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      一種檢測基因突變的方法

      文檔序號:409070閱讀:319來源:國知局
      專利名稱:一種檢測基因突變的方法
      技術(shù)領(lǐng)域
      本發(fā)明涉及一種檢測基因突變的方法。
      背景技術(shù)
      病原微生物的不斷變異是造成病原微生物免疫逃逸和抗藥性的根本原因,如能對重要病原微生物流行過程中基因組變異進行檢控及時檢測出抗原表位漂移及抗藥性突變的出現(xiàn),這對預(yù)測病原微生物流行趨勢,及早采取相應(yīng)的免疫措施或及時更換治療藥物具有重要的作用。盡管病原微生物變異及抗藥性突變檢測在疾病預(yù)防和治療中 都具有極高的應(yīng)用價值,但因缺乏高效、低廉能克服基因組高背景的檢測方法,使其難以應(yīng)用到臨床實踐中。Sanger測序法雖一直是突變檢測廣泛應(yīng)用的平臺,但其靈敏度較低,PCR產(chǎn)物混合測序時只能檢測到> 20%的突變,單個克隆測序又費力耗時。另外,在病原微生物混合感染中病原微生物的分離和鑒定也是臨床實踐中遇到的
      一大難題。

      發(fā)明內(nèi)容
      本發(fā)明的目的是提供一種檢測基因突變的方法。本發(fā)明提供了一種DNA分子測序的方法,包括如下步驟(I)以來自一個待測樣本的雙鏈DNA分子為模板,用單鏈DNA片段甲和單鏈DNA片段乙組成的引物對進行PCR擴增,回收PCR擴增產(chǎn)物,得到目的待測雙鏈DNA分子(目的待測雙鏈DNA分子即目的基因片段或帶有樣品條碼的目的基因片段);所述目的待測雙鏈DNA分子由單鏈DNA分子I和單鏈DNA分子2組成,且單鏈DNA分子I和單鏈DNA分子2反向互補;所述單鏈DNA片段甲為所述單鏈DNA分子I的5’端區(qū)域;所述單鏈DNA乙包括所述單鏈DNA分子2的5’端區(qū)域;(2)將步驟(I)的PCR擴增產(chǎn)物進行磷酸化;(3)將步驟(2)的產(chǎn)物單鏈化并與單鏈DNA片段丙及dNTP共孵育,所述單鏈DNA分子I的5’端區(qū)域與所述單鏈DNA片段丙的3’端區(qū)域配對形成雙鏈,所述單鏈DNA分子I的3’端區(qū)域與所述單鏈DNA片段丙的5’端區(qū)域配對形成雙鏈;在DNA聚合酶的作用下,所述單鏈DNA分子I的5’端區(qū)域與3’端區(qū)域通過與所述單鏈DNA片段丙的分子條碼區(qū)域互補的核苷酸連接成環(huán);所述單鏈DNA片段丙自5’末端至3’末端依次包括三個區(qū)域所述單鏈DNA分子2的5’端區(qū)域、分子條碼區(qū)域和所述單鏈DNA分子2的3’端區(qū)域;所述分子條碼區(qū)域由選自A、T、C和G的10至16個核苷酸組成;(4)將步驟(3)的產(chǎn)物用核酸外切酶進行消化,去除沒有成環(huán)的單鏈DNA分子;(5)以步驟(4)的產(chǎn)物為模板進行滾環(huán)復(fù)制;(6)將步驟(5)的產(chǎn)物的粘末端補平;(7)將步驟(6)的產(chǎn)物用核酸外切酶進行消化,去除單鏈DNA分子;
      (8)將步驟(7)的產(chǎn)物進行超聲破碎并回收與待測雙鏈DNA分子大小近似的片段;(9)將步驟(8)回收的片段進行末端修復(fù)和缺口連接;(10)將步驟(9)的產(chǎn)物進行磷酸化;(11)將步驟(10)的產(chǎn)物進行第一次測序;(12)完成步驟(11)后,以所述單鏈DNA片段甲為測序引物進行第二次測序,讀取分子條碼信息;(13)將具有相同分子條碼的測序結(jié)果進行拼接,每種分子條碼獲得一個具體的測
      序結(jié)果。
      所述單鏈DNA片段乙可為所述單鏈DNA分子2的5’端區(qū)域;所述單鏈DNA片段丙可由所述單鏈DNA分子2的5’端區(qū)域、所述分子條碼區(qū)域和所述單鏈DNA分子2的3’端區(qū)域組成。所述待測樣本為兩種以上時,采用相應(yīng)數(shù)量的樣品條碼分別進行標(biāo)記;所述樣品條碼由選自A、T、C和G的6個核苷酸組成;所述單鏈DNA乙的5’端還具有所述樣品條碼區(qū)域;所述單鏈DNA片段丙中,在所述單鏈DNA分子2的5’端區(qū)域和所述分子條碼區(qū)域之間,還具有與所述樣品條碼區(qū)域反向互補的DNA區(qū)域;所述方法中,將每種所述待測樣本分別進行所述步驟(I),混合后進行所述步驟(2)。所述單鏈DNA片段乙可由所述單鏈DNA分子2的5’端區(qū)域和所述樣品條碼區(qū)域組成;所述單鏈DNA片段丙可由所述單鏈DNA分子2的5’端區(qū)域、與所述樣品條碼區(qū)域反向互補的DNA區(qū)域、所述分子條碼區(qū)域和所述單鏈DNA分子2的3’端區(qū)域組成。以上任一所述方法均可用于檢測基因變異。所述方法用于檢測單個樣本中的目的基因變異時,將所述方法得到的各個測序結(jié)果分別與目的基因的現(xiàn)有序列進行比對,從而判斷目的基因發(fā)生的突變;所述來自一個待測樣本的雙鏈DNA分子為來自一個待測樣本的基因組DNA或cDNA。所述方法用于檢測多個樣本中的目的基因變異時,將所述方法得到的各個測序結(jié)果分別與目的基因的現(xiàn)有序列進行比對,從而判斷目的基因發(fā)生的突變;所述來自一個待測樣本的雙鏈DNA分子為來自一個待測樣本的基因組DNA或cDNA。所述目的待測雙鏈DNA分子可為500_1000bp。所述步驟(8)中,所述與待測雙鏈DNA分子大小近似的片段具體可為500-1000bp的片段。所述以來自一個待測樣本的雙鏈DNA分子具體可為來自293T細(xì)胞的cDNA。所述目的待測雙鏈DNA分子具體可為序列表的序列I所示的雙鏈DNA分子。所述步驟(8)中,所述與待測雙鏈DNA分子大小近似的片段具體可為600-1000bp的片段。本發(fā)明克服了新一代測序平臺讀出序列較短的不足,提供了一種能將同一分子不同短序列拼裝在一起的方法。本發(fā)明的特征是通過高通量測序,在單分子水平上進行基因變異的檢測,且可在同一基因上檢出多點突變。本發(fā)明可用于病原微生物變異的高靈敏性檢測和病原微生物混合感染的快速甄別。


      圖I為兩輪測序的流程示意圖。
      具體實施例方式以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明,但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法,如無特殊說明,均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料,如無特殊說明,均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗,均設(shè)置三次重復(fù)實驗,結(jié)果取平均值。293T細(xì)胞(ATCC CRL-11268) 0實施例中均采用Nano-100_微量分光光度計測定DNA含量。實施例1、293T細(xì)胞中Bcr-Abl基因變異的檢測一、制備 cDNAI、提取293T細(xì)胞的總RNA。2、以步驟I提取的總RNA為模板,采用NEB公司的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒制備cDNA(雙鏈)。二、目的片段高保真擴增I、以步驟一得到的cDNA為模板,用單鏈DNA片段甲和單鏈DNA片段乙組成的引物對,在Phusion DNA聚合酶(NEB公司的一種高保真DNA聚合酶)的作用下進行PCR擴增,得到PCR擴增產(chǎn)物。使用ZYMO公司的DNA純化試劑盒純化回收PCR擴增產(chǎn)物。單鏈DNA 片段甲5’ -AGGGAGGGTGTACCATTACAGGA-3’ ;單鏈DNA 片段乙5’ -TTCTCCCCTACCAGGCAGTTTC-3’。PCR擴增的反應(yīng)體系為50ul,其中含有Iul雙鏈cDNA、2. 5ul DNA片段甲(IOuM)、
      2.5ul DNA 片段乙(IOuM)和 Iul dNTP (each IOmM)。PCR擴增的反應(yīng)條件98°C 30s,98°C 10s、66°C 10s、72°C 30s,15 個循環(huán)(10-20 個循環(huán)均可);72°C 7min ;10°C保存。 2、取步驟I得到的PCR擴增產(chǎn)物(約300ng),使用NEB的T4DNA磷酸化酶進行磷酸化(采用50ul體系),然后采用ZYMO公司的DNA純化試劑盒純化回收。3、取步驟 2 的產(chǎn)物(約 IOOng)、10ul 單鏈 DNA 片段丙 IulUOXAmpligasebuffer2ul,用紫外線處理后的ddH20定容至18ul ;然后依次進行如下處理(使雙鏈DNA分子變性為兩條反向互補的單鏈DNA分子,即單鏈DNA分子I和單鏈DNA分子2,單鏈DNA分子I與單鏈DNA片段丙通過兩個互補區(qū)域結(jié)合):20°C 4min、95°C 5min、58°C 90min ;然后加入 IOmM dNTP (each IOmM) IulUOU Taq Stoffel Fragment (ABI) O. 5ul、5UAmpligase(Epi)O. 5ul ;然后依次進行如下處理(單鏈DNA分子I的5’端區(qū)域與3’端區(qū)域通過與單鏈DNA丙的分子條碼區(qū)域互補的核苷酸連接成環(huán))58°C 15min、37°C lmin,然后4°C保存。DNA片段丙為單鏈DNA,序列如下5,-TCCTGTAATGGTACACCCTCCCT-MB-TTCTCCCCTACCAGGCAGTTTC-3,。其中MB區(qū)域由16個核苷酸組成,該16個核苷酸選自A、T、C和G ;也就是單鏈DNA片段丙代表一組DNA,該組DNA中,除了 MB區(qū)域,其它區(qū)域都相同,因為MB區(qū)域代表龐大的信息量(416種可能),遠(yuǎn)大于待測分子數(shù),可確保不同的分子上引入不同的條碼,從而做到每個分子上引入條碼的唯一性。4、取20ul步驟3的產(chǎn)物、2ul EXoI和O. 4ulExoII混合并進行如下處理(通過核酸外切酶EXoI切除未成環(huán)的單鏈DNA片段)37°C 45min,80°C 20min, 10°C保存?zhèn)溆谩!?br> 5、取步驟 4 的產(chǎn)物(約 40ng)、25mM dNTP (Epicentre) 0.8ul、10mg/mlBSA(NEB)0. 4ul,100 μ M N6T2(hexamer, IDT)2ul、10 X phi29buffer(Epicentre)2ul、phi29DNA聚合酶(100U,Epicentre) Iul、DMSO 2ul,用紫外處理的H2O定容至20ul ;然后依次進行如下處理(以單鏈環(huán)狀DNA為模板進行滾環(huán)復(fù)制)28°C 3h,65°C lOmin,然后10°C保存;無水乙醇沉淀回收DNA分子然后用20ul H2O溶解。6、取步驟 5 回收的 DNA 分子 14ul、25mM dNTP (Epicentre) O. 5ul、10Xphi29buffer (Epicentre) 5ul>100U phi29DNA 聚合酶(Epicentre) 2ul、H2O (Ambion) 28. 5ul ;進行如下處理(補平粘末端)30°C 2h,65°C 3min,10°C保存。7、取步驟 6 的產(chǎn)物 47ul、10XSl buffer(pH4. 6,300mM NaAc,500mM NaCl,10mMZnS04)20ul、400U SI 核酸酶(USB) Iul、H2O(Ambion) 132ul ;然后進行如下處理(去除單鏈DNA) 37°C 30min ;然后添加IOul IOOmM EDTA停止反應(yīng)。
      8、取200ul步驟7的產(chǎn)物,在冰浴上進行超聲破碎處理(Duty = 50%, Output =
      6,2times, each time 15sec),回收 600-1000bp 的 DNA 片段。9、取 20ul 步驟 8 回收的片段、10Xbuffer2(NEB) IOulUOmM dNTP (Bioline) 5ul、T4DNA 聚合酶(3U,NEB)2ul、E. coli DNA 聚合酶 I (10U,NEB) 2ul、H2O (Ambion) 61ul ;然后進行如下處理(末端修復(fù)、缺口連接)25°C Ih, 75°C 10min,4°C保溫。10、使用ZYMO公司DNA純化試劑盒純化回收步驟9的產(chǎn)物,然后使用NEB的T4DNA磷酸化酶進行磷酸化(采用50ul體系),然后采用ZYMO公司的DNA純化試劑盒純化回收。11、采用Solexa測序Kit (ILUMINA)按試劑盒的說明進行第一次測序。12、以步驟I中的單鏈DNA片段甲為測序引物,在第一次測序的基礎(chǔ)上,進行第二次測序,讀取分子條碼信息(兩輪測序的流程示意圖見圖I)。13、將具有相同分子條碼的測序結(jié)果進行拼接,每種分子條碼獲得一個具體的測
      序結(jié)果。Bcr-Abl基因片段的野生型序列如序列表的序列I所示,經(jīng)過上述步驟,293T細(xì)胞中的Bcr-Abl基因得到了 5種測序結(jié)果,分別如下第一種結(jié)果與序列I 一致;第二種結(jié)果在序列I的320-404位發(fā)生了缺失;第三種結(jié)果在序列I的基礎(chǔ)上存在著I個突變,自5’末端第262位的G變成了 C ;第四種結(jié)果在序列I的基礎(chǔ)上存在著2個突變,分別是自5’末端第202位的G變成了 T、第399位的T變成了 C ;第五種結(jié)果在序列I的基礎(chǔ)上存在著2個突變,分別是自5’末端第388位的C變成了 A、第514位的G變成了 C。
      權(quán)利要求
      1.一種DNA分子測序的方法,包括如下步驟 (1)以來自一個待測樣本的雙鏈DNA分子為模板,用單鏈DNA片段甲和單鏈DNA片段乙組成的引物對進行PCR擴增,回收PCR擴增產(chǎn)物,得到目的待測雙鏈DNA分子;所述目的待測雙鏈DNA分子由單鏈DNA分子I和單鏈DNA分子2組成,且單鏈DNA分子I和單鏈DNA分子2反向互補;所述單鏈DNA片段甲為所述單鏈DNA分子I的5’端區(qū)域;所述單鏈DNA乙包括所述單鏈DNA分子2的5’端區(qū)域; (2)將步驟(I)的PCR擴增產(chǎn)物進行磷酸化; (3)將步驟(2)的產(chǎn)物單鏈化并與單鏈DNA片段丙及dNTP共孵育,所述單鏈DNA分子I的5’端區(qū)域與所述單鏈DNA片段丙的3’端區(qū)域配對形成雙鏈,所述單鏈DNA分子I的3’端區(qū)域與所述單鏈DNA片段丙的5’端區(qū)域配對形成雙鏈;在DNA聚合酶的作用下,所述單鏈DNA分子I的5’端區(qū)域與3’端區(qū)域通過與所述單鏈DNA片段丙的分子條碼區(qū)域互補的核苷酸連接成環(huán);所述單鏈DNA片段丙自5’末端至3’末端依次包括三個區(qū)域所述單鏈DNA分子2的5’端區(qū)域、分子條碼區(qū)域和所述單鏈DNA分子2的3’端區(qū)域;所述分子條碼區(qū)域由選自A、T、C和G的10至16個核苷酸組成; (4)將步驟(3)的產(chǎn)物用核酸外切酶進行消化,去除沒有成環(huán)的單鏈DNA分子; (5)以步驟(4)的產(chǎn)物為模板進行滾環(huán)復(fù)制; (6)將步驟(5)的產(chǎn)物的粘末端補平; (7)將步驟(6)的產(chǎn)物用核酸外切酶進行消化,去除單鏈DNA分子; (8)將步驟(7)的產(chǎn)物進行超聲破碎并回收與待測雙鏈DNA分子大小近似的片段; (9)將步驟(8)回收的片段進行末端修復(fù)和缺口連接; (10)將步驟(9)的產(chǎn)物進行磷酸化; (11)將步驟(10)的產(chǎn)物進行第一次測序; (12)完成步驟(11)后,以所述單鏈DNA片段甲為測序引物進行第二次測序,讀取分子條碼息; (13)將具有相同分子條碼的測序結(jié)果進行拼接,每種分子條碼獲得一個具體的測序結(jié)果O
      2.如權(quán)利要求I所述的方法,其特征在于所述待測樣本為兩種以上,并采用相應(yīng)數(shù)量的樣品條碼分別進行標(biāo)記;所述樣品條碼由選自A、T、C和G的6個核苷酸組成;所述單鏈DNA乙的5’端還具有所述樣品條碼區(qū)域;所述單鏈DNA片段丙中,在所述單鏈DNA分子2的5’端區(qū)域和所述分子條碼區(qū)域之間,還具有與所述樣品條碼區(qū)域反向互補的DNA區(qū)域;所述方法中,將每種所述待測樣本分別進行所述步驟(I),混合后進行所述步驟(2)。
      3.如權(quán)利要求I所述的方法,其特征在于所述單鏈DNA片段乙為所述單鏈DNA分子2的5’端區(qū)域;所述單鏈DNA片段丙由所述單鏈DNA分子2的5’端區(qū)域、所述分子條碼區(qū)域和所述單鏈DNA分子2的3’端區(qū)域組成。
      4.如權(quán)利要求2所述的方法,其特征在于所述單鏈DNA片段乙由所述單鏈DNA分子2的5’端區(qū)域和所述樣品條碼區(qū)域組成;所述單鏈DNA片段丙由所述單鏈DNA分子2的5’端區(qū)域、與所述樣品條碼區(qū)域反向互補的DNA區(qū)域、所述分子條碼區(qū)域和所述單鏈DNA分子2的3’端區(qū)域組成。
      5.權(quán)利要求I至4中任一所述方法在檢測基因變異中的應(yīng)用。
      6.權(quán)利要求I或3所述的方法的如下應(yīng)用檢測單個樣本中的目的基因變異;所述應(yīng)用中,將所述方法得到的各個測序結(jié)果分別與目的基因的現(xiàn)有序列進行比對,從而判斷目的基因發(fā)生的突變;所述來自一個待測樣本的雙鏈DNA分子為來自一個待測樣本的基因組DNA 或 cDNA。
      7.權(quán)利要求2或4所述的方法的如下應(yīng)用檢測多個樣本中的目的基因變異;所述應(yīng)用中,將所述方法得到的各個測序結(jié)果分別與目的基因的現(xiàn)有序列進行比對,從而判斷目的基因發(fā)生的突變;所述來自一個待測樣本的雙鏈DNA分子為來自一個待測樣本的基因組DNA 或 cDNA。
      全文摘要
      本發(fā)明公開了一種檢測基因突變的方法。本發(fā)明提供了一種DNA分子測序的方法,包括如下步驟(1)得到目的待測雙鏈DNA分子;(2)磷酸化;(3)在DNA聚合酶的作用下,單鏈DNA分子1的5’端區(qū)域與3’端區(qū)域通過與單鏈DNA片段丙的分子條碼區(qū)域互補的核苷酸連接成環(huán);(4)用核酸外切酶消化;(5)滾環(huán)復(fù)制;(6)粘末端補平;(7)用核酸外切酶消化;(8)超聲破碎;(9)末端修復(fù)和缺口連接;(10)磷酸化;(11)第一次測序;(12)第二次測序,讀取分子條碼信息;(13)獲得結(jié)果。本發(fā)明可用于病原微生物變異的高靈敏性檢測和病原微生物混合感染的快速甄別。
      文檔編號C12Q1/68GK102676654SQ20121007277
      公開日2012年9月19日 申請日期2012年3月19日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月17日
      發(fā)明者倪挺, 劉翟, 朱鈞, 楊懷義 申請人:中國科學(xué)院微生物研究所
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