2清晰可見，正調(diào)節(jié)表達(dá)的基因PTPR，EPHA6，血小板親和蛋白 (Plakophi 1 in) 1，H0XC6(圖1)和H0XD3與前列腺癌有關(guān)聯(lián)。因而，由表1和表2清晰可見， SFRP2 (表幻和H0XD10 (表3)的負(fù)調(diào)節(jié)表達(dá)與前列腺癌有關(guān)聯(lián)?？紤]從70個(gè)腫瘤樣本獲得的上述結(jié)果，表達(dá)的數(shù)據(jù)清晰的表明這些基因適合作為診斷前列腺癌的生物或者分子標(biāo)記。實(shí)施例3對(duì)70個(gè)前列腺癌樣本，使用基因表達(dá)圖譜(基因芯片⑧人外顯子1. OST陣列， Affymetrix公司)，與前列腺癌轉(zhuǎn)移和去勢(shì)難治性前列腺癌(CRPC)比較，發(fā)現(xiàn)數(shù)個(gè)基因在低危和高危前列腺癌中為差別表達(dá)。結(jié)合若干其它在基因芯片⑧人外顯子1. OST陣列差異化表達(dá)的基因，使用TaqMan 低密度陣列(TLDA，應(yīng)用生物系統(tǒng)(Applied Biosystems))驗(yàn)證了這些基因的表達(dá)水平。驗(yàn)證基因的概括見表3。表3 用于TLDA分析的基因表達(dá)檢測(cè)
權(quán)利要求
1.一種用于確定人類個(gè)體有或者沒有前列腺癌的方法，該方法包括a)測(cè)定來自所述人類個(gè)體的樣本中選自由RRM2、H0)(C6、TGM4、RORB,HOXD10, SFRP2和 SNAI2組成的組中的一個(gè)或多個(gè)基因表達(dá)，b)確定正調(diào)節(jié)，或負(fù)調(diào)節(jié)所述一個(gè)或多個(gè)基因的表達(dá)，相對(duì)于以下樣品中所述一個(gè)或多個(gè)基因的各自表達(dá)，所述樣品來自所述不包含前列腺癌細(xì)胞或前列腺癌組織的人類個(gè)體，或者源自沒患前列腺癌的個(gè)體；和c)根據(jù)所述的一個(gè)或多個(gè)基因的確定的正調(diào)節(jié)或負(fù)調(diào)節(jié)，來確定有或沒有前列腺癌。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的方法為一種取自活體的和/或體外的方法。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或者2所述的方法，其特征在于測(cè)定所述一個(gè)或多個(gè)基因表達(dá)包含測(cè)定mRNA表達(dá)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或者2所述的方法，其特征在于測(cè)定所述一個(gè)或多個(gè)基因表達(dá)包含測(cè)定蛋白質(zhì)水平。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一所述的方法，其特征在于所述一個(gè)或多個(gè)選自選自由以下組成的組兩個(gè)以上；三個(gè)以上；四個(gè)以上；五個(gè)以上；六個(gè)以上；和七個(gè)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一所述的方法，其特征在于確定人類個(gè)體有或者沒有前列腺癌，進(jìn)一步包括識(shí)別或者診斷，低危PrCa(LG)，高危PrCa(HG)，PrCa Met和/CRPC,優(yōu)選 CRPC。
7.選自由RRM2、H0XC6、TGM4、RORB、HOXD10、SFRP2和SNAI2組成的組中的一個(gè)或多個(gè)基因的表達(dá)分析，用于確立人類個(gè)體有或者沒有前列腺癌的用途。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的用途，其特征在于所述表達(dá)分析為取自活體的和/或在體外的。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或者8所述的用途，其特征在于所述一個(gè)或多個(gè)選自選自由以下組成的組兩個(gè)以上；三個(gè)以上；四個(gè)以上；五個(gè)以上；六個(gè)以上；和七個(gè)。
10.一種用于確立人類個(gè)體有或者沒有前列腺癌的試劑盒部分，該試劑盒部分包含-表達(dá)分析方法,用于測(cè)定選自由RRM2、H0XC6、TGM4、RORB, HOXD10, SFRP2和SNAI2組成的組中的一個(gè)或多個(gè)基因的表達(dá)；-使用說明。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的試劑盒部分，其特征在于所述表達(dá)分析方法包括mRNA表達(dá)分析方法，優(yōu)選用于PCR，rtPCR或者NASBA。
12.根據(jù)權(quán)利要求10所述的試劑盒部分，其特征在于所述表達(dá)分析方法包括蛋白質(zhì)表達(dá)分析方法，優(yōu)選的是ELISA或免疫組化方法。
13.根據(jù)權(quán)利要求10-12任一所述的試劑盒部分，其特征在于所述一個(gè)或多個(gè)選自選自由以下組成的組兩個(gè)以上；三個(gè)以上；四個(gè)以上；五個(gè)以上；六個(gè)以上；和七個(gè)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于診斷前列腺癌，尤其是診斷以下疾病的方法LG，即，原發(fā)腫瘤的預(yù)后良好的個(gè)體；HG，即，預(yù)后不良的個(gè)體；PrCa Met，即，預(yù)后不良并且轉(zhuǎn)移的個(gè)體；和CRPC，即，遭受侵入性局部病變的預(yù)后不良個(gè)體。特別地，本發(fā)明還涉及確定在人類個(gè)體內(nèi)有或沒有前列腺癌的方法，其包括a)測(cè)定來自所述人類個(gè)體的樣本中選自由RRM2、HOXC6、TGM4、RORB、HOXD1O、SFRP2和SNAI2組成的組中的一個(gè)或多個(gè)基因表達(dá)，b)確定正調(diào)節(jié)，或負(fù)調(diào)節(jié)所述一個(gè)或多個(gè)基因的表達(dá)，相對(duì)于以下樣品中所述一個(gè)或多個(gè)基因的各自表達(dá)，所述樣品來自所述不包含前列腺腫瘤細(xì)胞或前列腺腫瘤組織的人類個(gè)體，或者源自沒患前列腺癌的個(gè)體；和c)根據(jù)所述的一個(gè)或多個(gè)基因的確定的正調(diào)節(jié)或負(fù)調(diào)節(jié)，來確定有或沒有前列腺癌。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102272324SQ200980148342
公開日2011年12月7日 申請(qǐng)日期2009年9月29日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月1日
發(fā)明者杰克·A·沙爾肯, 桑德爾·阿德里安·揚(yáng)尼克, 費(fèi)朗西斯庫斯·皮特拉斯·斯米特, 達(dá)夫內(nèi)·赫塞爾斯 申請(qǐng)人:諾維奧根迪克斯研究有限公司