專利名稱：貓杯狀病毒感染性克隆及其構(gòu)建方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種正義RNA病毒表達(dá)載體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用，特別涉及一種貓杯狀病毒感染性克隆及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
單股正鏈RNA病毒的堿基序列與mRNA完全相同，可直接起到病毒mRNA的作用。因此，該類病毒稱為正義RNA病毒，其裸RNA具有感染性。該類病毒基因組復(fù)制的特點(diǎn)是先合成(-)RNA，再以之作為合成(+)RNA的模板。Racaniello和Baltimore于1981年首次成功的構(gòu)建了動(dòng)物RNA病毒的感染性克隆，他們把脊髓灰質(zhì)炎病毒(Poliovirus，PV)基因組的全長(zhǎng)cDNA克隆到pBR322載體中，用該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞后，可以產(chǎn)生具有感染性的病毒粒子，從此拉開了動(dòng)物RNA病毒反向遺傳學(xué)研究的序幕。隨后其它一些正鏈RNA病毒的反向遺傳學(xué)系統(tǒng)也在不斷被成功建立。Sumiyoshi等(1992)采用分段克隆的方法成功拯救了日本乙型腦炎病毒(Japanese encephalitis virus JEV)。分段克隆即將黃病毒的全基因組分成兩段或者多個(gè)片段構(gòu)成重組質(zhì)粒然后體外連接成全長(zhǎng)cDNA分子，再進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄或拯救，以此解決了黃病毒科中一些病毒基因組cDNA的亞克隆在寄主細(xì)菌中常不能穩(wěn)定增殖的問題。FMDV的第一個(gè)感染性cDNA由Zibert A等于1990年構(gòu)建成功，隨后 Riederd等也成功構(gòu)建了 A型FMDV的感染性克隆，他們各自采用不同的方法克服了 FMDV基因組中Poly(C)尾巴的問題。AlmaZ(5n(2000)等利用BAC系統(tǒng)首次成功構(gòu)建出了豬傳染性胃腸炎病毒(Transmissible gastroenteritis coronavirus TGEV)的全長(zhǎng)cDNA分子克隆， 并實(shí)現(xiàn)了病毒拯救。這是反向遺傳學(xué)發(fā)展史上的一個(gè)突破性進(jìn)展，TGEV感染性克隆的成功構(gòu)建表明RNA病毒的反向遺傳學(xué)操作將不再受到基因組大小的限制。2006年，St-Jean等利用BAC系統(tǒng)又成功拯救出具有神經(jīng)毒力的人冠狀病毒(Human corona virus，HCoV)。此外， Casais等0001)率先利用痘病毒做載體成功構(gòu)建了雞傳染性支氣管炎病毒Gnfectious bronchitis virus, IBV)的反向遺傳研究系統(tǒng)，為建立其它冠狀病毒的感染性克隆提供了范例。其后，Thiel等Q001)也將人冠狀病毒的全長(zhǎng)cDNA克隆到痘病毒載體中，并能穩(wěn)定的增值病毒cDNA。Yount等^00 在體外采用順次連接的方法獲得了 MHV的全長(zhǎng)cDNA，以其為模板進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，獲得了具有感染性的全長(zhǎng)RNA。這種策略雖然可行，但是存在RNA 獲得率低，病毒拯救效率低的缺陷。Coley等000 將體外裝配好的鼠肝炎病毒(Mouse hepatitis virus, MHV)的全長(zhǎng)cDNA分子克隆至痘苗病毒載體中，然后用豆苗病毒感染靶細(xì)胞，通過體內(nèi)轉(zhuǎn)錄過程實(shí)現(xiàn)了 MHV的拯救，用該方法拯救出的病毒不僅滴度高，而且具有很強(qiáng)的侵略性，與母本毒相似。至此冠狀病毒的反向遺傳學(xué)研究系統(tǒng)已經(jīng)完全走向成熟。貓杯狀病毒(Feline Calicivirus，F(xiàn)CV)，屬于杯狀病毒科，是一種正鏈RNA病毒。 是貓上呼吸道疾病的主要病原，主要引起貓的急性口腔潰瘍、上呼吸道感染和慢性胃腸炎疾病，該病發(fā)病率較高，但死亡率較低。幾乎所有的貓科動(dòng)物對(duì)FCV都易感。一歲以下的貓最易感，潛伏期為2 3天，病貓臨床癥狀表現(xiàn)為采食困難、打噴嚏、流涎、口腔潰瘍、結(jié)膜炎等。有些毒株可以引起急性關(guān)節(jié)炎，貓表現(xiàn)出跛行。FCV呈世界性分布，可能感染所有的貓科動(dòng)物。自首次在貓身上分離到該病毒后，之后從獵豹和老虎體內(nèi)也分離到該病毒。貓杯狀病毒屬于杯狀病毒科，杯狀病毒科現(xiàn)有四個(gè)屬兔病毒屬(Lagovirus)、諾瓦克病毒屬(Norovirus)、扎幌樣病毒屬(Sappovirus)、以及水泡疹病毒屬(Vesirus)。其中諾瓦克樣病毒和扎幌樣病毒合稱人類杯狀病毒(Human calicivirus HuCV)，它們是引起成人和兒童非細(xì)菌性急性胃腸炎的主要病原體，HuCV不僅可以引發(fā)腸道感染，也能引起心肌損害。而兔病毒屬的主要成員兔出血癥病毒(Rabbit hemorrhagic disease virus RHDV) 則是一種烈性毀滅性病毒性傳染病，已經(jīng)列入二類動(dòng)物病原微生物，對(duì)養(yǎng)兔業(yè)和實(shí)驗(yàn)兔危害極大。盡管此類病毒已發(fā)現(xiàn)很多年，但由于缺乏相應(yīng)的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，使得相關(guān)研究仍然緩慢。同科的貓杯狀病毒卻能夠在貓腎細(xì)胞(CRH0中培養(yǎng)增殖。因此科學(xué)家們以它作為研究模型，試圖解決目前存在的問題，現(xiàn)對(duì)FCV的分子生物學(xué)及反向遺傳學(xué)的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。在RNA病毒家族中，杯狀病毒是一類不易引起人們重視的病毒。隨著其重要成員偌瓦克病毒(NV)的發(fā)現(xiàn)，人們才開始重視該科病毒的研究。因?yàn)樗梢砸鹑祟惖姆羌?xì)菌性腸胃炎，對(duì)人類的健康威脅極大。遺憾的是該科的大多數(shù)病毒都不能在體外培養(yǎng)，給病毒的分離和研究帶來很大不便。反向遺傳學(xué)技術(shù)的興起給研究這些病毒帶來了希望。但水泡疹樣病毒屬(如FCV)例外，它可以在CRFK(貓腎細(xì)胞)中高滴度的增殖，因此它往往被作為杯狀病毒研究的模型。Manislav V. Sosnovtsev(1995)等最早利用RT-PCR的方法克隆了 FCVUrbana株的全基因組，運(yùn)用T7RNA聚合酶啟動(dòng)子在體外轉(zhuǎn)錄了 FCV mRNA,同時(shí)在5'-端加上帽狀結(jié)構(gòu)，恢復(fù)了具有感染性的FCV病毒粒子。Kyeong-OK Chang等采用同樣的方法恢復(fù)了具有感染性的豬的杯狀病毒。Jorg Oliver Thumfart等采用體外轉(zhuǎn)錄的方法和構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒的方法，都成功恢復(fù)了 FCV病毒粒子。并且把綠色熒光蛋白基因 (GFP)插入FCV衣殼蛋白基因位置后，構(gòu)建了感染性嵌合DNA克隆質(zhì)粒，轉(zhuǎn)錄細(xì)胞GFP獲得了表達(dá)，嵌合病毒基因組可自我復(fù)制，并且被包裝成病毒粒子。但是，現(xiàn)有的貓杯狀病毒感染性克隆普遍感染性不高，滴度較低。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種新型的貓杯狀病毒感染性克隆。本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供上述貓杯狀病毒感染性克隆的構(gòu)建方法。本發(fā)明的再一個(gè)目的在于提供上述貓杯狀病毒感染性克隆在表達(dá)外源蛋白中的應(yīng)用。本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是
貓杯狀病毒感染性克隆，通過在FCV病毒的全長(zhǎng)cDNA的兩端連接酶切位點(diǎn)，之后將序列連接到表達(dá)載體中得到。表達(dá)載體為去除了 f 1、ori、SV40、neo、ρ 1 yA序列的商品化質(zhì)粒pcDNA3，優(yōu)選的，表達(dá)載體的3’端連接有核酶。核酶優(yōu)選為自剪切型核酶。上述貓杯狀病毒感染性克隆的構(gòu)建方法，包括以下步驟
1)使用PCR法擴(kuò)增FCV全長(zhǎng)cDNA，并在兩端引入酶切位點(diǎn)；
2)將商品化質(zhì)粒pcDNA3的fl、ori、SV40、neo、plyA序列去除，得到改造質(zhì)粒；
3)在改造質(zhì)粒上引入核酶序列；4)克隆出FCV全長(zhǎng)基因組并連接到真核表達(dá)載體ρ⑶NA中，得到貓杯狀病毒感染性克隆。優(yōu)選的，引入核酶序列時(shí)包括如下步驟
1)以PCDNA3為模板以DNA3HDRZ1和DNAIBB為引物，進(jìn)行PCR，PCR程序是95°C5min ； 98°C 10s，55°C 15s，72°C 4min，30 個(gè)循環(huán)；72°C lOmin，得到 PCR 產(chǎn)物 pHDRZl ；
2)以pHDRZl 為模板，以 DNA3HDRZ2 和 DNA3B 為引物，PCR 程序是:95°C 5min ；98°C IOs, 55°C 15s，72°C 4min,30 個(gè)循環(huán)；72°C lOmin，得到的 PCR 產(chǎn)物命名為 pHDRZ2 ；
3)以pHDRZ2 為模板，以 DNA3HDRZ3 和 DNAIBB 為引物，PCR 程序是95°C 5min ；98°C IOs, 59°C 15s，72°C 4min，30 個(gè)循環(huán)；72°C lOmin，得到的 PCR 產(chǎn)物命名為 pCDNA-HDRZ ；
4)膠回收ρ⑶NA-HDRZ連接pMD18_T載體，轉(zhuǎn)化，得到改造載體； 其中，引物的序列為
DNA3HDRZ1 5 ‘ -GGACGCACGTCCACTCGGATGGCTAAGGGAGGGCGCTGATCAGCCTCGACTGTG C-3' ； (SEQ ID NO 1) DNA3HDRZ2
5 ‘ -TCCACCTCCTCGCGGTCCGACCTGGGCATCCGAAGGAGGACGCACGTCCACTCG-3 ‘ ；(SEQ ID NO 2)
DNA3HDRZ3
5' -ATTTAAATGCGGCCGCGGGTCGGCATGGCATCTCCACCTCCTCGCGGTC-3' (SEQ ID NO 3) DNA3B 5' -TTAATTAAGCTAGCAGTTAGCCAGA GAGCTC TGC-3 ’ (SEQ ID NO 4)。通過將外源蛋白編碼序列引入本發(fā)明的貓杯狀病毒感染性克隆中，即可表達(dá)翻譯得到外源蛋白。本發(fā)明的有益效果是
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，使用本發(fā)明克隆生產(chǎn)得到的FCV，與親本毒具有相似的特性，具有很好地感染性，可使細(xì)胞明顯變性，滴度高，傳代穩(wěn)定。有利于長(zhǎng)期使用。通過引入核酶序列，有助于基因組3、端的精確組裝。


圖1是FCV全序列的PCR產(chǎn)物的電泳圖； 圖2是改造的pcDNA3載體的電泳圖3是引入核酶過程中間序列的PCR產(chǎn)物的電泳圖； 圖4是病毒復(fù)制的動(dòng)力曲線圖。
具體實(shí)施例方式全長(zhǎng)的擴(kuò)增
PCV 的全序列如 GenBank ID :GU214989. 1 所示。使用引物FCVNORZ5 ‘ -GCAGAGCTCTCTGGCTAACTGTAAAAGAAATTTGAGAC-3 ‘ (SE Q ID NO :5)(下劃線部為Mc I酶切位點(diǎn))。前半部分為ρ⑶NA序列，后半部分為FCV 序列。FCVhouB 5 ‘ -TTTTCTAGAGCGGCCGCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3 ‘(SEQ ID NO :6)。(下劃線為Not I酶切位點(diǎn))。以含有DCV全長(zhǎng)的質(zhì)粒為模板，使用PrimeSTAR HSDNAPolymerase 擴(kuò)增，反應(yīng)體系PrimeSTAR 0. 5 μ L, dNTP (2. 5mM)4y L,5XPS BufferlO μ L, FCVNORZ(IOmM)1 μ L, FCVhouB(IOmM)1 μ L, pFCVO. 5 μ L, ddH20 up to50μ L。 PCR 程序95°C 5min ；98°C 10s，59°C 15s，72°C 4min，30 個(gè)循環(huán)；72°C IOmin0瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物
以IXTAE緩沖液配制瓊脂糖凝膠，每個(gè)加樣槽中加入5yL PCR產(chǎn)物，XDNA/ HindIIIMarker做對(duì)照，80V電泳30min，觀察結(jié)果。其結(jié)果如圖1所示，圖中，1為PCR產(chǎn)物， M 為 Marker。產(chǎn)物的回收和純化
按DNA小量凝膠回收試劑盒的使用說明進(jìn)行，具體操作如下PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上電泳后，用潔凈的手術(shù)刀在紫外燈下快速切下含有目的片段的凝膠，使它盡可能的小， 放入1. 5M Eppendorf管中稱重，向膠塊中加入3倍體積溶膠液PN，50°C水浴放置lOmin。 將上一步所得的溶液加入吸附柱CAl中，13，000r/rpm離心30s，倒掉收集管中的廢液，將吸附管重新放入收集管中。向吸附柱中加入700 μ L漂洗液PW(使用前以1 4加入無水乙醇)13，OOOr/rpm離心30s，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放入收集管中。向吸附柱中加入500 μ L漂洗液PW，13，000r/rpm離心30s，倒掉廢液。將離心柱放回收集管中，13，OOOr/ rpm離心2min，盡量除去漂洗液。將吸附柱于室溫或50°C溫箱5min，徹底晾干，以防止殘留的漂洗液影響下一步實(shí)驗(yàn)。將吸附柱放到一個(gè)干凈的Eppendorf管中，向吸附膜中間位置懸空滴加適量65 70°C水浴預(yù)熱的洗脫緩沖液EB，室溫放置aiiin。13，000r/rpm離心 Imin收集DNA溶液。為了提高DNA回收量，可以將離心得到的溶液重新加回離心吸附柱中， 13，000r/rpm 離心 Imin 收集 DNA 溶液。載體的改造
通過PCR方法去掉商品化質(zhì)粒pcDNA3中原有的fl、ori、SV40、neo、plyA 序列，以PDNA3F -CGGTATCAGCTCACTCAA-3' (SEQ ID N0:7)禾P PDNA3B 5，-TGGTTCTTTCCGCCTCAG-3，(SEQ ID NO 8)為引物擴(kuò)增改造后的質(zhì)粒。PCR 程序是:95V 5min ；98°C 10s，55°C 15s，72°C 3min30s，30 個(gè)循環(huán)；72°C IOmin0將PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳，其結(jié)果如圖2所示，圖中，1為PCR產(chǎn)物，M為Marker?；厥誔CR產(chǎn)物對(duì)其進(jìn)行磷酸化，使用T4 Polymucleotide Kinase。體系是純化 PCR 產(chǎn)物 25 μ L，IOX T4 Buffer 5μ L,T4 PNK 2 μ L, ATP 0. 5 μ L，補(bǔ)水至 50 μ L。自連后轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞JM109，挑單菌落并鑒定陽(yáng)性質(zhì)粒。送^witrogen測(cè)序。然后再抽提質(zhì)粒。 改造后的載體命名為P⑶NA。產(chǎn)物的連接、轉(zhuǎn)化與陽(yáng)性克隆質(zhì)粒的鑒定 1)大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備
在無菌條件下，挑取保存的JM109菌種，劃線接種于不含抗生素的LB瓊脂平板上，370C 倒置培養(yǎng)1 左右。挑取單個(gè)菌落，接種到3mL不含抗生素的LB培養(yǎng)液中，37°C振搖培養(yǎng)過夜。次日無菌吸取ImL細(xì)菌培養(yǎng)液加入到預(yù)熱至37°C的IOOmL不含抗生素的LB培養(yǎng)液中，37°C劇烈振搖培養(yǎng)。培養(yǎng)至培養(yǎng)物的0D600 = 0. 4 0. 5(約2. 5 3h)后，冰浴15min，使培養(yǎng)物冷卻至0°C。在無菌條件下(注意，以下操作均需嚴(yán)格無菌且在冰水浴中進(jìn)行)，將細(xì)菌培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移到2個(gè)無菌且冰預(yù)冷的50mL聚丙烯離心管中，4°C條件下離心(4，000r/rpm) IOmin,棄上清；回收細(xì)菌沉淀，每管加入IOmL冰預(yù)冷的75mmol/L CaCl2,IOmmol/LTris · Cl (pH 6. 5)溶液重懸沉淀，冰浴 IOmin, 4°C 4，000r/rpm 離心 lOmin，徹底棄上清；每管用 2mL 冰浴冷的 CaCl2 保存液(75mmol/L CaCl2、10mmol/L Tris. Cl、pH 6. 5、 15% (ν/ν)甘油)將菌體沉淀懸起。將重懸好的感受態(tài)細(xì)胞分裝于無菌微量離心管中，每管100 μ L，置_70°C超低溫冰箱凍存?zhèn)溆谩?)擴(kuò)增產(chǎn)物與pMD18-T連接
將瓊脂糖凝膠回收純化的PCR產(chǎn)物與pMDIS-T載體連接，連接反應(yīng)體系為DNA回收片段 3 μ L，pMD18-T 載體 0. 5 μ L，ligation Rase 1 μ L 加水補(bǔ)至 10 μ L，于 16°C連接過夜。3)連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化
在冰水中融化ー支JM 109感受態(tài)細(xì)胞，將10 μ L連接產(chǎn)物加入其中并輕輕混勻，冰浴 30min，42°C熱沖擊 90s 后，立即冰浴 5min，加 500 μ L LB (37°C )培養(yǎng)基，37°C 以 80_100r/ rpm振搖lh，取50 μ L 200 μ L加到含Amp (50 μ g/mL)的LB瓊脂板上，待菌液吸收后將平板倒置，于37°C培養(yǎng)過夜或14h 16h，可出現(xiàn)轉(zhuǎn)化菌落。4)陽(yáng)性克隆質(zhì)粒的鑒定菌液PCR鑒定
挑取單菌落，做菌液PCR鑒定。反應(yīng)體系如下
取ー潔凈 0.2mL PCR 管，カロ IOXEx Taq buffer 5μ L,2. 5mM dNTP 2 μ L，上游引物 1μ L，下游引物1μ L，菌液1μ L，Ex Taq酶0. 5 μ L，補(bǔ)水至25 μ L，瞬時(shí)離心10s，放置PCR 儀上進(jìn)行循環(huán)擴(kuò)增，參數(shù)同上。瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR反應(yīng)產(chǎn)物，觀察并記錄結(jié)果。質(zhì)粒的小量制備(堿裂解法)
挑取單克隆，在含有Amp的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，參照TaKaRa質(zhì)粒提取試劑盒中說明書提取重組質(zhì)粒。質(zhì)粒PCR鑒定
反應(yīng)體系為取ー潔凈 0. 2mL PCR 管，加 IOXExiTaq buffer 5μ L,2. 5mM dNTP2yL，上游引物1 μ L，下游引物1ロし質(zhì)粒0. IuLjEx Taq酶0. 5 μ L，補(bǔ)水至25 μ L，瞬時(shí)離心10s， 放置PCR儀上進(jìn)行循環(huán)擴(kuò)増。PCR反應(yīng)參數(shù)同上。瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR反應(yīng)產(chǎn)物， 觀察并記錄結(jié)果。陽(yáng)性質(zhì)粒命名為pMD-p⑶NA。核酶的引入
為了便于體內(nèi)轉(zhuǎn)錄，并使合成的RNA就有精確地末端結(jié)構(gòu)，在改造后的載體pCDNA 的-3'端通過多重PCR(Multi-PCR)分三步在基因組-3'端引入H印atitis delta ribozyme (HdvRz,88bp)。HdvRz的自我剪切位點(diǎn)在其5 ‘-末端的鳥嘌呤之后的磷酸ニ酯鍵。使用PrimeSTARTMHS DNAPolymerase以保證序列的真實(shí)性。HdvRz 的序列(88bp)
5' -GGGTCGGCATGGCATCTCCACCTCCTCGCGGTCCGACCTGGGCATCCGAAGGAGGACGCACGTCCACTC GGATGGCTAAGGGAGGGCG-3‘ (SEQ ID NO :9)。引入核酶引物 上游引物 DNA3HDRZ15 ‘ -GGACGCACGTCCACTCGGATGGCTAAGGGAGGGCGCTGATCAGCCTCGACTGTGC-3 ‘ (SEQ ID NO 1)下劃線為pCDNA3序列，其它為HDVRZ ； DNA3HDRZ2
5 ‘ -TCCACCTCCTCGCGGTCCGACCTGGGCATCCGAAGGAGGACGCACGTCCACTCG-3‘ (SEQ ID NO
2)
DNA3HDRZ3
5' -ATTTAAATGCGGCCGCGGGTCGGCATGGCATCTCCACCTCCTCGCGGTC-3' (SEQ ID NO 3)下劃線部分依次為Smi I和Not I序列，其它為DNA3HDRZ2重復(fù)序列。下游引物 DNA3B
5' -TTAATTAAGCTAGCAGTTAGCCAGAGAGCTCTGC-3' (SEQ ID NO :4)雙線為 pCDNA3TATA 盒后序列，下劃依次為PacI、NheI、NotI序列。多重PCR的步驟如下
1)第一歩PCR以pCDNA3為模板，以DNA3HDRZ1和DNAIBB為引物。PCR程序是95°C5min ； 98°C 10s，55°C 15s，72°C 4min，30 個(gè)循環(huán)；72°C IOmin0 得到的 PCR 產(chǎn)物命名為 pHDRZl ；
2)第二步PCR以pHDRZl為模板，以DNA3HDRZ2和DNAIBB為引物。PCR程序是95°C5min ； 98°C 10s，55°C 15s，72°C 4min，30 個(gè)循環(huán)；72°C IOmin0 得到的 PCR 產(chǎn)物命名為 pHDRZ2 ；
3)第三步PCR以pHDRZ2為模板，以DNA3HDRZ3和DNAIBB為引物。PCR程序是95°C5min ； 98°C 10s，59°C 15s，72°C 4min，30 個(gè)循環(huán)；72°C IOmin0 得到的 PCR產(chǎn)物命名為 pCDNA-HDRZ ；
膠回收pCDNA-HDRZ連接pMD18_T載體，轉(zhuǎn)化，挑單菌落，鑒定陽(yáng)性克隆，送hvitrogen 測(cè)序。陽(yáng)性質(zhì)粒命名為pMD-pCDNA-HDRZ。pHDRZ 1、pHDRZ2、pCDNA-HDRZ 的電泳圖如圖 3所示。圖中，1 3 為 PCR產(chǎn)物pHDRZ 1、 pHDRZ2、pCDNA-HDRZ，M 為 Marker。全基因組真核表達(dá)載體的構(gòu)建
用NotI和SacI處理pMD-pCDNA-HDRZ，得到含有NotI和SacI兩個(gè)酶切位點(diǎn)的 pCDNA-HDRZ表達(dá)載體，純化后-20 °C保存?zhèn)溆?，用Hind III處理用I^rime STAR HS DNA Polymerase擴(kuò)增得到的FCV全長(zhǎng)片段，F(xiàn)CV變成前后兩個(gè)片段FCVqian(3. 2k)和 FCVhou (4. 7k)，F(xiàn)CVqian 再用 Sac I 和 Hind III 處理，F(xiàn)CVhou 用 Hind III 和 Not I 處理， 分別純化后與之前經(jīng)Not I和Sac I處理過的ρ⑶NA-HDRZ載體，連接、轉(zhuǎn)化、鑒定，陽(yáng)性命名為 pCDNA-HDRZ-FCV。得到的載體ρ⑶NA-HDRZ-FCV可用于外源蛋白的表達(dá)。病毒的拯救
因?yàn)镕CV可以在細(xì)胞上培養(yǎng)，所以可以直接在敏感的細(xì)胞系中拯救病毒。方法采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將FCV全基因組真核表達(dá)載體ρ⑶NA-HDRZ-FCV轉(zhuǎn)染F81細(xì)胞。感染性克隆的鑒定轉(zhuǎn)染敏感細(xì)胞
轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)，觀察細(xì)胞病變的出現(xiàn)情況。至少盲傳三代，若出現(xiàn)典型的細(xì)胞病變則繼續(xù)傳代。盲傳三代后收獲出現(xiàn)CPE的細(xì)胞培養(yǎng)物，反復(fù)凍融三次后，抽提病毒總RNA，然后用特異引物進(jìn)行RT-PCR，如果能擴(kuò)增到特異性條帶，則證明被檢細(xì)胞中含有拯救的病毒。拯救病毒與親本病毒的區(qū)別鑒定
由于在構(gòu)建感染性克隆的時(shí)候，預(yù)先在病毒的cDNA序列中插入了 ー個(gè)“遺傳標(biāo)志”(genetic marker)即分子標(biāo)簽-限制性內(nèi)切酶Mlu I，該酶切位點(diǎn)。通過對(duì)該分子標(biāo)簽的檢測(cè)，將由感染性克隆衍生的病毒與野生型病毒區(qū)分開來。首先用特異性引物將含有該酶切位點(diǎn)的片段擴(kuò)增出來，然后用Mlu I消化此片段，結(jié)果預(yù)期可產(chǎn)生兩個(gè)片段。而野生型病毒的相應(yīng)擴(kuò)增片段中不含有Mlu I酶切位點(diǎn)，則不能被切割，從而將兩者區(qū)別開來。將拯救出來的病毒命名為rmFCV。拯救毒與親本毒復(fù)制動(dòng)力學(xué)比較
按常法滴定拯救毒rmFCV和親本毒FCV的TCID5tl效價(jià)，然后做病毒復(fù)制動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)，具體步驟如下
①F81鋪滿單層時(shí)，棄去培養(yǎng)液，用PBS液洗三次，將拯救毒rmFCV和親本毒FCV分別接種，接種量為IOOTCID5q 100 μ L，置37°C、5 % CO2孵育Ih后，棄去病毒液，再用PBS液洗三次，加入8mL細(xì)胞維持液(含1 % FBS和100U/mL雙抗的1640)，置37°C CO2培養(yǎng)箱中培
芥；
②于8h，16h，24h,32h,40h,48h分別取細(xì)胞上清200 μ L，滴定其TCID5tl效價(jià)；
③接毒、取樣、TCID5tl效價(jià)測(cè)定均重復(fù)3次，統(tǒng)計(jì)分析后，繪制病毒復(fù)制動(dòng)力曲線圖。其動(dòng)カ曲線圖如圖4所示。由圖可知，拯救毒rmFCV與親本毒FCV具有基本一致的復(fù)制動(dòng)力學(xué)曲線。
權(quán)利要求
1.貓杯狀病毒感染性克隆，通過在FCV病毒的全長(zhǎng)cDNA的兩端連接酶切位點(diǎn)，之后將序列連接到表達(dá)載體中得到。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的貓杯狀病毒感染性克隆，其特征在于表達(dá)載體為去除了fl、 ori、SV40、neo、plyA序列的商品化質(zhì)粒pcDNA3。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的貓杯狀病毒感染性克隆，其特征在于表達(dá)載體的3’端連接有核酶。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的貓杯狀病毒感染性克隆，其特征在于核酶為自剪切型核酶。
5.貓杯狀病毒感染性克隆的構(gòu)建方法，包括以下步驟1)使用PCR法擴(kuò)增FCV全長(zhǎng)cDNA，并在兩端引入酶切位點(diǎn)；2)將商品化質(zhì)粒pcDNA3的fl、ori、SV40、neo、plyA序列去除，得到改造質(zhì)粒；3)在改造質(zhì)粒上引入核酶序列；4)克隆出FCV全長(zhǎng)基因組并連接到真核表達(dá)載體ρ⑶NA中，得到貓杯狀病毒感染性克隆。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述貓杯狀病毒感染性克隆的構(gòu)建方法，其特征在于引入核酶序列時(shí)包括如下步驟1)以pCDNA3為模板以DNA3HDRZ1和DNAIBB為引物，進(jìn)行PCR，PCR程序是95°C5min ； 98°C 10s，55°C 15s，72°C 4min，30 個(gè)循環(huán)；72°C lOmin，得到 PCR 產(chǎn)物 pHDRZl ；2)以pHDRZl 為模板，以 DNA3HDRZ2 和 DNAiBB 為引物，PCR程序是:95°C 5min ；98°C 10s, 55°C 15s，72°C 4min,30 個(gè)循環(huán)；72°C lOmin，得到的 PCR 產(chǎn)物命名為 pHDRZ2 ；3)以pHDRZ2 為模板，以 DNA3HDR^3 和 DNA;3B 為引物，PCR程序是95°C 5min ；98°C 10s, 59°C 15s，72°C 4min，30 個(gè)循環(huán)；72°C lOmin，得到的 PCR 產(chǎn)物命名為 pCDNA-HDRZ ；4)膠回收ρ⑶NA-HDRZ連接pMD18_T載體，轉(zhuǎn)化，得到改造載體； 其中，引物的序列為DNA3HDRZ1 5 ‘ -GGACGCACGTCCACTCGGATGGCTAAGGGAGGGCGCTGATCAGCCTCGACTGTGC 3' ；(SEQ ID NO 1) DNA3HDRZ2 5 ‘ -TCCACCTCCTCGCGGTCCGACCTGGGCATCCGAAGGAGGACGCACGTC CACTCG-3 ‘ ；(SEQ ID NO 2)DNA3HDRZ3 5' -ATTTAAATGCGGCCGCGGGTCGGCATGGCATCTCCACCTCCTCGCGGTC-3' (SEQ ID NO 3) DNA3B 5' - TTAATTAAGCTAGCAGTTAGCCAGAGAGCTCTGC-3’ (SEQ ID NO :4)。
7.權(quán)利要求2所述貓杯狀病毒感染性克隆在表達(dá)外源蛋白的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了貓杯狀病毒感染性克隆，通過在FCV病毒的全長(zhǎng)cDNA的兩端連接酶切位點(diǎn)，之后將序列連接到表達(dá)載體中得到。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，使用本發(fā)明克隆生產(chǎn)得到的FCV，與親本毒具有相似的特性，具有很好地感染性，可使細(xì)胞明顯變性，滴度高，傳代穩(wěn)定。
文檔編號(hào)C12N15/66GK102559757SQ20121000485
公開日2012年7月11日 申請(qǐng)日期2012年1月6日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月6日
發(fā)明者向華, 徐敏, 陳晶, 黃元 申請(qǐng)人:廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所