專利名稱：一株低溫降解多環(huán)芳烴菌株及其在石油烴污染場地地下水生物修復中的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于環(huán)境工程和微生物工程技術領域，尤其涉及一株低溫降解多環(huán)芳烴的新鞘氨醇桿菌及其在石油烴污染場地地下水生物修復中的應用。
背景技術：
多環(huán)芳烴分子中含有兩個以上的苯環(huán)結構，屬不飽和烴，主要包括雙環(huán)芳烴 (萘)、三環(huán)芳烴(蒽、菲)以及三環(huán)以上芳烴(如苯并芘、苯并蒽)，其中以兩環(huán)、三環(huán)芳烴最為常見，其廣泛存在于原油和石油制品(汽油、煤油、柴油等)中。隨著石油及制品的生產與廣泛使用，各種途徑造成的多環(huán)芳烴污染也日趨嚴重， 其中石油烴直接滲入及雨水、灌溉水對土壤淋溶或是地表水體滲透均導致了許多國家和地區(qū)的地下水受到多環(huán)芳烴的嚴重污染。由于多環(huán)芳烴及其衍生物具有致癌性、致突變性和致畸性，以及急性毒性和亞致死作用，使得多環(huán)芳烴污染地下水的控制與修復已迫在眉睫。目前典型的地下水污染修復方法主要有異位修復方法和原位修復方法。異位修復 (抽出處理技術)被廣泛用于易揮發(fā)且易溶解污染質(V0Cs，SV0CS，F(xiàn)UelS)的恢復和治理中， 但由于多環(huán)芳烴的溶解度相對較低且難以揮發(fā)，使其在多環(huán)芳烴污染地下水修復中的應用受到了限制。和異位修復相比，原位修復不但修復費用相對節(jié)省，而且還能最大程度減少污染物的暴露和對土地環(huán)境的擾動，其中原位生物修復被認為是一種很有發(fā)展前景的地下水修復技術。原位生物修復，是指在基本不破壞土壤和地下水自然環(huán)境的條件下，對受污染環(huán)境對象不作搬運或輸送，而在原場所進行生物修復。能夠影響生物修復效率的因素有許多，其中功能微生物的污染物降解能力與效率最為重要。因此，對于多環(huán)芳烴污染而言，國內外進行了大量多環(huán)芳烴降解生物的篩選工作。到目前為止，已分離出具有多環(huán)芳烴降解能力的菌種主要有以下各屬的菌株假單胞菌屬(Pseudomonas)、糞產堿桿菌屬(Alcaligenes faecalis)、擬諾卡氏菌屬(Nocardioides)、氣單胞菌屬(Aeromonas)、 微球菌屬(Micrococcus)、莫拉氏菌屬(Moraxella)、拜葉林克氏菌屬(Bei jerinckia)、 分枝桿菌屬(Mycobacterium)、黃桿菌屬(Flavobacterium)、弧菌屬(Vibrio)、解環(huán)菌屬 (Cycloclasticus)、海桿菌屬(MarincAacter)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、鞘氨醇單胞菌屬 (Sphingomonas)、硫酸鹽還原菌(SRB)等細菌，以及酵母菌和白腐真菌等真菌；其中對細菌中假單胞菌和擬諾卡氏菌的多環(huán)芳烴降解研究最為廣泛與深入，而真菌的降解研究則相對較少。從上述多環(huán)芳烴降解菌種的篩選、降解能力及機理的研究中可知降解菌種的工作溫度大多為30-38°C左右，多環(huán)芳烴濃度(以萘、菲為例)多為幾百mg/L-幾十g/L，目標多環(huán)芳烴多為一種或兩種，測試條件下多環(huán)芳烴降解效率較高。然而實際多環(huán)芳烴污染場地的地下水環(huán)境溫度較低(10-15°C )、多環(huán)芳烴種類較多且較低(10 μ g/L-20mg/L),這使得已篩選的多環(huán)芳烴降解菌很難用于實際的地下水生物修復工程中，其中以溫度影響最為突出。因此，本發(fā)明是針對地下水環(huán)境低溫、多環(huán)芳烴濃度低等工程特點，經過獨特的分離、富集策略而篩選的低溫多環(huán)芳烴降解菌，用于石油烴污染場地地下水的生物修復。

發(fā)明內容
本發(fā)明旨在克服現(xiàn)有技術的不足之處而提供一種低溫降解多環(huán)芳烴菌株、該菌株的篩選方法以及該菌株用于治理石油烴污染地下水的生物修復技術，該菌株是具有在低溫條件下降解多種多環(huán)芳烴的新鞘氨醇桿菌，在治理石油烴污染地下水中可以應用。為達到上述目的，本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的本發(fā)明提供的新鞘氨醇桿菌 (Novosphingobium sp.)，于2009年10月12日保藏于“中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心”，其保藏號CGMCC No. 33沈。地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院，中國科學院微生物研究所。新鞘氨醇桿菌(Novosphingobium sp.)是從吉林油田某污染場地中分離，并經低溫強化自然富集篩選得到。菌株可在溫度10 37°C，pH值6. 5 8. 5培養(yǎng)條件下較好生長；菌株形態(tài)特征為革蘭氏陰性，桿菌，黃色，尺寸0. 3 0. 5 μ mX 1. O 1. 5 μ m，無鞭毛； 菌株LB培養(yǎng)24h菌落特征為圓形，菌落直徑2 3mm，黃色，表面光滑，邊緣整齊。本發(fā)明菌株的生理生化特性為氧化酶、接觸酶、硝酸鹽還原、尿素水解、產吲哚等試驗項目為陽性，產、明膠液化、反硝化、油脂水解、MR、VP、檸檬酸利用、3-酮基乳糖利用、亞硝酸鹽還原、產氨、淀粉水解等試驗項目為陰性，石蕊牛奶凝乳酶凝固，葡萄糖氧化產酸發(fā)酵。本發(fā)明所述菌株可在溫度10 37°C，pH值6. 5 8. 5培養(yǎng)條件下較好生長；菌株形態(tài)特征為革蘭氏陰性，桿菌，黃色，尺寸0. 3 0. 5 μ mX 1. 0 1. 5 μ m，無鞭毛；菌株LB 培養(yǎng)24h菌落特征為圓形，菌落直徑2 3mm，黃色，表面光滑，邊緣整齊。菌株具有在10 20°C低溫下快速降解多環(huán)芳烴的能力。作為一種優(yōu)選方案，本發(fā)明所述菌株能以多環(huán)芳烴為唯一碳源和能源生長。上述低溫降解多環(huán)芳烴菌株的篩選方法，可按如下步驟依次實施(1)在室外溫度小于-20°C時，從油田污染場地采集距地表下5 20cm處表層土壤樣品，以及地下水樣品，制備成菌懸液，共同作為菌源進行低溫自然富集培養(yǎng)；所述富集培養(yǎng)基含有無機鹽培養(yǎng)基、0#柴油、葡萄糖及酵母膏；所述無機鹽培養(yǎng)基含有K2HP04、NaH2PCV (NH4)2SO4, MgCl2 · 6H20、EDTA, ZnSO4 · 7H20、CaCl2 · 2H20、FeSO4 · 7H20、NaMoO4 · 2H20、CuSO4 · 5H20、 CoCl2 ·6Η20及MnCl2 ·2Η20 ； (2)取適量菌懸液重新接種至步驟(1)所述的富集培養(yǎng)基中，繼續(xù)低溫適應、富集；(3)連續(xù)傳代培養(yǎng)，逐次減少葡萄糖和酵母膏用量，直至0#柴油為唯一碳源和能源生長；(4)繼續(xù)低溫適應、富集，同時監(jiān)測富集培養(yǎng)基中柴油組分的降解情況， 發(fā)現(xiàn)0#柴油中多環(huán)芳烴被降解后，將菌懸液涂布在含0#柴油的固體無機鹽培養(yǎng)基上；將分離得到菌種分別接種至含0#柴油的無機鹽培養(yǎng)基中，依據各菌株所在培養(yǎng)基中的多環(huán)芳烴組分減少和濃度降低情況，進行分離即得目的產物低溫降解多環(huán)芳烴菌株新鞘氨醇桿菌 (Novosphingobium sp. )0上述低溫降解多環(huán)芳烴菌株可用于石油烴污染場地地下水的低溫生物修復。具體地，本發(fā)明可采用低溫降解多環(huán)芳烴菌株的生長細胞進行低溫降解多環(huán)芳烴。
另外，本發(fā)明還可采用低溫降解多環(huán)芳烴菌株的靜基細胞進行低溫降解多環(huán)芳烴。其次，本發(fā)明還可采用低溫降解多環(huán)芳烴菌株的固定化細胞進行低溫降解多環(huán)芳烴。本發(fā)明新鞘氨醇桿菌(Novosphingobium sp.)可在溫度10-37°C，pH值6. 5 8. 5 培養(yǎng)條件下較好生長；菌株形態(tài)特征為革蘭氏陰性，桿菌，黃色，尺寸0. 3 0. 5 μ mX 1. O 1. 5 μ m,無鞭毛。新鞘氨醇桿菌(Novosphingobiumsp.)在 LB (蛋白胨 10，牛肉膏 3，NaCl 5，pH 7. 4 7. 6，單位g/L)培養(yǎng)M小時菌落特征為圓形，菌落直徑2 3mm，黃色，表面光滑，邊緣整齊。新鞘氨醇桿菌(Novosphingobium sp.)的生理生化特征，見表1。表1新鞘氨醇桿菌(Novosphingobium sp.)生理生化特征
權利要求
1.一株低溫降解多環(huán)芳烴菌株，其特征在于，該菌株保藏名稱為新鞘氨醇桿菌 (Novosphingobium sp.)，保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏日期2009年10月12日，保藏號CGMCC No. 33洸。
2.根據權利要求1所述的低溫降解多環(huán)芳烴菌株，其特征在于所述菌株可在溫度 10 37°C，pH值6. 5 8. 5培養(yǎng)條件下較好生長；菌株形態(tài)特征為革蘭氏陰性，桿菌，黃色， 尺寸0. 3 0. 5 μ mX 1. O 1. 5 μ m，無鞭毛；菌株LB培養(yǎng)24h菌落特征為圓形，菌落直徑 2 3mm，黃色，表面光滑，邊緣整齊。
3.根據權利要求2所述的低溫降解多環(huán)芳烴菌株，其特征在于所述菌株能以多環(huán)芳烴為唯一碳源和能源生長。
4.根據權利要求1 3之任一所述的低溫降解多環(huán)芳烴菌株的篩選方法，其特征在于， 按如下步驟依次實施(1)在室外溫度小于_20°C時，從油田污染場地采集距地表下5 20cm處表層土壤樣品，以及地下水樣品，制備成菌懸液，共同作為菌源進行低溫自然富集培養(yǎng)；所述富集培養(yǎng)基含有無機鹽培養(yǎng)基、0#柴油、葡萄糖及酵母膏；所述無機鹽培養(yǎng)基含有K2HPO4、NaH2PO4、(NH4) 2SO4、MgCl2 · 6H20、EDTA、ZnSO4 · 7H20、CaCl2 · 2H20、FeSO4 · 7H20、 NaMoO4 · 2H20、CuSO4 · 5H20、CoCl2 · 6H20 及 MnCl2 · 2H20 ；(2)取適量菌懸液重新接種至步驟(1)所述的富集培養(yǎng)基中，繼續(xù)低溫適應、富集；(3)連續(xù)傳代培養(yǎng)，逐次減少葡萄糖和酵母膏用量，直至0#柴油為唯一碳源和能源生長；(4)繼續(xù)低溫適應、富集，同時監(jiān)測富集培養(yǎng)基中柴油組分的降解情況，發(fā)現(xiàn)0#柴油中多環(huán)芳烴被降解后，將菌懸液涂布在含0#柴油的固體無機鹽培養(yǎng)基上；將分離得到菌種分別接種至含0#柴油的無機鹽培養(yǎng)基中，依據各菌株所在培養(yǎng)基中的多環(huán)芳烴組分減少和濃度降低情況，進行分離即得目的產物低溫降解多環(huán)芳烴菌株新鞘氨醇桿菌 (Novosphingobium sp. )0
5.一種如權利要求1 3之任一所述的低溫降解多環(huán)芳烴菌株在石油烴污染場地地下水生物修復中的應用。
6.根據權利要求5所述的低溫降解多環(huán)芳烴菌株在石油烴污染場地地下水生物修復中的應用，其特征在于采用菌株的生長細胞低溫降解多環(huán)芳烴。
7.根據權利要求5所述的低溫降解多環(huán)芳烴菌株在石油烴污染場地地下水生物修復中的應用，其特征在于采用菌株的靜基細胞低溫降解多環(huán)芳烴。
8.根據權利要求5所述的低溫降解多環(huán)芳烴菌株在石油烴污染場地地下水生物修復中的應用，其特征在于采用菌株的固定化細胞低溫降解多環(huán)芳烴。
全文摘要
本發(fā)明屬于環(huán)境工程和微生物工程技術領域，尤其涉及一株低溫降解多環(huán)芳烴的新鞘氨醇桿菌及其在石油烴污染場地地下水生物修復中的應用。該菌株為新鞘氨醇桿菌(Novosphingobiumsp.)，于2009年10月12日保藏于“中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心”，其保藏號CGMCC No.3326。本發(fā)明菌株是從吉林油田某污染場地中分離，并經低溫強化自然富集篩選得到，該菌株可以以多環(huán)芳烴為唯一碳源、能源生長，其生長細胞、靜基細胞及固定化細胞均可以在低溫條件下降解多環(huán)芳烴污染物，特別適用于石油烴污染場地地下水的生物修復。
文檔編號C12N1/20GK102277312SQ20111000312
公開日2011年12月14日 申請日期2011年1月10日 優(yōu)先權日2011年1月10日
發(fā)明者張?zhí)m英, 張洪林, 李爽, 李長波, 趙國崢, 馬會強 申請人:遼寧石油化工大學