專利名稱：一種重組菌絲霉素及其制備方法和用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及基因工程領域，具體涉及一種重組菌絲霉素及其制備方法和用途。
背景技術：
近年來由于經(jīng)濟與利益的驅使，濫用抗生素和超標使用抗生素的現(xiàn)象普遍存在。隨著抗生素廣泛而長期的使用，其負面作用日益凸顯，細菌的耐藥性與藥物殘留嚴重威脅著人類健康，尋求抗生素替代品勢在必行。我國現(xiàn)已開發(fā)了抗菌肽、益生素、糖萜素、低聚糖、中草藥、酶制劑、酸化劑等綠色添加劑以替代抗生素。抗菌肽是宿主免疫系統(tǒng)產(chǎn)生的一類非特異性的抵抗外界病原體感染的免疫應答 產(chǎn)物，廣泛存在于昆蟲、植物、動物及人體內。抗菌肽因其種類多，來源安全，抗菌活性高，抗菌譜廣，靶菌株不易產(chǎn)生抗性突變等原因，被認為是替代抗生素的理想藥物。菌絲霉素是從腐生子囊菌假黑盤菌(Pseudoplectania nigrella)分泌的一種抗菌肽，又稱假黑盤菌抗菌肽，由于其獨特的殺菌機制，使菌絲霉素具有細胞毒性和溶血性等危害，具有很大的藥用潛力。然而，假黑盤菌中菌絲霉素的表達量低、分子小，分離困難，化學合成菌絲霉素成本高，所以利用分子生物學技術重組表達外源基因是獲取目標蛋白的有效途徑。申請?zhí)?01010115167. 4，發(fā)明名稱一種菌絲霉素基因及其原核融合基因工程菌的專利申請公開了一種重組菌絲霉素的制備方法及應用，該菌絲霉素的分子量為4401. 9Da，其核苷酸編碼序列如該申請中SEQ ID NO. I所示。管韜等，“菌絲霉素的串聯(lián)表達及其菌內抑菌活性分析”，畜牧獸醫(yī)學報，2012，43 (4):620-626公開了重組菌絲霉素的串聯(lián)表達菌株，表達的融合蛋白的分子量為30、35和40KD，核苷酸編碼序列的大小為135、261和387bp。王楠，“假黑盤菌素和T4溶菌酶微生物高效表達系統(tǒng)的建立”，中國農(nóng)業(yè)科學院學位論文，2010年10期公開了在畢赤酵母細胞中表達和生產(chǎn)重組菌絲霉素的方法，其制備得到的穩(wěn)定表達重組菌絲霉素的工程菌株Plel，在發(fā)酵條件優(yōu)化的前提下，中試規(guī)模(50L發(fā)酵體系)時,重組菌絲霉素的表達量僅為O. 14g/L,即140μ g/ml?，F(xiàn)有技術中，研究者用不同的基因工程方法表達得到了重組菌絲霉素，但是表達水平均較低，難以實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。

發(fā)明內容
為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一種新的重組抗菌肽一重組菌絲霉素，以及編碼該重組抗菌肽的核苷酸序列，包含該核苷酸序列的重組載體、工程菌，還提供了該重組抗菌肽的制備方法和用途。本發(fā)明重組抗菌肽的氨基酸序列如SEQ ID NO. I所示。所述重組抗菌肽的其核苷酸編碼序列如SEQ ID NO. 2。本發(fā)明SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列。本發(fā)明重組載體，它包括SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列。所述的重組載體優(yōu)選為pET30a重組載體。本發(fā)明重組菌，它包括前述的重組載體。所述重組菌優(yōu)選為重組大腸桿菌。本發(fā)明重組菌絲霉素的制備方法，它包括如下步驟( I)取前述重組菌，在大腸桿菌培養(yǎng)基中培養(yǎng)，誘導表達，離心，得菌體和發(fā)酵上清液；(2)取步驟(I)所得菌體裂解，離心，得裂解上清液，與步驟(I)所得發(fā)酵上清液合并，分離純化，即得。優(yōu)選地，所述步驟(I)中，大腸桿菌培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基，培養(yǎng)的條件是37°C、pH6.0、300r/min振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為3 18h，誘導表達使用的誘導劑是濃度為1.0M的IPTG0進一步優(yōu)選地，所述培養(yǎng)時間為10h。
優(yōu)選地,步驟(2)所述分離純化采用GSTrap FF柱層析。本發(fā)明最后提供了前述重組抗菌肽在制備抗菌藥物中的應用。本發(fā)明從天然菌絲霉素出發(fā)，用基因工程的方法制備得到了重組抗菌肽，該重組抗菌肽抗菌活性高，為臨床抗菌藥物提供了一種新的選擇，并且，且本發(fā)明重組抗菌肽的制備方法簡單，產(chǎn)量高，是現(xiàn)有重組菌絲霉素產(chǎn)量的12. 8倍以上，經(jīng)濟效益巨大，工業(yè)應用前景良好。顯然，根據(jù)本發(fā)明的上述內容，按照本領域的普通技術知識和慣用手段，在不脫離本發(fā)明上述基本技術思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。以下通過實施例形式的具體實施方式
，對本發(fā)明的上述內容再作進一步的詳細說明。但不應將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實例。凡基于本發(fā)明上述內容所實現(xiàn)的技術均屬于本發(fā)明的范圍。


圖I質粒pMD19-T-AP2雙酶切結果，MiDNA標準分子量(DL2000) ;1 :質粒PMD19-T-AP2酶切鑒定結果；2 :質粒pMD19_T_AP2酶切鑒定結果；圖2重組表達質粒pET30a_AP2酶切鑒定結果，MiDNA標準分子量；(DL4500) ；1 pET30a-AP2酶切鑒定結果；2 pET30a-AP2酶切鑒定結果；圖3本發(fā)明工程菌鑒定結果，M:DNA標準分子量(DL10000) ；1 :工程菌的質粒酶切
鑒定結果;圖4本發(fā)明重組抗菌肽的表達與純化，M:Protein marker; 1，2: 二聚體重組菌細胞總蛋白；3: 二聚體抗菌肽純化結果；圖5重組大腸桿菌30L誘導培養(yǎng)下菌體增殖與抗菌肽生產(chǎn)曲線。
具體實施例方式實驗材料LB培養(yǎng)基胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化鈉10g/L和蒸餾水；GSTrap FF 柱層析，市售。菌絲霉素由上海吉爾生化使用Apex 396多肽合成儀及固相合成法合成，氨基酸序列與天然菌絲霉素序列一致，抗菌效果與天然的菌絲霉素相同。
實施例I本發(fā)明重組抗菌肽的制備一、重組抗菌肽基因工程菌的構建I、目標基因片段的克隆(I)假黑盤菌(P. nigrella)總 RNA 提取采用Takara 公司 RNAiso Plus 總 RNA 提取試劑盒(D9108A).(2)用RT-PCR及定點突變技術擴增出菌絲霉素編碼序列，引物 (下劃線為酶切位點，斜體部分為突變堿基)和反應條件如下正向引物(F):5，-GAATTCGGATCCATTGAAGGCCGCGGCTTTGGCTGCAATGGC-3，反向引物(R):5，-AGCGGCCGCGTCGACTTAATAGCATTTGCACACAAAGCCGCCTTTCGCGCAATAGCC-3，反應條件為
94 '.'C4 min
94 V40 s59 C50 s L 35 cycles
72 V.Imin J
72 0CIOmin(3) DNA片段回收割取含目的基因的膠條，用小量柱式凝膠回收試劑盒進行回收；(4) 二聚體克隆質粒的構建將上述PCR擴增產(chǎn)物用限制酶酶切后進行DNA連接反應，得T載體,條件如下
反應組分組分含量
pMD19-T Simple0.5 μL VectorAP(抗菌肽)片段4.5卟
Ligation Mix5.0 μL
Toni10.0 ^iL檢測取T載體，用限制性內切酶EcoRI和SalI雙酶切后瓊脂糖凝膠電泳檢測，并進行測序檢測。電泳結果如圖I所示，得到含有大小為267bp的目的基因片段AP2 ;根據(jù)測序譜圖，讀出目的基因片段的序列如SEQ ID NO. 2所示。2、構建重組表達載體含目的基因AP2 (P. nigrella抗菌肽基因)的T克隆載體與表達載體ρΕΤ30 α均用限制性內切酶EcoRI和SalI雙酶切；酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳純化后回收備用(膠回收純化試劑盒，購自天根生物公司)。雙酶切體系如下
權利要求
1.一種重組抗菌肽，其特征在于其氨基酸序列如SEQ ID NO. I所示。
2.根據(jù)權利要求I所述的重組抗菌肽，其特征在于其核苷酸編碼序列如SEQID NO. 2所示。
3.SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列。
4.一種重組載體，其特征在于它包括SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列。
5.根據(jù)權利要求4所述的重組載體，其特征在于它是重組pET30a載體。
6.一種重組菌，其特征在于它包括權利要求4或5所述的重組載體。
7.根據(jù)權利要求6所述的重組菌，其特征在于它為重組大腸桿菌。
8.一種制備權利要求I或2所述重組抗菌肽方法，其特征在于它包括如下步驟 (1)取權利要求6或7所述的重組菌，在大腸桿菌培養(yǎng)基中培養(yǎng)，誘導表達，離心，得菌體和發(fā)酵上清液； (2)取步驟(I)所得菌體，裂解，離心，得裂解上清液，與步驟(I)所得發(fā)酵上清液合并，分離純化，即得。
9.根據(jù)權利要求8所述的方法，其特征在于所述步驟(I)中，大腸桿菌培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基，培養(yǎng)的條件是37°C、pH6. 0、300r/min振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為3 18h，誘導表達使用的誘導劑是濃度為I. OM的IPTG。
10.根據(jù)權利要求9所述的方法，其特征在于所述培養(yǎng)時間為10h。
11.根據(jù)權利要求8所述的方法，其特征在于所述步驟(2)中，分離純化采用GSTrapFF柱層析。
12.權利要求I或2所述的重組抗菌肽在制備抗菌藥物中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種重組抗菌肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；本發(fā)明公開了編碼該重組抗菌肽的核苷酸序列，以及包含該核苷酸序列的重組載體和重組菌，以及該重組抗菌肽的制備方法和抗菌用途。本發(fā)明重組抗菌肽抗菌活性強，制備重組抗菌肽的方法簡單，產(chǎn)量高，具有良好的應用前景。
文檔編號C12N1/21GK102898512SQ201210447668
公開日2013年1月30日 申請日期2012年11月9日 優(yōu)先權日2012年11月9日
發(fā)明者何軍, 陳代文, 余冰, 鄭萍, 毛湘冰 申請人:何軍