專利名稱：一種桑蠶絲素固定化凝血酶的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種桑蠶絲素固定化凝血酶的制備方法，具體涉及以交聯(lián)劑三羥甲基磷(THP)通過共價(jià)鍵將凝血酶固定在活化的桑蠶絲素上制成固定化凝血酶，屬于中藥制備技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
凝血酶即凝血因子，臨床上凝血酶主要用于各種原因引起的出血的快速止血。雖然凝血酶具有良好的促凝血性能，但由于其本質(zhì)是蛋白質(zhì)，因此易變性失活，穩(wěn)定性較差，從而使凝血酶的應(yīng)用受到了極大地限制，需要進(jìn)行固定化研究。凝血酶也能直接與血液中的纖維蛋白原結(jié)合將其水解生成纖維蛋白，使血液凝固，此乃導(dǎo)致人體內(nèi)血栓形成、誘發(fā)心腦血管疾病發(fā)生的重要病理基礎(chǔ)。凝血酶的分子表面 有一個(gè)富含堿性氨基酸的纖維蛋白原識(shí)別結(jié)合位點(diǎn)，水蛭素是到目前為止發(fā)現(xiàn)的最有效的凝血酶抑制劑，其肽鏈C端含有較多的酸性氨基酸，在一定條件下可以結(jié)合在纖維蛋白原識(shí)別結(jié)合位點(diǎn)上，阻止凝血酶、纖維蛋白原二者結(jié)合，有效的抗血液凝固。水蛭素對(duì)多種血栓疾病如靜脈血栓、彌散性血管內(nèi)凝血、腦凝血、血栓靜脈炎、及冠狀動(dòng)脈血栓都有預(yù)防和治療效果，特別是對(duì)外科手術(shù)后及深栓治療后的再栓塞有重要的預(yù)防和治療效果。要將水蛭素開發(fā)成抗凝、溶栓藥物，首先要研究開發(fā)制備高純度的水蛭素制備工藝。目前，水蛭素制備常用水或有機(jī)溶劑處理水蛭消化液或水蛭勻漿，得到水蛭素粗提液后，再使用離子交換、凝膠層析結(jié)合等電聚焦，離子交換結(jié)合親和色譜，DEAE-纖維素層析結(jié)合反相液相色譜等方法純化。這些方法雖然可以獲得高純度的產(chǎn)品，但需要使用昂貴的設(shè)備，且產(chǎn)量低，無法推廣。《兩種反膠束體系的水蛭素萃取效果比較》文中方富永等采用反膠束萃取、雙水相萃取等方法制備水蛭素，雖然工藝簡(jiǎn)單，但產(chǎn)品純度相對(duì)較低。根據(jù)水蛭素能與凝血酶專一結(jié)合的特異性，可以固定化凝血酶萃取水蛭素粗提液，其原理是在一定PH值條件下，纖維蛋白原識(shí)別結(jié)合位點(diǎn)的堿性氨基酸帶正電、水蛭素肽鏈C端的酸性氨基酸帶負(fù)電,通過靜電引力產(chǎn)生離子鍵,形成凝血酶-水蛭素復(fù)合物；分離該復(fù)合物并調(diào)整pH值，破壞離子鍵使凝血酶-水蛭素復(fù)合物分開?！赌傅墓潭ɑ捌浞€(wěn)定性研究》文中李平等使用戊二醛為交聯(lián)劑進(jìn)行過凝血酶的殼聚糖固定化研究；《海藻酸鈉-殼聚糖固定化凝血酶微球的制備及穩(wěn)定性研究》中郎軼詠以海藻酸鈉-殼聚糖微球?yàn)檩d體，以物理吸附法對(duì)凝血酶進(jìn)行固定化研究。利用活化絲素為載體，以自制的交聯(lián)劑THP通過共價(jià)鍵將凝血酶固定在活化的桑蠶絲素(以下簡(jiǎn)稱活化絲素)上制成固定化凝血酶的方法還未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種桑蠶絲素固定化凝血酶的制備方法，提供一種工藝簡(jiǎn)單易行、生產(chǎn)周期較短、固定化效果好制備方法；用該固定化凝血酶萃取水蛭素粗提液，離心回收固定化凝血酶可獲得高純度水蛭素。
為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明的目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案如下
一種桑蠶絲素固定化凝血酶的制備方法，包括以下幾個(gè)步驟
(I)THP的制備利用阻燃劑四羥甲基氯化磷(THPC)與氫氧化鉀(KOH)反應(yīng)得到，具體是取等摩爾量的THPC與KOH分別溶于90 mL和10 mL水中，劇烈攪拌下將KOH水溶液滴加到THPC水溶液中，滴加完畢反應(yīng)結(jié)束，得THP。(2)絲素脫膠將已除雜的桑蠶繭隨機(jī)切碎，按桑蠶繭質(zhì)量I g加50 mL的比例加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為O. 5%的碳酸鈉溶液，于100 °〇溫度下以300 r · mirT1攪拌25 35min，取出，按碳酸鈉溶液3倍的量加入蒸餾水洗滌3次，每次25 35 min。重復(fù)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為O. 5%的碳酸鈉溶液處理和蒸餾水洗滌步驟各I次，于45飛5°C真空干燥25 35 min得脫膠絲素。(3)脫膠絲素的活化使用THP處理使脫膠絲素通過其-NH2與與THP的-CH2OH脫水后結(jié)合。按每I g脫膠絲素用100 mL THP溶液的比例加入后，以300 r· mirT1攪拌,于25 35 °C交聯(lián)35 45 min。交聯(lián)結(jié)束后用O. I mo I · L-1 pH值為7. 5 8. O的磷酸鹽緩沖液·洗l(Tl5min，去除多余的THP，于50°C真空干燥得活化絲素，備用。(4)凝血酶的固定向100 mL濃度為15抗凝血酶活力單位(ATU) · mL—1的凝血酶溶液加入O. Γ0. 3g活化絲素，于25 °〇以300 r · mirT1攪拌，固定3. 5 4. 5 h后，用O. Imo I · Γ1 pH值為7. 5^8. O磷酸緩沖液洗至洗脫液于280 nm波長(zhǎng)處無光吸收，吸干，用生理鹽水浸泡，待測(cè)定活力回收率。(5)固定化凝血酶活力回收率的測(cè)定是用凝血酶滴定改進(jìn)法測(cè)定溶液中的水蛭素濃度。因凝血酶與水蛭素按等摩爾結(jié)合，所以凝血酶的濃度可以用水蛭素的濃度(ATU · mL-1)表示。測(cè)定固定化凝血酶活力回收率時(shí)，將一定質(zhì)量的固定化凝血酶放入一定體積、濃度已知的水蛭素溶液中于37 °C下作用I min后，分離固定化凝血酶，測(cè)定溶液中殘留的水蛭素濃度，用下述公式計(jì)算與固定化凝血酶結(jié)合的水蛭素?cái)?shù)量(指ATU數(shù)量，后同)
與固定化凝血酶結(jié)合的水蛭素?cái)?shù)量=固定化作用前溶液中水蛭素?cái)?shù)量一固定化作用后溶液中水蛭素?cái)?shù)量
固定化凝血酶活力回收率=與固定化凝血酶結(jié)合的水蛭素?cái)?shù)量+固定化前溶液中的游離凝血酶數(shù)量(用ATU數(shù)量表示,后同)X 100%
與現(xiàn)有的技術(shù)相比，本發(fā)明的突出實(shí)質(zhì)性特點(diǎn)和顯著的進(jìn)步是
(I)工藝簡(jiǎn)單易行、生產(chǎn)周期較短、固定化效果好。(2)用該固定化凝血酶萃取水蛭素粗提液，離心回收固定化凝血酶獲得水蛭素產(chǎn)品純度明顯提高。據(jù)資料介紹，用反膠束萃取和雙水相萃取等方法制備的水蛭素純度(比活力)分別為2389. 54、2459. 98 ATU · mg—1和3210. 27 ATU · mg—1，而用本發(fā)明制備的4批水蛭素樣品純度分別為 4163. 71,4165. 09,4160. 60,4162. 45 ATU · mg-1，平均 4162. 96ATU · mg—1，純度較前兩方法有顯著提高。(3)通常所用的固定化酶交聯(lián)劑為戊二醛，具有一定毒性，長(zhǎng)期接觸會(huì)損害操作者的健康，本發(fā)明使用的試劑及產(chǎn)物均為無毒，符合環(huán)保要求。
具體實(shí)施例方式下面通過實(shí)例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說明，這些實(shí)例僅用來說明本發(fā)明，并不限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例I
I、取等摩爾量的THPC與KOH分別溶于90 mL和10 mL水中，劇烈攪拌下將KOH水溶液滴加到THPC水溶液中，滴加完畢反應(yīng)結(jié)束，得THP。2、將已除雜的桑蠶繭隨機(jī)切碎，按桑蠶繭質(zhì)量I g加50 mL的比例加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為O. 5%的碳酸鈉溶液，于100 1溫度下以300 r · min—1攪拌25 min，取出，按碳酸鈉溶液3倍的量加入蒸餾水洗滌3次，每次25 min。重復(fù)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為O. 5%的碳酸鈉溶液處理和蒸餾水洗滌步驟各I次，于45°C真空干燥35 min得脫膠絲素。3、使用交聯(lián)劑THP處理使脫膠絲素通過其-NH2與THP的-CH2OH脫水后結(jié)合。按每I g脫膠絲素用100 mL THP溶液的比例加入后，以300 r · min—1攪拌，于25 °C交聯(lián)45min。交聯(lián)結(jié)束后用O. I mo I -Γ1 pH值為7. 8的磷酸鹽緩沖液洗10 min，去除多余的THP，
于50 °C真空干燥得活化絲素，備用。4、將100 mL濃度為15 ATU · mL—1的凝血酶溶液加入O. I g活化絲素，于25 °C以300 r · mirT1攪拌，固定3. 5 h后,用O. I mo I · L-1 pH值為7. 5磷酸緩沖液洗至洗脫液于280 nm波長(zhǎng)處無光吸收，吸干，用生理鹽水浸泡，待測(cè)定活力回收率。5、用凝血酶滴定改進(jìn)法測(cè)定溶液中的水蛭素濃度。將一定質(zhì)量的固定化凝血酶放 入一定體積、濃度已知的水蛭素溶液中于37 °C下作用I min后，分離固定化凝血酶，測(cè)定溶液中殘留的水蛭素濃度，用下述公式計(jì)算與固定化凝血酶結(jié)合的水蛭素?cái)?shù)量
與固定化凝血酶結(jié)合的水蛭素?cái)?shù)量=固定化作用前溶液中水蛭素?cái)?shù)量一固定化作用后溶液中水蛭素?cái)?shù)量
固定化凝血酶活力回收率=與固定化凝血酶結(jié)合的水蛭素?cái)?shù)量+固定化前溶液中的游離凝血酶數(shù)量X 100%
6、將已測(cè)定、計(jì)算活力回收率的固定化凝血酶包裝、貼簽，得固定化凝血酶產(chǎn)品，于-18°C保存?zhèn)溆谩?br> 實(shí)施例2
I、取等摩爾量的THPC與KOH分別溶于90 mL和10 mL水中，劇烈攪拌下將KOH水溶液滴加到THPC水溶液中，滴加完畢反應(yīng)結(jié)束，得THP。2、將已除雜的桑蠶繭隨機(jī)切碎，按桑蠶繭質(zhì)量I g加50 mL的比例加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為O. 5%的碳酸鈉溶液，于100 1溫度下以300 r · min—1攪拌35 min，取出，按碳酸鈉溶液3倍的量加入蒸餾水洗滌3次，每次35 min。重復(fù)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為O. 5%的碳酸鈉溶液處理和蒸餾水洗滌步驟各I次，于55°C真空干燥25 min得脫膠絲素。3、使用交聯(lián)劑THP處理使脫膠絲素通過其-NH2與THP的-CH2OH脫水后結(jié)合。按每I g脫膠絲素用100 mL THP溶液的比例加入后，以300 r · min—1攪拌，于35°C交聯(lián)35min。交聯(lián)結(jié)束后用O. I mo I -Γ1 pH值為8. O的磷酸鹽緩沖液洗15 min，去除多余的THP，
于50 °C真空干燥得活化絲素，備用。4、將100 mL濃度為15 ATU · mL—1的凝血酶溶液加入O. 3g活化絲素，于25 °C以300 r · mirT1攪拌，固定4. 5 h后,用O. I mo I · L-1 pH值為7. 5磷酸緩沖液洗至洗脫液于280 nm波長(zhǎng)處無光吸收，吸干，用生理鹽水浸泡，待測(cè)定活力回收率。5、用凝血酶滴定改進(jìn)法測(cè)定溶液中的水蛭素濃度。將一定質(zhì)量的固定化凝血酶放入一定體積、濃度已知的水蛭素溶液中于37 °C下作用I min后，分離固定化凝血酶，測(cè)定溶液中殘留的水蛭素濃度，用下述公式計(jì)算與固定化凝血酶結(jié)合的水蛭素?cái)?shù)量
與固定化凝血酶結(jié)合的水蛭素?cái)?shù)量=固定化作用前溶液中水蛭素?cái)?shù)量一固定化作用后溶液中水蛭素?cái)?shù)量
固定化凝血酶活力回收率=與固定化凝血酶結(jié)合的水蛭素?cái)?shù)量+固定化前溶液中的游離凝血酶數(shù)量X 100% 6、將已測(cè)定、計(jì)算活力回收率的固定化凝血酶包裝、貼簽，得固定化凝血酶產(chǎn)品，于-18°C保存?zhèn)溆?。?shí)施例3
I、取等摩爾量的THPC與KOH分別溶于90 mL和10 mL水中，劇烈攪拌下將KOH水溶液滴加到THPC水溶液中，滴加完畢反應(yīng)結(jié)束，得THP。2、將已除雜的桑蠶繭隨機(jī)切碎，按桑蠶繭質(zhì)量I g加50 mL的比例加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為O. 5%的碳酸鈉溶液，于100 1溫度下以300 r · min—1攪拌30 min，取出，按碳酸鈉溶液3倍的量加入蒸餾水洗滌3次，每次30 min。重復(fù)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為O. 5%的碳酸鈉溶液處理和蒸餾水洗滌步驟各I次，于50°C真空干燥30 min得脫膠絲素。3、使用交聯(lián)劑THP處理使脫膠絲素通過其-NH2與THP的-CH2OH脫水后結(jié)合。按每I g脫膠絲素用100 mL THP溶液的比例加入后，以300 r · min—1攪拌，于30°C交聯(lián)40min。交聯(lián)結(jié)束后用O. I mo I -Γ1 pH值為7. 8的磷酸鹽緩沖液洗12 min，去除多余的THP，
于50 °C真空干燥得活化絲素，備用。4、將100 mL濃度為15 ATU · mL—1的凝血酶溶液加入O. 2g活化絲素，于25 °C以300 r IirT1攪拌，固定4 h后，用O. I mo I -T1 pH值為7. 5磷酸緩沖液洗至洗脫液于280nm波長(zhǎng)處無光吸收，吸干，用生理鹽水浸泡，待測(cè)定活力回收率。5、用凝血酶滴定改進(jìn)法測(cè)定溶液中的水蛭素濃度。將一定質(zhì)量的固定化凝血酶放入一定體積、濃度已知的水蛭素溶液中于37 °C下作用I min后，分離固定化凝血酶，測(cè)定溶液中殘留的水蛭素濃度，用下述公式計(jì)算與固定化凝血酶結(jié)合的水蛭素?cái)?shù)量
與固定化凝血酶結(jié)合的水蛭素?cái)?shù)量=固定化作用前溶液中水蛭素?cái)?shù)量一固定化作用后溶液中水蛭素?cái)?shù)量
固定化凝血酶活力回收率=與固定化凝血酶結(jié)合的水蛭素?cái)?shù)量+固定化前溶液中的游離凝血酶數(shù)量X 100%
6、將已測(cè)定、計(jì)算活力回收率的固定化凝血酶包裝、貼簽，得固定化凝血酶產(chǎn)品，于-18°C保存?zhèn)溆谩?br> 權(quán)利要求
1.一種桑蠶絲素固定化凝血酶的制備方法，其特征在于包括以下幾個(gè)步驟三羥甲基磷(THP)的制備、絲素脫膠、脫膠絲素的活化、凝血酶的固定，具體方法如下 (1)THP的制備取等摩爾量的四羥甲基氯化磷(THPC)與氫氧化鉀(KOH)分別溶于90mL和10 mL水中，劇烈攪拌下將KOH水溶液滴加到THPC水溶液中，滴加完畢反應(yīng)結(jié)束，得THP ； (2)絲素脫膠將已除雜的桑蠶繭隨機(jī)切碎，將桑蠶繭加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為O.5%的碳酸鈉溶液，于100 1溫度下以300 r ^irT1攪拌25 35min，取出，按碳酸鈉溶液3倍的量加入蒸餾水洗滌3次，每次25 35 min,重復(fù)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為O. 5%的碳酸鈉溶液處理和蒸餾水洗滌步驟各I次，然后于45飛5°C真空干燥25 35min得脫膠絲素； (3)脫膠絲素的活化將脫膠絲素加入THP溶液后，以300r ^mirT1攪拌，于25 35°C交 聯(lián)35 45min，交聯(lián)結(jié)束后用O. I mo I · L-1 pH值為7. 5 8. O的磷酸鹽緩沖液洗10 15 min,去除多余的THP，于50 °C真空干燥得活化絲素，備用； (4)凝血酶的固定將100mL濃度為15抗凝血酶活力單位(ATU) -πιΓ1的凝血酶溶液力口入O. I O. 3 g活化絲素，于25°C以300 r .mirf1攪拌，固定3. 5 4. 5 h后，用O. I mo I .171pH值為7. 5 8. O磷酸緩沖液洗至洗脫液于280 nm波長(zhǎng)處無光吸收，吸干，用生理鹽水浸泡，準(zhǔn)備測(cè)定活力回收率。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種桑蠶絲素固定化凝血酶的制備方法，其特征在于步驟(2)所述的碳酸鈉溶液的加入量為按桑蠶絲質(zhì)量Ig加50 mL的比例加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為O. 5%的碳酸鈉溶液。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種桑蠶絲素固定化凝血酶的制備方法，其特征在于步驟(3)所述的THP的用量為按每Ig脫膠絲素用100 mL THP溶液的比例加入。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種桑蠶絲素固定化凝血酶的制備方法，屬于醫(yī)藥衛(wèi)生技術(shù)領(lǐng)域，包括三羥甲基磷的制備、絲素脫膠、脫膠絲素的活化、凝血酶的固定四個(gè)步驟，具體是利用阻燃劑四羥甲基氯化磷(THPC)與氫氧化鉀(KOH)反應(yīng)得到三羥甲基磷(THP)；將已除雜的桑蠶繭切碎，加入碳酸鈉溶液處理脫膠，用蒸餾水洗去碳酸鈉，真空干燥得脫膠絲素；加入三羥甲基磷溶液中交聯(lián)，分離，取固體部分用磷酸鹽緩沖液洗，去除多余的三羥甲基磷，真空干燥得活化絲素；取適量加入凝血酶溶液中以固定凝血酶，完成后用磷酸緩沖液洗去游離的凝血酶，吸干，測(cè)定活力回收率。本發(fā)明工藝簡(jiǎn)單易行，生產(chǎn)周期較短，生產(chǎn)過程環(huán)保無毒；可為批量制備高純度水蛭素提供物質(zhì)基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C12N11/06GK102876654SQ20121039839
公開日2013年1月16日 申請(qǐng)日期2012年10月19日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月19日
發(fā)明者方富永, 苗艷麗, 王宏波, 蘆志剛, 廖艷, 宋文東 申請(qǐng)人:廣東海洋大學(xué)