專利名稱：蛋氨酸裂解酶的基因序列及真核表達(dá)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體來說，本發(fā)明涉及編碼蛋氨酸裂解酶的變異序列 及蛋氨酸裂解酶在巴斯德畢赤酵母中的高效表達(dá)方法。
背景技術(shù)：
腫瘤和心血管疾病成為人類健康的最大殺手。在第18屆國際抗癌癥聯(lián)盟大會上， 世界衛(wèi)生組織發(fā)表的一項(xiàng)研究報(bào)告表明，全球癌癥狀況將日益嚴(yán)重，今后20年新患者人數(shù) 將由目前的每年1000萬增加到1500萬，因癌癥而死亡的人數(shù)也將由每年600萬增至1000 萬。我國流行病學(xué)調(diào)查表明，2003年我國城市居民惡性腫瘤致死率為94. 71/10萬，癌癥成 為第一位致死疾病。同時(shí)隨著人們生活水平的提高，心血管疾病發(fā)病率特在逐年增高。在 美國心血管疾病已成為影響人類健康頭號殺手?！都幽么筢t(yī)學(xué)會會刊》發(fā)表報(bào)告稱，加拿大 年青一代高血壓、糖尿病以及肥胖癥等患者數(shù)量明顯增多，這將導(dǎo)致未來數(shù)十年內(nèi)加心血 管疾病發(fā)病率大幅上升。人類健康面臨考驗(yàn)。傳統(tǒng)的腫瘤治療方法有化療和放射性療法，但二者都有很大的毒副作用，在治療 中給病人帶來很大的痛苦，如何尋找有效治療腫瘤的新途徑，成為人類健康研究的重大課 題。伴隨心血管疾病發(fā)病率的提高，如何做到及時(shí)檢測，對心血管疾病的預(yù)防和治療具有重 要的意義。L-蛋氨酸 γ-裂解酶(L-Methionine γ-lyase，EC4. 4. 1. 11)，簡稱 MGL，是一種磷 酸吡哆醛(PLP)依賴酶，屬于Y-蛋白家族。它能催化L-蛋氨酸及其衍生物的α，γ-消 除反應(yīng)及Y-取代反應(yīng)，催化L-半胱氨酸及其衍生物的α，β-消除反應(yīng)及β-取代反 應(yīng)。MGL在生物體內(nèi)含硫氨基酸的代謝中發(fā)揮重要作用，并被開發(fā)成為新型抗腫瘤藥物及同 型半胱氨酸血癥的診斷試劑，其作用機(jī)理及在治療上的潛在應(yīng)用價(jià)值引起了人們的極大關(guān) 注。MGL主要分布在一些細(xì)菌類中，如惡臭假單孢桿菌氣單孢菌屬、弗洛因德枸櫞 酸桿菌、擴(kuò)展短桿菌、牙齦卟啉菌、齒垢密螺旋體等，以及原蟲類陰道毛滴蟲和痢疾阿米 巴，還有低等植物擬南芥等。Coombs等對其他一些厭氧原蟲，如Ε. invadens, Τ. foetus, Τ. batrachorum, Giardia Iamblia的細(xì)胞裂解液進(jìn)行分析，未發(fā)現(xiàn)有MGL活性。Tokoro等 通過NCBI在23種古細(xì)菌中尋找MGL的同源結(jié)構(gòu)，只在甲烷八疊球古菌和巴氏甲烷八疊球 古菌等3種古細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)了類似結(jié)構(gòu)，并且在其他真核生物中，如酵母、真菌、人類等未發(fā) 現(xiàn)同源結(jié)構(gòu)。天然來源的MGL由于受產(chǎn)酶條件及產(chǎn)酶水平的影響，而限制了在實(shí)驗(yàn)研究及商業(yè) 化生產(chǎn)中的有效應(yīng)用，因此對MGL的異源表達(dá)成為研究的熱點(diǎn)。迄今為止已對多種來源的 MGL進(jìn)行克隆表達(dá)。雖然已有對多種不同來源的MGL進(jìn)行原核表達(dá)，但商業(yè)化的酶僅限于幾 種，如P. putida和T. vaginalis,國外已經(jīng)將其應(yīng)用于臨床抗腫瘤治療和同型半胱氨酸的 檢測。原核表達(dá)過程中重組蛋白有時(shí)容易形成包涵體，純化復(fù)性后酶的活性較低，造成了酶 的產(chǎn)量底，同時(shí)酶的穩(wěn)定性差、保存成本高也限制了其應(yīng)用。另外，重組MGL的免疫原性、蛋白降解、活性殘基的氧化及丟失輔酶因子影響其在血漿中的穩(wěn)定性。因此如何得到具有優(yōu) 良性狀、適合商業(yè)化應(yīng)用的MGL對于降低酶制劑的成本和提高應(yīng)用安全性具有重要意義。酵母為單細(xì)胞真核生物，既具有原核生物生長快、便于大規(guī)模廉價(jià)培養(yǎng)和基因操 作簡單等特點(diǎn)，又具有高等真核生物的分子生物學(xué)特性，如能進(jìn)行蛋白質(zhì)的正確加工、折疊 和翻譯后修飾等，從而產(chǎn)生具有天然生物活性的蛋白產(chǎn)物，并且后處理過程簡單，因而近些 年陸續(xù)開發(fā)了一些酵母表達(dá)系統(tǒng)，其中尤以畢赤酵母(Pichia pastoris)表達(dá)系統(tǒng)的應(yīng)用 最為廣泛。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種蛋氨酸裂解酶的基因序列及真核表達(dá)，即從人陰道毛 滴蟲中克隆出的能夠編碼蛋氨酸裂解酶的全長cDNA，命名為YMGLl cDNA序列，并將該片段 克隆到畢赤酵母分泌型表達(dá)載體ppic9k上，轉(zhuǎn)化到畢赤酵母GS115，經(jīng)篩選得到一株高效 表達(dá)的酵母基因工程微生物的方法。本發(fā)明的基因序列及真核表達(dá)是利用RT-PCR技術(shù)從人陰道毛滴蟲RNA中克隆出 的編碼蛋氨酸裂解酶(MGL)的cDNA基因全長1191bp，命名為Ymgll cDNA序列，生工測序結(jié) 果，這段序列與現(xiàn)有序列有四個(gè)變異堿基。測序結(jié)果如圖下
1ATGTCTCACGAGAGAATGACCCCGGCAACAGCATGCATCCATGCTAATCC
51ACAGAAGGATCAGTTTGGAGCAGCCATCCCACCAATCTACCAAACATCAA
101CATTCGTTTTCGATAACTGCCAACAGGGTGGAAACAGATTCGCTGGTCAG
151GAATCCGGCTACATCTACACACGTCTCGGCAACCCAACAGCTTCAAACCT
201CGAAGGCAAGATCGCCTTCCTCGAGAAAACAGAAGCATGCGTTGCCACAT
251CTTCTGGCATGGGTGCCATTGCTGCTACAGTTTTGACAATCCTCAAGGCC
301GGAGATCACTTAATCTCCGATGAGTGCCTTTATGGCTGCACACATGCTCT
351CTTTGAGCACGCATTGACAAAGTTCGGCATCCAGGTCGACTTCATCAACA
401CAGCCATCCCAGACGAGGTCAAGAAGCACATGAAGCCAAACACAAAGATT
451GTCTATTTCGAGACACCAGCCAACCCAACACTCAAGATCATCGACATGGA
501GCGCGTCTGCAAGGAAGTCCACAGCCAGGAGGGCGTCTTAGTTATCGCCG
551ATAACACATTCTGCTCACCAATGATCACAAACCCAGTCGACTTTGGCGTC
601GATGTTGTTGTCCACTCTGCGACAAAGTACATCAACGGCCACACAGATGT
651CGTCGCTGGCCTTATCTGTGGCAAGGCTGACCTCCTTCAACAGATTCGTA
701TGGTTGGTATCAAGGATATCACAGGATCTGTTATCAGCCCACACGACGCT
751TGGCTCATCACACGTGGCCTCTCAACACTCAACATCAGAATGAAGGCTGA
801GAGCGAGAACGCCATGAAGGTCGCTGAGTACCTCAAATCTCACCCAGCCG
851TTGAGAAGGTTTACTACCCAGTCTTCGAGGACCACGAGGGCCACGATATC
901GCTAAGAAGCAGATGAGAATGTACGGTTCAATGATCACATTCATCCTCAA
951GTCCGGCTTCGAAGGCGCTAAGAAGCTCCTCGACAACCTCAAGCTTATCA
1001CACTTGCAGTTTCCCTTGGTGGCTGCGAGTCCCTCATCCAGCACCCAGCT
1051TCAATGACTCACGCTGTCGTTCCAAAGGAGGAACGTGAGGCCGCTGGTAT
5
1101 TACAGATGGC ATGATCCGCC TTTCTGTCGG TATTGAAGAT GCCGACGAAC1151 TCATCGCTGA TTTCAAACAG GGCCTTGACG CTCTTTTATA A從人陰道毛滴蟲中克隆出蛋氨酸裂解酶基因片段，經(jīng)測序這段序列全長1191bp， 與目前國內(nèi)外已報(bào)道序列有四個(gè)變異堿基。將該基因片段克隆到畢赤酵母分泌型表達(dá)載體 PPicQk上，再轉(zhuǎn)化到畢赤酵母GS115，并建立畢赤酵母高效表達(dá)蛋氨酸裂解酶的基因工程 方法。本發(fā)明從人陰道毛滴蟲中克隆出的編碼蛋氨酸裂解酶變異基因cDNA全長為 1191bp，將此序列與現(xiàn)有的序列對照有所差異，其中與Trichomonas vaginalis mgll gen (PUBMED ID =9488680)有10個(gè)堿基存在差異，分別位于第24位(A — G)、第191位 (T —C)、第 413 位(G —D)、第 516 位(C —A)、第 518 位(C —T)、第 621 位(A —G)、第 872 位(G —T)、923 位(C —Α)、第 924 位(G — C)和第 1083 位(G —Α)，其中第 191、413、 516、518、872、923位堿基差異使編碼氨基酸發(fā)生變化，分別為第64位(V — Α)、第128位 (G — Α)、第 172 位(D — Ε)、第 173 位(Α — V)、第 291 位(G — V)第 308 位(S — Y)，一致性 達(dá)99. 16%;與Trichomonas vaginalis G3Chain A Methionine Gamma-Lyase mRNA(PUBMED ID : 17218520)有8個(gè)堿基存在差異，即上面除了第923位和924位10處中的8處，相應(yīng)氨基 酸變異數(shù)減小為5處；與馬百坤等從陰道毛滴蟲中克隆蛋氨酸裂解酶基因所得基因經(jīng)序列 分析，在ffiNEBANK (PUBMED ID =9488680)登錄的序列對照，有5個(gè)堿基存在差異，分別位于 第 24 位(A — G)、第 208 位(G — A)、第 516 位(C — A)，第 872 位(G — T)、1083 位(G — A) 其中第208、516位堿基差異使2個(gè)編碼氨基酸即賴氨酸和天冬氨酸均變?yōu)楣劝彼幔?91位的 谷氨酸變?yōu)槔i氨酸?？傊?，本發(fā)明從人陰道毛滴蟲中克隆出的編碼蛋氨酸裂解酶變異基因與現(xiàn)有的序 列存在4個(gè)堿基差異。分別位于第24位，第516位(C — A)，第872位(G — T)、1083位 (G — A)。將本發(fā)明克隆的Ymgll基因片段克隆到畢赤酵母分泌型表達(dá)載體pPic9k上，轉(zhuǎn) 化到畢赤酵母GS115，從重組的畢赤酵母中篩選出能夠高效表達(dá)的基因工程酵母菌株。以 甲醇誘導(dǎo)重組蛋氨酸裂解酶表達(dá)，結(jié)果顯示重組蛋白在畢赤酵母中主要以包涵體形式存 在。經(jīng)過表達(dá)條件優(yōu)化，確定優(yōu)化的表達(dá)條件是培養(yǎng)基PH 6. 0，培養(yǎng)溫度29.5°C，轉(zhuǎn)接量 1 45，誘導(dǎo)時(shí)菌體濃度0D_為5.0，誘導(dǎo)劑甲醇的終濃度為0.9%，誘導(dǎo)時(shí)間為48小時(shí)。通過G-75凝膠層析柱對重組蛋白進(jìn)行純化，并做SDS-PAGE電泳，利用凝膠成像分 析軟件測得純度達(dá)到95%以上。每升發(fā)酵菌液可以提取8. 58毫克可溶性MGL，純化回收率達(dá)到41. 1%。重組后的畢赤酵母菌體表達(dá)的MGL經(jīng)純化后分別以L-蛋氨酸、D L-同型半胱氨 酸、L-半胱氨酸為底物測定重組酶Km值為0. 432mM, 2. 36mM, 1. 98mM,比活性分別為27. 4、 351. 45,69. 62umol/min/mg proten,比文獻(xiàn)報(bào)道 rMGLl 活性分別高 2. 6 倍，1. 3 倍，4. 64 倍。發(fā)明得到的從人陰道毛滴蟲中克隆出的編碼蛋氨酸裂解酶變異基因序列，克隆到 真核表達(dá)載體上并轉(zhuǎn)入到真核酵母中表達(dá)的方法，所得到的蛋氨酸裂解酶具有很高的分泌 效率和酶活性。本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明是通過RT-PCR方法從人陰道毛滴蟲中克隆出的 mgll基因序列，將該片段克隆到畢赤酵母分泌型表達(dá)載體pPic9k上，獲得重組表達(dá)質(zhì)粒pPic9k-mgll，轉(zhuǎn)化到畢赤酵母GS115中，再從中篩選一種高效表達(dá)酵母基因工程株。得到 一菌株經(jīng)甲醇誘導(dǎo)后可高效表達(dá)蛋氨酸裂解酶的重組株，蛋氨酸裂解酶表達(dá)量每毫升為 8. 58mg，酶活為27. 4U/mg，經(jīng)過該種方法得到的工程株具有非常顯著的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和社會價(jià)值。


圖1是蛋氨酸裂解酶基因逆轉(zhuǎn)錄PCR產(chǎn)物電泳圖1為空白對照；2，3為蛋氨酸裂解酶的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；M =DNA marker DL 2000 ；圖2是目的基因pPic9k-mgll雙酶切鑒定電泳圖Ml 為 DNA marker DL 2000 ；1,2 % pPic9k_Ymgll 被 NotI 和 EcoR I 雙酶切；3，4 為pPic9k被NotI和EcoR I雙酶切；圖3是pPic9k_Ymgll的PCR鑒定電泳圖Ml 為 DNA marker DL 2000 ；1 為 pPic9k_Ymgll ；2 為 pPic9k ；3 為 F、R 引物對 pPic9k-Ymgll基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；4 :F、R引物對PRC pPic9k基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；5 3，AOXU a-Factor 通用引物對 pPic9k-Ymgll 基因的 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物；6 :3，AOXU a-Factor 引物對pPic9k基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；M2 :DNA marker DL 15000 ；圖4和圖5是生工測序報(bào)告單圖6是菌落PCR電泳7是重組質(zhì)粒pPic9k-Ymgll在酵母中的表達(dá)電泳圖M為低分子量蛋白Marker ；1、2、3、4、5、6均為酵母菌含pPic9k_Ymgll誘導(dǎo)后電泳 圖；圖8是實(shí)驗(yàn)總體路線圖；
具體實(shí)施例方式實(shí)驗(yàn)所需的材料、試劑及菌種(1)菌株和載體陰道毛滴蟲(解放軍第四六一醫(yī)院體檢、白帶常規(guī)涂片檢查含陰道毛滴蟲但近期 未服用抗生素的患者)、大腸桿菌DH5 α、畢赤酵母GS115、表達(dá)載體pPic9k。(2)酶類及其它生化試劑質(zhì)粒小提試劑盒(TIANGEN)；凝膠回收試劑盒(V-gene公司)；經(jīng)典總RNA提取試 劑盒(上海生工)。TaKaRa pfu酶，T4 DNA連接酶；胰蛋白胨，酵母提取物，瓊脂糖，瓊脂，低 相對分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白，標(biāo)準(zhǔn)核酸:marker DL 2000，marker DL 15000，TEMED，溴酚藍(lán)，SDS, Amp，CaCl2，考馬氏亮藍(lán) R-250，Tris-HCl，EDTA，NaOH，CH3COOH,山梨醇，葡萄糖，甲醇，甘油， 生物素，Tris等(從鼎國公司購買)。其余試劑均為分析純或生化試劑；所用引物由上海生 工公司合成。(3)培養(yǎng)基使用的培養(yǎng)基:LB培養(yǎng)基，YPD，MD，MM，BMMY，BMGY培養(yǎng)基均參照Invitrogen畢氏 酵母操作手冊。實(shí)施例IYMGLl cDNA基因序列的獲得
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(1)、總 RNA 的提取取陰道毛滴蟲的菌液，SOOOrpm離心2min，0. 25MX3蔗糖洗滌沉淀，得到細(xì)胞沉淀 50mg/管。采用上海生工經(jīng)典總RNA提取試劑盒按50mg量提取，最后在50°C烘箱中烘干乙 醇，lOulDEPC水溶解。
(2)、獲取目的基因PCR引物
根據(jù)引物設(shè)計(jì)原則，利用primer primer軟件設(shè)計(jì)引物 上游引物(YmgllF)5' -CGGAATTCATGTCTCACGAGAGAATG-3 ‘ EcoR I 下游引物(YmgllR)5' -ATGCGGCCGCTTATAAAAGAGCGTCAAG-3‘ Not I pPic9k通用引物
a-Factor primer 5' -TACTATTGCCAGCATTGCTGC-3‘ 3' A0X 1 primer 5' -GCAAATGGCATTCTGACATCC-3‘
(3)、目的基因RT-PCR 3. 1RT
權(quán)利要求
一種蛋氨酸裂解酶的基因序列，其基因序列是利用RT PCR技術(shù)從人陰道毛滴蟲RNA中克隆出的編碼蛋氨酸裂解酶MGL的cDNA基因全長1191bp，命名為Ymgl1 cDNA序列，生工測序結(jié)果，這段序列與現(xiàn)有的序列有四個(gè)變異堿基；測序結(jié)果如圖下1ATGTCTCACG AGAGAATGAC CCCGGCAACA GCATGCATCC ATGCTAATCC51 ACAGAAGGAT CAGTTTGGAG CAGCCATCCC ACCAATCTAC CAAACATCAA101 CATTCGTTTT CGATAACTGC CAACAGGGTG GAAACAGATT CGCTGGTCAG151 GAATCCGGCT ACATCTACAC ACGTCTCGGC AACCCAACAG CTTCAAACCT201 CGAAGGCAAG ATCGCCTTCC TCGAGAAAAC AGAAGCATGC GTTGCCACAT251 CTTCTGGCAT GGGTGCCATT GCTGCTACAG TTTTGACAAT CCTCAAGGCC301 GGAGATCACT TAATCTCCGA TGAGTGCCTT TATGGCTGCA CACATGCTCT351 CTTTGAGCAC GCATTGACAA AGTTCGGCAT CCAGGTCGAC TTCATCAACA401 CAGCCATCCC AGACGAGGTC AAGAAGCACA TGAAGCCAAA CACAAAGATT451 GTCTATTTCG AGACACCAGC CAACCCAACA CTCAAGATCA TCGACATGGA501 GCGCGTCTGC AAGGAAGTCC ACAGCCAGGA GGGCGTCTTA GTTATCGCCG551 ATAACACATT CTGCTCACCA ATGATCACAA ACCCAGTCGA CTTTGGCGTC601 GATGTTGTTG TCCACTCTGC GACAAAGTAC ATCAACGGCC ACACAGATGT651 CGTCGCTGGC CTTATCTGTG GCAAGGCTGA CCTCCTTCAA CAGATTCGTA701 TGGTTGGTAT CAAGGATATC ACAGGATCTG TTATCAGCCC ACACGACGCT751 TGGCTCATCA CACGTGGCCT CTCAACACTC AACATCAGAA TGAAGGCTGA801 GAGCGAGAAC GCCATGAAGG TCGCTGAGTA CCTCAAATCT CACCCAGCCG851 TTGAGAAGGT TTACTACCCA GTCTTCGAGG ACCACGAGGG CCACGATATC901 GCTAAGAAGC AGATGAGAAT GTACGGTTCA ATGATCACAT TCATCCTCAA951 GTCCGGCTTC GAAGGCGCTA AGAAGCTCCT CGACAACCTC AAGCTTATCA1001 CACTTGCAGT TTCCCTTGGT GGCTGCGAGT CCCTCATCCA GCACCCAGCT1051 TCAATGACTC ACGCTGTCGT TCCAAAGGAG GAACGTGAGG CCGCTGGTAT1101 TACAGATGGC ATGATCCGCC TTTCTGTCGG TATTGAAGAT GCCGACGAAC1151 TCATCGCTGA TTTCAAACAG GGCCTTGACG CTCTTTTATA A圖示結(jié)束。
2.一種蛋氨酸裂解酶的基因序列的真核表達(dá)，其真核表達(dá)是從人陰道毛滴蟲中克隆 出蛋氨酸裂解酶基因片段，經(jīng)測序這段序列全長1191bp，與現(xiàn)有的序列有四個(gè)變異堿基； 將該基因片段克隆到畢赤酵母分泌型表達(dá)載體pPic9k上，再轉(zhuǎn)化到畢赤酵母GS115，并建 立畢赤酵母高效表達(dá)蛋氨酸裂解酶的基因工程方法。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種蛋氨酸裂解酶的基因序列的真核表達(dá)，其真核表達(dá)是 克隆的Ymgll基因片段克隆到畢赤酵母分泌型表達(dá)載體pPic9k上，轉(zhuǎn)化到畢赤酵母GS115， 從重組的畢赤酵母中篩選出能夠高效表達(dá)的基因工程酵母菌株；以甲醇誘導(dǎo)重組蛋氨酸裂 解酶表達(dá)，結(jié)果顯示重組蛋白在畢赤酵母中主要以包涵體形式存在；經(jīng)過表達(dá)條件優(yōu)化，確 定優(yōu)化的表達(dá)條件是，培養(yǎng)基PH 6.0，培養(yǎng)溫度29.5°C，轉(zhuǎn)接量1 45，誘導(dǎo)時(shí)菌體濃度 OD600為5. 0，誘導(dǎo)劑甲醇的終濃度為0. 9%，誘導(dǎo)時(shí)間為48小時(shí)；通過G-75凝膠層析柱對重組蛋白進(jìn)行純化，并做SDS-PAGE電泳，利用凝膠成像分析軟 件測得純度達(dá)到95%以上； 每升發(fā)酵菌液可以提取8. 58毫克可溶性MGL，純化回收率達(dá)到41. 1% ； 重組后的畢赤酵母菌體表達(dá)的MGL經(jīng)純化后分別以L-蛋氨酸、D L-同型半胱氨酸、 L-半胱氨酸為底物測定重組酶Km值為0. 432mM, 2. 36mM, 1. 98mM,比活性分別為27. 4、 351. 45,69. 62umol/min/mg proten,比 rMGLl 活性分別高 2. 6 倍，1. 3 倍，4. 64 倍。
全文摘要
一種蛋氨酸裂解酶的基因序列及真核表達(dá)，涉及基因工程領(lǐng)域，其基因序列及真核表達(dá)是從人陰道毛滴蟲中克隆出蛋氨酸裂解酶基因片段，經(jīng)測序這段序列全長1191bp，將該基因片段克隆到畢赤酵母分泌型表達(dá)載體pPic9k上，再轉(zhuǎn)化到畢赤酵母GS115，并建立畢赤酵母高效表達(dá)蛋氨酸裂解酶的基因工程方法。有益效果是通過RT-PCR方法從人陰道毛滴蟲中克隆出的mgl1基因序列，克隆到畢赤酵母分泌型表達(dá)載體pPic9k上，獲得重組表達(dá)質(zhì)粒pPic9k-mgl1，轉(zhuǎn)化到畢赤酵母GS115中，得到一菌株經(jīng)甲醇誘導(dǎo)后可高效表達(dá)蛋氨酸裂解酶的重組株，經(jīng)過該種方法得到的工程株具有非常顯著的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和社會價(jià)值。
文檔編號C12N9/88GK101955959SQ201010175798
公開日2011年1月26日 申請日期2010年5月19日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月19日
發(fā)明者于源華, 侯巍, 夏立亮, 姚健, 楊佳新, 王保學(xué) 申請人:長春理工大學(xué)