本發(fā)明涉及分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，是一種基于多重HRM分析的氯吡格雷耐藥基因檢測(cè)方法。

背景技術(shù)：

氯吡格雷用于治療冠心病患者經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入術(shù)(percutaneous coronary intervention，PCI)后預(yù)防血栓事件。臨床應(yīng)用時(shí)4％～30％患者在常規(guī)劑量治療中達(dá)不到預(yù)期的抗血小板作用，嚴(yán)重者會(huì)導(dǎo)致再次心梗、血栓、死亡等心血管不良事件，這種現(xiàn)象稱(chēng)為氯吡格雷抵抗(clopidogrel resistance，CR)。氯吡格雷是一種前體藥物，在體外無(wú)活性，通過(guò)酶促反應(yīng)衍生成硫醇代謝物而發(fā)揮臨床療效。影響藥物轉(zhuǎn)化的相關(guān)基因主要包括影響藥物吸收的ABCB1和影響代謝過(guò)程的肝藥酶代謝酶基因。在氯吡格雷的代謝過(guò)程中CYP2C19發(fā)揮至關(guān)重要的作用，CYP2C19基因存在多態(tài)性，其中慢代謝型以CYP2C19*2(rs4244285)、CYP2C19*3(rs4986893)變異為主，分別導(dǎo)致了酶失去催化活性和活性降低；CYP2C19*17(rs12248560)突變則顯著升高了2C19的轉(zhuǎn)錄活性，是一種超快速代謝的基因表型。PON1酶是氯吡格雷代謝過(guò)程中的關(guān)鍵酶，控制著2-O-氯吡格雷生成活性產(chǎn)物，PON1Q192R(rs662)基因多態(tài)性可能影響血小板的聚集。編碼小腸多耐藥P-糖蛋白的ABCB1基因多態(tài)性會(huì)影響氯吡格雷的生物利用度，ABCB13435C＞T(rs1045642)與十二指腸P-gp高表達(dá)以及P-gp底物生物利用度降低有關(guān)。因此，建議在使用氯吡格雷前進(jìn)行CYP2C19、PON1和ABCB1基因檢測(cè)，依據(jù)患者基因型確定合適給藥方案。

高分辨熔解曲線(xiàn)(high-resolution melt,HRM)分析技術(shù)是近幾年來(lái)在國(guó)外興起的一種用于突變掃描和基因分型的最新遺傳學(xué)分析方法。它是一種高效穩(wěn)健的PCR技術(shù)，不受突變堿基位點(diǎn)與類(lèi)型的局限，無(wú)需序列特異性探針，在PCR結(jié)束后直接運(yùn)行高分辨熔解，即可完成對(duì)樣品基因型的分析。

中國(guó)專(zhuān)利文獻(xiàn)CN104450935A公開(kāi)了一種HRM技術(shù)檢測(cè)氯吡格雷用藥相關(guān)基因多態(tài)性的方法。中國(guó)專(zhuān)利文獻(xiàn)CN105018583A公開(kāi)了一種華法林與氯吡格雷個(gè)體化用藥相關(guān)基因多態(tài)性檢測(cè)試劑盒及其應(yīng)用，可用于鑒別氯吡格雷耐藥性相關(guān)基因的多態(tài)性位點(diǎn)。中國(guó)專(zhuān)利文獻(xiàn)CN105671165A公開(kāi)了一種基于Sequenom Mass ARRAY分型系統(tǒng)的檢測(cè)與氯吡格雷藥物抵抗反應(yīng)相關(guān)的基因位點(diǎn)高效分型的試劑盒。但是臨床醫(yī)療檢測(cè)的準(zhǔn)確性至關(guān)重要，而基于HRM技術(shù)的高通量檢測(cè)由于同一反應(yīng)體系中引物較多，外加其他反應(yīng)成分，往往檢測(cè)準(zhǔn)確率較低，因此提供一種能同時(shí)檢測(cè)多個(gè)位點(diǎn)并且準(zhǔn)確率很高的氯吡格雷耐藥基因檢測(cè)引物及方法十分必要。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種用于HRM分析法檢測(cè)氯吡格雷耐藥基因的引物組合。

本發(fā)明的再一的目的是，提供一種基于多重HRM分析的氯吡格雷耐藥基因檢測(cè)方法。

本發(fā)明的另一的目的是，提供氯吡格雷耐藥基因檢測(cè)的引物組合的應(yīng)用。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：一種用于HRM分析法檢測(cè)氯吡格雷耐藥基因的引物組合，其用于檢測(cè)rs4244285、rs4986893、rs12248560三個(gè)位點(diǎn)，rs4244285位點(diǎn)的上游引物序列如SEQ ID NO:1所示，rs4244285位點(diǎn)的下游引物序列如SEQ ID NO:2所示；rs4986893位點(diǎn)的上游引物序列如SEQ ID NO:3所示，rs4986893位點(diǎn)的下游引物序列如SEQ ID NO:4所示；rs12248560位點(diǎn)的上游引物序列如SEQ ID NO:5所示，rs12248560位點(diǎn)的下游引物序列如SEQ ID NO:6所示。

一種用于HRM分析法檢測(cè)氯吡格雷耐藥基因的引物組合，其用于檢測(cè)rs662、rs1045642兩個(gè)位點(diǎn)，rs662位點(diǎn)的上游引物序列如SEQ ID NO:7所示，rs662位點(diǎn)的下游引物序列如SEQ ID NO:8所示；rs1045642位點(diǎn)的上游引物序列如SEQ ID NO:9所示，rs1045642位點(diǎn)的下游引物序列如SEQ ID NO:10所示。

一種用于HRM分析法檢測(cè)氯吡格雷耐藥基因的引物組合，其用于檢測(cè)rs4244285、rs4986893、rs12248560、rs662、rs1045642位點(diǎn)，rs4244285位點(diǎn)的上游引物序列如SEQ ID NO:1所示，rs4244285位點(diǎn)的下游引物序列如SEQ ID NO:2所示；rs4986893位點(diǎn)的上游引物序列如SEQ ID NO:3所示，rs4986893位點(diǎn)的下游引物序列如SEQ ID NO:4所示；rs12248560位點(diǎn)的上游引物序列如SEQ ID NO:5所示，rs12248560位點(diǎn)的下游引物序列如SEQ ID NO:6所示；rs662位點(diǎn)的上游引物序列如SEQ ID NO:7所示，rs662位點(diǎn)的下游引物序列如SEQ ID NO:8所示；rs1045642位點(diǎn)的上游引物序列如SEQ ID NO:9所示，rs1045642位點(diǎn)的下游引物序列如SEQ ID NO:10所示。

為實(shí)現(xiàn)上述第二個(gè)目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：一種檢測(cè)氯吡格雷耐藥基因的HRM分析方法，所述的方法包括以下步驟：對(duì)DNA樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)反應(yīng)體系緩慢程序升溫，升溫過(guò)程中記錄熒光信號(hào)，獲得高分辨率熔解曲線(xiàn)。

優(yōu)選地，PCR擴(kuò)增反應(yīng)在熒光定量PCR分析儀內(nèi)進(jìn)行，PCR擴(kuò)增的條件為：95℃預(yù)變性3min，然后進(jìn)行35個(gè)反應(yīng)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括95℃、15s的變性，和30s的退火延伸，檢測(cè)rs4244285、rs4986893、rs12248560三個(gè)位點(diǎn)的退火延伸溫度為60℃，檢測(cè)rs662和rs1045642兩個(gè)位點(diǎn)的退火延伸溫度為62℃。

優(yōu)選地，在熒光定量PCR分析儀內(nèi)對(duì)反應(yīng)體系進(jìn)行緩慢程序升溫，溫度每上升0.2℃記錄一次熒光信號(hào)。

為實(shí)現(xiàn)上述第三個(gè)目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：所述的引物組合在制備多重HRM分析的試劑或試劑盒中的應(yīng)用。

所述的試劑或試劑盒用于檢測(cè)氯吡格雷耐藥基因。

一種基于多重HRM分析的氯吡格雷耐藥基因檢測(cè)的試劑盒，所述的試劑盒包含鎂離子、dNTP、rTaq酶、Syto9染料、堿基序列如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10所示的引物，前六種引物與后四種引物分開(kāi)設(shè)置。

本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)在于：

1、本發(fā)明的檢測(cè)方法是針對(duì)多個(gè)SNP位點(diǎn)的HRM分型方法，用以分析與氯吡格雷精準(zhǔn)用藥相關(guān)的5個(gè)SNP位點(diǎn)rs4244285、rs4986893、rs12248560、rs662和rs1045642。

2、本發(fā)明的檢測(cè)方法可以在同一個(gè)反應(yīng)體系中檢測(cè)rs4244285、rs4986893、rs12248560三個(gè)位點(diǎn)，和/或rs1045642、rs662兩個(gè)位點(diǎn)，減少了試劑用量，縮短了檢測(cè)時(shí)間。

3、本發(fā)明的檢測(cè)方法對(duì)316個(gè)經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入造影手術(shù)的病人的樣本進(jìn)行檢測(cè)，并用Sanger測(cè)序方法進(jìn)行驗(yàn)證，rs4244285、rs4986893、rs12248560、rs1045642和rs662五個(gè)位點(diǎn)的檢測(cè)正確率分別為100％、99.37％、99.37％、100％、100％，準(zhǔn)確率高。

附圖說(shuō)明

附圖1：rs4986893、rs12248560片段多重PCR反應(yīng)產(chǎn)物的高分辨率熔解曲線(xiàn)負(fù)導(dǎo)數(shù)圖。曲線(xiàn)1中rs4986893引物不含額外的GC序列，可以看到rs4986893的熔解峰與rs12248560的熔解峰重合并相互干擾。曲線(xiàn)2中rs4986893引物添加了GC序列，熔解峰(右)和rs12248560的熔解峰(左)可以很好的分開(kāi)。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明提供的具體實(shí)施方式作詳細(xì)說(shuō)明。

實(shí)施例1本發(fā)明的氯吡格雷耐藥基因檢測(cè)方法

材料

Rotor-Gene Q實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析儀(qiagen)，rTaq酶(Takara)，Syto9熒光染料(Invitrogen)，引物(上海生工生物)，人基因組DNA樣本(提取自經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入造影手術(shù)的病人)。

方法

1、引物設(shè)計(jì)：針對(duì)五個(gè)與氯吡格雷耐藥有關(guān)的SNP位點(diǎn)：rs4244285、rs4986893、rs12248560、rs1045642和rs662，設(shè)計(jì)五對(duì)PCR擴(kuò)增引物，使每一對(duì)引物產(chǎn)生的擴(kuò)增子中包含相應(yīng)的SNP位點(diǎn)。其中，為了提高rs4986893擴(kuò)增子的Tm值，使其與rs12248560擴(kuò)增子的熔解峰在HRM曲線(xiàn)上分開(kāi)，在rs4986893引物的5’端增加一段GC序列(劃線(xiàn)部分)。引物序列見(jiàn)表1。

2、PCR擴(kuò)增體系：擴(kuò)增反應(yīng)體積為20μL，包括鎂離子1.5mM，dNTP 200μM，rTaq酶0.5U，Syto9染料50pmol，以及1μL基因組DNA樣品。用來(lái)檢測(cè)rs4244285、rs4986893、rs12248560三個(gè)位點(diǎn)的反應(yīng)體系中還包括：rs4244285的F、R引物各0.35μM，rs4986893的F、R引物各0.1μM，rs12248560的F、R引物各0.35μM。用來(lái)檢測(cè)rs662和rs1045642的反應(yīng)體系中還包括rs662的F、R引物各0.15μM，rs1045642的F、R引物各0.35μM。

3、PCR擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性3min，然后進(jìn)行35個(gè)反應(yīng)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括95℃、15s的變性，和30s的退火延伸(檢測(cè)rs4244285、rs4986893、rs12248560三個(gè)位點(diǎn)溫度為60℃，rs662和rs1045642兩個(gè)位點(diǎn)為62℃)，擴(kuò)增反應(yīng)在熒光定量PCR分析儀內(nèi)進(jìn)行。

4、HRM分析：PCR反應(yīng)結(jié)束后，在熒光定量PCR分析儀內(nèi)對(duì)反應(yīng)體系進(jìn)行緩慢程序升溫，溫度每上升0.2℃記錄一次熒光信號(hào)，熒光信號(hào)隨溫度的變化即形成高分辨率熔解曲線(xiàn)。同一個(gè)體系中不同的擴(kuò)增子由于Tm值的不同，熔解峰分布在不同的溫度區(qū)間。利用HRM分析軟件對(duì)不同的溫度區(qū)間進(jìn)行分析，就可以得到相應(yīng)SNP位點(diǎn)的基因型。不同SNP的擴(kuò)增子熔解峰分布區(qū)間見(jiàn)表2。

結(jié)果

本研究建立了一種針對(duì)多個(gè)SNP位點(diǎn)的HRM分型方法，用以分析與氯吡格雷精準(zhǔn)用藥相關(guān)的5個(gè)SNP位點(diǎn)rs4244285、rs4986893、rs12248560、rs662和rs1045642。引物5’端GC序列的加入使不同SNP位點(diǎn)的考察區(qū)間更好的分布在不同的溫度范圍內(nèi)(圖1)。

表1：針對(duì)不同SNP位點(diǎn)的引物序列

表2：不同SNP的擴(kuò)增子熔解峰分布區(qū)間

實(shí)施例2本發(fā)明的氯吡格雷耐藥基因檢測(cè)方法的準(zhǔn)確率驗(yàn)證

使用本發(fā)明的氯吡格雷耐藥基因檢測(cè)方法對(duì)316個(gè)未知基因型的樣本進(jìn)行檢測(cè)。所有樣本均來(lái)自仁濟(jì)醫(yī)院2015年4月至12月胸悶胸痛入院行經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入造影手術(shù)，并需要給予阿司匹林+氯吡格雷雙聯(lián)抗血小板治療的連續(xù)病人，其中77個(gè)樣本為女性，239個(gè)樣本為男性，年齡范圍為35到94歲。檢測(cè)結(jié)果與Sanger測(cè)序方法進(jìn)行比對(duì)，rs4244285、rs4986893、rs12248560、rs1045642和rs662五個(gè)位點(diǎn)的檢測(cè)正確率分別為100％、99.37％、99.37％、100％、100％，準(zhǔn)確率顯著高于常規(guī)水平。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明方法的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和補(bǔ)充，這些改進(jìn)和補(bǔ)充也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。