專利名稱：OsMADS57蛋白或其編碼基因在促進水稻分蘗中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及ー種0sMADS57蛋白或其編碼基因在促進水稻分蘗中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
植物株型是影響作物產(chǎn)量的重要因素之一，特別對水稻作物而言。目前知道水稻的分蘗數(shù)目、分蘗角度、植株高度、葉夾角、水稻穗子的大小和水稻小穗分支多少共同決定了水稻株型，而水稻的分蘗數(shù)和穗子的形狀又是決定水稻產(chǎn)量的最重要因素。對于水稻分蘗發(fā)育而言，分蘗期是水稻營養(yǎng)生長的最主要時期，包括從分蘗芽的分化到幼穗的形成。一般水稻品種，生長環(huán)境條件(溫度、水分、營養(yǎng)狀況)及其種植密度也會影響分蘗的發(fā)育。生長周期長的水稻品種一般比生長周期短的水稻分蘗要少ー些。水稻分蘗包括ー級分蘗和ニ級分蘗。根據(jù)分蘗結(jié)實的情況，分蘗又分為有效分蘗和無效分蘗兩種。有效分蘗的多少是決定水稻產(chǎn)量重要因素之一，所以我們通過各種手段盡可能的増加可育分蘗數(shù)量。隨著科學研究的進展，特別是水稻的基因組學和生物信息學的迅速發(fā)展。目前，水稻中與分蘗發(fā)育相關(guān)的ー些基因陸續(xù)被克隆出來。如我國學者李家洋實驗室克隆的MOCl基因直接影響水稻的分蘗數(shù)目，當該基因突變后表現(xiàn)出分蘗減少的表型，該基因的超表達轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出分蘗增多的表型。該實驗室最新研究發(fā)現(xiàn)MOCl相互作用的蛋白TAD1，編碼這個蛋白的基因突變后表現(xiàn)出分蘗增多的表型。研究表明水稻中D17/HTD1及擬南芥同源基因MAX3和DlO及擬南芥同源基因MAX4均編碼類胡蘿卜素切割雙氧酶蛋白，它們分別簡稱 carotenoid cleavage deoxygenate protein 7 (CCD7)和 carotenoid cleavagedeoxygenate protein 8 ((XD8)。MAX3和MAX4這兩個基因參與了植物分支激素(獨腳金內(nèi)酷)的生物合成，這個激素合成的途徑中發(fā)現(xiàn)位于(XD7和(XD8的下游存在另外ー些關(guān)鍵基因，例如擬南芥中編碼ー種細胞色素P450酶MAX1，水稻還沒有相關(guān)同源基因的報道。2009年李家洋課題組報道了ー個和dlO經(jīng)典分蘗突變體表型類似的突變體d27，D27編碼ー個鐵離子包含蛋白，亞細胞定位顯示該基因和葉綠體共定位，主要在莖和根的微管細胞中表達。最終實驗證據(jù)表明D27可能是獨腳金內(nèi)酯生物合成途徑的ー個新成員。另ー個影響水稻分蘗發(fā)育的基因D3則編碼ー個含F(xiàn)-box的LRR蛋白，這個基因突變后也表現(xiàn)出分蘗增多的表型。2009年幾個課題組相繼報道了另ー個和分蘗相關(guān)的突變體dl4/htd2/d88，同樣具有獨腳金內(nèi)酯途徑中經(jīng)典突變體的表型，即分蘗數(shù)增多和植株矮化，還表現(xiàn)出穂子變短和種子變小的表型。2003年日本一個課題組根據(jù)同源性分析發(fā)現(xiàn)玉米的TE0SINTEBRANCHED I (TBl)高度同源性基因OsTBl/FCl，該基因編碼TCP轉(zhuǎn)錄因子家族的蛋白，是分蘗發(fā)育的負調(diào)控因子。這個基因的突變體表現(xiàn)出分蘗數(shù)增多和半矮化的表型，該基因超表達轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出分蘗減少的表型。2009年日本另外ー個課題組發(fā)現(xiàn)了這個基因的另ー個突變體fcl，獨腳金內(nèi)酯處理該突變體的生理實驗證明fcl表現(xiàn)出對這個激素不敏感的表型，作者推測OsTBl/FCl也可能位于MAX/RMS/D遺傳途徑的下游，部分參與了獨腳金內(nèi)酯的信號傳導。2009 年 a rice dwarf and low_tillering(dlt)mutant 被發(fā)現(xiàn)和研究,這個突變體表現(xiàn)出矮化和分蘗減少的表型，相應(yīng)的DLT轉(zhuǎn)基因證實了該突變體的表型，結(jié)果表明dlt突變體表現(xiàn)出類似于水稻中油菜素內(nèi)酯缺陷和信號突變體的表型。組成型超表達技術(shù)和反義轉(zhuǎn)基因是ー個已經(jīng)發(fā)展比較成熟的研究基因功能的技木。它是將基因以正向和反向的方式插入到強啟動子的下游，可以使表達的基因轉(zhuǎn)錄本在體內(nèi)得到強的表達和表達量降低，從而使目的蛋白表達量增加和表達量減少。當對某ー個感興趣的基因進行功能鑒定時，采用組成型超表達和反義轉(zhuǎn)基因技術(shù)可以使我們了解在該基因的表達很大程度的增強和內(nèi)源基因的表達量減少，研究目的基因表達增強和表達減少的情況下，植物的生長發(fā)育等過程是否會受到影響，從未可以推斷該基因的可能的生物學功能。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的ー個目的是提供0sMADS57蛋白或其編碼基因或表達0sMADS57的重組載體的新用途。
本發(fā)明提供了 0sMADS57蛋白或其編碼基因或表達0sMADS57的重組載體在促進植物分蘗中的應(yīng)用；所述0sMADS57蛋白的氨基酸序列為序列表中的序列2。上述應(yīng)用中，所述0sMADS57蛋白的編碼基因的核昔酸序列為序列表中的序列I或序列表中的序列I自5’末端第1-726位核苷酸；所述表達0sMADS57的重組載體為將所述0sMADS57的編碼基因插入表達載體中，得到表達0sMADS57的載體；所述表達0sMADS57的重組載體具體為將所述序列表中的序列I自5’末端第1-726位核苷酸插入表達載體pUN1301的BamHI和KpnI酶切位點間得到的載體，且所述序列表中的序列I自5’末端第1-726位核苷酸的5’端通過所述pUN1301的BamHI酶切位點與其連接，所述序列表中的序列I自5’末端第1-726位核苷酸的3’端通過所述PUN1301的KpnI酶切位點與其連接。上述應(yīng)用為將所述0sMADS57蛋白的編碼基因?qū)肽康闹参镏?，得到分蘗數(shù)大于所述目的植物的轉(zhuǎn)基因植物。上述應(yīng)用中，所述0sMADS57蛋白的編碼基因通過所述表達0sMADS57的重組載體導入目的植物中。上述應(yīng)用中，所述目的植物為單子葉植物或雙子葉植物，所述單子葉植物具體為水稻。本發(fā)明的另ー個目的是提供ー種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法。本發(fā)明提供的方法，為將上述的應(yīng)用中的所述0sMADS57蛋白的編碼基因?qū)肽康闹参镏?，得到分蘗數(shù)大于所述目的植物的轉(zhuǎn)基因植物。上述方法中，所述0sMADS57蛋白的編碼基因通過重組載體導入目的植物中。上述方法中，所述重組載體具體為將所述序列表中的序列I自5’末端第1-726位核苷酸插入表達載體PUN1301的BamHI和KpnI酶切位點間得到的載體，且所述序列表中的序列I自5’末端第1-726位核苷酸的5’端通過所述pUN1301的BamHI酶切位點與其連接，所述序列表中的序列I自5’末端第1-726位核苷酸的3’端通過所述pUN1301的KpnI酶切位點與其連接。本發(fā)明的第三個目的是提供ー種重組載體。本發(fā)明提供的重組載體，為將上述的應(yīng)用中的所述0sMADS57的編碼基因插入表達載體中，得到表達0sMADS57的載體。
所述重組載體為將所述序列表中的序列I自5’末端第1-726位核苷酸插入表達載體pUN1301的BamHI和KpnI酶切位點間得到的載體，且所述序列表中的序列I自5’末端第1-726位核苷酸的5’端通過所述pUN1301的BamHI酶切位點與其連接，所述序列表中的序列I自5’末端第1-726位核苷酸的3’端通過所述pUN1301的KpnI酶切位點與其連接。本發(fā)明的實驗證明，在粳稻中花十號中克隆到ー個0sMADS57基因，將其正向插入表達載體，得到正義表達載體；利用正義表達載體導入水稻中花十號，得到正義轉(zhuǎn)基因水稻株系，與野生型水稻相比，正義轉(zhuǎn)基因水稻株系的分蘗增多。


圖I為RT-PCR方法擴增到0sMADS57的全長圖2為超表達載體pUN_0sMADS57 (正義)的物理圖譜圖3為超表達轉(zhuǎn)基因水稻(正義)的定量PCR鑒定圖4為0sMADS57超表達轉(zhuǎn)基因水稻(正義)分蘗的表型
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實施例I、0sMADS57蛋白及其編碼基因的獲得根據(jù)數(shù)據(jù)庫分析的結(jié)果設(shè)計引物超表達載體構(gòu)建使用引物5^端引物5’ -CGGGATCCATGGGGAGGGGGAAGATAGT-3’ (下劃線序列為 BamHI 位點，序列 3)，3'端引物5 ’ -GGGGTACCTTAAGGCAGATGAAGTCCCAGT-3，(下劃線序列為KpnI位點，序列4)。提取粳稻中花十號三葉期幼苗總RNA，采用RT-PCR方法擴增到0sMADS57的726bp全長cDNA。具體操作過程如下I)植物總RNA的提取選取IOOmg三葉期水稻中花十號(Oryza sativa L. cvZhonghua 10)的幼苗(李梅芳，水稻花培品種一中花10號，農(nóng)業(yè)科技通訊，1998年第I期第26頁。公眾可從中國科學院植物研究所獲得。)為材料，在液氮中研磨，將液氮中研碎的凍干粉轉(zhuǎn)入到含lml Trizol試劑(Invitrogen)的I. 5ml離心管中，充分混勻；25°C放置5分鐘；每管中加入O. 2ml新鮮氯仿，劇烈振搖15秒，25°C溫育2_3分鐘；12，OOOrpm，4°C，離心15分鐘；把上清的水相O. 5ml轉(zhuǎn)移到一個新的I. 5ml離心管中，加O. 5ml異丙醇，25°C放置10分鐘使RNA沉淀；12，OOOrpm, 4°C，離心10分鐘；去上清，將RNA沉淀用Iml 75%こ醇清洗2次，超凈臺吹至半干；用50 μ I DEPC-ddH20重懸沉淀，60°C水浴10分鐘，以溶解RNA沉淀獲得RNA溶液。將此RNA溶液分裝后-70°C保存，備做反轉(zhuǎn)錄的模板。2) RT-PCR :取I μ I上述RNA溶液，用DEPC_ddH20稀釋100倍，用分光光度計測定RNA濃度。參照RT-PCR試劑盒(Promega)說明書，根據(jù)RNA的定量結(jié)果，取含有2 μ gRNA的上述RNA溶液，加l.Oyg Oligo dT引物，用DEPC_ddH20補充至15 μ 1，混勻后70°C變性5分鐘，冰浴5分鐘。短暫離心后，加入25 μ I反轉(zhuǎn)錄混合物(5 μ IM-MLV 5XReactionBuffer,6 μ I dNTP Mixture (2. 5mM), I μ I M-MLV Reverse Transcriptase,0. 5 μ I RNaseInhibitor, 12. 5μ I DEPC_ddH20)?；靹蚝?，42°C水浴I小時完成反轉(zhuǎn)錄過程；75°C水浴10分鐘使反轉(zhuǎn)錄酶失活，得到含有第一鏈cDNA的混合物。取I μ I上述第一鏈cDNA作為PCR的模板，按以下體系進行PCR反應(yīng)0. 2 μ ILATaq (5υ/μ1)、10μ1 2XGC buffer, I. 8μ I dNTPs, O. 5 μ I 5 '端弓I 物(ΙΟμΜ)，O. 5 μ 13'端引物(10 μ Μ)，加 ddH20 終體積 20 μ I。5'端引物和3'端引物分別如下以超表達構(gòu)建引物序列5'端引物5’ -CGGGATCCATGGGGAGGGGGAAGATAGT-3’ (下劃線序列為 BamHI 位點，序列 3)，3'端引物5 ’ -GGGGTACCTTAAGGCAGATGAAGTCCCAGT-3，(下 劃線序列為KpnI位點，序列4)為引物，進行PCR擴增，得到PCR產(chǎn)物(正義)。上述PCR程序為94° C預(yù)變性30s后進入PCR循環(huán)，循環(huán)參數(shù)為98° C 10秒變性一55° C 15秒復(fù)性一72° C 40秒延伸，35個循環(huán)后在72° C繼續(xù)合成10分鐘。將上述PCR產(chǎn)物(正義)經(jīng)過O. 8%的瓊脂糖凝膠電泳分離，結(jié)果如圖I所示，PCR產(chǎn)物(正義)的條帶大小為726bp?；厥誔CR產(chǎn)物(正義)進行測序，結(jié)果為PCR產(chǎn)物(正義)的核苷酸序列具有序列表中序列I自5’末端第1-726位核苷酸，序列I的OFR為序列表中序列I自5’末端第1-726位核苷酸。該PCR產(chǎn)物的基因命名0sMADS57，0sMADS57編碼的蛋白為0sMADS57，該蛋白的氨基酸序列為序列表中的序列2。實施例2、0sMADS57蛋白及其編碼基因的應(yīng)用一、過表達載體pUN-MADS57 (正義)l、pUN1301質(zhì)粒的獲得第一歩剪取約O. 2g玉米幼苗，置于液氮中研磨；然后加入800 μ L新配制的提取緩沖液(含 O. IM Tris-HCl ρΗ8· O, 50mM EDTA，O. 5M NaCl，1%SDS 和 I % β -巰基こ醇)，劇烈振蕩使其全部懸?。?5°C水浴30分鐘，每5分鐘顛倒混勻一次；然后加入250 μ L預(yù)冷的5Μこ酸鉀水溶液，立即顛倒混勻，冰浴5分鐘；加入等量酚/氯仿，抽提一次，12000rpm離心5分鐘；收集上清液，加入O. 6倍體積的異丙醇沉淀DNA，室溫放置40分鐘；4°C 12000rpm離心15分鐘，棄上清；沉淀用70%、100%こ醇各洗一次；干燥后，溶于20 μ L含100 μ g/mLRNaseA的ddH20中，得到玉米基因組DNA。第二步取上述玉米基因組DNA溶液2μ L作為模板，以帶有Hind III識別位點的5 '引物(GGAAGCTTCTGCAGTGCAGCGTGACCCGG)和帶有BamHI識別位點的3 '引物(CGGGATCCAAGTAACACCAAACAACAGGG)為引物，進行 PCR 擴增，PCR 反應(yīng)條件為先 94°C 3 分鐘；再94°C 45秒，62°C 45秒，72°C 2分鐘，共35個循環(huán)，最后72°C 10分鐘。反應(yīng)結(jié)束后，對PCR產(chǎn)物進行O. 8%瓊脂糖凝膠電泳檢測，表明得到長度約為2kb的擴增片段，與預(yù)期結(jié)果相符，回收該目的片段，用限制性內(nèi)切酶Hind III和BamHI雙酶切后回收，得到片段經(jīng)測序，該片段為序列表中的序列5自5’末端的第1-1986位核苷酸，為帶有粘性末端的玉米泛素啟動子(UbiPix))。(玉米泛素啟動子(UbiPro)也可以人工合成獲得。)
第三步用限制性內(nèi)切酶Sac I和EcoR I將Noster poly A終止序列從質(zhì)粒載體PBI 121 (北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司目錄號MP-091)上切下，連接到載體pUC19 (北京百泰克生物技術(shù)有限公司目錄號DP7801 M^Sac I和EcoR I位點間，得到重組載體，命名為pUC19_Noster。再用限制性內(nèi)切酶Hind III和BamHI雙酶切pUC19_Noster,瓊脂糖凝膠電泳檢測后，回收線性化的載體大片段，并將該回收片段與第二步中經(jīng)酶切獲得的帶有粘性末端的玉米泛素啟動子(UbiPro)相連,得到重組載體,命名為pUN19。
第四步用限制性內(nèi)切酶EcoR I 部分酶切和Hind III完全酶切從第三步購建的重組載體PUN19切下包含UbiPro和Noster的長度約為2. 3kb的片段，將該片段克隆入質(zhì)粒載體 PCAMBIA1301 (Biovector Co.，LTD 公司目錄號 Biovec-II)的 EcoR I 和 Hind III位點處，得到重組載體，命名為pUN1301。2、過表達載體pUN-MADS57 (正義)的獲得用限制性內(nèi)切酶KpnI和BamHI對I步驟獲得的質(zhì)粒pUN1301進行雙酶切，酶切體系為質(zhì)粒 10μ l、10x 酶切緩沖液 5μ l、BglIIly I (IOU/μ I)、SacI O. 8 μ I (lOU/μ I),加ddH20補充反應(yīng)體系至50 μ 1，37°C酶切4小吋。用瓊脂糖凝膠電泳對酶切產(chǎn)物進行分離，回收線性化的PUN1301大片段，溶于20 μ I ddH20中。用限制性內(nèi)切酶KpnI和BamHI對由實施例I得到的726bp PCR產(chǎn)物(正義)進行雙酶切，酶切體系為質(zhì)粒1(^1，酶切緩沖液5“1、8&111!1114 1 (IOU/μ I)、加ddH20補充反應(yīng)體系至50μ 1，37°C酶切4個小時。再加入KpnI O. 2 μ I (IOU/μ 1)，37°C酶切20分鐘。用O. 8%瓊脂糖凝膠電泳對酶切產(chǎn)物進行分離，用AxyPrep公司的DNA凝膠回收試劑盒回收該片斷，回收726bp的0sMADS57片段(正義)。將10 μ I回收的726bp的0sMADS57 (正義)、6μ I回收的載體pUN1301大片段溶液、2 μ I (3U/ μ I)Τ4 DNA連接酶和2 μ I IOx連接酶緩沖液混和，16°C連接16小時，得到的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細胞，經(jīng)含卡那霉素的抗性平板篩選得到陽性克隆。提取陽性克隆中的重組質(zhì)粒，進行測序驗證，該質(zhì)粒為將序列表中的序列I自5’末端第1-726位核苷酸插入pUN1301的BamHI和KpnI酶切位點間得到的載體，將該質(zhì)粒命名為pUN-0sMADS57 (正義)，且序列表中的序列I自5’末端第1_726位核苷酸的5’端通過所述PUN1301的BamHI酶切位點與其連接，序列表中的序列I自5’末端第1_726位核苷酸的3’端通過所述pUN1301的KpnI酶切位點與其連接。pUN_0sMADS57中啟動子、基因和終止子的結(jié)構(gòu)正確。在該表達載體中采用玉米泛素啟動子(UbiPro)啟動目的片段0sMADS57在植物中超表達，其物理圖譜示意圖如圖2所示。ニ、轉(zhuǎn)0sMADS57水稻(正義)的獲得及鑒定I、轉(zhuǎn)0sMADS57水稻(正義)的獲得參照電激儀(Easy JecT Plus電激儀，英國EquiBio公司)操作指南，將PUN-MADS57 (正義)用電擊法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105 (Biovector Co.，LTD公司目錄號Biovec-ΙΙ)，經(jīng)含卡那霉素的抗性平板篩選得到陽性克隆的超表達工程菌，命名為EHA105/pUN-0sMADS57 (正義)。將EHA105/pUN_0sMADS57 (正義)導入中花十號水稻(Oryza sativaL. cvZhonghualO,以下簡稱野生型水稻)的愈傷組織中，再用含300mg/L頭孢霉素的無菌水洗漆
4-5遍，無菌濾紙吸干后轉(zhuǎn)至N6D2S1培養(yǎng)基上，篩選一代；兩周后，轉(zhuǎn)移至N6D2S2培養(yǎng)基上篩選ニ代(2周/代);取出經(jīng)過3代篩選生長旺盛的抗性愈傷組織，轉(zhuǎn)移至分化培養(yǎng)基(1)，上，在分化培養(yǎng)箱(12小時光周期，白天28°C，夜晚25°C)中培養(yǎng)7天；然后轉(zhuǎn)移至分化培養(yǎng)基
(2)，上，在分化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至產(chǎn)生再生苗。再生的植株在生根壯苗培養(yǎng)基上生根壯苗；待小苗長至10厘米左右時，打開容器封ロ膜，煉苗2-3天，然后將小苗移入人工氣候室栽培，獲得10個株系共60棵TO代轉(zhuǎn)OsMADS57水稻(正義)。所用培養(yǎng)基如下
NA培養(yǎng)基N6大量元素，B5微量元素，Bjf生素，300 mg/L水解
酪蛋白，500 mg/L脯氨酸，500 mg/L谷氨酰胺，30 g/L蔗糖，2 mg/L 2, 4-D, 7 g/L agar, pH 5. 8N6D2S1 培養(yǎng)基NA, 25 mg/L 潮霉素(Hygromycine)，600 mg/L 頭抱霉素(Cefotaxime), pH 5.8 N6D2S2培養(yǎng)基NA, 50 mg/L潮霉素，300 mg/L頭孢霉素，pH5. 8AAM-AS培養(yǎng)基AAM鹽分和氨基酸，MS維生素，100 μπιοΙ/L乙酰丁香酮(Acetosyringone, AS), pH 5.2N6D2C 培養(yǎng)基NA, IOg/!/葡萄糖，ΙΟΟμοιοΙ/L 乙酰丁香酮，pH 5. 2
分化培養(yǎng)基(1): MS鹽分和維生素，300 mg/L水解酪蛋白，50 rag/L潮霉素，I mg/L 6-BA (6-芐氨基嘌呤，已核實)，O. 5 mg/L
KT (氯吡苯服，已核實)，0.2 mg/L ZT (玉米素)，
O. 25 mg/L NAA (萘乙酸，已核實)，30 g/L蔗糖，30 g/L 山梨醇，7 g/L agar, pH 5. 8
分化培養(yǎng)基(2): MS鹽分和維生素，300 mg/L水解酪蛋白，50 mg/L潮
霉素，I mg/L 6-BA, O. 5 mg/L KT, 0.2 mg/L ZT，
O. 5 mg/L NAA, 30 g/L 蔗糖，20 g/L 山梨醇，7 g/L agar， pH 5.8
生根壯苗培養(yǎng)基1/2 MS鹽分，MS錐生素，I mg/L多效唑，O. 5 mg/L NAA,
8 g/L agar, pH . 82、轉(zhuǎn)0sMADS57水稻(正義)的鑒定I )、⑶S組織化學染色將由實施例I獲得的70棵TO代轉(zhuǎn)0sMADS57水稻(正義)的2_3mm長的根段分別放到⑶S染色液中，抽氣幾分鐘，然后置于37°C溫育過夜，染色后的組織用70%こ醇脫色。根呈藍色的植株即為陽性轉(zhuǎn)基因材料。⑶S染色液(pH 7. O)組分為100mM Na3PO4 (pH 7.0)，O. l%Triton X-100, IOmM EDTA，0. 5mM 亞鐵氰化鉀，0. 5mM 鐵氰化鉀，lmg/ml X-Gluc0 結(jié)果共鑒定出6個株系合計50棵陽性TO代轉(zhuǎn)0sMADS57水稻(正義)，將此幼苗移至溫室栽培，按照不同株系收種，得到Tl代轉(zhuǎn)基因種子，在此基礎(chǔ)上經(jīng)過繁種得到純合T2代種子。在以后的實驗中選取轉(zhuǎn)OsMADS57水稻(正義)株系I (OEl)和2 (0E2)的純合種子T2為材料。2)、定量 PCR 鑒定從OEl和0E2的T2轉(zhuǎn)0sMADS57水稻(正義)幼苗中提取mRNA，并分別轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，以野生型水稻(水稻中花十號)為對照。利用熒光實時定量PCR法，以cDNA為模板，以I μ I 5'端引物 I (10 μ Μ) (5' -GCACCAACATGAAAACTGTGA-3' )，I μ I 3'端引物 I (10 μ Μ)(5 ' -CTCCCTCTGCCAAATCTTAATT-3 ')為引物，對陽性 T2 轉(zhuǎn) 0sMADS57 水稻(正義)的表達豐度進行檢測。用于定量分析的試劑為SYBR Green Realtime PCR Master Mix(TOYOBO)。所用儀器為美國Stratagene公司實時熒光定量PCR儀Mx3000P。吸取I μ I第一鏈cDNA溶液，稀釋50倍作為模板，按以下體系進行PCR反應(yīng)10 μ I SYBR Green Realtime PCRMaster Mix, 4 μ I 模板，I μ I 5'端引物 I (10 μ Μ)，I μ I 3'端引物 I (10 μ Μ)，加 ddH20 終體積20 μ I0結(jié)果如圖3所示，在Actin基因作為內(nèi)參的情況下，與野生型水稻相比，OEl和0Ε2 的Τ2幼苗中0sMADS57的表達豐度有了不同程度的上調(diào)，說明目的基因(0sMADS57)再轉(zhuǎn)錄水平已經(jīng)成功表達。采用同樣的方法將空載體PUN1301導入野生型水稻中得到TO代轉(zhuǎn)空載體水稻，從TO代轉(zhuǎn)pUN1301水稻上收獲Tl代轉(zhuǎn)pUN1301水稻種子，播種，從Tl代轉(zhuǎn)pUN1301水稻上收獲T2代轉(zhuǎn)pUN1301水稻種子。三、轉(zhuǎn)0sMADS57水稻(正義)的表型觀察將T2代轉(zhuǎn)0sMADS57水稻(正義)的OEl和0E2種子、中花十號野生型水稻種子(ZHlO)和T2代轉(zhuǎn)pUN1301水稻種子，均播種在花卉營養(yǎng)土和蛭石的混合物里(兩者的混合比例為4:1)，30で萌發(fā)后放在溫室里(32で)培養(yǎng)至3葉期，接著把生長的幼苗種植于水稻田中。每個株系30個，實驗重復(fù)三次，結(jié)果取平均值。對植株分蘗數(shù)進行觀察，結(jié)果如下拍照如圖4A所示，可以看出，與野生型水稻相比，T2代轉(zhuǎn)0sMADS57水稻(正義)0E1的分蘗數(shù)增多。在播種后約第70天統(tǒng)計T2代轉(zhuǎn)0sMADS57水稻(正義)的OEl和0E2種子、中花十號野生型水稻種子(ZHlO)和T2代轉(zhuǎn)pUN1301水稻分蘗數(shù)，結(jié)果如圖4B所示，T2代轉(zhuǎn)0sMADS57水稻(正義)OEU T2代轉(zhuǎn)0sMADS57水稻(正義)0E2、中花十號野生型水稻(ZHlO)的分蘗數(shù)分別為14個、17個和26個。T2代轉(zhuǎn)pUN1301水稻和野生型水稻結(jié)果無顯著差異。
權(quán)利要求
1.OsMADS57蛋白或其編碼基因或表達OsMADS57的重組載體在促進植物分蘗中的應(yīng)用； 所述OsMADS57蛋白的氨基酸序列為序列表中的序列2。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的應(yīng)用，其特征在于所述OsMADS57蛋白的編碼基因的核苷酸序列為序列表中的序列I或序列表中的序列I自5’末端第1-726位核苷酸； 所述表達OsMADS57的重組載體為將所述OsMADS57的編碼基因插入表達載體中，得到表達OsMADS57的載體； 所述表達OsMADS57的重組載體具體為將所述序列表中的序列I自5’末端第1-726位核苷酸插入表達載體PUN1301的BamHI和KpnI酶切位點間得到的載體，且所述序列表中的序列I自5’末端第1-726位核苷酸的5’端通過所述pUN1301的BamHI酶切位點與其連接，所述序列表中的序列I自5’末端第1-726位核苷酸的3’端通過所述pUN1301的KpnI酶切位點與其連接。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的應(yīng)用，其特征在于所述應(yīng)用為將所述OsMADS57蛋白的編碼基因?qū)肽康闹参镏校玫椒痔Y數(shù)大于所述目的植物的轉(zhuǎn)基因植物。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一所述的應(yīng)用，其特征在于所述OsMADS57蛋白的編碼基因通過所述表達OsMADS57的重組載體導入目的植物中。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一所述的應(yīng)用，其特征在于 所述目的植物為單子葉植物或雙子葉植物，所述單子葉植物具體為水稻。
6.ー種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，為將權(quán)利要求1-5中任一所述的應(yīng)用中的所述OsMADS57蛋白的編碼基因?qū)肽康闹参镏校玫椒痔Y數(shù)大于所述目的植物的轉(zhuǎn)基因植物。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述OsMADS57蛋白的編碼基因通過重組載體導入目的植物中。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的方法，其特征在于所述重組載體為將所述OsMADS57的編碼基因插入表達載體中，得到表達OsMADS57的載體； 所述重組載體具體為將所述序列表中的序列I自5’末端第1-726位核苷酸插入表達載體pUN1301的BamHI和KpnI酶切位點間得到的載體，且所述序列表中的序列I自5’末端第1-726位核苷酸的5’端通過所述pUN1301的BamHI酶切位點與其連接，所述序列表中的序列I自5’末端第1-726位核苷酸的3’端通過所述pUN1301的KpnI酶切位點與其連接。
9.ー種重組載體，為將權(quán)利要求1-5中任一所述的應(yīng)用中的所述OsMADS57的編碼基因插入表達載體中，得到表達OsMADS57的載體。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的重組載體，其特征在于所述重組載體為將所述序列表中的序列I自5’末端第1-726位核苷酸插入表達載體PUN1301的BamHI和KpnI酶切位點間得到的載體，且所述序列表中的序列I自5’末端第1-726位核苷酸的5’端通過所述pUN1301的BamHI酶切位點與其連接，所述序列表中的序列I自5’末端第1-726位核苷酸的3’端通過所述PUN1301的KpnI酶切位點與其連接。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種OsMADS57蛋白或其編碼基因在促進水稻分蘗中的應(yīng)用。本發(fā)明提供了OsMADS57蛋白或其編碼基因或表達OsMADS57的重組載體在促進植物分蘗中的應(yīng)用。本發(fā)明的實驗證明，在粳稻中花十號中克隆到一個OsMADS57基因，將其正向插入表達載體，得到正義表達載體；利用正義表達載體導入水稻中花十號，得到正義轉(zhuǎn)基因水稻株系，與野生型水稻相比，正義轉(zhuǎn)基因水稻株系的分蘗增多。
文檔編號C12N15/82GK102690838SQ201210182988
公開日2012年9月26日 申請日期2012年6月5日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月5日
發(fā)明者徐云遠, 種康, 郭思義 申請人:中國科學院植物研究所