專利名稱：利用玉米花色素苷調(diào)節(jié)基因Lc快速培育不育水稻的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體說，是利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將玉米花色素苷調(diào)節(jié)基因Lc導(dǎo)入水稻植株并表達(dá)，從而培育出不育水稻植株的方法。
背景技術(shù)：
水稻是世界上最重要的糧食作物之一。全球一半以上的人口以稻米為主要食物來源。水稻也是我國最重要的糧食作物。我國作為ー個水稻種植與消費(fèi)的大國，水稻的產(chǎn)量一直受到國家、科學(xué)界及民眾的關(guān)注。用兩種遺傳特性不同的品種作為父母本進(jìn)行雜交，得到的雜種第一代，往往比父母本有較強(qiáng)的生長勢、適應(yīng)性、抗逆性和生產(chǎn)力，這叫做雜種優(yōu)勢。雜交水稻一般可比常規(guī)水稻增產(chǎn)20%(白德明，作物研究，1990，4(1) :26-28)。近年來，我國雜交水稻年種植面積占總水稻面積的57%，即1600萬公頃。全國雜交水稻平均產(chǎn)量為7.2噸/公頃，大約比常規(guī)水稻單產(chǎn)多1.4噸/公頃。我國毎年種植雜交水稻所增產(chǎn)的糧食可多養(yǎng)活7000萬人ロ。雜交水稻為解決中國糧食問題，使中國成為最大的糧食自給國發(fā)揮了關(guān)鍵性作用(龍軍，光明日報，2011，7，12)。水稻屬于自花授粉作物，正常水稻進(jìn)行雜交必須人為去除一朵花中的雄蕊或雌蕊。國外早在幾十年前，就有人從事雜交水稻的研究，但一直未能用于生產(chǎn)。1964年，我國“雜交水稻之父”袁隆平院士在我國率先開展雜交水稻研究。袁隆平院士課題組在1964年至1965年發(fā)現(xiàn)6株天然雄性不育的植株(袁隆平，科學(xué)通報，1966，11 (4) : 185-185)，以及在1970年他的助手再次發(fā)現(xiàn)水稻不育植株，都為三系雜交水稻成功應(yīng)用奠定了非常重要的基礎(chǔ)。1973年，石明松在農(nóng)墾58水稻大田中發(fā)現(xiàn)了ー種不同于袁隆平院士早年發(fā)現(xiàn)的水稻不育植株。經(jīng)以后研究得知，石明松發(fā)現(xiàn)的水稻不育植株屬于光溫敏雄性不育水稻。這種類型不育株的發(fā)現(xiàn)為今天利用兩系雜交方法培育超級雜交稻研究做出了極其重要的貢獻(xiàn)。目前國內(nèi)外一直都非常重視對水稻不育現(xiàn)象的研究。最近，我國華中農(nóng)業(yè)大學(xué)張啟發(fā)院士課題組和華南農(nóng)業(yè)大學(xué)莊楚雄研究員課題組分別在國際著名雜志，發(fā)表控制水稻光敏感核不育基因的研究成果(Ding et al, http://www. pnas. org/content/109/7/2654; Zhou et al，Cell Research，2012，22 :649-660)。這些研究成果為指導(dǎo)兩系雜交稻育種，以及深入利用水稻雜種優(yōu)勢都具有深遠(yuǎn)的意義。在我國兩次不同類型水稻不育植株的發(fā)現(xiàn)以及隨后的研究，都對雜交水稻在生產(chǎn)中的應(yīng)用起到了極大的推動作用。盡管水稻不育屬于ー種異常的生理現(xiàn)象，但是正是由于對水稻不育機(jī)理的研究成果有可能進(jìn)ー步推進(jìn)雜交水稻的應(yīng)用。因此，對水稻不育機(jī)理探索一直是科學(xué)家們特別感興趣的研究領(lǐng)域。為了更多探索水稻不育的機(jī)理，本領(lǐng)域需要建立各種方法設(shè)法獲得不育水稻植株的方法。
1989 年，Ludwig 從玉米中分離獲得了 Lc 基因(Ludwig et al, Proc Natl AcadSc i，1989，86 (18) : 7092-7096)。Lc基因參與調(diào)控葉脈、葉舌、葉耳、穎片、內(nèi)稃和果皮等組織中花色素苷的產(chǎn)生，是第I個在植物中發(fā)現(xiàn)的具有bHLH結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子，屬于R/B基因家族成員。目前利用Lc基因進(jìn)行轉(zhuǎn)化研究的報道較多，但人們都是單獨(dú)利用該基因或與玉米另ー個轉(zhuǎn)錄因子基因Cl、或是Pl—同導(dǎo)入某種作物中，主要都是試圖改變花色或果皮的顔色，同時設(shè)法増加果實(shí)中的類黃酮物質(zhì)含量。Lloyd等在1992年將Lc基因轉(zhuǎn)入擬南芥和煙草中，轉(zhuǎn)Lc基因的煙草花色素表達(dá)量得到提高；轉(zhuǎn)Lc基因的擬南芥在葉、莖、萼片中花色素含量增加(Lloyd et al，Science, 1992，258:1773-1775)。Quattrocchio在1993將Lc基因?qū)氚珷颗?，愈傷組織和花都呈現(xiàn)紅色(Quattrocchio,Plant Cell, 1993，5 (11) : 1497-1512);在番茄中，Lc基因能夠增強(qiáng)花色素苷的積累，轉(zhuǎn)基因植株呈現(xiàn)明顯的紫色(Goldsbrough et al,Plant J, 1996, 9:927-933);在 1998年，Bradley等發(fā)現(xiàn)含有Lc基因矮牽牛葉片為紫色，營養(yǎng)和生殖器官中的花色素苷含量都有所提高，同時還分析了參與類黃酮生物合成相關(guān)酶的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，較多與黃酮類物質(zhì)合成相關(guān)酶蛋白的基因表達(dá)水平也明顯提高(Bradley et al, Plant, 1998, 13 (3) :381-392)；1999年，Bradley等又將Lc基因?qū)胙蠼酃：吞祗每参铮D(zhuǎn)基因后代盡管無明顯性狀改變，但是轉(zhuǎn)基因洋桔梗類黃酮生物合成途徑中的酶基因表達(dá)增加(Bradley et al, PlantSci, 1999，140:31-39) ；De Vos等將Lc和Cl 一同導(dǎo)入馬鈴薯，塊莖中花色素含量增加，塊莖的皮變?yōu)樽霞t色(De Vos et al, Polyphenols Commun, 2000，1:25-26) ;Bovy 等將 Lc 和Cl 一同導(dǎo)入番茄，轉(zhuǎn)基因番茄葉片為紫色，在果肉中黃酮醇含量提高，總黃酮醇含量為對照的20倍，參與類黃酮生物合成相關(guān)酶基因表達(dá)水平也有提高(Bovy et al,The Plant CellOnline, 14，2509-2526) ；Ray等將Lc基因?qū)胲俎?，在?qiáng)光和低溫條件下培養(yǎng)，植株表現(xiàn)紫紅色(Ray et al, Plant Physiol, 2003, 132:1448-1463) ；Li 等人報道了將 Lc 基因?qū)腚p色貝母，轉(zhuǎn)基因植株根、莖、葉中出現(xiàn)紅色(Li et al, Plant Cell R印，2005，23:716-720);Li等將Lc基因?qū)胩O果，愈傷組織、葉、莖變成紅色和紫紅，同時發(fā)現(xiàn)類黃酮生物合成途徑中的ー些酶基因表達(dá)水平提高，類黃酮中的花色素苷和原花色素含量也明顯增加(Liet al, Planta, 2007，226:1243-1254)。Yun-Jeong Han 等人為使匍匍翦股穎(creepingbentgrass)更具有觀賞價值，將Lc和Pl兩種基因轉(zhuǎn)入匍匐翦股穎，使匍匐翦股穎轉(zhuǎn)變?yōu)樽仙?Han et al, Plant Cell Reports, 2009，28，397-406)。另外，Henryk Flachowsky 等人發(fā)現(xiàn)，異源表達(dá)Lc基因的轉(zhuǎn)基因蘋果樹，其生長習(xí)性發(fā)生改變，抵抗蘋果黑星病和火疫病的能力也相應(yīng)有所提高(Flachowsky et al，Planta, 231 (3) :623-635)。本實(shí)驗室也曾經(jīng)將Lc基因在花椰菜花葉病毒35S基因啟動子引導(dǎo)下轉(zhuǎn)化煙草，獲得24棵轉(zhuǎn)基因煙草植株。轉(zhuǎn)基因煙草植株花冠筒、冠檐、花絲顏色都比對照有明顯加深的現(xiàn)象(李建粵等，上海師范大學(xué)學(xué)報，2008，37 (6) : 613-617)，但是在實(shí)驗中我們從轉(zhuǎn)基因煙草植株上都順利地收獲了第一代種子。在將第一代種子種下后又成功收獲到第二代種子。在前人和本實(shí)驗室關(guān)于利用Lc基因?qū)ψ魑镞M(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化的研究中從未見涉及引起作物不育現(xiàn)象的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之ー是提供ー種快速獲得不育水稻的方法。 本發(fā)明還將玉米花色素苷調(diào)節(jié)基因Lc用于培育和篩選不育水稻。
本發(fā)明還提供了 ー種用于培育不育水稻重組表達(dá)載體。本發(fā)明將玉米花色素苷調(diào)節(jié)基因Lc用于培育和篩選不育水稻，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將玉米花色素苷調(diào)節(jié)基因Lc導(dǎo)入水稻植株并表達(dá)，從而培育出不育水稻植株。本發(fā)明還提供了ー種利用玉米花色素苷調(diào)節(jié)基因Lc快速獲得不育水稻的方法，該方法包括以下步驟(I)將啟動子引導(dǎo)的玉米花色素苷調(diào)節(jié)基因Lc插入載體，得到重組表達(dá)載體，并用所述的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化水稻；所述啟動子為花特異表達(dá)基因的啟動子或組成型基因的啟動子；可利用根瘤農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻遺傳轉(zhuǎn)化法將表達(dá)載體的T-DNA區(qū)段轉(zhuǎn)入受體水稻中；(2)鑒定選取檢測結(jié)果為陽性的轉(zhuǎn)基因水稻；鑒定方法為 利用PCR鑒定轉(zhuǎn)基因水稻植株中存在玉米花色素苷調(diào)節(jié)基因Lc ;利用RT-PCR分析確定玉米花色素苷調(diào)節(jié)基因Lc在轉(zhuǎn)基因水稻植株中能夠表達(dá)；(3)選取幼穗穎花呈紅色或者抽穗后穎花花藥呈粉紅色的轉(zhuǎn)基因水稻植株，即為不育水稻植株。步驟(I)中，重組表達(dá)載體的制備方法包括以下步驟將玉米花色素苷調(diào)節(jié)基因Lc插入到載體的含有左右邊界序列的T-DNA中，并且在玉米花色素苷調(diào)節(jié)基因Lc的上下游分別連接啟動子和終止子；啟動子為花特異表達(dá)基因的啟動子或組成型基因的啟動子。組成型基因的啟動子選自選自花椰菜花葉病毒的35S基因啟動子片段，或是玉米泛素蛋白基因的啟動子片段，或是水稻肌動蛋白基因的啟動子片段。終止子為胭脂堿合成酶基因終止子或是花椰菜花葉病毒的35S基因終止子。載體可選用pCAMBIA1301質(zhì)?；騪CAMBIA1300質(zhì)粒。本發(fā)明還提供了一種用于培育不育水稻重組表達(dá)載體，它是由組成型基因的啟動子或花特異表達(dá)基因的啟動子引導(dǎo)玉米花色素苷調(diào)節(jié)基因Lc構(gòu)建的表達(dá)載體，包括如下序列(I)啟動子；(2)玉米花色素苷調(diào)節(jié)基因Lc ；(3)終止子；啟動子位于玉米花色素苷調(diào)節(jié)基因Lc上游，終止子位于玉米花色素苷調(diào)節(jié)基因Lc下游；所述啟動子為組成型基因的啟動子或花特異表達(dá)基因的啟動子。組成型基因的啟動子選自花椰菜花葉病毒的35S基因啟動子、玉米泛素蛋白基因的啟動子、水稻肌動蛋白基因的啟動子或者花特異表達(dá)基因的啟動子。終止子為胭脂堿合成酶基因終止子或者花椰菜花葉病毒的35S基因終止子。這種重組表達(dá)載體還含有內(nèi)切酶敏感序列或者標(biāo)記基因序列。本發(fā)明通過將含有玉米花色素苷調(diào)節(jié)基因Lc在組成型基因的啟動子或花特異表達(dá)基因的啟動子引導(dǎo)下構(gòu)成的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化水稻，轉(zhuǎn)基因水稻的穎花不僅會出現(xiàn)類似前人研究中呈現(xiàn)的花色變化的現(xiàn)象，如幼嫩的穎花或抽穗后退化的穎花呈現(xiàn)紅色，抽穗后的花藥會呈粉紅色的現(xiàn)象，還會使這些花器官有顏色變化的水稻植株表現(xiàn)為完全不育的現(xiàn)象。本發(fā)明為獲得不育水稻提供了新思路。本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供ー種快速獲得不育水稻的方法，以滿足目前對水稻不育機(jī)理研究中需要快速獲得不育水稻的要求，以及在對由Lc基因?qū)е滤静挥龣C(jī)理研究獲得的成果有可能被應(yīng)用于今后雜交水稻的生產(chǎn)中。


圖I是本發(fā)明使用的表達(dá)載體pCAMBIA1301-35S-Lc-N0S的T-DNA結(jié)構(gòu)圖。LB、RB為T-DNA的左右邊界；35S-pro、35S-ter為花椰菜花葉病毒35S基因啟動子和終止子；Nos-ter為胭脂堿合成酶基因終止子；Lc為花色素苷調(diào)節(jié)基因；hpt為潮霉素抗性基因；gus為β-葡萄糖醛酸糖苷酶基因。圖2是pCAMBIA1301質(zhì)粒的T-DNA結(jié)構(gòu)圖。圖中LB、RB為T-DNA的左右邊界；35S-pro、35S-ter為花椰菜花葉病毒35S基因啟動子和終止子；hpt為潮霉素抗性基因；gus為β -葡萄糖醛酸糖苷酶基因；Xh為XhoI的縮寫；E為EcoRI的縮寫；Sa為SacI的縮寫；K為KpnI的縮寫；S為SmaI的縮寫；B為BamHI的縮寫；X為XbaI的縮寫；Sal為SalI 的縮與；P為PstI的縮與；H為HindIII的縮與。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)ー步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。構(gòu)建表達(dá)載體和水稻轉(zhuǎn)化操作中涉及的常規(guī)PCR擴(kuò)增、限制性內(nèi)切酶酶切和連接、根瘤農(nóng)桿菌培養(yǎng)轉(zhuǎn)化等方法主要參考《分子克隆實(shí)驗指南》(薩姆布魯克J等，分子克隆實(shí)驗指南(第二版)，科學(xué)出版社，1992)。實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例I本實(shí)施例是為了說明構(gòu)建含有花椰菜花葉病毒的35S基因啟動子引導(dǎo)玉米花色素苷調(diào)節(jié)基因Lc表達(dá)載體的方法以及所獲載體的結(jié)構(gòu)組成，構(gòu)建過程如下(I)在pCAMBIA1301 (來自于中科院上海植物生理與生態(tài)研究所王宗陽研究員)質(zhì)粒載體(圖2) NOS終止子兩端設(shè)計PCR引物，上游和下游引物分別引入KnpI和EcoR I酶切位點(diǎn)；PCR引物的序列是5’ ggtaccgtttcttaagattgaatcctgttg3 (下劃線為KnpI酶切位點(diǎn))和 5，gaattcttcccgatctagtaacatagatg3 (下劃線為 EcoR I 酶切位點(diǎn))。PCR 條件94°C預(yù)變性5min、94°C變性30s、58°C退火30s，72°C合成30min，35個循環(huán)后，72°C延伸5min。圖2中LB、RB為T-DNA的左右邊界；35S-pro、35S_ter為花椰菜花葉病毒35S基因啟動子和終止子；hpt為潮霉素抗性基因；gus為β -葡萄糖醛酸糖苷酶基因；Xh為XhoI的縮寫；E為EcoRI的縮寫；Sa為SacI的縮寫；K為KpnI的縮寫；S為SmaI的縮寫；B為BamHI的縮寫；X為XbaI的縮寫；Sal為SalI的縮寫；P為PstI的縮寫；H為Hind III的縮寫。將PCR產(chǎn)物與T載體連接得到T-I載體，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，采用PCR、酶切及測序鑒定。將鑒定正確的T-ι載體和PCAMBIA1301質(zhì)粒均采用KnpI和EcoRI雙酶切，分別從電泳凝膠中回收小片段和大片段序列，采用T4DNA連接酶進(jìn)行連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，采用PCR、酶切及測序鑒定，獲得pCAMBIA1301-N0S載體；即在兩個35S基因啟動子之間插入ー個NOS終止子。(2)參照GenBank公布的Lc基因序列(GenBank:Μ26227· I),分別在Lc基因編碼區(qū)起始密碼子和終止密碼子處設(shè)計ー對引物，上游引物含有XbaI酶切位點(diǎn)，下游引物含有KnpI酶切位點(diǎn)。從已授粉后的玉米雌花序中提取RNA，利用RT-PCR克隆花色素苷調(diào)節(jié)基因Lc0PCR 引物的序列是 5’ tctagaatggcgctttcagcttccc3’ (下劃線為 XbaI 酶切位點(diǎn))和5’ ggtacctcaccgcttccctatagc3’ (下劃線為為Knp酶切位點(diǎn))。PCR條件為94°C預(yù)變性 5min、94°C變性 45s、55°C退火 45s，72°C合成 lmin，35 個循環(huán)后，72°C延伸 lOmin。
將PCR產(chǎn)物與T載體連接得到T-2載體，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，采用PCR、酶切及測序鑒定。將鑒定正確的T-2載體和pCAMBIA1301-N0S載體均采用KnpI和Xba I雙酶切，分別從電泳凝膠中回收小片段和大片段序列，采用T4DNA連接酶進(jìn)行連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，采用PCR、酶切及測序鑒定，獲得pCAMBIA1301-Lc-N0S載體；(3)設(shè)計能夠與pCAMBIA1301質(zhì)粒上引導(dǎo)潮霉素抗性基因的花椰菜花葉病毒35S基因啟動子配對的引物，上游和下游引物分別引入Hind III和Xba I酶切位點(diǎn)，PCR擴(kuò)增后電泳回收分子量約為780bp產(chǎn)物。PCR引物的序列是.5’tctagaagagatagatttgtagagagaata3’ (下劃線為 Xba I 酶切位點(diǎn))和 5’aagcttcgacactctcgtctactcc3’ (下劃線為 Hind III酶切位點(diǎn))。PCR條件是94°C預(yù)變性5min、94°C變性45s、56°C退火30s，72°C合成45s，35個循環(huán)后，72°C延伸IOmin。將PCR產(chǎn)物與T載體連接后得到T-3載體，并轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞；通過酶切、PCR及測序鑒定。將鑒定正確的T-3載體和pCAMBIA1301-N0S載體均采用Hind III和Xba I雙酶切，分別從電泳凝膠中回收小片段和大片段序列，采用T4DNA連接酶進(jìn)行連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，采用PCR、酶切及測序鑒定，獲得本發(fā)明使用的最終表達(dá)載體pCAMBIA1301-35S-Lc-N0S，如圖I所示；其中啟動子為花椰菜花葉病毒35S基因啟動子(也可以用玉米泛素蛋白基因的啟動子、水稻肌動蛋白基因的啟動子代替花椰菜花葉病毒的35S基因啟動子)。實(shí)施例2本實(shí)施例是為了說明如何利用實(shí)施例I構(gòu)建的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化水稻。利用表達(dá)載體pCAMBIA1301-35S-Lc_N0S單質(zhì)粒對水稻進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，在培育轉(zhuǎn)基因水稻中涉及的根瘤農(nóng)桿菌培養(yǎng)及抗性愈傷組織篩選及植株再生主要參考李建粵等的方法進(jìn)行(李建粵等，西北植物學(xué)報，2008，28 (6) : 1082-1087)。實(shí)施例3本實(shí)施例是為了說明如何從轉(zhuǎn)基因水稻中獲得不育單株，具體操作如下利用CTAB法抽提實(shí)施例2所得到轉(zhuǎn)基因水稻基因組DNA，使用能夠與的目的基因Lc特異配對的引物對轉(zhuǎn)基因水稻基因組DNA進(jìn)行PCR檢測，保留PCR檢測為陽性的植株；PCR 引物分別為 5' GCCGGCTCTCTGTCGCCGGA3'和 5' GTCTGCTGCGGCCTCGCCGGTCTC3'。RT-PCR方法分析確定Lc基因在植株中能夠表達(dá)利用TRIZOL Reagent抽提PCR檢測為陽性的轉(zhuǎn)基因水稻穎花總RNA,并使用AMV First Strand cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得cDNA的第一鏈。使用能夠與目的基因Lc特異配對的引物確定Lc基因是否能夠轉(zhuǎn)錄mRNA。保留Lc基因mRNA能夠轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)基因植株。
在轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)入生殖發(fā)育早期剝?nèi)∮姿胗^察，保留幼穗穎花呈紅色的植株；或者在轉(zhuǎn)基因水稻抽穗后，通過剝開穎花見到花藥呈粉紅色的植株，這些即為不育水稻植株。在水稻抽穗后，分別取紙袋套住幼穗穎花呈紅色或抽穗后穎花花藥呈粉紅色植株的穗子和非轉(zhuǎn)基因水稻穗子；或是將幼穗穎花呈紅色或抽穗后穎花花藥呈粉紅色植株和非轉(zhuǎn)基因水稻植株放在兩個不同的環(huán)境，即達(dá)到隔離的效果。在一月后取轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因?qū)φ账舅胱佑^察可以發(fā)現(xiàn)，非轉(zhuǎn)基因水稻能夠正常結(jié)種子，而轉(zhuǎn)基因水稻呈100%不育。用pCAMBIA1300質(zhì)粒代替pCAMBIA1301質(zhì)粒作為載體，將玉米花色素苷基因Lc片段插入PCAMBIA1300質(zhì)粒；或用玉米泛素蛋白基因的啟動子、水稻肌動蛋白基因的啟動子代替花椰菜花葉病毒的35S基因啟動子；或用35S終止子代替NOS終止子，結(jié)果相同，也獲得不育水稻。在轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)入生殖發(fā)育早期剝?nèi)∮姿胗^察，選擇幼穗穎花呈紅色的植株； 或者在轉(zhuǎn)基因水稻抽穗后，選擇剝開穎花后見到花藥呈粉紅色的植株，經(jīng)檢驗，這些也均為不育水稻植株。
權(quán)利要求
1.ー種利用玉米花色素苷調(diào)節(jié)基因Lc快速獲得不育水稻的方法，其特征在于，包括如下步驟 (1)將啟動子引導(dǎo)的玉米花色素苷調(diào)節(jié)基因Lc插入載體，得到重組表達(dá)載體，并用所述的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化水稻； (2)鑒定選取檢測結(jié)果為陽性的轉(zhuǎn)基因水稻； (3)選取幼穗穎花呈紅色或者抽穗后穎花花藥呈粉紅色的植株，即為不育水稻植株。
2.權(quán)利要求I所述利用玉米花色素苷調(diào)節(jié)基因Lc快速獲得不育水稻的方法，其特征在于，步驟(I)重組表達(dá)載體的制備方法包括以下步驟 將玉米花色素苷調(diào)節(jié)基因Lc插入到載體的含有左右邊界序列的T-DNA中，并且在玉米花色素苷調(diào)節(jié)基因Lc的上下游分別連接啟動子和終止子。
3.權(quán)利要求I或2所述利用玉米花色素苷調(diào)節(jié)基因Lc快速獲得不育水稻的方法，其特征在于，所述的載體為PCAMBIA1301質(zhì)粒或pCAMBIA1300質(zhì)粒。
4.權(quán)利要求I或2所述利用玉米花色素苷調(diào)節(jié)基因Lc快速獲得不育水稻的方法，其特征在于，所述的啟動子為花特異表達(dá)基因的啟動子或組成型基因的啟動子。
5.權(quán)利要求4所述利用玉米花色素苷調(diào)節(jié)基因Lc快速獲得不育水稻的方法，其特征在于，所述組成型基因的啟動子選自花椰菜花葉病毒的35S基因啟動子片段，或是玉米泛素蛋白基因的啟動子片段，或是水稻肌動蛋白基因的啟動子片段。
6.權(quán)利要求2所述利用玉米花色素苷調(diào)節(jié)基因Lc快速獲得不育水稻的方法，其特征在于，所述的終止子為胭脂堿合成酶基因終止子或是花椰菜花葉病毒的35S基因終止子。
7.權(quán)利要求I所述利用玉米花色素苷調(diào)節(jié)基因Lc快速獲得不育水稻的方法，其特征在于，步驟(2)的鑒定方法為 利用PCR鑒定轉(zhuǎn)基因水稻植株中存在玉米花色素苷調(diào)節(jié)基因Lc ;利用RT-PCR分析確定玉米花色素苷調(diào)節(jié)基因Lc在植株中能夠表達(dá)。
8.玉米花色素苷調(diào)節(jié)基因Lc用于培育和篩選不育水稻。
9.一種用于培育不育水稻重組表達(dá)載體，其特征在于，包括以下序列 (O啟動子； (2)玉米花色素苷調(diào)節(jié)基因Lc； (3)終止子; 啟動子位于玉米花色素苷調(diào)節(jié)基因Lc上游，終止子位于玉米花色素苷調(diào)節(jié)基因Lc下游；所述啟動子為組成型基因的啟動子或花特異表達(dá)基因的啟動子。
10.權(quán)利要求9所述用于培育不育水稻重組表達(dá)載體，其特征在于，還含有內(nèi)切酶敏感序列或者標(biāo)記基因序列。
11.權(quán)利要求9所述用于培育不育水稻重組表達(dá)載體，其特征在于，所述組成型基因的啟動子選自花椰菜花葉病毒的35S基因啟動子、玉米泛素蛋白基因的啟動子、水稻肌動蛋白基因的啟動子或者花特異表達(dá)基因的啟動子；所述的終止子為胭脂堿合成酶基因終止子或是花椰菜花葉病毒的35S基因終止子。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用玉米花色素苷調(diào)節(jié)基因Lc培育不育水稻的方法。方法為(1)將啟動子引導(dǎo)的玉米花色素苷調(diào)節(jié)基因Lc插入載體，得到重組表達(dá)載體，并用所述的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化水稻；(2)鑒定選取檢測結(jié)果為陽性的轉(zhuǎn)基因水稻；(3)選取幼穗穎花呈紅色或者抽穗后穎花花藥呈粉紅色的植株，即為不育水稻植株。本發(fā)明的方法為快速獲得不育水稻提供了新思路。
文檔編號C12Q1/68GK102649966SQ201210141599
公開日2012年8月29日 申請日期2012年5月8日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月8日
發(fā)明者宋亞娥, 張濤, 戴晴, 李建粵, 李源, 沈忠偉 申請人:上海師范大學(xué)