專利名稱：一種體外誘導(dǎo)人間充質(zhì)干細(xì)胞分化為胰島素分泌細(xì)胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于干細(xì)胞誘導(dǎo)分化研究領(lǐng)域，涉及一種誘導(dǎo)干細(xì)胞分化的方法，尤其是一種體外誘導(dǎo)人間充質(zhì)干細(xì)胞分化為胰島素分泌細(xì)胞的方法。
背景技術(shù)：
糖尿病是一組以血葡萄糖水平增高為特征的代謝性疾病，主要是由于胰島素分泌相對(duì)或絕對(duì)不足或胰島素受體作用缺陷引起的糖、脂肪和蛋白質(zhì)代謝紊亂性疾病。糖尿病死亡率僅次于心腦血管和腫瘤，嚴(yán)重威脅人類生命和健康。隨著其發(fā)病率的逐年上升，糖尿病對(duì)人類健康的危害還將進(jìn)一步加重。世界衛(wèi)生組織估計(jì)，全世界有I. 8億人患有糖尿病，這一數(shù)字很可能到2030年將翻番一倍以上。在糖尿病治療方面，傳統(tǒng)的治療無(wú)外乎促進(jìn)β細(xì)胞胰島素的分泌、增加外周組織對(duì)胰島素的敏感性及使用外源胰島素幾個(gè)方面，然而這些治療策略顯然未能使糖尿病患者得到根治；胰腺移植和胰島移植又難以克服供體不足和免疫排斥這兩大問(wèn)題，使其臨床應(yīng)用和效果也受到極大影響。因此迫切需求治愈糖尿病的新方法。干細(xì)胞以其極強(qiáng)自我更新和多向分化潛能，已成為人們尋找替代患者自身免疫系統(tǒng)破壞的胰島細(xì)胞的最佳種子細(xì)胞來(lái)源，以干細(xì)胞移植為主的再生治療為糖尿病的根治帶來(lái)了新的希望。間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells, MSCs),是目前最有應(yīng)用優(yōu)勢(shì)的種子細(xì)胞。間充質(zhì)干細(xì)胞具有非常強(qiáng)的自我增殖能力和分化的多潛能性，國(guó)內(nèi)外的研究表明能根據(jù)特定的環(huán)境分化為胰島素分泌細(xì)胞，并且間充質(zhì)干細(xì)胞具有其它干細(xì)胞所不可比擬的優(yōu)點(diǎn)，如取材方便、增殖和分化能力強(qiáng)、移植無(wú)免疫原性，同時(shí)也避免了胚胎干細(xì)胞移植所面臨的倫理問(wèn)題。目前對(duì)于間充質(zhì)干細(xì)胞向胰島細(xì)胞分化的誘導(dǎo)方案可以歸為以下兩類多數(shù)為集中神經(jīng)生長(zhǎng)因子及活化素的聯(lián)合應(yīng)用，如bFGF、EGF等；另一種方法是轉(zhuǎn)染胰島細(xì)胞發(fā)育、胰島素分泌過(guò)程中的關(guān)鍵基因，如roX-l、Ngn3等轉(zhuǎn)錄因子。但是現(xiàn)有研究誘導(dǎo)分化方案有很大局限性，分化效率不高，應(yīng)用時(shí)效果不理想。血清反應(yīng)因子(SRF)是一種高度保守且廣泛存在于多種生物體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，它可以與多個(gè)基因啟動(dòng)子上CArG box位點(diǎn)特異性結(jié)合，進(jìn)而特異性上調(diào)靶基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平。目前發(fā)現(xiàn)其主要功能是參與調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)骨架肌動(dòng)蛋白和其他一些支架蛋白的基因轉(zhuǎn)錄過(guò)程，進(jìn)而參與多種哺乳動(dòng)物生理過(guò)程，例如肌原纖維發(fā)育及其分化為骨骼肌、平滑肌等過(guò)程。最新的研究發(fā)現(xiàn)胰島素基因啟動(dòng)子上含有SRF的結(jié)合位點(diǎn)CArG box,并且SRF和PDX-I可以協(xié)同促進(jìn)胰島素基因的轉(zhuǎn)錄，但是利用SRF與生長(zhǎng)因子組合共同誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞向平滑肌細(xì)胞分化尚未見(jiàn)報(bào)道
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種體外誘導(dǎo)人間充質(zhì)干細(xì)胞分化為胰島素分泌細(xì)胞的方法，本方法利用SRF基因修飾與多種生長(zhǎng)因子協(xié)同誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞向胰島素分泌細(xì)胞分化。為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種體外誘導(dǎo)人間充質(zhì)干細(xì)胞分化為胰島素分泌細(xì)胞的方法，包括以下步驟
(I)構(gòu)建含有SRF基因的重組真核表達(dá)質(zhì)粒；(2)誘導(dǎo)人間充質(zhì)干細(xì)胞向Nestin+細(xì)胞分化當(dāng)步驟(I)中細(xì)胞至70_80%融合時(shí)，去除原有培養(yǎng)基，加入誘導(dǎo)培養(yǎng)基I培養(yǎng)5 6小時(shí)；所述步驟⑵中所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基I為含有5mmol/L β -巰基乙醇和2%胎牛血清的DMEM-高糖培養(yǎng)基，含25mM葡萄糖；(3)誘導(dǎo)Nestin+細(xì)胞向胰腺始祖細(xì)胞分化在步驟(2)獲得細(xì)胞中，去除步驟(2)中誘導(dǎo)培養(yǎng)基I，加入誘導(dǎo)培養(yǎng)基II培養(yǎng)7 8天；步驟(3)中所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基II為含有5 20nmol/L bFGF、5 20nmol/L EGF,2% B27、0. 1% β -巰基乙醇和2%胎牛血清的DMEM-高糖培養(yǎng)基，含25mM葡萄糖；(4)誘導(dǎo)胰腺始祖細(xì)胞向胰島素分泌細(xì)胞分化在步驟(3)獲得細(xì)胞中，去除步驟
(2)中誘導(dǎo)培養(yǎng)基II，加入誘導(dǎo)培養(yǎng)基III，同時(shí)轉(zhuǎn)染步驟(I)中的SRF基因的重組真核表達(dá)質(zhì)粒，培養(yǎng)7 8天；步驟⑷中所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基III為含有5 20nmol/L Exendin_4、5 20mmol/L尼克酰胺、2% B27和2%胎牛血清的DMEM-高糖培養(yǎng)基，含25mM葡萄糖。而且，步驟(I)中構(gòu)建含有SRF基因的重組真核表達(dá)質(zhì)粒，真核表達(dá)載體為pEGFP、pcDNA3. I 或 pCMV。而且，步驟(2)中所述的人間充質(zhì)干細(xì)胞包括羊水、骨髓、胎盤、臍帶血或脂肪組織來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞。而且，步驟(4)中所述的SRF真核表達(dá)質(zhì)粒為去內(nèi)毒素的質(zhì)粒，質(zhì)粒超螺旋帶型清晰，A260/A280 = I. 8 2. O。而且，所述步驟(3)中所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基II為含有10nmol/L bFGFUOnmoI/L EGF、2% B27.0. 1% β-巰基乙醇和2%胎牛血清的DMEM-高糖培養(yǎng)基，含25mM葡萄糖。而且，所述步驟(4)中所述的誘導(dǎo)液培養(yǎng)基III為含有10nmol/L Exendin-4、10mmol/L尼克酰胺、2% B27和2%胎牛血清的DMEM-高糖培養(yǎng)基，含25mM葡萄糖。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果如下I、本發(fā)明首次將SRF用作誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞向胰島素分泌細(xì)胞分化過(guò)程中的修飾基因，并首次將轉(zhuǎn)染SRF和多種生長(zhǎng)因子組合共同誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞向胰島素分泌細(xì)胞分化。2、本發(fā)明利用生長(zhǎng)因子組合誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞分化為胰腺始祖細(xì)胞(此時(shí)細(xì)胞高表達(dá)rox-i)，同時(shí)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行基因修飾，上調(diào)細(xì)胞中的SRF表達(dá)，并輔以生長(zhǎng)因子和活性物質(zhì)將可能獲得分泌胰島素的細(xì)胞，此方法的建立對(duì)于研發(fā)基于干細(xì)胞移植治療為主的“再生醫(yī)學(xué)”具有重要意義和實(shí)用價(jià)值。3、本發(fā)明所述的Effectene Transfection Reagent轉(zhuǎn)染系統(tǒng)轉(zhuǎn)染效率高，并且安全性好。4、本發(fā)明可為間充質(zhì)干細(xì)胞的向胰島素分泌細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化和其臨床應(yīng)用提供新的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)，并為與之相關(guān)的藥物開發(fā)和篩選提供了新的模型。


圖I為本發(fā)明利用SRF的上、下游引物對(duì)SRF基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，M為分子量marker，I代表擴(kuò)增PCR產(chǎn)物片段；圖2為本發(fā)明所構(gòu)建的SRF質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證，M為分子量marker，I為所構(gòu)建質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切后的電泳圖。圖3為本發(fā)明利用誘導(dǎo)培養(yǎng)基組合三步誘導(dǎo)法誘導(dǎo)人間充質(zhì)干細(xì)胞向胰島素分泌細(xì)胞分化的細(xì)胞形態(tài)圖，其中，圖3-1代表未誘導(dǎo)組的間充質(zhì)干細(xì)胞的形態(tài)；圖3-2代表利用誘導(dǎo)培養(yǎng)基I誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞分化為nestin+細(xì)胞的形態(tài)變化情況；圖3_3代表利用誘導(dǎo)培養(yǎng)基II誘導(dǎo)nestin+細(xì)胞分化為胰腺始祖細(xì)胞的形態(tài)變化情況；圖3_4代表利用誘導(dǎo)培養(yǎng)基III誘導(dǎo)胰腺始祖細(xì)胞分化為胰島素分泌細(xì)胞的形態(tài)變化情況。圖4為本發(fā)明利用誘導(dǎo)培養(yǎng)基組合三步誘導(dǎo)法誘導(dǎo)人間充質(zhì)干細(xì)胞向胰島素分泌細(xì)胞分化后，利用雙硫腙染色檢測(cè)胰島素分泌細(xì)胞團(tuán)，其中，圖4-1代表未誘導(dǎo)組的間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行雙硫腙染色；圖4-2代表利用生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)后雙硫腙染色，說(shuō)明利用誘導(dǎo)培養(yǎng)基組合誘導(dǎo)后出現(xiàn)表達(dá)胰島素的細(xì)胞團(tuán)。圖5為本發(fā)明利用誘導(dǎo)培養(yǎng)基組合三步誘導(dǎo)法與轉(zhuǎn)錄因子SRF共同誘導(dǎo)人間充質(zhì)干細(xì)胞向胰島素分泌細(xì)胞分化后，利用RT-PCR檢測(cè)分化后細(xì)胞表達(dá)胰島素基因mRNA水平，其中A代表誘導(dǎo)培養(yǎng)基組合三步誘導(dǎo)法誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞分化后，胰島素基因mRNA水平；B代表誘導(dǎo)培養(yǎng)基組合三步誘導(dǎo)法與轉(zhuǎn)錄因子SRF共同誘導(dǎo)人間充質(zhì)干細(xì)胞分化后，胰島素基因mRNA水平。說(shuō)明在誘導(dǎo)培養(yǎng)基組合與轉(zhuǎn)錄因子SRF共誘導(dǎo)之后胰島素的mRNA水平較聞。圖6為本發(fā)明利用誘導(dǎo)培養(yǎng)基組合三步誘導(dǎo)法與轉(zhuǎn)錄因子SRF共同誘導(dǎo)人間充質(zhì)干細(xì)胞向胰島素分泌細(xì)胞分化后，利用ELISA方法檢測(cè)培養(yǎng)基中胰島素的分泌情況，其中A代表誘導(dǎo)培養(yǎng)基組合三步誘導(dǎo)法誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞分化后，培養(yǎng)基中胰島素的分泌情況；B代表誘導(dǎo)培養(yǎng)基組合三步誘導(dǎo)法與轉(zhuǎn)錄因子SRF共同誘導(dǎo)人間充質(zhì)干細(xì)胞分化后，培養(yǎng)基中胰島素的分泌情況。說(shuō)明在誘導(dǎo)培養(yǎng)基組合與轉(zhuǎn)錄因子SRF共誘導(dǎo)之后胰島素分泌顯著升高。
具體實(shí)施例方式下面通過(guò)具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳述，以下實(shí)施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明中沒(méi)有具體指明單位的百分比均為重量百分比。本發(fā)明未詳細(xì)說(shuō)明的方法均為本領(lǐng)域公知技術(shù)或公知實(shí)驗(yàn)方法，不具有特殊性。本發(fā)明提供一種由多種誘導(dǎo)物組合而成的分3步誘導(dǎo)的新方法，其中SRF基因修飾是間充質(zhì)干細(xì)胞向胰島素分泌細(xì)胞分化中首次采用的方法，該方法能將人間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為胰島素分泌細(xì)胞，并具有較高的胰島素分泌量，具體包括以下步驟(I)間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞包括羊水、骨髓、胎盤、臍帶血、脂肪等組織來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞。
(2)構(gòu)建含有SRF基因的重組真核表達(dá)質(zhì)粒，含有SRF基因的真核表達(dá)質(zhì)粒的制備方法是本領(lǐng)域常用的構(gòu)建真核表達(dá)載體的方法。具體的是選擇合適的載體，載體可以是pcDNA3. I、pCMV等真核表達(dá)載體。根據(jù)SRF基因全長(zhǎng)序列與所選載體設(shè)計(jì)酶切位點(diǎn)，利用PCR或人工合成的方法獲得SRF基因全長(zhǎng)，利用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切反應(yīng)，然后用連接酶將酶切后的SRF基因片段和載體連接，進(jìn)一步通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳、限制性內(nèi)切酶酶切鑒定、PCR鑒定及測(cè)序的方法對(duì)獲得的質(zhì)粒進(jìn)行鑒定，獲得SRF真核表達(dá)質(zhì)粒。
(3)誘導(dǎo)人間充質(zhì)干細(xì)胞向Nestin+細(xì)胞分化將步驟(I)中細(xì)胞種入6孔板中，待生長(zhǎng)至70-80%融合時(shí)，去除原有DiffiM和10%胎牛血清培養(yǎng)基，加入誘導(dǎo)培養(yǎng)基I 2mL培養(yǎng)5 6小時(shí)，誘導(dǎo)培養(yǎng)基I為含有5mmol/Lβ -巰基乙醇和2%胎牛血清的DMEM-高糖(25mM葡萄糖)培養(yǎng)基。培養(yǎng)基加入量與使用培養(yǎng)板大小有關(guān)，如用6孔板，則加2ml，如用24孔板，則加lmL。(4)誘導(dǎo)Nestin+細(xì)胞向胰腺始祖細(xì)胞分化在步驟(3)獲得細(xì)胞中，去除步驟(3)中誘導(dǎo)培養(yǎng)基I，加入誘導(dǎo)培養(yǎng)基II 2mL培養(yǎng) 7 8 天，誘導(dǎo)培養(yǎng)基 II 為含有 5 20nmol/L bFGF、5 20nmol/L EGF,2% B27.0. 1%β -巰基乙醇和2%胎牛血清的DMEM-高糖(25mM葡萄糖)培養(yǎng)基。(5)誘導(dǎo)胰腺始祖細(xì)胞向胰島素分泌細(xì)胞分化在步驟⑷獲得細(xì)胞中，去除步驟⑷中誘導(dǎo)培養(yǎng)基II，加入誘導(dǎo)培養(yǎng)基III 2mL，同時(shí)轉(zhuǎn)染步驟(2)中的SRF基因的重組真核表達(dá)質(zhì)粒，培養(yǎng)7 8天，誘導(dǎo)培養(yǎng)基III為含有5 20nmol/LExendin-4、5 20mmol/L尼克酰胺、2% B27和2%胎牛血清的DMEM-高糖(25mM葡萄糖)培養(yǎng)基。(6)分化后細(xì)胞的鑒定利用細(xì)胞形態(tài)觀察、RT-PCR、雙硫腙染色等方法對(duì)分化后的細(xì)胞進(jìn)行鑒定。實(shí)施例I一種體外誘導(dǎo)人間充質(zhì)干細(xì)胞分化為胰島素分泌細(xì)胞的方法，本實(shí)施例采用的是人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，步驟如下I.人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)從健康志愿者髖骨分離獲取人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，然后收集細(xì)胞培養(yǎng)當(dāng)細(xì)胞達(dá)到70-80%融合時(shí)，用PBS清洗后，用胰酶消化，然后加入含有10%胎牛血清的DMEM低糖培養(yǎng)基(5. 6mM葡萄糖)終止消化，吹打成單細(xì)胞懸液，離心后棄上清，再用含有10%胎牛血清的DMEM低糖培養(yǎng)基(5. 6mM葡萄糖)重新懸浮細(xì)胞；然后傳代培養(yǎng)；2.含有SRF基因的重組真核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建(I)小鼠基因組的提取提取小鼠的心臟組織，將組織置于冰塊上，同時(shí)注意無(wú)菌操作。使用PH值為7. 4的PBS，將心臟組織濕潤(rùn)。用眼科剪將心臟組織剪為O. 5cm X O. 5cm的小塊，將剪碎的心臟組織放入勻漿器中，在10-20mg心臟組織加入I毫升Trizol，至于冰上研磨5分鐘，離心取上清，利用傳統(tǒng)方法(氯仿/異丙醇)提取RNA。(2)根據(jù)NCBI中Genebank數(shù)據(jù)庫(kù)中SRF的全長(zhǎng)序列信息和所用pcDNA3. I載體信息設(shè)計(jì)引物，引物序列如下上游引物I :5’ -CATGGATCCCCATGTTACCGACCCAAGCT-3’
下游引物1 :5’ -GGTCTCGAGGTTCACCACCTGTAGCTCGG-3’PCR反應(yīng)體系
基因組模板Ιμ
正向引物Ιμ
反向引物Ιμ dNTP4μL
IOxbuffer5 μι
EasyTaq 聚合酶Ιμ
總體積5(^L利用EasyTaq 聚合酶在 94°C 5min, (94°C lmin,53°C 30s，72°C 3min) 35 個(gè)循環(huán)，72°C IOmin的反應(yīng)條件下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增獲得的PCR產(chǎn)物于I %的TBE瓊脂糖凝膠中電泳(如圖I)，利用瓊脂糖凝膠DNA快速純化回收試劑盒純化回收獲得SRF基因片段。(3)將SRF基因和pcDNA3. I質(zhì)粒用BamHI和XhoI雙酶切后，經(jīng)T4DNA連接酶(Promega)連接，取連接產(chǎn)物10 μ I加入到感受態(tài)細(xì)胞(常規(guī)CaCl2法制備Ε. coliDH5 α感受態(tài)細(xì)胞)中，輕敲管壁使內(nèi)容物混勻，冰浴30min，42°C水浴熱擊90s，迅速轉(zhuǎn)置冰浴2min，加入500 μ ILB培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)，將300 μ I轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基平板上，置于37°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)過(guò)夜。培養(yǎng)12h后挑取單克隆，分別接種于3ml含氨芐青霉素的液體培養(yǎng)基，37°C振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。利用質(zhì)粒小提試劑盒(Solarbio)提取質(zhì)粒，用BamHI和XhoI雙酶切驗(yàn)證(如圖2)，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)有I. 6kb左右的SRF目的片段，進(jìn)一步將含有pcDNA3. I-SRF質(zhì)粒的DH5a菌液送至上海生工生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序鑒定，測(cè)序結(jié)果在Genebank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)，證明閱讀框完全正確，pcDNA3. I-SRF質(zhì)粒中含有SRF全長(zhǎng)基因。(4)質(zhì)粒DNA的大量提取，將pcDNA3. I-SRF質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，取菌液30 μ 1，接種到3ml含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，在37°C水浴搖床上震蕩培養(yǎng)過(guò)夜，利用去內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒(Solarbio)操作步驟純化提取pcDNA3. I-SRF質(zhì)粒備用。提取后的質(zhì)粒進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳觀察，質(zhì)粒超螺旋帶型清晰。同時(shí)利用核酸蛋白測(cè)定儀(美國(guó)Bio-Rad公司)對(duì)核酸進(jìn)行定量分析，A260/A280 = I. 8 2. O為最佳。3.誘導(dǎo)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向胰腺始祖細(xì)胞分化待分離獲得長(zhǎng)期培養(yǎng)的間充質(zhì)干細(xì)胞生長(zhǎng)至70 80%，加入誘導(dǎo)培養(yǎng)基I (5mmol/L β -巰基乙醇和2%胎牛血清的DMEM-高糖(25mM葡萄糖)培養(yǎng)基)，放入37V,5% CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)5 6小時(shí)，將間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)為Nestin+細(xì)胞；吸去舊培養(yǎng)基，加入誘導(dǎo)培養(yǎng)基II (I Onmo I/L bFGF U Onmo I/L EGF,2% B27.0. 1% β-巰基乙醇和2%胎牛血清的DMEM-高糖(25mM葡萄糖)培養(yǎng)基)，放入37°C、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，48h首次半量換液，之后每3天全量換液一次，培養(yǎng)7天。4.在胰腺始祖細(xì)胞中轉(zhuǎn)染SRF真核表達(dá)質(zhì)粒，誘導(dǎo)其向胰島素分泌細(xì)胞分化按照Effectene Transfection Reagent轉(zhuǎn)染系統(tǒng)將SRF基因轉(zhuǎn)染入胰腺始祖細(xì)胞，具體操作步驟如下在24孔板中預(yù)先加入O. 5mL含血清但不含抗生素的DMEM低糖培養(yǎng)基，置于37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育。細(xì)胞在轉(zhuǎn)染前匯合度達(dá)到60-70%，將培養(yǎng)基吸去，加入PBS漂洗一次后，加入O. 25%胰酶消化細(xì)胞，離心收獲細(xì)胞，并用不含Ca2+和Mg2+的PBS漂洗細(xì)胞，離心去上清，加入重懸緩沖液R重懸細(xì)胞，使其終濃度為I. O X IO7個(gè)細(xì)胞/mL。將重懸的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至I. 5mL無(wú)菌微量離心管中，按I μ g/每孔分別將不含SRF基因的pcDNA3. I質(zhì)粒和含有SRF的pcDNA3. 1-SRF表達(dá)質(zhì)粒加入到細(xì)胞懸液中，輕輕混勻。打開Neon 儀器開關(guān)，在Neon 管中加入3mL電解緩沖液，然后將它插入Neon 移液器吸頭架中，用Neon 移液器夾取一個(gè)Neon 吸頭，確保移液器與吸頭無(wú)縫隙。將Neon 吸頭浸入細(xì)胞-質(zhì)?；旌衔镏?，吸取IO uL混合物。然后將移液器垂直插入位于Neon 移液器吸頭架上的Neon 管中。在顯示屏上設(shè)置電轉(zhuǎn)參數(shù)為電壓990V，脈沖時(shí)間40ms，點(diǎn)擊次數(shù)I次，然后按下START鍵。當(dāng)觸摸屏顯示Complete，說(shuō)明電轉(zhuǎn)完成。將移液器取下，并吸頭中的樣品轉(zhuǎn)移至預(yù)先加入誘導(dǎo)培養(yǎng)基III (10nmol/L Exendin-4、10mmol/L尼克酰胺、2%B27和2%胎牛血清的DMEM-高糖(25mM葡萄糖)培養(yǎng)基)孵育的孔板中。輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)板，確保細(xì)胞分布均勻。將培養(yǎng)板置于37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)，進(jìn)行半量換液，之后每3天全量換液一次，誘導(dǎo)其向胰島素分泌細(xì)胞分化。5.檢測(cè)分化后細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化在誘導(dǎo)分化過(guò)程中，順序利用誘導(dǎo)培養(yǎng)液I、誘導(dǎo)培養(yǎng)液II、誘導(dǎo)培養(yǎng)液III同時(shí)進(jìn)行SRF基因修飾誘導(dǎo)細(xì)胞分化，經(jīng)歷Nestin+細(xì)胞、胰腺始祖細(xì)胞、胰島素分泌細(xì)胞三個(gè)階段，利用倒置相差顯微鏡進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，結(jié)果如圖3所示，細(xì)胞在形態(tài)學(xué)上發(fā)生明顯變化，變圓并形成細(xì)胞簇。6.利用雙硫腙染色方法鑒定胰島素分泌細(xì)胞首先配置雙硫腙染色劑，50mg雙硫腙(DTZ)加入5mL DMSO溶解作為儲(chǔ)備液，用PBS稀釋終濃度為0. lmg/mL，抽濾除菌，配制為染色液。對(duì)于誘導(dǎo)分化的細(xì)胞和未誘導(dǎo)分化的細(xì)胞，用PBS漂洗2次，加入染色液，37°C溫育15min后鏡檢。結(jié)果如圖4所示，誘導(dǎo)分化后細(xì)胞著色較深，呈棕紅色。實(shí)施例2一種體外誘導(dǎo)人間充質(zhì)干細(xì)胞分化為胰島素分泌細(xì)胞的方法，本實(shí)施例使用的是pCMV-Tag2B作為載體，具體方法如下I.人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)，同實(shí)施例I。2.構(gòu)建pCMV-SRF真核表達(dá)質(zhì)粒(I)以實(shí)施例I中構(gòu)建好的pcDNA3. I-SRF質(zhì)粒為模版，以pCMV_Tag2B作為載體，采用PCR的方法從pcDNA3. I-SRF質(zhì)粒中擴(kuò)增SRF基因片段，根據(jù)SRF的全長(zhǎng)序列信息和所用pCMV載體信息設(shè)計(jì)引物，引物序列如下上游引物2 :5 ’ -ATCGGGATCCATGTTACCGACCCAAGCT-3 ’下游引物2 :5 ’ -GGTCTCGAGGTTCACCACCTGTAGCTCGG-3 ’進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物利用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，利用凝膠純化方法純化回收獲得SRF基因片段。(2)將SRF基因和pCMV_Tag2B質(zhì)粒用BamHI和XhoI雙酶切后，經(jīng)T4DNA連接酶(Promega)連接，取連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α (轉(zhuǎn)化方法同實(shí)施例I)，將300 μ I轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基平板上，置于37°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)過(guò)夜。培養(yǎng)12h后挑取單克隆，分別接種于3ml含氨芐青霉素的液體培養(yǎng)基，37°C振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。利用質(zhì)粒小提試劑盒(Solarbio)提取質(zhì)粒,用BamHI和XhoI雙酶切驗(yàn)證,瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)有I. 6kb左右的SRF目的片段，進(jìn)一步將含有pCMV-SRF質(zhì)粒的DH5 α菌液送至上海生工生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序鑒定，測(cè)序結(jié)果在Genebank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)，證明閱讀框完全正確，pCMV-SRF質(zhì)粒中含有SRF全長(zhǎng)基因(3)pCMV-SRF質(zhì)粒的大量提取方法，同實(shí)施例I。3.誘導(dǎo)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向胰腺始祖細(xì)胞分化，同實(shí)施例I。4.在胰腺始祖細(xì)胞中轉(zhuǎn)染SRF真核表達(dá)質(zhì)粒，誘導(dǎo)其向胰島素分泌細(xì)胞分化轉(zhuǎn)染質(zhì)粒為pCMV-SRF質(zhì)粒，其他同實(shí)施例I。5.利用雙硫腙染色方法鑒定胰島素分泌細(xì)胞，同實(shí)施例I。6.利用RT-PCR的方法檢測(cè)胰島素分泌細(xì)胞特異性基因insulin的mRNA表達(dá)情況。誘導(dǎo)分化后，利用Trizol法提取培養(yǎng)細(xì)胞的總RNA，提取的總RNA用核酸定量?jī)x檢測(cè)并定量。以mRNA為模板，采用Oligo (dT)為引物，利用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。設(shè)計(jì)insulin的引物，由Invitrogen生物技術(shù)公司合成。引物序列如下正向引物3 :5 ’ -CAGCCGCAGCCTTTGTGAA-3 ’反向引物3 :5 ’ -TCCACAATGCCACGCTTCTG-3 ’利用反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板在95 V 5min, 32個(gè)循環(huán)擴(kuò)增(95 V 30s、55. I0C 45s, 72 °C 60s)，72。。延伸IOmin的條件下進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果如圖5所示(A)代
表誘導(dǎo)培養(yǎng)基組合三步誘導(dǎo)法誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞分化后，胰島素基因mRNA水平；(B)代表誘導(dǎo)培養(yǎng)基組合三步誘導(dǎo)法與轉(zhuǎn)錄因子SRF共同誘導(dǎo)人間充質(zhì)干細(xì)胞分化后，胰島素基因mRNA水平。結(jié)果說(shuō)明在誘導(dǎo)培養(yǎng)基組合與轉(zhuǎn)錄因子SRF共誘導(dǎo)之后胰島素的mRNA水平較高。實(shí)施例3一種體外誘導(dǎo)人間充質(zhì)干細(xì)胞分化為胰島素分泌細(xì)胞的方法，本實(shí)施例采用的是人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞，具體步驟如下I.人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)，同實(shí)施例I。取抗凝臍血和等體積的PBS混勻，利用Ficoll分離液分離單個(gè)核細(xì)胞層，PBS清洗，細(xì)胞計(jì)數(shù)，以2X IO7細(xì)胞密度接種，置于37°C、體積分?jǐn)?shù)為5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。于貼壁2小時(shí)后更換新鮮培養(yǎng)液，待細(xì)胞達(dá)80%融合時(shí)以O(shè). 25%胰酶和O. 02%EDTAl I混合笑話，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。2.含有SRF基因的重組真核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建，同實(shí)施例I。3.誘導(dǎo)人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞向胰腺始祖細(xì)胞分化，同實(shí)施例I。4.在胰腺始祖細(xì)胞中轉(zhuǎn)染SRF真核表達(dá)質(zhì)粒，誘導(dǎo)其向胰島素分泌細(xì)胞分化轉(zhuǎn)染質(zhì)粒為pcDNA-SRF質(zhì)粒，同實(shí)施例I。5.利用RT-PCR的方法檢測(cè)胰島素分泌細(xì)胞特異性基因insulin的mRNA表達(dá)情況，同實(shí)施例I。6.利用胰島素(INS)酶聯(lián)免疫分析(ELISA)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)培養(yǎng)基中胰島素分泌量誘導(dǎo)分化完成之后，吸取誘導(dǎo)培養(yǎng)基，PBS輕洗3遍，換用無(wú)血清H-DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)12h。收集培養(yǎng)基上清，-80°C保存?zhèn)錅y(cè)。
利用胰島素酶聯(lián)免疫分析試劑盒(R&D)檢測(cè)步驟如下 (I)標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋和加樣在酶標(biāo)包被板上設(shè)標(biāo)準(zhǔn)品孔10孔，在第一、第二孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品100 μ L，然后在第一、第二孔中加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50 μ L，混勻；然后從第一孔、第二孔中各取100 μ L分別加到第三孔、第四孔，再在第三、第四孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50 μ L，混勻；然后在第三、第四孔中先各取50 μ L棄掉,再各取50 μ L分別加到第五、第六孔中，再分別加入50 μ L標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液，混勻；混勻后從第五、第六孔中各取50 μ L分別加入到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分別加入標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50yL，混勻；混勻后從第七第八空中各取50 μ L分別加到第九、第十空中，加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50 μ L混勻；混勻后各取50yL棄掉。(稀釋后沒(méi)孔加樣量都為50μ 1，濃度分別為12mU/L，8mU/L，4mU/L，2，mU/L,ImU/L),其余步驟與下面相同,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。(2)加樣分別設(shè)空白孔(空白孔不加樣品和酶標(biāo)試劑，其余步驟相同)、待測(cè)樣品孔。在酶標(biāo)包被板上待測(cè)樣品孔先加樣品稀釋液40 μ L，然后再加待測(cè)樣品10 μ L。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，混勻。(3)溫育用封板膜封板后置于37°C,30min。(4)配液將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后備用。(5)洗滌小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，加滿洗滌液，靜置30s后棄去，重復(fù)5次。(6)加酶每孔加入酶標(biāo)試劑50 μ L，空白孔除外。(7)溫育同 3。(8)洗滌同 5。(9)顯色每孔先加入顯色劑Α50 μ L，再加入顯色劑B 50 μ L，輕輕混勻，37°C避光顯色15min。(10)終止每孔加終止液50 μ L，終止反應(yīng)(此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色)。(11)測(cè)定以空白孔調(diào)零，450nm波長(zhǎng)依序測(cè)定各孔吸光度。(12)計(jì)算根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出每孔樣品的胰島素含量。結(jié)果如圖6所示，利用本發(fā)明方法所誘導(dǎo)分化的細(xì)胞能夠產(chǎn)生胰島素，并且，與只利用三種誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)細(xì)胞分化組相比，同時(shí)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行SRF基因修飾后的分化細(xì)胞產(chǎn)生胰島素量顯著升高，從5. 64±1. 04mU/L上升至12. 98±1. 86mU/L。
權(quán)利要求
1.一種體外誘導(dǎo)人間充質(zhì)干細(xì)胞分化為胰島素分泌細(xì)胞的方法，其特征在于包括以下步驟 (1)構(gòu)建含有SRF基因的重組真核表達(dá)質(zhì)粒； (2)誘導(dǎo)人間充質(zhì)干細(xì)胞向Nestin+細(xì)胞分化當(dāng)步驟(I)中細(xì)胞至70-80%融合時(shí)，去除原有培養(yǎng)基，加入誘導(dǎo)培養(yǎng)基I培養(yǎng)5 6小時(shí)； 所述步驟⑵中所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基I為含有5mmol/L β -巰基乙醇和2%胎牛血清的DMEM-高糖培養(yǎng)基，含25mM葡萄糖； (3)誘導(dǎo)Nestin+細(xì)胞向胰腺始祖細(xì)胞分化在步驟(2)獲得細(xì)胞中，去除步驟(2)中誘導(dǎo)培養(yǎng)基I，加入誘導(dǎo)培養(yǎng)基II培養(yǎng)7 8天； 步驟(3)中所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基II為含有5 20nmol/L bFGF、5 20nmol/L EGF,2%B27、0. 1% β-巰基乙醇和2%胎牛血清的DMEM-高糖培養(yǎng)基，含25mM葡萄糖； (4)誘導(dǎo)胰腺始祖細(xì)胞向胰島素分泌細(xì)胞分化在步驟(3)獲得細(xì)胞中，去除步驟(2)中誘導(dǎo)培養(yǎng)基II，加入誘導(dǎo)培養(yǎng)基III，同時(shí)轉(zhuǎn)染步驟(I)中的SRF基因的重組真核表達(dá)質(zhì)粒，培養(yǎng)7 8天； 步驟⑷中所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基III為含有5 20nmol/L Exendin_4、5 20mmol/L尼克酰胺、2% B27和2%胎牛血清的DMEM-高糖培養(yǎng)基，含25mM葡萄糖。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的體外誘導(dǎo)人間充質(zhì)干細(xì)胞分化為胰島素分泌細(xì)胞的方法，其特征在于所述步驟(I)中構(gòu)建含有SRF基因的重組真核表達(dá)質(zhì)粒，真核表達(dá)載體為pEGFP、pcDNA3. I 或 pCMV。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的體外誘導(dǎo)人間充質(zhì)干細(xì)胞分化為胰島素分泌細(xì)胞的方法，其特征在于步驟(2)中所述的人間充質(zhì)干細(xì)胞包括羊水、骨髓、胎盤、臍帶血或脂肪組織來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的體外誘導(dǎo)人間充質(zhì)干細(xì)胞分化為胰島素分泌細(xì)胞的方法，其特征在于步驟(4)中所述的SRF真核表達(dá)質(zhì)粒為去內(nèi)毒素的質(zhì)粒，質(zhì)粒超螺旋帶型清晰，A260/A280 = I. 8 2. O。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的體外誘導(dǎo)人間充質(zhì)干細(xì)胞分化為胰島素分泌細(xì)胞的方法，其特征在于所述步驟⑶中所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基II為含有10nmol/L bFGF、10nmol/L EGF,2%B27、0. 1% β-巰基乙醇和2%胎牛血清的DMEM-高糖培養(yǎng)基，含25mM葡萄糖。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的體外誘導(dǎo)人間充質(zhì)干細(xì)胞分化為胰島素分泌細(xì)胞的方法，其特征在于所述步驟⑷中所述的誘導(dǎo)液培養(yǎng)基III為含有10nmol/L Exendin-4、10mmol/L尼克酰胺、2% B27和2%胎牛血清的DMEM-高糖培養(yǎng)基，含25mM葡萄糖。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體地說(shuō)是涉及一種體外誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞向胰島素分泌細(xì)胞分化的方法，技術(shù)方案構(gòu)建SRF基因的重組真核表達(dá)質(zhì)粒，真核表達(dá)載體包括是pEGFP、pcDNA或pCMV；將人間充質(zhì)干細(xì)胞首先預(yù)誘導(dǎo)為nestin+細(xì)胞，進(jìn)一步誘導(dǎo)為胰腺始祖細(xì)胞，然后將含有SRF基因的真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到上述細(xì)胞中，最后誘導(dǎo)為胰島素分泌細(xì)胞。本發(fā)明可為糖尿病的細(xì)胞治療提供新的種子細(xì)胞來(lái)源，為間充質(zhì)干細(xì)胞的定向誘導(dǎo)分化為胰島素分泌細(xì)胞和其臨床應(yīng)用提供新的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)，并為與之相關(guān)的藥物開發(fā)和篩選提供了新的模型。
文檔編號(hào)C12N5/10GK102618500SQ20121007625
公開日2012年8月1日 申請(qǐng)日期2012年3月21日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月21日
發(fā)明者俞如發(fā), 張同存, 王楠 申請(qǐng)人:天津科技大學(xué)