從紅肉桃中分離提純花色素苷的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了從紅肉桃中分離提純花色素苷的方法，將紅肉桃果實粉末，用體積比乙醇：水：甲酸：三氟乙酸=70:27:2:1的混合溶液為浸提劑浸提，依次經大孔樹脂Amberlite XAD-7、葡聚糖凝膠SepHadex LH-20、大孔樹脂SP700吸附洗脫純化，真空濃縮后上反相C18色譜柱，根據(jù)所得的色譜圖收集含紅肉桃果肉中主導花色素苷組分的洗脫液，真空濃縮干燥得到花色素苷。本發(fā)明方法采用乙醇:水:甲酸:三氟乙酸浸提，依次經大孔樹脂Amberlite XAD-7、葡聚糖凝膠SepHadex LH-20、大孔樹脂SP700吸附洗脫；再利用高效液相色譜表征和收集，并濃縮，可得到純度高達92.7%的矢車菊素 3-葡萄糖苷。本發(fā)明方法能有效分離提純紅肉桃果肉內的花色素苷，得到高純度花色素苷單體，能較好地滿足各種功能食品、保健品、藥品添加劑的需求。
【專利說明】從紅肉桃中分離提純花色素苷的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及從紅肉桃中分離提純花色素苷的方法，屬于食品加工【技術領域】。
【背景技術】
[0002]紅肉桃是桃中最具特色的資源，是近幾年研宄和開發(fā)利用的重點材料。紅肉桃果肉深紅色，主導花色素苷成分為矢車菊素3-葡萄糖苷。
[0003]花色素苷一方面賦予園藝產品艷麗的外觀品質，花色和果色是商品價值的重要組成部分；另一方面，花色素苷積累水平與植物抵御各種生物和非生物脅迫，適應極端條件的能力密切相關；再者，花色素苷強有力的藥理活性和抗氧化能力在許多研宄中得到了證實，是人類和動物重要的醫(yī)藥資源。因此，分離制備高純度天然花色素苷具有重要意義。
[0004]專利文獻CN104098633A公開了一種從越橘中提取花色苷的方法，主要采取超濾膜分離純化，成品花色苷含量為52?55%，花色苷的收率為43?48%，其花色苷純度明顯偏低。專利文獻CN103601771A公開了一種從白刺果實中分離制備花色苷單體的方法，將白刺果實用甲酸甲醇溶液浸提后，濾紙過濾，再采用大孔吸附樹脂處理，然后色譜分離，可制得純度多90%的花色苷單體，花色苷純度較高。但是該專利所公開的方法并不適用于紅肉桃花色素苷的分離提純。因為花色素苷屬于酚類物質的一種，而紅肉桃果肉中除了含有大量的花色素苷以外，還同時含有大量的其它酚類物質，如綠原酸和原花青素的含量極其豐富，再加上酚類物質結構較相似，故分離提純比較困難。文獻《荔枝果皮中花色苷的分離純化、結構鑒定及其抗氧化活性》公開了利用大孔樹脂吸附后進行了葡聚糖凝膠的二次純化分離花色苷的方法，花色素苷的純度也僅為82.7%。因此，如果按現(xiàn)有技術對紅肉桃花色素苷進行簡單的一種性質的大孔樹脂的一次吸附洗脫或者僅再結合葡聚糖凝膠的再次純化，并不能得到純度高的花色素苷單體。
【發(fā)明內容】
[0005]本發(fā)明的目的是提供一種從紅肉桃中分離提純花色素苷的方法，該方法能從紅肉桃中分離獲得高純度的天然花色素苷。
[0006]為達到上述目的，本發(fā)明采用的技術方案為:一種從紅肉桃中分離提純花色素苷的方法，其步驟包括:
(1)紅肉桃果肉材料的制備:取紅肉桃果實果肉，液氮研磨成粉，-70°C保存?zhèn)溆茫?br>
(2)紅肉桃果肉花色素苷粗提液A的制備:取一定量的紅肉桃果實粉末，用體積比乙醇:水:甲酸:三氟乙酸=70:27:2:1的混合溶液為浸提劑，浸提劑體積:粉末重量=2mL:lg，避光超聲波提取，然后在4°C下10000 rpm離心lOmin，取上清液于30°C下真空濃縮至無乙醇，得到粗提液A ;
(3)紅肉桃果肉花色素苷一次純化液B的制備:取粗提液A用已活化的大孔樹脂Amberlite XAD-7吸附，待吸附結束，用三氟乙酸酸化的PH值調節(jié)到2_3的80%乙醇將樹脂柱上吸附的花色素苷洗脫下來，于30°C下真空濃縮至無乙醇，制得一次純化液B ; (4)紅肉桃果肉花色素苷粗提液C的制備:取一次純化液B用已處理平衡好的葡聚糖凝膠S印hadex LH-20吸附，待吸附結束，用三氟乙酸酸化的PH值調節(jié)到2_3的20%甲醇將樹脂柱上吸附的花色素苷洗脫下來，于30°C下真空濃縮至無甲醇，制得二次純化液C ;
(5)紅肉桃果肉花色素苷提取濃縮液的制備:取二次純化液C用已活化的大孔樹脂SP700吸附，待吸附結束，用三氟乙酸酸化的PH值調節(jié)到2-3的60%乙醇將樹脂柱上吸附的花色素苷洗脫下來，收集洗脫液于30°C下真空濃縮至無乙醇，得到花色素苷提取濃縮液；
(3)利用高效液相色譜表征、分離提純花色素苷單體:取一定量的花色素苷提取濃縮液，上反相C18色譜柱，分離條件為:
流動相A:甲醇:磷酸:三氟乙酸=97:2:1V/V ；
流動相B:水:磷酸:三氟乙酸=97:2:1V/V ；
流速:1.0 ml/min ；
波長:515 nm ；
柱溫:25°C ；
梯度沖洗:0-17 min，流動相B從95-44% ； 17-20 min，流動相B從44-95% ；
用紫外檢測器檢測洗脫液，根據(jù)所得的色譜圖收集含紅肉桃果肉中主導花色素苷組分的洗脫液，將洗脫液于30°C下真空濃縮干燥得到花色素苷單體。
[0007]進一步的，所述花色素苷為矢車菊素3-葡萄糖苷。
[0008]進一步的，所述紅肉桃果實為成熟的‘北京一線紅’品種果實。
[0009]紅肉桃為新型桃資源，其果肉含豐富的花色素苷，可進行提取加工，從而提高紅肉桃鮮果的綜合利用率；本發(fā)明方法利用紅肉桃‘北京一線紅’果肉為材料，采用乙醇:水:甲酸:三氟乙酸浸提，經大孔樹脂Amberlite XAD-7吸附，三氟乙酸酸化的80%乙醇洗脫，得到一次純化液；再經葡聚糖凝膠S印Hadex LH-20吸附，三氟乙酸酸化的20%甲醇洗脫，主要除去原花青素物質；再經大孔樹脂SP700吸附，三氟乙酸酸化的60%乙醇洗脫，主要除去綠原酸物質；并真空濃縮；然后利用高效液相色譜表征收集濃縮，可得到純度高達92.7%的矢車菊素3-葡萄糖苷。本發(fā)明方法能有效分離提純紅肉桃果肉內的花色素苷，得到高純度花色素苷單體，能較好地順應和滿足各種功能食品，保健品、藥品添加劑的需求，極大的提高了紅肉桃鮮果的綜合利用率，提高和開拓了新型桃資源紅肉桃的競爭力和市場。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0010]圖1為實施例1中紅肉桃果肉花色素苷粗提液A在515nm波長下的高效液相色譜圖。
[0011]圖2為實施例1中紅肉桃果肉花色素苷粗提液A在280nm波長下的高效液相色譜圖。
[0012]圖3為實施例1中制得的矢車菊素3-葡萄糖苷單體成品在515nm波長下的高效液相色譜圖。
[0013]圖4為實施例1中制得的矢車菊素3-葡萄糖苷單體成品在280nm波長下的高效液相色譜圖。
[0014]圖5為對比例I中制得的矢車菊素3-葡萄糖苷單體成品在515nm波長下的高效液相色譜圖。
[0015]圖6為對比例I中制得的矢車菊素3-葡萄糖苷單體成品在280nm波長下的高效液相色譜圖。
[0016]圖7為對比例2中制得的矢車菊素3-葡萄糖苷單體成品在515nm波長下的高效液相色譜圖。
[0017]圖8為對比例2中制得的矢車菊素3-葡萄糖苷單體成品在280nm波長下的高效液相色譜圖。下面結合附圖對本發(fā)明的實施方式做進一步說明。
【具體實施方式】
[0018]試劑與設備:
大孔樹脂SP700、葡聚糖凝膠SepHadex LH-20、大孔樹脂Amberlite XAD-7 ；
大孔樹脂SP700活化方法:用去離子水浸泡，上樣，用去離子水過柱清洗，待用。
[0019]葡聚糖凝膠SepHadex LH-20使用前處理:浸泡于70%乙醇中充分攪拌過夜，抽干然后濕態(tài)裝柱，用一倍柱體積的70%乙醇淋洗，再用水洗凈乙醇，最后用兩倍柱體積的20%甲醇平衡，待用。
[0020]大孔樹脂Amberlite XAD-7活化方法:用95%的乙醇浸泡，上樣，用三倍柱體積的95%乙醇淋洗，再用水洗凈乙醇，待用。
[0021]標準品矢車菊素3-葡萄糖苷，純度為彡98% (sigma);乙酸乙酯、乙醇、三氟乙酸、甲醇、磷酸試劑均為色譜純。
[0022]真空濃縮儀；超聲波清洗器；離心機；Agilent高效液相色譜系統(tǒng):1100系列，VffD紫外檢測器，Agilent ZORBAX SB-C18 色譜分析柱(4.6X250 mm，5ym)。
[0023]實施例1
本發(fā)明從紅肉桃中分離提純花色素苷的方法，其步驟包括:
(1)紅肉桃果肉材料的制備:取‘北京一線紅’品種果實果肉，液氮研磨成粉，-70°C保存?zhèn)溆茫?br>
(2)紅肉桃果肉花色素苷粗提液A的制備:用體積比乙醇:水:甲酸:三氟乙酸=70:27:2:1的混合溶液為浸提劑，取紅肉桃果實粉末20g加入40ml浸提劑中，避光超聲波提取，然后在4°C下10000 rpm離心lOmin，取上清液于30°C下真空濃縮至無乙醇，得到粗提液A ；
(3)紅肉桃果肉花色素苷一次純化液B的制備:取粗提液A用已活化的大孔樹脂Amberlite XAD-7吸附，待吸附結束，用三氟乙酸酸化的PH值調節(jié)到2_3的80%乙醇將樹脂柱上吸附的花色素苷洗脫下來，于30°C下真空濃縮至無乙醇，制得一次純化液B ;
(4)紅肉桃果肉花色素苷二次純化液C的制備:取一次純化液B用已處理平衡好的葡聚糖凝膠S印hadex LH-20吸附，待吸附結束，用三氟乙酸酸化的PH值調節(jié)到2_3的20%甲醇將樹脂柱上的花色素苷洗脫下來，取上清液于30°C下真空濃縮至無甲醇，制得二次純化液C ；
(5)紅肉桃果肉花色素苷提取濃縮液的制備:二次純化液C用已活化的大孔樹脂SP700吸附，待吸附結束，用三氟乙酸酸化的PH值調節(jié)到2-3的60%乙醇將樹脂柱上吸附的花色素苷洗脫下來，收集洗脫液于30°C下真空濃縮至無乙醇，得到花色素苷提取濃縮液；
(3)利用高效液相色譜表征、分離提純花色素苷單體:取一定量的花色素苷提取濃縮液，上反相C18色譜柱，分離條件為:
流動相A:甲醇:磷酸:三氟乙酸=97:2: 1V/V ；
流動相B:水:磷酸:三氟乙酸=97:2:1V/V ；
流速:1.0 ml/min ；
波長:515 nm ；
柱溫:25°C ；
梯度沖洗:0-17 min,流動相B從95-44% ； 17-20 min,流動相B從44-95% ；
用紫外檢測器檢測洗脫液，根據(jù)所得的色譜圖收集含紅肉桃果肉中主導花色素苷組分的洗脫液，將洗脫液于30°C下真空濃縮干燥得到花色素苷單體。
[0024]將粗提液A、花色素苷單體以浸提劑溶解定容，再上反相C18色譜柱，色譜條件同上進行色譜分析；改變波長為280nm，其他條件同上再次進行色譜分析，得到的色譜圖為圖1-4。根據(jù)色譜圖峰面積，根據(jù)標準品外標法測定和計算純度，平行測定5次，并取平均值。結果表明制得的矢車菊素3-葡萄糖苷單體純度為92.7%。
[0025]對比例I
用體積比乙醇:水:甲酸:三氟乙酸=70:27:2:1的混合溶液為浸提劑，取紅肉桃果實粉末20g加入40ml浸提劑中，避光超聲波提取，浸提后在4°C下10000 rpm離心lOmin，取上清液；將上清液用已活化的大孔樹脂Amberlite XAD-7吸附，待吸附結束，用三氟乙酸酸化的PH值調節(jié)到2-3的80%乙醇洗脫，收集洗脫液于30°C下真空濃縮至無乙醇，得到花色素苷一次純化液。
[0026]將花色素苷一次純化液上反相C18色譜柱，分離條件為:
流動相A:甲醇:磷酸:三氟乙酸=97:2:1 (V/V)；
流動相B:水:磷酸:三氟乙酸=97:2:1 (V/V)；
流速:1.0 ml/min ；
波長:515 nm ；
柱溫:25°C ；
梯度沖洗:0-17 min,流動相B從95-44% ； 17-20 min,流動相B從44-95%。
[0027]用紫外檢測器檢測洗出液，根據(jù)所得的色譜圖收集紅肉桃果肉中主導花色素苷，將洗脫液真空濃縮干燥得到花色素苷粉末。
[0028]將花色素苷粉末以浸提劑溶解定容，再上反相C18色譜柱，色譜條件同上進行色譜分析；改變波長為280nm，其他條件同上再次進行色譜分析，得到的色譜圖為圖5-6。根據(jù)色譜圖峰面積，根據(jù)標準品外標法測定和計算純度，平行測定5次，并取平均值。結果表明制得的矢車菊素3-葡萄糖苷單體純度為70.6%。
[0029]對比例2
用體積比乙醇:水:甲酸:三氟乙酸=70:27:2:1的混合溶液為浸提劑，取紅肉桃果實粉末20g加入40ml浸提劑中，避光超聲波提取，浸提后在4°C下10000 rpm離心lOmin，取上清液；將上清液用已活化的大孔樹脂Amberlite XAD-7吸附，待吸附結束，用三氟乙酸酸化的PH值調節(jié)到2-3的80%乙醇洗脫，收集洗脫液于30°C下真空濃縮至無乙醇，得到一次純化液。取一次純化液用已處理平衡好的葡聚糖凝膠S印hadex LH-20吸附，待吸附結束，用三氟乙酸酸化的PH值調節(jié)到2-3的20%甲醇洗脫，于30°C下真空濃縮至無甲醇，制得花色素苷二次純化液；
將花色素苷二次純化液上反相C18色譜柱，分離條件為:
流動相A:甲醇:磷酸:三氟乙酸=97:2:1 (V/V)；
流動相B:水:磷酸:三氟乙酸=97:2:1 (V/V)；
流速:1.0 ml/min ；
波長:515 nm ；
柱溫:25°C ；
梯度沖洗:0-17 min,流動相B從95-44% ； 17-20 min,流動相B從44-95%。
[0030]用紫外檢測器檢測洗出液，根據(jù)所得的色譜圖收集紅肉桃果肉中主導花色素苷，將洗脫液真空濃縮干燥得到花色素苷粉末。
[0031]將花色素苷粉末以浸提劑溶解定容，再上反相C18色譜柱，色譜條件同上進行色譜分析；改變波長為280nm，其他條件同上再次進行色譜分析，得到的色譜圖為圖7-8。根據(jù)色譜圖峰面積，根據(jù)標準品外標法測定和計算純度，平行測定5次，并取平均值。結果表明制得的矢車菊素3-葡萄糖苷單體純度為81.3%。
[0032]從實施例1、對比例I和對比例2可以看出，常規(guī)的花色素苷提取方法未經其它類型大孔樹脂和葡聚糖凝膠等的結合，多次洗脫和純化，即對比例I中直接用大孔樹脂Amberlite Amberlite XAD-7吸附和三氟乙酸酸化的PH值調節(jié)到2-3的80%乙醇洗脫，而未先經葡聚糖凝膠SepHadex LH-20吸附純化，三氟乙酸酸化的20%甲醇洗脫，以及更進一步的大孔樹脂SP700吸附，三氟乙酸酸化的60%乙醇洗脫除去非花色素苷的酚類物質的方法，所得到的花色素苷純度低，僅為70.6% ；以及對比例2中僅用大孔樹脂Amberlite XAD-7吸附和三氟乙酸酸化的PH值調節(jié)到2-3的80%乙醇洗脫，再經葡聚糖凝膠S印Hadex LH-20吸附純化，三氟乙酸酸化的20%甲醇洗脫，而未經大孔樹脂SP700吸附，三氟乙酸酸化的60%乙醇洗脫的方法，所得到的花色素苷純度也不能很好地滿足提取工藝要求，僅為81.3% ;而采用本發(fā)明的方案可有效除去非花色素苷的酚類物質，得到純度高達92.7%的高純度花色素苷。
【權利要求】
1.一種液相色譜搭載VWD檢測器測定水果中糖組分的方法，其步驟包括: a、配制4種糖的混合標準溶液，繪制標準溶液曲線； b、從水果果肉中提取糖配制樣品溶液； c、在色譜條件下對樣品溶液進行高效液相色譜分析，并用VWD檢測器進行檢測； d、將樣品溶液的分析結果與標準曲線做比對，得出樣品溶液中的糖含量； 其中高效液相色譜分析的色譜條件為: 檢測器:VWD檢測器； 色譜柱:CARBOS印 CH0-620，Ca 型，6.5 mmX300 mmX1 um ； 流動相:超純水； 流速:0.5 ml/min ； 波長:190 nm ； 柱溫:80°C ； 時間:30min。
2.根據(jù)權利要求1所述的液相色譜搭載VWD檢測器測定水果中糖組分的方法，其特征在于:步驟b中從果肉中提取糖配制樣品溶液的步驟為:稱取Ig果肉，加入7 ml 80%乙醇，避光超聲波提取10 min，4°C下10000 rpm離心10 min，取上清液定容到1ml ;再吸取2ml到真空濃縮儀濃縮至干燥，用0.5ml超純水溶解制得樣品溶液，經0.22 _有機濾頭過濾。
3.根據(jù)權利要求2所述的液相色譜搭載VWD檢測器測定水果中糖組分的方法，其特征在于:步驟a中配制4種糖的混合標準溶液的步驟為:分別準確稱取1.6g各種糖的標準品，用超純水溶解定容，制得濃度為160 g/L的標準溶液；分別移取1.0O ml各標準溶液，混合并用超純水逐級稀釋，制得混合標準溶液。
4.根據(jù)權利要求3所述的液相色譜搭載VWD檢測器測定水果中糖組分的方法，其特征在于:所述糖包括蔗糖、葡萄糖、果糖和山梨醇。
【文檔編號】G01N30/88GK104483431SQ201410813360
【公開日】2015年4月1日 申請日期:2014年12月24日 優(yōu)先權日:2014年12月24日
【發(fā)明者】嚴娟, 沈志軍, 蔡志翔, 楊勇, 郭紹雷, 馬瑞娟, 俞明亮 申請人:江蘇省農業(yè)科學院