專利名稱：在乳酸乳球菌表面展示表達(dá)幽門螺桿菌蛋白的載體及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種可在乳酸乳球菌中表達(dá)幽門螺桿菌蛋白、且使表達(dá)蛋白展示于菌體表面的表達(dá)載體，同時(shí)還涉及一種該載體的制備方法與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
幽門螺桿菌(Helicobacter pylori, H. pylori)是一種革蘭氏陰性致病菌，感染者占世界人口 50%以上。幽門螺桿菌感染與人體慢性胃炎、消化性潰瘍、胃癌等疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[Kitajima Y，Ohtaka K，Mitsuno M, et al. Helicobacter pyloriinfection is an independent risk factor for Runx3 methylation in gastriccancer. Oncol Rep, 2008, 19 (I) : 197-202]，防治幽門螺桿菌感染可以降低這些疾病的發(fā)病率。由于釆用抗生素治療幽門螺桿菌感染容易產(chǎn)生抗藥性，且不能預(yù)防重復(fù)感染，因此控制幽門螺桿菌感染流行主要寄希望于幽門螺桿菌疫苗的研制成功。幽門螺桿菌定植于人·體胃粘膜表面，經(jīng)口免疫是最合理的免疫途徑。目前，雖有個(gè)別幽門螺桿菌疫苗進(jìn)入臨床試驗(yàn)的報(bào)道，但尚無免疫效果理想的口服疫苗菌株[Zhang S, Moise L, Moss SF. H. pylorivaccines: why we still don’t have any. Hum Vaccin，2011，7 (11) : 1153-7.]?，F(xiàn)有石開究表明，缺乏安全有效的疫苗載體是影響口服疫苗研究發(fā)展的一個(gè)關(guān)鍵性因素[AgarwalK，Agarwal S. Helicobacter pvlori vaccine: from past to future. Mayo Cl inProcj 2008，83 (2): 169-175. ] 現(xiàn)有研究多釆用減毒傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)作為幽門螺桿菌口服疫苗載體[Xu C，Li ZSj Du YQj et al. Construction of recombinant attenuatedSalmonella typhimurium DNA vaccine expressing H pylori ureB and IL-2. World JGastroenterol, 2007，13 (6) :939-944]。由于沙門氏菌是致病菌，減毒株不僅仍具有一定的毒性，而且還存在遺傳穩(wěn)定性問題，應(yīng)用于人體時(shí)其安全性很難保證[Lee MHj RousselYj Wilks Mj et al. Expression of Helicobacter pylori urease subunit B gene inLactococcus lactis MG1363 and its use as a vaccine delivery system against H.pylori infection in mice. Vaccine，2001，19 (28-29) : 3927-3935];而且動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯不以該菌為載體構(gòu)建的抗幽門螺桿菌疫苗菌株用于免疫小鼠時(shí)常引發(fā)較嚴(yán)重的免疫后胃炎，造成組織損傷。因此，有必要探討更安全有效的口服疫苗載體。乳酸乳球菌(Lactococcus lactis, L. lactis)是乳酸菌類的一個(gè)菌種，在食品加工中的應(yīng)用已有悠久的歷史，屬于食品級(jí)的益生菌，其安全性十分可靠[MorelloEjBermudez-Humaran LG. Llull D, et al.Lactococcus lactis,an effcient cellfactory for recombinant protein production and secretion. J Mol MicrobiolBiotechnol，2008，14(1-3) :48-58];而且其生長(zhǎng)迅速，易于培養(yǎng)，遺傳背景和調(diào)控機(jī)制相對(duì)清楚，具有作為口服疫苗載體的很大潛力[Stentz Rj Bongaerts RJj Gunning AP,Gasson M，Shearman C. Controlled release of protein from viable Lactococcuslactis cells. Appl Environ Microbiol, 2010, 76(9):3026-3031. ] 目前，NICE 系統(tǒng)是應(yīng)用最為廣泛的乳酸菌表達(dá)系統(tǒng)[Mierau I, Kleerebezem M. IOyears of thenisin-controlled gene expression system(NICE)in Lactococcus lactis.ApplMicrobiol Biotechnol, 2005，68(6) :705-17.]。采用 NICE 系統(tǒng)的表達(dá)載體 pNZ8110和PNZ8149表達(dá)幽門螺桿菌抗原已有報(bào)道，但這兩種表達(dá)載體只能將外源蛋白表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中或分泌至細(xì)胞外[Zhang XJ, Duan G, Zhang R, Fan Q. Optimized expressionof Helicobacter pylori ureB gene in the Lactococcus lactis nisin-controlledgene expression (NICE) system and experimental study of its immunoreactivity.Curr Microbiol. 2009, 58(4) :308-14. //Chen S, Zhang R, Duan G, Shi J. Food-gradeexpression of Helicobacter pylori ureB subunit in Lactococcus lactis and itsimmunoreactivity. Curr Microbiol. 2011, 62 (6) : 1726-31.]，而無在細(xì)胞壁或細(xì)胞膜上展示表達(dá)外源蛋白的功能。作為口服疫苗抗原表達(dá)載體，PNZ8110和pNZ8149存在明顯缺陷。因?yàn)楝F(xiàn)有研究顯示，作為口服疫苗載體，將疫苗抗原展示表達(dá)于宿主菌細(xì)胞壁或細(xì)胞膜上，可顯著提高疫苗菌株的免疫效果[翟偉強(qiáng).減毒傷寒沙門氏菌作為表面展示疫苗載體的應(yīng)用.研究華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，碩士學(xué)位論文，2011.6見中國(guó)學(xué)術(shù)文獻(xiàn)網(wǎng)絡(luò)出版總庫(kù)]。因此，應(yīng)用基因工程技術(shù)，通過對(duì)PNZ8110表達(dá)載體的改造，構(gòu)建能夠在L. Iactis表面展示表達(dá)幽門 螺桿菌疫苗抗原的表達(dá)載體，建立更為安全有有效的抗幽門螺桿菌疫苗菌株，這對(duì)幽門螺桿菌感染及相關(guān)疾病的防治具有重要意義和實(shí)用價(jià)值，可望產(chǎn)生可觀的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)效益。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種可表面展示表達(dá)幽門螺桿菌蛋白的乳酸乳球菌表達(dá)載體。同時(shí)，本發(fā)明的目的還在于提供一種可表面展示表達(dá)幽門螺桿菌蛋白的乳酸乳球菌表達(dá)載體的制備方法與應(yīng)用。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案采用了一種可表面展示表達(dá)幽門螺桿菌黏附素(HpaA)的L. Iactis表達(dá)載體，HpaA是免疫效果最好的幽門螺桿菌疫苗候選抗原之一。所述L. Iactis表達(dá)載體的核苷酸序列為SEQ ID NO. 6所示的核苷酸序列或與SEQ ID NO. 6所示的核苷酸序列存在至少95%或至少90%同源性。本發(fā)明所述表達(dá)載體pNZ8110_hpaA_lysM包含以下元件來自幽門螺桿菌的hpaA基因序列(見序列表中SEQ ID NO. 3)、來自L. Iactis基因組的IysM基因序列(見序列表中SEQID NO. 2)、來自 L. Iactis 表達(dá)載體 pNZ8110 的啟動(dòng)子 Pnis、復(fù)制子 repC 和 repA、Usp45蛋白信號(hào)肽序列ssusp45、氯霉素抗性基因cm及Nae I、Sph I、Xba I等限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)。IysM是L. Iactis自溶素(AcmA)的錨定區(qū)基因序列，具有序列表中SEQ ID NO. 2所述的核苷酸序列。在誘導(dǎo)劑Nisin作用下,表達(dá)載體pNZ8110-hpaA_lysM中的ssusp45、hpaA與IysM基因融合表達(dá),ssusp45編碼的信號(hào)肽引導(dǎo)融合蛋白分泌至胞外，IysM基因編碼的錨定肽與細(xì)胞壁結(jié)合，從而使融合表達(dá)的HpaA蛋白展示于菌體表面。本發(fā)明的技術(shù)方案還采用了一種表達(dá)幽門螺桿菌蛋白的重組乳酸乳球菌(Lactococcus lactis),于2012年5月16日保藏在位于中國(guó)北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)的中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC NO. 6115，分類命名為乳酸乳球菌Lactococcus lactis。表達(dá)幽門螺桿菌HpaA蛋白的重組乳酸乳球菌菌株，它是用乳酸乳球菌表達(dá)載體 pNZ8110_hpaA_lysM 轉(zhuǎn)化 L. lactis NZ3900 得到的重組菌株，被命名為 LactococcuslactisNZ3900/pNZ8110-hpaA-lysM，具有表面展示表達(dá)幽門螺桿菌黏附素(HpaA)的功能。本發(fā)明還提供了核苷酸序列為SEQ ID NO. 6的L. Iactis表達(dá)載體pNZ8110_hpaA_lysM 的構(gòu)建方法。本發(fā)明還提供了 L. Iactis表達(dá)載體pNZ8110_hpaA_lysM的應(yīng)用。尤其是應(yīng)用 pNZ8110-hpaA-lysM 與 L. lactis NZ3900 構(gòu)建重組菌株 L. lactis NZ3900/pNZ8110-hpaA-lysMo
本發(fā)明通過實(shí)驗(yàn)證明，L. Iactis表達(dá)載體pNZ8110_hpaA_lysM可通過以下方法構(gòu)
建并鑒定I)根據(jù)Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)中幽門螺桿菌hpaA基因序列(Genbank DQ353891)，利用生物軟件Primer5. 0設(shè)計(jì)PCR引物，上游引物Pl的核苷酸序列為5’ -CGTGCCGGCATGAAAGCAAATAATC-3’，含有NaeI酶切位點(diǎn)，下游引物P2的核苷酸序列為5’ -ACATGCATGCTTATCGGTTT CT-3’，含有 SphI 酶切位點(diǎn)。2)以幽門螺桿菌H. pylori MEL-HP27基因組DNA為模板，用PCR方法擴(kuò)增幽門螺桿菌hpaA基因。采用質(zhì)粒提取試劑盒(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)從大腸桿菌(Escherichia coli) MC1061/pNZ81IO-IysM 菌株中提取表達(dá)載體 pNZ8110_lysM。3)將hpaA基因用Nae I +Sph I雙酶切，并用同樣酶雙酶切L. Iactis表達(dá)載體pNZ8110-lysM，酶切片段經(jīng)瓊脂糖電泳后進(jìn)行純化回收，將得到的hpaA基因和載體pNZ81 IO-IysM酶切片段用T4DNA連接酶連接。4)將上述hpaA基因與載體pNZ8110_lysM的連接產(chǎn)物用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌Escherichia coli MC1061菌株,利用載體含有的氯霉素抗性基因篩選陽性轉(zhuǎn)化菌。培養(yǎng)篩選的陽性轉(zhuǎn)化菌，采用常規(guī)堿裂解法從陽性轉(zhuǎn)化菌中提取質(zhì)粒，并進(jìn)行酶切及測(cè)序鑒定，鑒定結(jié)果符合預(yù)期的重組質(zhì)粒即為所構(gòu)建的乳酸乳球菌表達(dá)載體，將其命名為pNZ8110-hpaA-lysMo5)制備L. lactis NZ3900菌株感受態(tài)細(xì)胞，應(yīng)用電穿孔法將pNZ8110-hpaA_lysM轉(zhuǎn)入L. Iactis細(xì)胞，通過氯霉素抗性篩選陽性轉(zhuǎn)化菌，用質(zhì)粒提取試劑盒從陽性轉(zhuǎn)化菌中提取質(zhì)粒，對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行PCR、酶切及測(cè)序鑒定，得到含有pNZ8110-hpaA-lysM的L. IactisNZ3900 重組菌，將其命名為L(zhǎng). lactis NZ3900/pNZ8110-hpaA-lysM。6)為鑒定表達(dá)載體pNZ8110-hpaA_lysM具有在L. Iactis菌體表面展示表達(dá)幽門螺桿菌HpaA蛋白的功能，培養(yǎng)菌株L. lactis NZ3900/pNZ8110-hpaA-lysM,并用乳酸鏈球菌素(Nisin)誘導(dǎo)。提取細(xì)胞壁蛋白，用SDS-PAGE和Western blots法檢測(cè)蛋白表達(dá)及其免疫活性。結(jié)果,應(yīng)用Westernblots方法在細(xì)胞壁蛋中檢測(cè)到表達(dá)的HpaA蛋白，而且重組表達(dá)的HpaA蛋白能夠與幽門螺桿菌菌體裂解抗原(lysate antigens)免疫小鼠血清發(fā)生免疫反應(yīng)。本發(fā)明通過實(shí)驗(yàn)證明，L. Iactis表達(dá)載體pNZ8110_hpaA_lysM與重組菌株L. lactis NZ3900/pNZ8110-hpaA-lysM可應(yīng)用于制備幽門螺桿菌口服疫苗、幽門螺桿菌感染免疫診斷試劑和食品加工。本發(fā)明具有以下有益效果I)本發(fā)明構(gòu)建的表達(dá)載體pNZ8110-hpaA_lysM能夠在L. Iactis中表達(dá)幽門螺桿菌蛋白HpaA,并使表達(dá)的重組蛋白與細(xì)胞壁結(jié)合,實(shí)現(xiàn)了在L. Iactis菌體表面展示疫苗抗原HpaA的目的，目前尚無相同研究報(bào)道，這是幽門螺桿菌口服疫苗研究的一次技術(shù)進(jìn)步。2)L. lactis 重組菌株 L. lactis NZ3900/pNZ8110-hpaA_lysM 能有效表達(dá)幽門螺桿菌HpaA抗原，且表達(dá)的重組抗原HpaA可與小鼠抗幽門螺桿菌菌體抗原免疫血清反應(yīng),證實(shí)表達(dá)的HpaA蛋白有抗原活性，表明該L. Iactis菌株在幽門螺桿菌疫苗研制中具有應(yīng)用價(jià)值，有望應(yīng)用于幽門螺桿菌疫苗的制備。
3) L. Iactis 重組菌株 L. lactis NZ3900/pNZ8110-hpaA_lysM 表達(dá)的 HpaA 蛋白可與幽門螺桿菌菌體裂解抗原免疫小鼠血清發(fā)生免疫反應(yīng)而與正常小鼠血清無免疫反應(yīng)，表明該L. Iactis菌株在幽門螺桿菌感染診斷試劑的制備中具有應(yīng)用價(jià)值。4) L. Iactis 重組菌株 L. lactis NZ3900/pNZ8110-hpaA-lysM 能表達(dá)具有免疫活性的幽門螺桿菌疫苗抗原HpaA，表明此L. Iactis菌株可用于生產(chǎn)具有預(yù)防和治療幽門螺桿菌感染及相關(guān)胃腸疾病的保健食品，例如，將該菌作為發(fā)酵菌株，應(yīng)用于乳制品發(fā)酵，生產(chǎn)具有預(yù)防幽門螺桿菌感染的酸奶等，有望產(chǎn)生非?？捎^的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)效益。


圖I為L(zhǎng). Iactis表達(dá)載體pNZ8110-hpaA_lysM構(gòu)建示意圖；圖2為幽門螺桿菌hpaA基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖；圖中廣4為hpaA基因擴(kuò)增產(chǎn)物，5 為 DNAMarker ；圖3 為重組菌 Escherichia coli MC1061/pNZ8110-hpaA_lysM 菌液 PCR 鑒定電泳圖；圖中I為陰性對(duì)照，2，3，4為以MC1061/pNZ8110-hpaA-lysM菌液為模板的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，5 為 DNA Marker ；圖4 為重組菌 Escherichia coli MC1061/pNZ8110-hpaA-lysM 的質(zhì)粒酶切鑒定電泳圖；圖中I為SphI酶切的pNZ8110-hpaA_lysM，2為Sphl+Nael酶切的pNZ8110-hpaA-lysM, 3 為 SphI 酶切的 pNZ8110，4 為 hpaA 基因 PCR 產(chǎn)物，5 為 DNA Marker ；圖5為誘導(dǎo)后L. lactis NZ3900/pNZ8110-HpaA_LvsM細(xì)胞壁蛋白及菌體全蛋白的 SDS-PAGE 電泳圖；圖中 I, 2，3，4 分別是 L. lactis NZ3900、L. lactis NZ3900/pNZ8110、L. lactis NZ3900/pNZ8110 和 L. lactis NZ3900/pNZ8110-hpaA-lysM 菌株的細(xì)胞壁蛋白，圖中 5，6，7，8 分別是 L. lactis NZ3900、L. lactis NZ3900/pNZ8110、L. lactis NZ3900/PNZ8110 和 L. lactis NZ3900/pNZ8110-hpaA-lysM 菌株的菌體總蛋白，9 為 ProteinMarker ；圖6 為 L. lactis NZ3900/pNZ81IO-HpaA-LysM 表達(dá) HpaA 蛋白與小鼠免疫血清的Westernblots 分析;圖中 1，2，3 是 L. lactisNZ3900/pNZ8110-HpaA_LvsM 細(xì)胞壁蛋白與小鼠免疫血清反應(yīng)結(jié)果,4，5分別是L. lactis NZ3900和L. lactis NZ3900/pNZ8110菌株細(xì)胞壁蛋白與小鼠免疫血清反應(yīng)結(jié)果，6是Protein Marker。
具體實(shí)施方式
(一)本發(fā)明實(shí)驗(yàn)中使用的細(xì)菌菌株和質(zhì)粒L. lactis NZ3900 菌株(lacF'pepN: :nisRnisK)購(gòu)自荷蘭 NIZO FoodResearch (Kernhemseweg, Netherlands)。也可從德國(guó) Mobitec 公司(Gdttingen,Germany)購(gòu)得。采用含150ml/L甘油的GM17培養(yǎng)基于_80°C保存該菌種。大腸桿菌(Escherichia coli) MC1061/pNZ8110_lysM菌株是 保藏在位于中國(guó)北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)的中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心的菌株，保藏日期為2012年5月16日，保藏號(hào)為CGMCC NO. 6116，分類命名為大腸埃希氏菌Escherichia coli。采用含200ml/L甘油和10 y g/ml氯霉素的LB液體培養(yǎng)基于_80°C保存該菌種。L. Iactis 表達(dá)載體 pNZSllO 購(gòu)自荷蘭 NIZO Food Research (Kernhemseweg,Netherlands) 0其核苷酸序列為SEQ ID NO. 3所示，含啟動(dòng)子Pnis、分泌信號(hào)肽序列ssusp45、多克隆酶切位點(diǎn)、復(fù)制子repC和repA及氯霉素抗性基因cm等元件。幽門螺桿菌菌株Helicobacter pylori MEL-HP27為在位于中國(guó)北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)的中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏的菌株，保藏日期為2005年3月29號(hào)，保藏號(hào)為CGMCC NO. 1338，分類命名為幽門螺桿菌Helicobacterpylorio幽門螺桿菌菌種保存方法屬于公知技術(shù)。發(fā)明人采用100g/L的鹿糖溶液與等體積胎牛血清的混合液為菌株保存液，將菌株保存于_80°C冰箱。E.coli MC1061 菌株(F-araD139A (ara-leu)7696 galE15 galK16A (lac)X74rpsL (Strr) hsdR2 (rK_mK+)mcrA mcrBl)是常用基因工程菌株，屬于公知技術(shù)，可于美國(guó)BocaScientifc Inc.公司或 Sigma-Aldrich 公司購(gòu)得。( 二)本發(fā)明實(shí)驗(yàn)中使用和涉及的培養(yǎng)基的配制(I) LB 培養(yǎng)基LB液體培養(yǎng)基稱取I. Og胰蛋白胨,0. 5g酵母浸粉,I. Og氯化鈉，溶于IOOml蒸餾水中，用10mol/LNa0H調(diào)pH值至7. 2，121 °C高壓滅菌20min，置4°C保存?zhèn)溆?。LB固體培養(yǎng)基稱取I. Og胰蛋白胨，0. 5g酵母浸粉，I. Og氯化鈉，I. 5g瓊脂粉，溶于IOOml蒸懼水中，用10mol/LNa0H調(diào)pH值至7. 2,121 °C高壓滅菌20min,冷卻至約50°C時(shí)傾注平板備用。⑵乳酸菌培養(yǎng)基GM17培養(yǎng)基稱取4. 25gM17培養(yǎng)基，溶于80ml蒸餾水中，用10mol/L NaOH調(diào)pH值至7. 2，定容至100ml，121 °C高壓滅菌20min，冷卻后加入葡萄糖至終濃度為5. 0g/L。GM17培養(yǎng)基平板稱取4. 25g GM17培養(yǎng)基，I. 5g瓊脂粉，溶于80ml蒸餾水中，用10mol/LNa0H調(diào)pH值至7. 2，定容至100ml，121 °C高壓滅菌20min，冷卻至約60°C時(shí)加入葡萄糖至終濃度為5. 0g/L，混勻后將培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中，制成培養(yǎng)基平板。GSGM17培養(yǎng)基稱取85. 50g蔗糖，12. 50g甘氨酸，18. 63g M17培養(yǎng)基，溶于400ml蒸餾水中，用lOmol/LNaOH調(diào)pH值至7. 2，定容至500ml，高壓滅菌。冷卻后加入葡萄糖至終濃度為5. 0g/L。GM17MC 恢復(fù)培養(yǎng)基稱取 3. 73g M17 培養(yǎng)基，0. 19g MgCl2, 0. 02g CaCl2，溶于 80ml蒸餾水中，用lOmol/LNaOH調(diào)pH至7. 2，定容至100ml，高壓滅菌。冷卻后加入葡萄糖至終濃度為5. 0g/L。
(3)幽門螺桿菌培養(yǎng)基布氏血平板培養(yǎng)基稱取大豆蛋白胨l.OOg，胰蛋白胨1.0(^，酵母浸出粉0. IOg,氯化鈉0. 50g,亞硫酸鈉0. Olg,瓊脂粉I. 50g,加入蒸懼水100ml,調(diào)pH至7. 2,121 °C高壓滅菌20min,冷卻至60°C左右時(shí),加入羊血8ml,胎牛血清5ml,并加入下列4種抗生素10mg/L萬古霉素0. 5ml,2mg/L兩性霉素0. 5ml，2500U/L多粘菌素0. lml,5mg/L磺胺增效劑(TMP)0. 2ml?；靹蚝髢A倒入經(jīng)高壓滅菌的玻璃培養(yǎng)皿中。(三)本發(fā)明實(shí)驗(yàn)中使用的試劑M17培養(yǎng)基(青島海博生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品)、氯霉素(美國(guó)Amresco公司)、T4DNA連接酶和限制性內(nèi)切酶NaeI和SphI等(美國(guó)Fermentas公司)、凝膠回收試劑盒(杭州愛思進(jìn)(AxyGen)生物科技有限公司)、質(zhì)粒提取試劑盒和DNA marker III (北京康為世紀(jì)科技有限公司)、RNA酶(RNaseA)和PCR反應(yīng)試劑盒(北京天根生化科技有限公司)、 其他常用試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純級(jí)試劑。未作特別說明的實(shí)驗(yàn)材料與方法屬于公知技術(shù)，在生物技術(shù)領(lǐng)域常用工具書，例如，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(J薩姆布魯克和D. W拉塞爾著，第三版，科學(xué)出版社，2002)，中可查到。實(shí)施例I乳酸乳球菌表達(dá)載體pNZ8110-hpaA-lysM的構(gòu)建乳酸乳球菌表達(dá)載體pNZ8110-hpaA-lysM的構(gòu)建參見圖I。I幽門螺桿菌基因組DNA的制備I. I米用布氏血平板培養(yǎng)基，于37°C,5%C02,微需氧條件下，培養(yǎng)幽門螺桿菌MEL-HP27菌株3 4d，用接種環(huán)刮取I 2環(huán)菌體，加入0. 5ml滅菌去離子水和100 u I IOOg/L SDS 溶液，100。。煮沸 5min。I. 2加RNaseA (至終濃度50 U g/ml)于37°C水浴作用lh，然后加入蛋白酶K至終濃度為50 u g/ml，于42°C水浴Ih。I. 3分別用等體積的苯酚、酚氯仿(苯酚與氯仿等體積混合物)、氯仿各抽提一次。I. 4加入2倍體積冰預(yù)冷的無水乙醇和1/10體積2. 5mol/L醋酸鈉，于_20°C使DNA 沉淀 lh, 15000r/min 離心 15min。I. 5用75%無水乙醇洗滌沉淀兩次，自然晾干，將DNA沉淀溶于100 U I去離子水中，于-20°C保存?zhèn)溆谩?.幽門螺桿菌hapA基因的PCR擴(kuò)增2. I引物設(shè)計(jì)與合成根據(jù)Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)中幽門螺桿菌hpaA基因序列(Genbank:DQ353891),利用生物軟件Primer5. 0設(shè)計(jì)PCR引物，上游引物Pl序列為5’ -CGTGCCGGCATGAAAGCAAATAATC-3’ (SEQ ID NO. 4)，含有 Nae I 酶切位點(diǎn)，下游引物 P2 序列為 5’ -ACATGCATGCTTATCGGTTTCT-3，(SEQ ID NO. 5)，含有 Sph I 酶切位點(diǎn)。2. 2幽門螺桿菌hpaA基因的PCR擴(kuò)增⑴PCR反應(yīng)體系參照PCR反應(yīng)試劑盒(北京天根生化科技有限公司)說明配制50 U I 反應(yīng)體系:2011] 的上游引物1111，2011]\1的下游引物111 l，2XTaq PCR Master Mix25 ill，幽門螺桿菌基因組DNA模板2 ill，加去離子水至50 ill。⑵PCR循環(huán)條件95°C預(yù)變性5min，94 V變性60s，50 V退火50s，72°C延伸50s，共30個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸IOmin。⑶PCR產(chǎn)物分析取3 ill PCR反應(yīng)產(chǎn)物，于I. 0%瓊脂糖凝膠中電泳，電壓為5V/cm,電泳20min,用凝膠圖像分析儀分析電泳結(jié)果。3.大腸桿菌MC1061菌株感受態(tài)細(xì)胞的制備應(yīng)用常規(guī)CaCl2法制備大腸桿菌MC1061菌株感受態(tài)細(xì)胞[J.薩姆布魯克，D. W拉塞爾著，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，第三版，科學(xué)出版社，2002]。4.大腸桿菌中質(zhì)粒pNZ8110_lysM的提取(I)從-80 V 冰箱中取保種的大腸桿菌(Escherichia coli) MC1061/pNZ81 IO-IysM菌株，接種于含氯霉素10 y g/ml的LB固體培養(yǎng)基，于30°C、5%C02培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)過夜(本發(fā)明說明書中過夜培養(yǎng)的時(shí)長(zhǎng)為12h 14h)。 (2)從培養(yǎng)板上挑取單菌落接種于5ml含10 y g/ml氯霉素的LB液體培養(yǎng)基，于37°C培養(yǎng)箱中搖震培養(yǎng)12h，轉(zhuǎn)速180r/min。(3)取3ml菌液，按常規(guī)大腸桿菌質(zhì)粒提取方法(堿裂解法)[J.薩姆布魯克，D. W拉塞爾著，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，第三版，科學(xué)出版社，2002]提取質(zhì)粒pNZ8110-lysM。將提取的質(zhì)粒置于_20°C貯存。5. hpaA基因與表達(dá)載體pNZ8110_lysM的雙酶切取PCR擴(kuò)增得到hpaA基因及提取的質(zhì)粒pNZ81 IO-IysM用限制性內(nèi)切酶SphI和NaeI進(jìn)行雙酶切。酶切體系質(zhì)粒pNZ8110或hpaA基因25 ii 1，IOXBuffer 5u I,SphIlu I, NaeI Iu 1，去離子水 18y I。37°C 酶切 12h，65°C 水浴 20min 滅活內(nèi)切酶。取 hpaA基因雙酶切產(chǎn)物5 ill于20g/L瓊脂糖凝膠電泳，取質(zhì)粒pNZ8110-lysM雙酶切產(chǎn)物5 yl用10g/L瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分析。6. hpaA基因片段與質(zhì)粒pNZ8110_lysM酶切產(chǎn)物的回收用凝膠回收試劑盒(杭州愛思進(jìn)生物技術(shù)有限公司)回收酶切片段，步驟如下⑴取50 U I雙酶切產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳中電泳20min，依據(jù)DNA Marker條帶的相應(yīng)位置，在紫外燈下切下含有目的片段的瓊脂糖凝膠，用濾紙將凝膠表面液體吸干，然后裝入I. 5ml的潔凈的EP管中，稱其重量，根據(jù)凝膠重量估算凝膠體積(IOOmg的凝膠按IOOu I體積估算)；⑵加入3個(gè)凝膠體積的溶液DE-A，混合均勻后于75°C水浴，間斷混合，直到凝膠完
全熔化。⑶加入0. 5個(gè)Buffer DE-A體積的Buffer DE-B,混合均勻。⑷將步驟三的混合液轉(zhuǎn)移到DNA制備管中，12000r/min離心Imin,棄濾液。(5)將制備管置回2ml離心管,加500 ii I Buffer Wl, 12000r/min離心30s,棄濾液。(6)將制備管置回2ml離心管，加700 u I Buffer W2, 12000r/min離心30s，棄濾液。以同樣的方法再用700 ii I Buffer W2洗漆一次，12000r/min離心lmin。⑴將制備管置回2ml離心管中，12000r/min離心lmin。⑶將制備管置于潔凈的I. 5ml離心管中，在制備膜中央加30 ill去離子水，室溫靜置 lmin。12000r/min 離心 2min 洗脫 DNA，DNA 置于 _20°C貯存。7. hpaA基因與表達(dá)載體pNZ8110_lysM的連接將凝膠回收得到的hpaA基因與乳酸乳球菌表達(dá)載體pNZ8110_1 y sM的雙酶切產(chǎn)物進(jìn)行連接。連接反應(yīng)體系10XBuffer 2 yl，T4DNA連接酶I yl，hpaA基因8 yl，pNZ8110-lysM載體2iil，去離子水7iil。于16°C進(jìn)行連接反應(yīng)16h。8.大腸桿菌MC106感受態(tài)細(xì)胞的制備從LB培養(yǎng)基平板上挑選大腸桿菌MC106單菌落，接種到5ml LB液體培養(yǎng)基中，180r/min搖振過夜。取Iml菌液加入100ml LB液體培養(yǎng)基中，37 °C，250r/min培養(yǎng)約80min,至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí),將菌液轉(zhuǎn)移至兩個(gè)50ml的聚丙烯管中，于冰中放置20min。于4°C,4000g離心IOmin,倒出上清。用IOml冰預(yù)冷的0. IM的CaCl2重懸細(xì)菌,置于冰中30min。于4°C，4000g離心lOmin，倒出上清。每管中加4ml 0. IM的CaCl2溶液，重懸細(xì)菌，按每管200 ii I菌液進(jìn)行分裝。4°C貯存,3天內(nèi)使用。9.大腸桿菌Escherichia coli MC1061感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化(I)取IOiil連接產(chǎn)物加入200 ill大腸桿菌MC1061感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕旋轉(zhuǎn)混勻,冰水中放30min。 (2)將 1.5ml Ep 管置于 42°C 水浴中，90s。(3)將管快速轉(zhuǎn)移到冰浴中，冷卻3min。(4)每管加800 u I LB液體培養(yǎng)基，37°C水浴IOmin后，將管放入搖床，120r/min振蕩培養(yǎng)45min使細(xì)菌復(fù)蘇。(5) 4000r/min離心5min，去除800 U I液體培養(yǎng)基，剩余液體混勻后涂含10 u g/ml氯霉素的LB固體培養(yǎng)板。室溫放30min，使菌液吸收。(6)倒置平板培養(yǎng),于37°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)約16h。10.陽性轉(zhuǎn)化菌的鑒定(I)菌液PCR鑒定從大腸桿菌轉(zhuǎn)化菌篩選培養(yǎng)基平板上挑取單菌落，接種到5ml含10 y g/ml氯霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)12h。以菌液為PCR模板，采用的前述PCR引物Pl和P2擴(kuò)增hpaA基因。PCR循環(huán)條件為95°C預(yù)變性5min，94°C變性60s，50°C退火50s，72°C延伸50s，共30個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸lOmin。取3 PCR反應(yīng)產(chǎn)物，于10g/L瓊脂糖凝膠中電泳，電壓為5V/cm,用DNAMarker做分子量標(biāo)記，電泳20min,用凝膠圖像分析儀分析電泳結(jié)果。(2)重組質(zhì)粒的酶切鑒定采用常規(guī)大腸桿菌質(zhì)粒提取法(堿裂解法)[J.薩姆布魯克，D. W拉塞爾著，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，第三版，科學(xué)出版社，2002]，從培養(yǎng)的轉(zhuǎn)化菌中提取重組質(zhì)粒。分別采用Sph I單酶切和Sph I +Nae I雙酶切鑒定質(zhì)粒。雙酶切體系質(zhì)粒15 yl，IOXBuffer
1，SphIl ii 1，NaeIl ii 1，去離子水 28ii I。單酶切體系質(zhì)粒 15 y I，IOXBuffer 5u I,Sph I 2 iil，去離子水28 ill。37°C酶切12h，65°C水浴20min滅活內(nèi)切酶。取酶切產(chǎn)物5 Ul用10g/L瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分析。(3)重組質(zhì)粒的測(cè)序鑒定由上海捷瑞生物工程有限公司對(duì)重組質(zhì)粒中hpaA基因進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果與GenBank 上公布的 hpaA 序列(Genbank:DQ353891)進(jìn)行 BLAST 比對(duì)。結(jié)果如下幽門螺桿菌hpaA的PCR擴(kuò)增結(jié)果以幽門螺桿菌基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增hpaA基因，取3iU PCR產(chǎn)物于10g/L瓊脂糖凝膠中電泳，結(jié)果顯示，PCR擴(kuò)增片段長(zhǎng)度與預(yù)期的hapA基因擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度(783bp)符合(圖2)。以陽性轉(zhuǎn)化菌菌液為模版，用引物Pl和P2對(duì)hpaA基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并用IOg/L瓊脂糖電泳分析PCR產(chǎn)物，結(jié)果顯示擴(kuò)增片段長(zhǎng)度與預(yù)期長(zhǎng)度一致(圖3)。從陽性轉(zhuǎn)化菌中提取重組質(zhì)粒，分別進(jìn)行Sph I單酶切和Nae I +Sph I雙酶切，酶切產(chǎn)物用10g/L瓊脂糖電泳分析，結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒單酶切和雙酶切片段長(zhǎng)度均與預(yù)期一致(圖4)，進(jìn)一步證實(shí)hapA基因正確插入表達(dá)載體pNZ8110-lysM中。對(duì)從陽性轉(zhuǎn)化菌中提取的重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序鑒定，結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒中包含hpaA基因序列(SEQ ID NO. 3),測(cè)序得到的hpaA基因序列(SEQ ID NO. 3)與Genbank上公布的hpaA基因序列(Genbank:DQ353891) —致,證實(shí)該重組質(zhì)粒即為構(gòu)建成功的乳酸乳球菌表達(dá)載體，將此表達(dá)載體命名為pNZ8110-hpaA-lysM，包含此表達(dá)載體的重組大腸桿菌命名為E. coli MC1061/pNZ8110-hpaA-lysM。采用含 200 ml/L 甘油和 10 u g/ml 氯霉素的LB培養(yǎng)基于-80°C保存該菌株。實(shí)施例2 構(gòu)建 L. lactis NZ3900/pNZ8110-hpaA-lysMI.乳酸乳球菌L. lactis NZ3900菌株感受態(tài)細(xì)胞的制備(I)從_80°C保存的L. lactis NZ3900菌種管中取200 y I菌液接種于5ml GSGM17培養(yǎng)基中，放入CO2培養(yǎng)箱，30 0C、5%C02靜置過夜培養(yǎng)；(2)將過夜培養(yǎng)的5ml菌液加入50ml GSGM17培養(yǎng)基中，30°C、5%C02靜置培養(yǎng)12h 14h ；(3)將培養(yǎng)的50ml菌液加入400ml GSGM17培養(yǎng)基中，30°C、5%C02靜置培養(yǎng)至OD6tltl約為0. 3 ；(4)將菌液于4°C、4000r/min離心20min,收集菌體；(5)用冰冷的400ml的洗液I (0. 5mol/L蔗糖，100ml/L甘油)洗滌一次，4000r/min、4°C離心20min,收集菌液；(6)用冰冷的 200ml 洗液 II (0. 5mol/L 蔗糖，100ml/L 甘油，50mM EDTA)重懸菌體，冰上靜置15min ;4000r/min、4°C離心20min,收集菌體；(7)再用冰冷的洗液I (0.5mol/L蔗糖，100ml/L甘油)IOOml重懸菌體，4000r/min、4°C離心20min,收集菌體；(8)用4ml冰冷的洗液I (0. 5mol/L蔗糖，100ml/L甘油)懸浮菌體，分裝入事先冰浴的0.5ml EP管中，每管40 iil，儲(chǔ)存于-80°C。2. L. lactis NZ3900 菌株的轉(zhuǎn)化將I ii I 重組質(zhì)粒 pNZ8110-hpaA-lysM(10ng 20ng)與 40ii I NZ3900 感受態(tài)細(xì)胞混合，轉(zhuǎn)入用冰預(yù)冷的0. 2cm電轉(zhuǎn)化杯中，設(shè)置電擊參數(shù)為2. 0KV,25 u F、200 Q，用紙巾擦干電轉(zhuǎn)化杯金屬電極片上水分，然后將轉(zhuǎn)化杯置于電擊槽中電擊。電擊后立即加入800 u IGM17MC恢復(fù)培養(yǎng)基，冰浴5min后轉(zhuǎn)入I. 5ml EP管中，恢復(fù)培養(yǎng)2h，將菌液涂布于含氯霉素的GM17培養(yǎng)板上，待菌液被吸收后，于30°C、5%C02培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)40h，篩選鑒定陽性轉(zhuǎn)化菌。3.乳酸乳球菌轉(zhuǎn)化菌的鑒定從篩選陽性轉(zhuǎn)化菌的含10 U g/ml氯霉素的GM17培養(yǎng)板上挑取單菌落接種于5ml液體GM17培養(yǎng)基，于30°C、5%C02培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)12h。取3ml菌液，用于質(zhì)粒提取。
乳酸乳球菌轉(zhuǎn)化菌中質(zhì)粒的提取既可參照L. lactis NZ3900菌株供應(yīng)商提供的技術(shù)資料，也可使用高純度質(zhì)粒提取試劑盒(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)，按如下方法完成(I)將上 述所取的3ml菌液,加入離心管中，13000r/min離心lmin,棄上清，向留有菌體沉淀的離心管中加入250 ill Buffer Pl和lOOyl 100mg/ml的溶菌酶，使用渦旋振蕩
器懸浮細(xì)菌沉淀。(2)向離心管中加入250 U I Buffer P2，溫和地上下顛倒混勻4 6次，使菌體充分裂解。此時(shí)菌液應(yīng)變得清亮粘稠。所用時(shí)間不應(yīng)超過5min，以免質(zhì)粒受損傷。(3)向離心管中加入350 ii I BufferN3，立即溫和地上下顛倒混勻4-6次，此時(shí)出現(xiàn)白色絮狀沉淀。13000r/min離心IOmin,吸取上清，加入到已裝入Collection Tube的Spin ColumnCM 中。(4) 13000r/min 離心 30_60s,倒掉 Collection Tube 中的廢液，將 Spin ColumnCM 放回 Collection Tube 中。向 Spin Column CM 加入 500iil Buffer PB, 13000r/min 離心 30 60s,倒掉 Collection Tube 中的廢液,將 SpinColumn CM 重新放回 Collection Tube中。(5)向 Spin Column CM 中加入 700iil Buffer PW, 13000r/min 離心 30 60s,倒掉Collection Tube 中的廢液,將 Spin Column CM 重新放回收 Collection Tube 中。向 SpinColumn CM 中加入 500 u I Buffer Pff, 13000r/min 離心 lmin,倒掉 Collection Tube 中的廢液，將 Spin Column CM 重新放回收 Collection Tube 中。(6) 13000r/min離心lmin,倒掉廢液。將Spin Column CM置于室溫?cái)?shù)分鐘，以徹底晾干吸附膜上殘余的Buffer PW。將Spin Column CM置于一個(gè)新的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加50iil Buffer EB，室溫放置I 2分鐘，13000r/min離心lmin，將質(zhì)粒收集到離心管中，用于以下酶切和測(cè)序鑒定。采用實(shí)施例I中鑒定重組質(zhì)粒(pNZ8110-hpaA-lysM)的方法對(duì)從乳酸轉(zhuǎn)化菌轉(zhuǎn)化菌中提取的質(zhì)粒進(jìn)行酶切和測(cè)序鑒定，酶切體系和反應(yīng)條件相同。結(jié)果如下對(duì)從乳酸乳球菌陽性轉(zhuǎn)化菌中提取的質(zhì)粒進(jìn)行酶切和測(cè)序鑒定的結(jié)果與實(shí)施例I中對(duì)重組質(zhì)粒pNZ8110-hpaA-1y sM的鑒定結(jié)果相同，表明得到的陽性轉(zhuǎn)菌中為含有重組質(zhì)粒pNZ8110-hpaA-lysM重組乳酸乳球菌菌株，將該菌株命名為L(zhǎng). lactis NZ3900/pNZ8110-hpaA-lysM (保藏編號(hào)為 CGMCC NO. 6115)。采用含 150ml/L 甘油和 10 u g/ml 氯霉素的GM17培養(yǎng)基于_80°C保存該菌株。實(shí)施例3重組菌株L. lactis NZ3900/pNZ8110的制備重組菌株L. lactis NZ3900/pNZ8110的制備可以參照L. lactis NZ3900菌株銷售方荷蘭NIZO Food Research或德國(guó)Mobitec公司提供的技術(shù)方法,也可采用以下方法I.制備 L. lactis NZ3900 感受態(tài)細(xì)胞方法同實(shí)施例2。2.電轉(zhuǎn)化L. lactis NZ3900菌株感受態(tài)細(xì)胞取Iiil 表達(dá)載體 pNZ8110(10ng 20ng)與 40iilL. lactis NZ3900 感受態(tài)細(xì)胞混合，電轉(zhuǎn)化L. Iactis和陽性轉(zhuǎn)化菌的篩選方法參見實(shí)施例2。
3. L. lactis陽性轉(zhuǎn)化菌的鑒定3. I從篩選陽性轉(zhuǎn)化菌的含10 u g/ml氯霉素的GM17培養(yǎng)板上挑取單菌落接種于5ml液體GM17培養(yǎng)基，于30°C、5%C02培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)12h。取3ml菌液，參照實(shí)施例2的方法從乳酸乳球菌轉(zhuǎn)化菌中提取質(zhì)粒。3. 2分別用NaeI和Sph I單酶切提取的質(zhì)粒。NaeI酶切體系為NaeIl yl、IOXBuffer 2 yl、質(zhì)粒10 yl、去離子水9 yl。37°C酶切4h。Sph I酶切體系為SphII Iu UlOXBuffer 2 yl、質(zhì)粒10 yl、去離子水9 yl。37°C酶切4h。酶切產(chǎn)物用10g/L的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分析。結(jié)果顯示從篩選的陽性轉(zhuǎn)化菌中提取的質(zhì)粒經(jīng)酶切得到片段長(zhǎng)度與預(yù)期片段長(zhǎng)度3459bp符合，證明該陽性轉(zhuǎn)化菌為構(gòu)建正確的重組L. Iactis菌株，將其命名為L(zhǎng). lactisNZ3900/pNZ8110o 采用含 150ml/L 甘油和 10 y g/ml 氯霉素的 GM17 培養(yǎng)基于-80°C保存該菌株。
實(shí)施例4幽門螺桿菌菌體裂解抗原免疫小鼠血清的制備I.幽門螺桿菌菌體裂解抗原(lysate antigens)的制備采用布氏血平板培養(yǎng)基，于37°C，5%C02，微需氧條件下，培養(yǎng)幽門螺桿菌H. pyloriMEL-HP27菌株3 4天。將培養(yǎng)的幽門螺桿菌刮入生理鹽水中，混勻后離心去上清。用6mlPBS (IOmM Na2HPO4, 2. 7mM KCl, 137mM NaCl,2mM KH2PO4, pH 7. 4)重懸細(xì)菌，進(jìn)行超聲破碎，條件為300w,超聲IOs,間歇10s，共30次。超聲破碎物于40C，8000g離心30min,取上清測(cè)定總蛋白濃度，調(diào)整蛋白濃度為0. g/iil。為制備初次免疫抗原，取2ml濃度為0. 5 u g/ u I幽門螺桿菌菌體裂解抗原與2ml弗氏完全佐劑混勻后，進(jìn)行超聲乳化，條件為200w, IOs,間歇lmin，共4次。為制備加強(qiáng)免疫抗原，取2ml濃度為0. 5 y g/的幽門螺桿菌菌體裂解抗原與2ml弗氏不完全佐劑混勻后，進(jìn)行超聲乳化，條件為200w，10s,間歇lmin,共 4 次。2.免疫小鼠選擇8周齡的Balb/c小鼠10只，第I周，每只小鼠兩只后腿和腹腔注射初次免疫抗原200 Ul (約含總蛋白50 y g)，分別在第2周、第3周、第4周以同樣的方式注射加強(qiáng)免疫抗原(200 iil/次/只，約含總蛋白50iig)各I次。3.采集血清與抗體檢測(cè)最后I次免疫后I周，摘眼球取血，分離血清，-20°C保存?zhèn)溆谩Ｍㄟ^Westernblots，檢測(cè)到制備的小鼠免疫血清與幽門螺桿菌菌體裂解抗原呈陽性反應(yīng)，證明免疫血清制備成功。也可采用常規(guī)ELISA方法測(cè)定免疫血清抗體滴度[J.薩姆布魯克，D. W拉塞爾著，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，第三版，科學(xué)出版社，2002]。實(shí)施例5L. lactis NZ3900/pNZ8110-hpaA-lysM的誘導(dǎo)表達(dá)與免疫鑒定I.誘導(dǎo)劑乳酸鏈球菌素Nisin的配制(10mg/ml)稱取純度為2. 5%(ff/ff)的Nisin干粉0. 20g，溶于0. 5ml 0. 5ml/L的乙酸溶液中，振蕩數(shù)分鐘促進(jìn)溶解，12000r/min離心IOmin,取上清即為10mg/ml Nisin儲(chǔ)存液。臨用前用去離子水稀釋至IOii g/ml備用。2.菌株 L. lactis NZ3900/pNZ8110-hpaA_lysM 的活化取_80°C凍存的菌株L. lactis NZ3900/pNZ8110-hpaA_lysM劃線接種于含氯霉素10 U g/ml的GM17固體培養(yǎng)板上，于30°C、5%C02培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)40h。挑取單菌落接種于4ml含10 ii g/ml氯霉素的GM17液體培養(yǎng)基中，于30°C、5%C02培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)12h，即成為活化種子菌液。3.菌株 L. lactis NZ3900/pNZ8110-hpaA_lysM 的誘導(dǎo)表達(dá)取活化的種子菌液400 U I轉(zhuǎn)種于IOml含10 y g/ml氯霉素的GM17液體培養(yǎng)基，370C靜止培養(yǎng)至OD600為0. 3 0. 4時(shí)，加入Nisin工作液至終濃度為40ng/ml，誘導(dǎo)5h。同時(shí)以菌株 L. lactis NZ3900 和 L. lactis NZ3900/pNZ8110 為陰性對(duì)照。4. L. Iactis細(xì)胞壁蛋白的提取取誘導(dǎo)后的菌液IOml,于4°C、4300g離心5min,棄上清，留取菌體細(xì)胞沉淀；菌體沉淀用 TES 緩沖液(50mM Tris-HCl, ImM EDTA，pH7. 4)洗滌兩次；菌體用 200 yl TES-LMR 緩沖液(50mM Tris-HCl, ImM EDTA, 20% 鹿糖，30mg/ml 溶菌酶,0. lmg/mlRNase A, pH7. 4)懸 ??；于371溫浴3h，期間混勻數(shù)次，使TES-LMR充分消化細(xì)胞壁；于41、2500(^離心lOmin，取上清，菌體沉淀保存?zhèn)溆茫簧锨逡褐屑尤胗帽A(yù)冷的80%三氯醋酸水溶液(V/V)50iU，使其終濃度為16%，以沉淀細(xì)胞壁釋放的蛋白質(zhì)。冰浴20min，4°C、11500g離心lOmin，棄上清液；沉淀用100 ill 50mM NaOH懸浮，4°C作用12h后離心取上清。5. L. lactis NZ3900/pNZ8110-hpaA-lysM 表達(dá)蛋白的 SDS-PAGE 分析參照文獻(xiàn)[J.薩姆布魯克和D.W拉塞爾著，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，第三版，科學(xué)出版社，2002]，操作步驟如下5. I取2 ill蛋白提取物用Bradford法測(cè)定OD595,從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查找相應(yīng)蛋白質(zhì)量，即可計(jì)算出蛋白濃度。取相同的蛋白量分別加入2X上樣緩沖液，100°C煮5min，冷卻后進(jìn)行SDS-PAGE電泳。5. 2制備分離膠和濃縮膠配制12%分離膠，混勻后加入凝膠板中，室溫聚合約Ih ；配制5%濃縮膠，混合均勻后灌膠，放置樣品梳，室溫聚合約30min。5. 3上樣及電泳取相同蛋白量的各個(gè)樣品行SDS-PAGE電泳，電泳緩沖液為IX甘氨酸緩沖液，濃縮膠中電泳電壓為80V，待溴酚藍(lán)電泳至濃縮膠與分離膠交界時(shí)，更換電壓為120V，待溴酚藍(lán)電泳至凝膠下緣時(shí)停止電泳。6.重組菌株L. lactis NZ3900/pNZ8110-hpaA_lysM表達(dá)蛋白的免疫學(xué)鑒定采用Western blots方法,參照文獻(xiàn)[J.薩姆布魯克和D. W拉塞爾著,分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，第三版，科學(xué)出版社，2002]，具體步驟如下6. I轉(zhuǎn)膜實(shí)施例4的SDS-PAGE電泳結(jié)束后，將凝膠取出，用去離子水漂洗lOmin，然后放在轉(zhuǎn)移液中平衡IOmin ;剪與膠大小相同的硝酸纖維素膜(北京索萊寶科技有限公司)一張和兩張稍小的超厚濾紙，放入轉(zhuǎn)移緩沖液，浸泡15min，浸泡好后，取出凝膠、硝酸纖維素膜和濾紙，從下往上依次為超厚濾紙、NC膜、凝膠、超厚濾紙，放入Bio-Rad半干式電轉(zhuǎn)儀中，轉(zhuǎn)膜條件為18V、10min。6. 2 封閉轉(zhuǎn)印后，硝酸纖維素膜用 PBS (IOmM Na2HPO4, 2. 7mM KCl, 137mM NaCl,2mM KH2PO4,pH 7. 4)漂洗一次，然后將硝酸纖維素膜置于封閉液(含20g/L脫脂奶粉的PBS)中，室溫緩慢搖動(dòng)封閉2h，封閉后，用PBS洗滌3次，每次漂洗lOmin。6. 3 —抗反應(yīng)免疫血清用封閉液1:100稀釋，硝酸纖維素膜置于稀釋后的免疫血清中，37°C 孵育 lh。用 PBS 洗 3 次，每次漂洗 lOmin。再用 TBS(0. 15mM NaCl，0. IM Tris-HCl,pH 7. 5)漂洗3次，每次持續(xù)IOmin ；6. 4 二抗反應(yīng)在硝酸纖維素膜上加入用含20g/L脫脂奶粉的TBS稀釋過的辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG，37°C lh，用TBS溶液漂洗3次，每次IOmin ；
6. 5顯色將硝酸纖維素膜放入平皿中，用DBA顯色試劑盒(北京康為世紀(jì)科技有限公司)進(jìn)行顯色，參照產(chǎn)品說明書，步驟為取Iml試劑B入到I. 5ml離心管中，再向離心管中加入50 u I試劑A，混勻后，將混合液滴加在硝酸纖維素膜上，顯色f 5min，顯色后把膜放入到去離子水中浸泡，終止反應(yīng)。結(jié)果如下SDS-PAGE 結(jié)果顯示，重組菌株 L. lactis NZ3900/pNZ8110-hpaA-lysM 與對(duì)照菌株L. lactis NZ3900、L. lactis NZ3900/pNZ8110在菌體總蛋白和細(xì)胞壁蛋白電泳圖譜上均無顯著差異(圖5)，可能與菌體蛋白組分復(fù)雜、與目的蛋白分子量相近的背景蛋白呈高表達(dá)及SDS-PAGE分析的敏感性較低等因素有關(guān)。Western blots結(jié)果顯不在乳酸乳球菌重組菌株L. lactis NZ3900/PNZ8110-hpaA-lysM細(xì)胞壁蛋白圖譜中，在預(yù)期位置(29KD)出現(xiàn)明顯的雜交帶，而陰性對(duì)照菌株L. lactis NZ3900和L. lactis NZ3900/pNZ8110在相應(yīng)位置均無雜交條帶(圖6)。結(jié)果表明，乳酸乳球菌重組菌株L. lactis NZ3900/pNZ8110-hpaA-lysM能夠于菌體胞壁展示表達(dá)HpaA蛋白，而且該表達(dá)蛋白具有幽門螺桿菌HpaA抗原的免疫活性。實(shí)施例6L. lactis NZ3900/pNZ8110-hpaA_lysM菌株在制備口服疫苗中的應(yīng)用L. lactis NZ3900/pNZ8110-hpaA-lysM菌株在制備口服疫苗中的應(yīng)用包括將該重組菌株用于制備防治幽門螺桿菌感染及相關(guān)疾病的口服疫苗。此類應(yīng)用的一種可行的技術(shù)方案是培養(yǎng)重組菌株L. lactis NZ3900/pNZ8110-hpaA-lysM，通過Nisin誘導(dǎo)使菌體表面展示表達(dá)幽門螺桿菌疫苗抗原，將菌液制成適合人類口服的劑型，制劑被人類口服后可產(chǎn)生預(yù)防幽門螺桿菌感染的免疫作用。實(shí)施例7L. lactis NZ3900/pNZ8110-hpaA-lysM菌株在制備免疫診斷試劑的應(yīng)用方案I :培養(yǎng) L. lactis NZ3900/pNZ8110-hpaA-lysM 菌株；用誘導(dǎo)劑 Nisin 誘導(dǎo)hpaA基因表達(dá)；菌液經(jīng)離心，分離得到菌體，用10ml/L甲醛溶液固定后，于4°C貯存?zhèn)溆?；取適量菌體，加入待檢測(cè)血清，37°C溫育2h，用PBS液(IOmM Na2HPO4, 2. 7mM KCl，137mMNaCl,2mM KH2PO4,pH 7. 4)洗滌菌體3次；加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗人IgG抗體，37°C溫育2h，用TBS液(0. 15mM NaCl, 0. IM Tris-HCl, pH 7. 5)洗菌體3次；加酶的底物(如DAB)顯色；菌液經(jīng)離心后取上清，用分光度計(jì)測(cè)定菌液上清的OD值，以乳酸乳球菌NZ3900/PNZ8110菌體為陰性對(duì)照，設(shè)立陽性反應(yīng)判定標(biāo)準(zhǔn)，確定檢測(cè)結(jié)果。普通ELISA檢測(cè)血清抗體時(shí)需要先用抗原包被ELISA反應(yīng)孔，因此耗時(shí)較長(zhǎng)，操作較繁瑣。該方案無需用抗原包被ELISA反應(yīng)孔，免疫反應(yīng)可以在普通0. 5ml Ep管中完成，不依賴ELISA反應(yīng)板，在技術(shù)上有實(shí)質(zhì)性的特點(diǎn)和顯著進(jìn)步。方案2 :體外培養(yǎng)乳酸乳球菌重組菌株NZ3900/pNZ8110-hpaA-lysM，用誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)hpaA基因表達(dá)；菌液經(jīng)離心處理分離出菌體，含1%甲醛的PBS液固定菌體，于4°C貯存?zhèn)溆?；取適量菌體，加入待檢測(cè)血清，37溫育2h，用PBS液洗菌體3次；加入熒光標(biāo)記羊抗人IgG抗體37°C溫育2h，用PBS緩沖液洗菌體3次；通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)熒光染色的菌體；由于檢測(cè)到特異性熒光染色菌體，能反映待檢血清中抗HpaA抗體的存在，因此該方案可為診斷幽門螺桿菌感染提供免疫學(xué)依據(jù)。該方案用表面攜帶抗原(HpaA)的乳酸乳球菌菌體代替流式細(xì)胞分析(免疫磁珠法或液相芯片法)中的免疫磁珠，用于檢測(cè)血清中的抗體，可以避免制備免疫標(biāo)記磁珠的繁瑣步驟，可顯著減少檢測(cè)成本，具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，符合該領(lǐng)域技術(shù)發(fā)展的趨勢(shì)。實(shí)施例8L. lactis NZ3900/pNZ8110-hpaA_lysM菌株在食品加工中的應(yīng)用取適量乳酸乳球菌重組菌株L. lactis NZ3900/pNZ8110-hpaA-lysM，作為發(fā)酵菌株，用于乳制品或其它食品加工工藝中，使產(chǎn)品具有預(yù)防幽門螺桿菌感染及其相關(guān)疾病的有益作用。該菌株的此類應(yīng)用可望為我國(guó)食品工業(yè)尤其是乳制品工業(yè)發(fā)展產(chǎn)生促進(jìn)作用，產(chǎn)生巨大社會(huì)和經(jīng)濟(jì)效益。序列表SEQUENCE LISTING
<110>鄭州大學(xué) <120>在乳酸乳球菌表面展示表達(dá)幽門螺桿菌蛋白的載體及其制備方法和應(yīng)用〈160〉6〈170〉PatentIn version 3. 5〈210〉 I〈211〉3709〈212〉DNA〈213〉人工序列〈221〉 pNZ81IO-IysM〈222〉 (I).. (3709)〈400〉Iagatctagtc ttataactat actgacaata gaaacattaa caaatctaaa acagtcttaa 60ttctatcttg agaaagtatt ggtaataata ttattgtcga taacgcgagc ataataaacg 120gctctgatta aattctgaag tttgttagat acaatgattt cgttcgaagg aactacaaaa 180taaattataa ggaggcactc accatggcta aaaaaaagat tatctcagct attttaatgt 240ctacagtgat actttctgct gcagccccgt tgtcaggtgt ttacgccggc tgcagccggc 300gtaaacacct gacaacgggg ctgcaggcat gcgacggacg gagcttcttc agctggaaat 360actaattctg gtggctcgac aaccacaatt acgaataata attctggaac caatagcagt 420tcaactactt ataccgtcaa atctggtgat actctttggg gaatctcaca aagatatgga 480attagtgtcg ctcaaattca aagtgcgaat aatcttaaaa gtaccattat ctacattggt 540caaaaacttg tactgacagg ttcagcttct tctacaaatt caggtggttc ataatctaga 600gagctcaagc tttctttgaa ccaaaattag aaaaccaagg cttgaaacgt tcaattgaaa 660tggcaattaa acaaattaca gcacgtgttg ctttgattga tagccaaaaa gcagcagttg 720ataaagcaat tactgatatt gctgaaaaat tgtaatttat aaataaaaat caccttttag 780aggtggtttt tttatttata aattattcgt ttgatttcgc tttcgataga acaatcaaag 840cgagaataag gaagataaat cccataaggg cgggagcaga atgtccgaga ctaatgtaaa 900tttgtccacc aattaaagga ccgataacgc gagcttctcg agtgcatatt ttcggcaatc 960ttctcaatga gatgctcttc agcatgttca atgatgtcga ttttttatta aaacgtctca 1020
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〈212〉DNA〈213〉人工序列〈221〉 IysM〈222〉 (I). . (266)〈400〉2atgcgacgga cggagcttct tcagctggaa atactaattc tggtggctcg acaaccacaa 60ttacgaataa taattctgga accaatagca gttcaactac ttataccgtc aaatctggtg 120atactctttg gggaatctca caaagatatg gaattagtgt cgctcaaatt caaagtgcga 180ataatcttaa aagtaccatt atctacattg gtcaaaaact tgtactgaca ggttcagctt 240cttctacaaa ttcaggtggt tcataa266〈210〉3〈211〉783〈212〉DNA〈213〉 Helicobacter pylori〈221〉hpaA〈222〉 (1)..(783)atgaaagcaa ataatcattt taaagatttt gcatggaaaa aatgcctttt aggcgcgagc 60gtggtggctt tgttagtggg atgcagtccg catattattg aaaccaatga agtcgctttg 120aaattgaatt accatccagc tagcgagaaa gttcaagcgt tagatgaaaa gattttactt 180ttaaagccag cttttcaata cagcgataat attgctaaag agtatgaaaa caaattcaag 240aatcaaacca cgctcaaggt tgaacagatt ttgcaaaatc agggctataa ggttattaat 300gtagatagca gcgataaaga cgatctttct tttgcgcaaa aaaaagaagg gtatttggcc 360gttgctatga gtggcgaaat tgttttacgc cccgatccta aaagaaccac acagaaaaaa 420tcagaacccg ggttattatt ctccactggt ttggataaaa tggaaggggt tttaatcccg 480gccgggttta tcaaggttac catattagag cctatgagtg gggaatcttt agattctttt 540acgatggatt tgagcgagtt ggacattcaa gaaaaattct taaaaaccac ccattcaagc 600catagcgggg ggttagttag cactatggtt aagggaacgg ataattctaa tgatgcgatc 660aagagcgctt tgaataagat ttttgcaaat atcatgcaag aaatagacaa aaagctcact 720caaaagaatt tagaatctta tcaaaaagac gctaaggaat tgaaaaacaa gagaaaccga 780taa783〈210〉 權(quán)利要求
1.一種在乳酸乳球菌表面展不表達(dá)幽門螺桿菌蛋白的載體，其特征在于包含有SEQID NO. 6所示的核苷酸序 列。
2.一種表達(dá)幽門螺桿菌蛋白的重組乳酸乳球菌(Lactococcus lactis) NZ3900/pNZ8110-hpaA-lysM，其特征在于保藏編號(hào)為 CGMCC NO. 6115。
3.—種如權(quán)利要求I所述的在乳酸乳球菌表面展示表達(dá)幽門螺桿菌蛋白的載體的構(gòu)建方法，其特征在于包括以下步驟 1)以幽門螺桿菌基因組DNA為模板，用PCR方法得到幽門螺桿菌黏附素(HpaA)基因hpaA(SEQ ID NO. 3)； 2)將得到的hpaA基因與表達(dá)載體pNZ8110-lysM(SEQID NO. I)經(jīng)酶切后進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌Escherichia coli MC1061感受態(tài)細(xì)胞； 3)篩選陽性轉(zhuǎn)化菌，從陽性轉(zhuǎn)化菌中提取質(zhì)粒，酶切和測(cè)序鑒定結(jié)果與預(yù)期符合的質(zhì)粒即為在乳酸乳球菌表面展示表達(dá)幽門螺桿菌蛋白的載體，將其命名為pNZ8110-hpaA-lysM ； 4)用電穿孔法將pNZ8110-hpaA-lysM導(dǎo)入乳酸乳球菌NZ3900菌株，經(jīng)篩選和鑒定得到重組菌株 L. lactis NZ3900/pNZ8110-hpaA-lysM ； 5)培養(yǎng)L. lactis NZ3900/pNZ8110-hpaA-lysM 菌株，用乳酸鏈球菌素 Nisin 誘導(dǎo) hpaA基因的表達(dá)，提取細(xì)胞壁蛋白，用SDS-PAGE和Western blots法檢測(cè)蛋白表達(dá)。
4.一種如權(quán)利要求2所述的表達(dá)幽門螺桿菌蛋白的重組乳酸乳球菌菌株在制備抗幽門螺桿菌疫苗方面的應(yīng)用。
5.一種如權(quán)利要求2所述的表達(dá)幽門螺桿菌蛋白的重組乳酸乳球菌菌株在制備幽門螺桿菌感染診斷試劑方面的應(yīng)用。
6.一種如權(quán)利要求2所述的表達(dá)幽門螺桿菌蛋白的重組乳酸乳球菌菌株作為發(fā)酵菌株在食品加工中的應(yīng)用。
7.—種如權(quán)利要求2所述的表達(dá)幽門螺桿菌蛋白的重組乳酸乳球菌菌株在乳制品加工方面的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種具有在乳酸乳球菌表面展示表達(dá)幽門螺桿菌蛋白的載體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。該載體的構(gòu)建方法以幽門螺桿菌基因組DNA為模板，用PCR方法擴(kuò)增hpaA基因；將得到的hpaA基因與表達(dá)載體pNZ8110-lysM經(jīng)酶切后進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌；篩選并鑒定陽性轉(zhuǎn)化菌，從陽性轉(zhuǎn)化菌中提取重組質(zhì)粒pNZ8110-hpaA-lysM；用電穿孔法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入乳酸乳球菌NZ3900菌株，經(jīng)篩選和鑒定得到重組菌株L.lactis NZ3900/pNZ8110-hpaA-lysM；培養(yǎng)該重組菌株，用誘導(dǎo)劑Nisin誘導(dǎo)hpaA基因的表達(dá)。Western blots分析顯示重組菌株細(xì)胞壁蛋白中含有表達(dá)的HpaA蛋白，且該蛋白具有免疫活性。本發(fā)明提供的表達(dá)載體及包含該載體的重組菌株可應(yīng)用于抗幽門螺桿菌疫苗和診斷試劑的制備或食品加工。
文檔編號(hào)C12N1/21GK102796757SQ20121021842
公開日2012年11月28日 申請(qǐng)日期2012年6月28日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月28日
發(fā)明者段廣才, 張榮光, 程文濱, 范清堂, 張衛(wèi)東, 郗園林, 陳帥印 申請(qǐng)人:鄭州大學(xué)