專利名稱：一種利用金色鏈霉菌的冷凍搖瓶菌絲替代孢子接種的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，是一種利用金色鏈霉菌的冷凍搖瓶菌絲替代孢子接種的方法。在金霉素發(fā)酵工藝中，現(xiàn)行的金霉素發(fā)酵種子接種過程，是由3-6個生長良好的孢子瓶制備成孢子液，然后采用壓差法把孢子液接入種子罐進行培養(yǎng)。孢子液制備過程中，需要制備大量的孢子瓶來滿足生產(chǎn)的需要，并且對大量的孢子瓶的保藏需要多臺冷藏設(shè)備。本專利著重研制一種新的接種工藝(搖瓶菌絲進罐)，減少孢子的使用量。提高金色鏈霉菌的產(chǎn)抗能力及工作效率。具體為:用I個生長良好的孢子瓶，采用挖塊法取Icrn2左右孢子，接入滅菌后的搖瓶中進行培養(yǎng)。培養(yǎng)好后，混合均勻分裝到接種瓶中，采用壓差法把菌絲液接入種子罐進行培養(yǎng)。種子罐培養(yǎng)好后移入發(fā)酵罐進行發(fā)酵。
背景技術(shù)：
金霉素(Chlortetracycline),又稱氯四環(huán)素,屬四環(huán)素類中衍生物的一種?；瘜W名:6~ 甲基 ~4~ _■甲氣基 _3,6,10,12,12a-五輕基-1，11- _-氧代 ~7~ 氣-1,4,4a, 5, 5a, 6，11，12a-八氫-2-并四苯甲酰胺。分子量:478.8 ;分子式=C22H23ClN2O8。金霉素抗菌譜廣，對陽性菌、陰性菌、螺旋體、立克次氏體、支原體、衣原體、某些原蟲等均可產(chǎn)生抑制作用。金霉素的抗菌作用主要在于抑制細菌的生長，在其較高濃度時具有殺菌作用，其作用機制是干擾蛋白質(zhì)的合成。適用于雞白痢、傷寒、豬細菌性腸炎以及禽類副傷寒、霍亂等疾病。同時，作為理想的飼料添加劑它還具有預防潛在感染、改善消化代謝、抑制腸道內(nèi)有害微生物，促進有益微生物生長、提高飼料效能等。在全球范圍內(nèi)，金霉素是所有飼料藥物添加劑中使用量最大的品種，是國際上重要的獸用抗生素之一。在金霉素發(fā)酵工藝中，大型發(fā)酵罐現(xiàn)行的金霉素發(fā)酵種子接種過程，是由3-6個生長良好的孢子瓶制備成孢子液，每瓶加無菌水約30ml，用刮孢鏟將孢子磨下，將磨好的孢子液倒入已滅菌的空孢瓶內(nèi)，裝上微孔接種針備用。然后采用壓差法把孢子液接入種子罐進行培養(yǎng)。種子罐控制一定的生長時間，培養(yǎng)好后，再利用壓力差移入發(fā)酵罐進行發(fā)酵。但是這種接種方式容易產(chǎn)生一些問題。首先，孢子培養(yǎng)基主要原料為麩皮，麩皮為小麥最外層的表皮，小麥被磨面機加工后，變成面粉和麩皮兩部分，麩皮就是小麥的外皮，它價格低廉，富含纖維素和半纖維素，是微生物生長的優(yōu)良碳源，尤其是在鏈霉素的培養(yǎng)基中使用廣泛，對于促進產(chǎn)孢效果顯著。但麩皮的質(zhì)量受產(chǎn)地、品種、氣候、耕種條件、儲藏期限、制備工藝等諸多因素影響，無量化指標對其質(zhì)量進行有效控制。麩皮的波動直接影響培養(yǎng)的孢子，進而影響進罐種子質(zhì)量，對于后續(xù)的發(fā)酵產(chǎn)抗都會產(chǎn)生關(guān)聯(lián)，這種影響對于生產(chǎn)過程的控制增加了難度，很多時候更會給結(jié)果帶來不利的影響。其次，同一種子罐使用多只孢子瓶的孢子液，孢子的菌落差異導致種子生長階段存在一定的內(nèi)在差異，統(tǒng)一的種齡控制不能完美地滿足所有的種子。這會造成發(fā)酵過程起步狀態(tài)的不統(tǒng)一，同樣會給生產(chǎn)過程控制增加困難，并在一定程度上造成結(jié)果的差異化。
再次，采用此種制種方式，在工廠生產(chǎn)的孢子液制備環(huán)節(jié)中，需要制備大量的孢子瓶來滿足生產(chǎn)的需要，并且對大量的孢子瓶的保藏需要多臺冷藏設(shè)備。這無疑都增加了人員、設(shè)備的投入要求，不利于企業(yè)的生產(chǎn)成本控制，也給菌種的保藏管理帶來壓力。因此，我們尋求開發(fā)一種新的接種工藝，以搖瓶菌絲的接種形式代替孢子懸液進罐。搖瓶菌絲制備使用的孢子瓶孢子量較少，通過搖瓶培養(yǎng)，將孢子萌發(fā)為菌絲體，其生長階段和質(zhì)量趨一致性，對種子罐種齡和質(zhì)量控制更便捷、有效，能夠有效提高工業(yè)水平大容量發(fā)酵罐金霉素發(fā)酵的產(chǎn)抗能力及大規(guī)模發(fā)酵工業(yè)的工作效率

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，提供一種培養(yǎng)周期短，穩(wěn)定性好，生長成本低的新接種工藝。與傳統(tǒng)工藝比較，新的接種工藝以搖瓶菌絲的接種形式代替孢子懸液接種。搖瓶菌絲制備使用的孢子量較少，通過搖瓶培養(yǎng)，將孢子萌發(fā)為菌絲體，其生長階段和質(zhì)量趨于一致性，對微生物種子質(zhì)量控制更便捷、有效，能夠提高工業(yè)水平大容量金霉素產(chǎn)生菌的產(chǎn)抗能力及大規(guī)模發(fā)酵工業(yè)的工作效率。本發(fā)明的優(yōu)點和有益效果為:1:本項研究通過接種形式的改變，提高了發(fā)酵種子質(zhì)量的一致性，穩(wěn)定了發(fā)酵過程代謝，使發(fā)酵過程更易于控制；同時降低了種子制備的勞動強度，給工作帶來了顯著的改
盡
口 O2:與傳統(tǒng)工藝比較，新的接種工藝以搖瓶菌絲的接種形式代替孢子懸液接種。搖瓶菌絲制備使用的孢子量較少，通過搖瓶培養(yǎng)，將孢子萌發(fā)為菌絲體，其生長階段和質(zhì)量趨于一致性，對發(fā)酵種子培養(yǎng)和質(zhì)量控制更便捷、有效，能夠提高工業(yè)水平大容量金霉素產(chǎn)生菌的產(chǎn)抗能力及大規(guī)模發(fā)酵工業(yè)的工作效率。
具體實施例方式為了更好地理解本發(fā)明，下面結(jié)合實施例進一步闡明本發(fā)明的內(nèi)容，但本發(fā)明的內(nèi)容不僅僅局限于下面的實施。實施例1在金霉素發(fā)酵工藝中，現(xiàn)行的金霉素發(fā)酵種子接種過程，是由3-6個生長良好的孢子瓶制備成孢子液，然后采用壓差法把孢子液接入種子罐進行培養(yǎng)。種子罐培養(yǎng)好后移入發(fā)酵罐進行發(fā)酵。孢子液制備過程中，需要大量的孢子瓶來滿足生產(chǎn)的需要，并且，大量孢子瓶的保藏需要多臺冷藏設(shè)備。本項目著重研制一種新的接種工藝(搖瓶菌絲接種)，減少孢子的使用量，提高金色鏈霉菌的產(chǎn)抗能力及工作效率。具體為:用I個生長良好的孢子瓶，采用挖塊法取Icrn2左右孢子，接入滅菌后的搖瓶中進行培養(yǎng)。培養(yǎng)成熟后，混合均勻分裝到接種瓶中，采用壓差法把菌絲液接入種子罐進行 培養(yǎng)。種子罐培養(yǎng)成熟后移入發(fā)酵罐進行發(fā)酵。實踐表明，兩種接種方式比較，效價、產(chǎn)量均無明顯差異，金霉素產(chǎn)品質(zhì)量指標均能滿足國內(nèi)外產(chǎn)品質(zhì)量標準。
權(quán)利要求
1.一種利用金色鏈霉菌的冷凍搖瓶菌絲替代孢子接種的方法，包括:(1)孢子培養(yǎng)；(2)搖瓶菌絲；(3)種子培養(yǎng)；(4)深層液體通氣發(fā)酵，其中深層液體通氣發(fā)酵的條件如下:①發(fā)酵培養(yǎng)基組成:花生餅粉或黃豆餅粉:3.0% -5.0% ;玉米淀粉:8.0% -12.0% ;氯化鈉:0.2% -0.3%;硫酸銨:0.4% -0.6%;碳酸鈣:0.5% -0.8%;酵母粉:0.1% -1.6%;硫酸鎂:0.02% -0.03%;磷酸二氫鉀:0% -0.03%;淀粉酶:0.003% -0.02%;②培養(yǎng)溫度:接種后培養(yǎng)溫度控制在28-34°C，菌絲成熟后降溫至29±3°C培養(yǎng)；③發(fā)酵周期為90-124小時；④發(fā)酵培養(yǎng)基消后PH控制在5.6-6.5 發(fā)酵培養(yǎng)過程中為固定轉(zhuǎn)速，控制在120-140rpm ；⑥溶氧大于30%。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用金色鏈霉菌的冷凍搖瓶菌絲替代孢子接種的方法，其特征在于:從母瓶上挑取孢子豐滿、無白點的單菌落4-10只于約1-1Oml無菌水中，攪勻，用玻璃鏟挑取孢子液，接入子瓶斜面培養(yǎng)基上；要求菌落分布均勻，密布整個培養(yǎng)基表面；接好的斜面標識后，置于溫度32土1°C、濕度40-65%的恒溫室內(nèi)培養(yǎng)3-5天，成熟后置于0-10°C冰箱保藏備用。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用金色鏈霉菌的冷凍搖瓶菌絲替代孢子接種的方法，其特征在于:搖瓶種子培養(yǎng)成熟后，在無菌條件下，將種子液合并為150mL/瓶的接種瓶內(nèi)，可直接用于種子罐培養(yǎng)，也可將合瓶后的種子液于_20°C冰箱內(nèi)冷凍保藏，保藏期限< 45天。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用金色鏈霉菌的冷凍搖瓶菌絲替代孢子接種的方法，其特征在于:將保藏的搖瓶菌絲室溫下解凍，接入種子罐內(nèi)培養(yǎng)；種子罐培養(yǎng)溫度控制在26-33°C，罐壓控制在0.04-0.06Mpa條件下進行培養(yǎng)，從消后到培養(yǎng)過程中，取樣做無試檢查與生化參數(shù)(pH值、總糖、氨基氮、效價等)檢驗，培養(yǎng)時間19-25小時，二級種子液培養(yǎng)時間4-8小時，種子生 長良好可移入發(fā)酵罐。
全文摘要
本發(fā)明涉及到一種利用金色鏈霉菌的冷凍搖瓶菌絲替代孢子接種的方法，包括(1)孢子培養(yǎng)；(2)搖瓶菌絲；(3)種子培養(yǎng)；(4)深層液體通氣發(fā)酵。本發(fā)明著重研制一種新的接種工藝(搖瓶菌絲發(fā)酵)，用冷凍搖瓶菌絲替代孢子接種，減少孢子的使用量，提高發(fā)酵種子種齡和種子質(zhì)量的一致性，穩(wěn)定微生物代謝，降低種子制備工作量和勞動強度，提高金色鏈霉菌的產(chǎn)抗能力及工作效率。
文檔編號C12R1/49GK103074245SQ201210299280
公開日2013年5月1日 申請日期2012年8月22日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月22日
發(fā)明者李亞峰, 王友琦, 張雪崢 申請人:駐馬店華中正大有限公司