專利名稱：一種培育矮桿水稻的方法
一種培育矮桿水稻的方法技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)領(lǐng)域，具體而言是一種利用轉(zhuǎn)基因抑制水稻中 0sDCL3a基因的表達(dá)培育矮桿水稻的方法。
背景技術(shù)：
水稻是我國(guó)重要的糧食作物，其產(chǎn)量和品質(zhì)對(duì)于我國(guó)的糧食生產(chǎn)和糧食安全都至關(guān)重要的。最近年來(lái)，全球氣候多變，臺(tái)風(fēng)、颶風(fēng)增多，水稻倒伏現(xiàn)象嚴(yán)重，大大降低了水稻的產(chǎn)量和品質(zhì)，我國(guó)糧食生產(chǎn)面臨著嚴(yán)峻的考驗(yàn)。一般說(shuō)來(lái)，高桿的水稻倒伏現(xiàn)象比較嚴(yán)重，矮桿水稻的抗倒伏能力比較強(qiáng)，因此培育矮桿水稻能夠減少水稻的倒伏率、增加產(chǎn)量、 提高品質(zhì)，是現(xiàn)代水稻育種中的熱點(diǎn)問(wèn)題之一。隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，分子生物學(xué)在水稻育種方面發(fā)揮著越來(lái)越重要的作用。
小分子RNA是現(xiàn)代分子學(xué)研究的熱點(diǎn)，具有調(diào)節(jié)功能的非編碼小分子RNA是指長(zhǎng)度為21-25 nt左右，大多在進(jìn)化上具有序列保守的小分子RNA。它們不編碼蛋白質(zhì)，而是以RNA的形式，在轉(zhuǎn)錄后水平上通過(guò)降解mRNA或抑制其翻譯等方式，參與調(diào)節(jié)真核生物染色體結(jié)構(gòu)的維持、防御病毒及調(diào)控生長(zhǎng)發(fā)育等過(guò)程。小分子RNA特別是miRNA的發(fā)現(xiàn)是近年來(lái)生命科學(xué)研究的一個(gè)重大突破。
小分子RNA根據(jù)其前體及其合成途徑可以分為siRNA和miRNA (microRNA)兩大類。其中，siRNA是由一種具有RNA酶III活性的Dicer切割長(zhǎng)的dsRNA分子產(chǎn)生的，然后組裝到一個(gè)名為RISC的蛋白復(fù)合物中發(fā)揮作用。動(dòng)物中Dicer基因較少，如人、小鼠和線蟲中只有一個(gè)Dicer基因，因此負(fù)責(zé)了全部miRNA和siRNA的生物合成。在果蠅中，Dicer-I 和Dicer-2則分別負(fù)責(zé)miRNA和siRNA的合成和代謝。植物DCL基因相對(duì)較多，功能也相對(duì)復(fù)雜，如擬南芥有四個(gè)DCL基因編碼的蛋白，各自具有不同的功能。例如，dell突變體導(dǎo)致各種發(fā)育缺陷。dell強(qiáng)突變體使胚胎發(fā)育停止在球形胚期。dell弱突變體表現(xiàn)出各種不同的發(fā)育缺陷，例如，葉片形狀改變、開花遲緩以及子房發(fā)育不正常等，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)， dcll-9miRNA不能正?！しe累。
本研究首次提供了一種利用水稻中Dicer的蛋白0sDCL3a培育矮桿水稻的方法， 這不僅提供了一種解決水稻倒伏的方法，而且為利用先進(jìn)的小分子RNA技術(shù)解決現(xiàn)代育種問(wèn)題提供了一個(gè)切實(shí)的方案，具有重要的意義。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種利用水稻中Dicer蛋白0sDCL3a培育矮桿水稻的方法， 該方法是利用轉(zhuǎn)基因抑制水稻細(xì)胞中0sDCL3a基因的表達(dá)，從而獲得矮桿的水稻。0sDCL3a 基因的脫氧核苷酸序列如序列表中序列2所示。
優(yōu)選為利用RNA干擾技術(shù)抑制水稻中0sDCL3a基因的表達(dá)，具體步驟如下1，將a或b構(gòu)建到pCAMBIA2300 (可購(gòu)自cambia公司)載體上，得到pCAMBIA2300 — 0sDCL3aIR重組載體。
(a)序列表中序列I所示的核苷酸序列；
(b)由(a)中的核苷酸序列經(jīng)過(guò)突變或替換得到的能夠與(a)的反義鏈相結(jié)合的核苷酸序列。2，將 pCAMBIA2300 — 0sDCL3aIR 導(dǎo)入水稻細(xì)胞。其中，本發(fā)明以pCAMBIA2300為出發(fā)載體，攜帶有本發(fā)明水稻矮化相關(guān)的0sDCL3a 基因的植物重組表達(dá)載體可通過(guò)使用原生質(zhì)體-化學(xué)介導(dǎo)法(Ca2+、PEG)、Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、花粉管導(dǎo)入、微注射、電激、基因槍、農(nóng)桿菌介導(dǎo)等常規(guī)生物學(xué)方法中的任何一種或幾種方法的組合轉(zhuǎn)化水稻細(xì)胞、組織或器官，并將轉(zhuǎn)化的水稻細(xì)胞、組織或器官培育成植株；所述組織和器官可包括宿主水稻的果莢、愈傷組織、莖尖、葉片和種子等。pCAMBIA2300 一 0sDCL3aIR轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系和轉(zhuǎn)基因宿主菌均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。


圖I 為 pCAMBIA2300_0sDCL3aIR 的物理圖譜。圖2為0sDCL3a基因通過(guò)RNAi敲除后植株表現(xiàn)出的表型。圖 3 為 pCAMBIA2300- 0sDCL3aIR轉(zhuǎn)基因植株的 Small RNA Northern 雜交結(jié)果。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所用方法如無(wú)特別說(shuō)明均為常規(guī)方法，具體步驟可參見 《Molecular Cloning: A Laboratory Manual》(Sambrook, J. , Russell, David ff., Molecular Cloning: A Laboratory Manual,3rd edition,200I,NY,Cold Spring Harbor)。 所用引物及DNA序列均由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。
實(shí)施例一 PCAMBIA2300 — 0sDCL3aIR載體的構(gòu)建 1， pUCRNAi載體的改造
PUCRNAi載體是在pUC18載體基礎(chǔ)上改造得到，按照如下方法構(gòu)建將pUC18載體經(jīng) BamHl和及^I酶切后，由T4聚合酶將其補(bǔ)平，以馬鈴薯基因組DNA為模板，利用正向引物 CCT GCA GGC TCG AGA CTA GTA GAT CTG GTA CGG ACC GTA CTA CTC TA 和反向引物CCT GCA GGG TCG ACT CTA GAG GAT CCC CTA TAT AAT TTA AGT GGA AAA 進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增馬鈴薯 GA20氧化酶中的內(nèi)含子。將擴(kuò)增的產(chǎn)物以平端的方式插入PUC18載體的及麗71和及位點(diǎn)間，得到PUCRNAi載體。2， PCAMBIA2300ACT 載體的改造
PCAMBIA2300ACT是由pCAMBIA2300 (CAMBIA公司)載體基礎(chǔ)上構(gòu)建的，具體方法如下以水稻日本晴的基因組DNA為模板，用引物CGAATTCGAGCTCGGTACCC TCGAGGTCATTCATATGCTTGAGA 和 TCTAGAGGATCCCCGGGTACCTCTTCTACC TACAAAAAAGCTCCGCAC 進(jìn)行PCR，擴(kuò)增Actinl。將PCR產(chǎn)物經(jīng)和油<^1酶切后插入pCAMBIA2300載體的 EcoRl和油a7I位點(diǎn)間，作為驅(qū)動(dòng)的啟動(dòng)子，得到重組載體pCAMBIA2300ACT。3，pCAMBIA2300 — 0sDCL3aIR 載體的構(gòu)建提取水稻日本晴植株花序的總RNA，用oligo d (T)為引物，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，用引物 CX0022 (5’-CGCGGATCCAGTTCCAGAAATTGTA-3’)和 CX0023 (5’-CCGCTCGAGCATTAGGTACTTTTG ATCT-3’)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到如許列表中序列1所示的核苷酸序列，該片段命名為OsDCL-3a-399。用XhoI和Bgl II酶切pUCRNAi，回收大片段與經(jīng)及麗TI和損ol雙酶切的PCR產(chǎn)物連接，將fls々aJa-399反向插入pUCRNAi的損ol和勒“/II位點(diǎn)間得到的重組載體命名為 pUCRNAi -0sDCL3a- >m。用 BatnHl 和 Sal\ 雙酶切 pUCRNAi-fls々aJa-399，回收大片段與經(jīng)及m HI和損ol雙酶切的PCR產(chǎn)物連接，將0sDCL3a- >m正向插入pUCRNAi-fls々aJa_399 的BamHl和Sal\位點(diǎn)間得到的重組載體命名^\iC-0sDCL3aIR。再將用I3StI酶切 V\iC-0sDCL3aIR 得到的正反方向的莖環(huán)片段{0sDCL3a~399a-Qk2Q intron-0sDCL3a_399s) 插入pCAMBIA2300ACT中I3StI酶切位點(diǎn)間，重組載體命名為pCAMBIA2300-fls々aJa/T ，如附圖1所示。
實(shí)施例二矮桿水稻的獲得將重組表達(dá)載體pCAMBIA2300-fls々aJa77 通過(guò)根癌農(nóng)桿(Agrobacterium tume faciens)菌株AGLl的介導(dǎo)轉(zhuǎn)入水稻日本晴成熟種子愈傷組織，在愈傷組織分化出的芽長(zhǎng)至3-5cm時(shí)，切下芽，移入附加25mg/L除草劑草銨膦的生根培養(yǎng)基(MS+25mg/L草銨膦)， 光照培養(yǎng)生根，得到TO代轉(zhuǎn)基因植株；幼苗長(zhǎng)至約8-lOcm高，培養(yǎng)瓶開蓋煉苗1_2 天，洗去根部植物凝膠，種植于田間，常規(guī)管理。
轉(zhuǎn)化獲得的植株通過(guò)PCR驗(yàn)證新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶II (NPTII)基因是否存在驗(yàn)證轉(zhuǎn)基因是否成功。以植株的基因組DNA為模板，利用引物CX637(5' GATTGAACAAGATGGATTGCACGCAGGTT3，)和 CX638 (5，CAGAAGAACTCGTCAAGAAGGCGATAGAA 3，) PCR擴(kuò)增得到666bp的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶II片段的第一代轉(zhuǎn)基因植株為TO代轉(zhuǎn)基因植株。 結(jié)果得到10株TO代轉(zhuǎn)pCAMBIA2300-fls々aJa77 植株。
該10株TO代pCAMBIA2300-fl^aJa77 轉(zhuǎn)基因植株中有兩株與野生型(正常未轉(zhuǎn)基因的水稻日本晴)均表現(xiàn)明顯異常的表型；pCAMBIA2300-fl^aJa77 轉(zhuǎn)基因水稻植株表現(xiàn)植株變矮，我們得到了矮化的水稻(見附圖2)。RT-PCR顯示這些轉(zhuǎn)基因株系中0sDCL3a 均有不同程度的過(guò)量表達(dá)。
實(shí)施例三矮桿水稻的檢測(cè)和驗(yàn)證為了進(jìn)一步驗(yàn)證pCAMBIA2300-fl^aJa77 轉(zhuǎn)基因水稻植株，我們提取野生型日本晴和pCAMBIA2300-fls々aJa77 轉(zhuǎn)基因苗葉片的總RNA，通過(guò)半定量RT-PCR鑒定0sDCL3a基因的表達(dá)。結(jié)果表明，在pCAMBIA2300-fls々aJa77 轉(zhuǎn)基因水稻中0sDCL3a基因的表達(dá)水平相對(duì)于野生型日本晴明顯下降。而OsDCLl和OsDClA的表達(dá)量在pCAMBIA2300-fls々aJa77 轉(zhuǎn)基因水稻和野生型日本晴間沒有變化，說(shuō)明對(duì)0sDCL3a基因的敲除是特異的，轉(zhuǎn)基因植株的異常表型是由于0sDCL3a的功能喪失造成的。
同時(shí)，提取水稻日本晴植株花序的總RNA，用oligo d (T)為引物，反轉(zhuǎn)錄成 cDNA,用引物 CX0022 (5，-CGCGGATCCAGTTCCAGAAATTGTA-3，)和 CX0023 (5，-CCGCTCGAG ATTAGGTACTTTTGATCT-3' ) PCR擴(kuò)增序列2的自5’末端第1856位至22 位脫氧核糖核普酸，并連入 pGEM-T Easy 載體，得到重組載體 pGEM_0sDCL3a_399。以 pGEM_0sDCL3a_399 為模板，用引物M13 (+) (5’ -GTAAAACGACGGCCAG-3’)和引物CX0023進(jìn)行PCR擴(kuò)增。獲得的序列是由T7啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)下的序列2的自5’末端第1856位至22M位脫氧核糖核苷酸。以5該序列為模板，在17 RNA聚合酶的作用下，合成32P-UTP標(biāo)記的RNA探針。所述RNA探針是將序列2的自5’末端第1856位至2254位脫氧核糖核苷酸中的T均替換為U得到的RNA。 分別提取三株TO代轉(zhuǎn)pCAMBIA2300-tt^aJa77 植株植株花序的總RNA，利用如上RNA探針進(jìn)行小分子RNA Northern雜交，結(jié)果表明三株表現(xiàn)為TO代轉(zhuǎn)pCAMBIA2300-tt^aJa77 植株得到較強(qiáng)24nt和22nt的雜交條帶(圖3中泳道2_4)，而正常未轉(zhuǎn)基因的水稻日本晴 (Nipponbare)植株未得到雜交條帶(圖3中泳道1，5)。這進(jìn)一步說(shuō)明了，我們通過(guò)抑制 0sDCL3a基因的表達(dá)，獲得了矮化的水稻。
權(quán)利要求
1.一種培育矮桿水稻的方法，包括通過(guò)轉(zhuǎn)基因抑制水稻中0sDCL3a基因的表達(dá)而獲得矮桿水稻。
2.權(quán)利要求I所述的培育矮桿水稻的方法，其中所述轉(zhuǎn)基因是將(a)或(b)序列所示的核苷酸導(dǎo)入水稻細(xì)胞中。(a)序列表中序列I所示的核苷酸序列；(b)由(a)中的核苷酸序列經(jīng)過(guò)突變或替換得到的能夠與(a)的反義鏈相結(jié)合的核苷酸序列。
3.權(quán)利要求2所述的培育矮桿水稻的方法，其中(a)或(b)序列所示的核苷酸是通過(guò)植物重組表達(dá)載體導(dǎo)入水稻的，優(yōu)選所述植物重組表達(dá)載體是pCAMBIA2300-0sDCL3aIR。
4.植物重組表達(dá)載體，包含權(quán)利要求2所述的核苷酸序列，優(yōu)選為 pCAMBIA2300-0sDCL3aIR。
5.經(jīng)轉(zhuǎn)化的微生物細(xì)胞，具有權(quán)利要求3所述的重組載體。
6.經(jīng)轉(zhuǎn)化的水稻細(xì)胞，具有權(quán)利要求3所述的重組載體。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種利用水稻中Dicer蛋白OsDCL3a培育矮桿水稻的方法，該方法是利用轉(zhuǎn)基因抑制水稻細(xì)胞中OsDCL3a基因的表達(dá)，具體地是利用RNA干擾技術(shù)抑制水稻中OsDCL3a基因的表達(dá)從而獲得矮桿的水稻，對(duì)于水稻的抗倒伏具有重要的意義，應(yīng)用前景廣闊。
文檔編號(hào)C12N5/10GK102533757SQ20111000006
公開日2012年7月4日 申請(qǐng)日期2011年1月2日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月2日
發(fā)明者儲(chǔ)成才, 劉斌, 劉春艷, 宋顯偉, 曹曉風(fēng) 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所