專利名稱：新的蛋白質(zhì)及編碼該蛋白質(zhì)的基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及在腎臟內(nèi)特異性表達(dá)的衍生自小鼠或人的新的動(dòng)力敏感通道蛋白(機(jī)械刺激應(yīng)答通道蛋白)(SAC1(小鼠)和hSAC(人)，編碼這些蛋白質(zhì)的DNA，用該蛋白質(zhì)來(lái)篩選促進(jìn)或阻滯陽(yáng)離子通道活性的物質(zhì)的方法，以及針對(duì)該蛋白質(zhì)的抗體。
本發(fā)明的蛋白質(zhì)、DNA以及針對(duì)該蛋白質(zhì)的抗體可用作高血壓、糖尿病等基于陽(yáng)離子通道異常的疾病的診斷藥或治療藥，或者可用作用來(lái)尋找預(yù)防和/或治療這些疾病的藥物的工具。另外，在本發(fā)明中，SAC1和hSAC等動(dòng)力敏感通道蛋白統(tǒng)稱為SAC。
背景技術(shù)：
離子通道是以脂質(zhì)雙層為基本構(gòu)造的跨生物膜存在的膜內(nèi)在性蛋白質(zhì)，其內(nèi)部有孔結(jié)構(gòu)。離子通道根據(jù)其電生理學(xué)性質(zhì)、即門(mén)控、電導(dǎo)和離子選擇性等分類(lèi)。離子通道分子具有多個(gè)構(gòu)象，在某一狀態(tài)(開(kāi)狀態(tài))下允許離子通過(guò)，而在其它狀態(tài)(閉狀態(tài))下則不允許。這種構(gòu)象變化稱為“門(mén)的開(kāi)關(guān)(門(mén)控；gating)”。控制這種門(mén)控的因素已知有三種膜電位、小分子(配體)的結(jié)合和膜牽張。
電位依賴性通道的例子有Na+通道、Ca2+通道、K+通道等，在這些通道的分子結(jié)構(gòu)中有電荷集合的部位或是電位傳感器。認(rèn)為它由于膜兩側(cè)的電位差而受力移動(dòng)從而引起構(gòu)象變化。配體敏感型通道是通過(guò)與來(lái)自細(xì)胞外的特異性配體(激動(dòng)劑)結(jié)合而活化的通道，稱為受體內(nèi)藏通道。與此相對(duì)，有通過(guò)與細(xì)胞內(nèi)的第二信使等小分子結(jié)合來(lái)控制開(kāi)閉的通道。細(xì)胞膜內(nèi)存在的IP3(肌醇三磷酸)受體(與來(lái)自胞質(zhì)側(cè)的IP3結(jié)合后打開(kāi)的Ca2+通道)是一個(gè)例子。動(dòng)力敏感通道是通過(guò)膜牽張來(lái)控制門(mén)開(kāi)閉的離子通道，由于很多是通過(guò)牽張來(lái)打開(kāi)，因此稱為“牽張敏感性”通道。認(rèn)為該通道與滲透壓調(diào)節(jié)和細(xì)胞體積調(diào)節(jié)有關(guān)。這種通道中當(dāng)然存在肌梭等牽張感受器。目前已經(jīng)在多種細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)這種通道(Morris C.E.，J.Membrane Biol.，113，93-107(1990)；Bear，C.E.，Am.J.Physiol.，258，C421-8(1990)；Cemerik，D. & Sackin，H.，Am.J.Physiol.，264，F(xiàn)697-714(1993)；Lansman，J.B.，等人，Nature，325，811-3(1987)；Sackin，H.，Am.J.Physiol.，253，F(xiàn)1253-62(1987))。
另外，已經(jīng)表明，編碼具有4個(gè)跨膜部位的TWIK1(弱內(nèi)向整流K+通道中的連串P結(jié)構(gòu)域)有關(guān)的TASK(TWIK-1相關(guān)的酸敏感型K+通道)的哺乳動(dòng)物K+通道具有靠機(jī)械刺激來(lái)開(kāi)閉的性質(zhì)(Duprat，F(xiàn).，等人.，(1997)EMBO J.，16，5464-71，Patel，A.J.，等人.，(1998)EMBO J.17，4283-90)。
本發(fā)明者根據(jù)這樣一個(gè)假定，即對(duì)物理因素?zé)崦舾械南闾m素樣(Vanilloid)受體是機(jī)械刺激應(yīng)答通道，進(jìn)行了基因克隆。結(jié)果報(bào)道了與香蘭素樣受體(Caterina，M.J.，等人.，(1997)Nature，389，816-24)相似的具有錨蛋白重復(fù)序列和6個(gè)跨膜部位并且通過(guò)牽張來(lái)抑制的非選擇性陽(yáng)離子通道(SIC)的編碼cDNA(Suzuki，M.，等人.，(1999)J.Biol.Chem.274，6330-5)。由于機(jī)械刺激應(yīng)答通道能將機(jī)械性刺激轉(zhuǎn)變成Ca2+流入，所以通過(guò)牽張來(lái)活化(stretch-activated；SA)的非選擇性陽(yáng)離子通道很重要。
發(fā)明揭示鑒于上述情況，本發(fā)明者深入研究了新的機(jī)械應(yīng)答通道蛋白質(zhì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了腎臟特異性表達(dá)的、具有對(duì)機(jī)械刺激應(yīng)答從而非選擇性地將陽(yáng)離子攝入細(xì)胞內(nèi)的功能的蛋白質(zhì)，即，新的機(jī)械刺激應(yīng)答通道蛋白質(zhì)。因此，本發(fā)明的課題是提供從小鼠或人衍生獲得的腎臟特異性表達(dá)的、具有對(duì)機(jī)械刺激應(yīng)答從而非選擇性地將陽(yáng)離子攝入細(xì)胞內(nèi)的功能的新的機(jī)械刺激應(yīng)答通道蛋白質(zhì)(SAC1(小鼠)(牽張活化通道蛋白1)和hSAC(人)(人牽張活化通道蛋白))，編碼該蛋白質(zhì)的DNA，使用該蛋白質(zhì)來(lái)篩選促進(jìn)或抑制陽(yáng)離子通道活性的物質(zhì)的方法，以及針對(duì)該蛋白質(zhì)的抗體。
本發(fā)明涉及一種從小鼠或人衍生獲得的、腎臟特異性表達(dá)的、具有對(duì)機(jī)械刺激應(yīng)答從而非選擇性地將陽(yáng)離子攝入細(xì)胞內(nèi)的功能的新的機(jī)械刺激應(yīng)答通道蛋白質(zhì)(SAC1(小鼠)和hSAC(人))。另外，本發(fā)明還涉及編碼該蛋白質(zhì)的DNA。另外，本發(fā)明還涉及使用該蛋白質(zhì)來(lái)篩選促進(jìn)或抑制陽(yáng)離子通道活性的物質(zhì)的方法。另外，本發(fā)明還涉及針對(duì)該蛋白質(zhì)的抗體。所述蛋白質(zhì)、DNA以及針對(duì)該蛋白質(zhì)的抗體可用作高血壓、糖尿病等基于陽(yáng)離子通道異常的疾病的診斷藥或治療藥，或者可用作用來(lái)尋找預(yù)防和/或治療這些疾病的藥物的工具。
為了進(jìn)行新膜通道的分離、鑒定和功能分析，需要分子生物學(xué)技術(shù)、細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)以及電生理學(xué)技術(shù)等先進(jìn)的技術(shù)。因此，本發(fā)明者使用這些技術(shù)從小鼠腎臟中分離出SA陽(yáng)離子通道(SAC1)的cDNA，確定了其氨基酸序列。它屬于香蘭素樣受體超家族，局部存在于腎臟的腎小管中。該SAC1在哺乳動(dòng)物細(xì)胞系中表達(dá)。另外，用衍生自小鼠的SAC1基因獲得了人對(duì)應(yīng)的通道基因。
電生理學(xué)分析的結(jié)果是，通過(guò)機(jī)械刺激表達(dá)SAC1的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)的游離鈣增加。另外，它是通過(guò)負(fù)壓活化的單一通道，被Gd3+阻滯，對(duì)陽(yáng)離子的通過(guò)是非選擇性的，且SAC1中的離子透過(guò)性Na+大于K+。細(xì)胞的逆轉(zhuǎn)電位通過(guò)細(xì)胞膨脹向正電位側(cè)偏移。另外，由于當(dāng)使缺失突變表達(dá)時(shí)通道對(duì)牽張沒(méi)有應(yīng)答性，因此暗示SAC1成為SA通道。
如上所述，本發(fā)明涉及一種從小鼠或人衍生獲得的、腎臟特異性表達(dá)的、具有對(duì)機(jī)械刺激應(yīng)答從而非選擇性地將陽(yáng)離子攝入細(xì)胞內(nèi)的功能的新的機(jī)械刺激應(yīng)答通道蛋白質(zhì)(SAC1(小鼠)和hSAC(人))以及編碼該蛋白質(zhì)的DNA。本發(fā)明的蛋白質(zhì)可如下所示獲得。即，構(gòu)建小鼠腎臟cDNA庫(kù)，采用適當(dāng)?shù)囊锿ㄟ^(guò)PCR擴(kuò)增得到SAC1cDNA。并且，以該SAC1 cDNA作為探針通過(guò)對(duì)人腎臟cDNA庫(kù)進(jìn)行克隆，得到hSACcDNA。衍生自小鼠的SAC1是由871個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)，而衍生自人的hSAC也是由871個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)。它們的氨基酸序列表現(xiàn)出94.4％的同源性。認(rèn)為這種顯著的同源性表示SAC1在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中有共同的結(jié)構(gòu)和功能。編碼hSAC的DNA長(zhǎng)約18kb，由14個(gè)外顯子構(gòu)成，存在于染色體12q24.1中。
將所得小鼠或人的SAC基因?qū)牒线m的載體中，用該載體轉(zhuǎn)化宿主，就能得到小鼠或人的SAC蛋白質(zhì)。作為宿主細(xì)胞可列舉細(xì)菌、酵母或動(dòng)物細(xì)胞等。特別是動(dòng)物細(xì)胞，宜采用HeLa細(xì)胞、中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞或COS-7細(xì)胞等。另外，作為細(xì)胞系表達(dá)質(zhì)粒的控制作用，可使用病毒的多形瘤、腺病毒、巨細(xì)胞病毒、猿病毒40的啟動(dòng)子。特別是作為動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)體系中利用性高的質(zhì)粒，宜為pCMV(Thomsen，等人.，PNAS，(1984)81，659)。所得蛋白質(zhì)是對(duì)機(jī)械刺激有應(yīng)答的膜結(jié)合蛋白，可用作高血壓或糖尿病等基于陽(yáng)離子通道異常的疾病的診斷藥或治療藥，或者可用作用來(lái)尋找預(yù)防和/或治療這些疾病的藥物的工具。
另外，本發(fā)明的蛋白質(zhì)或其片段可用于缺損hSAC的DNA的雜交診斷，hSAC突變體可用于高血壓病和糖尿病的研究。另外，也可用公知的技術(shù)不難通過(guò)SAC的DNA及其突變體的5′和3′端與其它蛋白質(zhì)或合成多肽的編碼核苷酸序列結(jié)合來(lái)獲得融合蛋白質(zhì)。例如，可將融合蛋白制成前體蛋白，在體外和體內(nèi)切割時(shí)發(fā)揮作用。除了其本來(lái)的功能外，還可以有指向目標(biāo)組織等的靶向性。
另外，用表達(dá)的蛋白質(zhì)、其突變體及其片段免疫動(dòng)物，可得到多克隆抗體。另外，將受免疫動(dòng)物的淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，用融合而成的雜交瘤細(xì)胞可制得單克隆抗體。
另外，本發(fā)明的蛋白質(zhì)或其突變體和類(lèi)似物可用來(lái)尋找作為通道蛋白質(zhì)相關(guān)疾病的診斷藥或治療藥等的對(duì)SAC有激動(dòng)作用和拮抗作用的物質(zhì)。另外，由于得到了SAC的DNA序列信息，因此制備部分DNA或RNA序列很容易。由于這些部分DNA具有與合適選擇的基因雜交的能力，因此可用作核酸探針。這些探針能有效地檢測(cè)各種組織中的cDNA序列。利用用SAC制得的探針能從各種生物及其組織中得到雜交核酸。所得核酸包括編碼與SAC相同的同種型的核酸或是編碼顯示新特性的蛋白質(zhì)的核酸。另外，制得的探針可用于疾病的基因診斷。通過(guò)鑒別與該探針雜交的患者的核苷酸序列，可能會(huì)檢測(cè)出疾病基因。另外，還包括用于治本療法的基因治療藥。SAC、其突變體及其衍生物的核苷酸序列可通過(guò)參入質(zhì)?；蚋杉?xì)胞中來(lái)給藥，作為基因治療藥使用。
本發(fā)明的蛋白質(zhì)以及針對(duì)該蛋白質(zhì)的抗體可對(duì)人和靈長(zhǎng)動(dòng)物安全地給藥。本發(fā)明的蛋白質(zhì)可制成制劑進(jìn)行經(jīng)口或非經(jīng)口的給藥。藥物組合物的形式可列舉注射用組合物、灌輸用組合物、栓劑、經(jīng)鼻劑、舌下劑、經(jīng)皮吸收劑等。這些制劑可根據(jù)公知的制劑學(xué)方法來(lái)配制，通過(guò)使用藥理學(xué)上容許的載體、賦形劑、穩(wěn)定劑、著色劑、表面活性劑和/或其它添加劑等，制成目標(biāo)制劑。在注射用組合物場(chǎng)合，宜將藥理學(xué)有效量的本發(fā)明蛋白質(zhì)與制藥學(xué)上容許的賦形劑/活化劑(如氨基酸、糖類(lèi)、纖維素衍生物和其它有機(jī)/無(wú)機(jī)化合物等)混合。另外，在用本發(fā)明抗體和這些賦形劑/活化劑來(lái)配制注射劑的場(chǎng)合，可根據(jù)需要通過(guò)常規(guī)方法添加pH調(diào)節(jié)劑、緩沖劑、穩(wěn)定劑、增溶劑等，制成各種注射劑。
另外，本發(fā)明的DNA可單獨(dú)或通過(guò)包封在脂質(zhì)體內(nèi)或插入逆轉(zhuǎn)錄病毒或腺病毒等基因治療用載體中用于基因治療。
附圖簡(jiǎn)單說(shuō)明

圖1(a)顯示了用全長(zhǎng)cDNA進(jìn)行的SAC1 mRNA表達(dá)的Northern印跡分析的結(jié)果。各泳道加入從小鼠組織制得的總RNA(2微克)。
圖1(b)顯示了用腎臟組織的免疫染色結(jié)果。染色部分用白色表示。
圖2顯示了對(duì)SAC1表達(dá)細(xì)胞(GFP陽(yáng)性)對(duì)觸摸應(yīng)力的影響的調(diào)查結(jié)果。
圖中，○、▲、●分別表示380nm下的熒光強(qiáng)度、熒光強(qiáng)度比(360nm/380nm)和360nm下的熒光強(qiáng)度。
圖3顯示了對(duì)于SAC單一通道牽張的應(yīng)答結(jié)果。
(A)顯示了分階段施加負(fù)壓時(shí)的SAC1通道的典型結(jié)果。
(B)顯示了緩慢施加負(fù)壓時(shí)的結(jié)果。
(C)顯示了在添加和不添加GdCl3時(shí)向SAC1施加的壓力與Po之間的關(guān)系。
圖中，○和△分別表示對(duì)照(不加GdCl3時(shí)的壓力)和添加0.5M GdCl3時(shí)的壓力。
實(shí)施發(fā)明的最佳方式實(shí)施例本發(fā)明根據(jù)下面的實(shí)施例作詳細(xì)的說(shuō)明，但是，這些只是為了舉例目的，本發(fā)明并不局限于這些實(shí)施例。
實(shí)施例1編碼SAC1的cDNA的分離RNA通過(guò)硫氰酸胍方法用Trizol(Gibco-BRL)分離。mRNA用polyA柱(Pharmacia)純化。用Marathon cDNA構(gòu)建試劑盒(Clonetech Co.)制備小鼠腎臟cDNA庫(kù)。cDNA用引物系列1(AA13f2(序列表SEQ ID NO5)和mA13end1(SEQ ID NO6)以ExTaq聚合酶(寶酒造社)進(jìn)行PCR擴(kuò)增(94℃30秒，70℃4分鐘作為1輪，進(jìn)行30輪)。合成嵌套引物(AAl3r2(SEQ ID NO7))，用5′RACE法測(cè)定5′末端。用引物系列2(A13st1(SEQID NO8)和AA13r1(SEQ ID NO9))以及ExTaq聚合酶(寶酒造社)在相同條件下進(jìn)行PCR擴(kuò)增。使用2種引物系列PCR擴(kuò)增得到的片段，用引物系列(A13st1和mA13end1)PCR擴(kuò)增含有全長(zhǎng)的區(qū)域。再次從cDNA庫(kù)中克隆約3.2kb的SAC1 cDNA。將克隆的cDNA與TA克隆載體(TOPO-XL；InVitrogen)連接，將其BamHI-HindIII片段連接入哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體(pCMV-SPORT；Gibco-BRL)。用熱測(cè)序酶染色終止循環(huán)測(cè)序預(yù)混物(Thermo Sequenase dye terminator cycle sequencing premix)在自動(dòng)化測(cè)序儀(373-S型；Applied Bioinstruments Inc.)中進(jìn)行測(cè)序。SAC1 cDNA是編碼871個(gè)氨基酸的2616個(gè)核苷酸。其序列在序列表中是SEQ ID NO1(氨基酸序列)和SEQ IDNO2(核苷酸序列)。插入了SAC1 cDNA的質(zhì)粒命名為pmSAC1 TOPO，最初于1999年11月30日保藏于國(guó)立生命科學(xué)和人體技術(shù)研究所(日本茨城縣Tsukuba市東一區(qū)1番3號(hào)(郵編305-8566))。隨后于2000年11月1日根據(jù)布達(dá)佩斯條約請(qǐng)求轉(zhuǎn)移保藏，保藏號(hào)為FERM BP-7345。
然后，用32P標(biāo)記過(guò)的SAC1 cDNA作為探針通過(guò)Northern雜交(65℃)確認(rèn)SAC1在各組織中的表達(dá)。結(jié)果確認(rèn)約3kb的SAC1 mRNA僅在腎臟中表達(dá)(圖1(a))。
另外，為了分離編碼衍生自人的SAC(hSAC)的cDNA，用32P標(biāo)記過(guò)的SAC1cDNA作為探針來(lái)篩選人腎臟cDNA庫(kù)。將所得克隆分別亞克隆到載體M13mp1、M13mp19(寶酒造社)和pGEM3Z(Promega Co.)中，用上述同樣方法測(cè)定核苷酸序列。序列用序列表中SEQ ID NO3(氨基酸序列)和SEQ ID NO4(核苷酸序列)表示。
實(shí)施例2抗體的制備和免疫染色制備針對(duì)和聚乙二醇結(jié)合的SAC1蛋白質(zhì)C端部(844-853)的特異性肽(下文稱為“C端肽”)(序列表中SEQ ID NO10)的抗體。小鼠SAC1蛋白質(zhì)C端肽與聚乙二醇(PEG)的結(jié)合根據(jù)Maeda等人的方法(Biochem.Biophys.Res.Comm.(1998)248，485-489)進(jìn)行。即，在溶解于二氯甲烷的氧化PEG(和光純藥社)中添加1當(dāng)量二環(huán)己基碳二亞胺，在0℃下攪拌后，添加10當(dāng)量的乙二胺攪拌過(guò)夜。從濾液中蒸發(fā)除去溶劑，將所得產(chǎn)物溶解在50％乙酸中。用Sephadex G-25柱純化氨基酸型PEG(aaPEG)，N末端氨基Fmoc化，制得Fmoc-aaPEG。用二異丙基碳二亞胺/1-羥基苯并三唑法(Konig和Geiger，Chem.Ber.(1970)103，788-798，2024-2033)，將Fmoc-aaPEG、然后是Boc-PLD(Pmc)NLGNPNC-OH連接到Rink樹(shù)脂(300毫克；渡邊化學(xué)社)上。除去Fmoc后，樹(shù)脂在三氟乙酸/茴香硫醚/苯甲醚/乙二硫醇(94/2/2/2)中處理3小時(shí)，切除C端肽aaPEG。在濾液中添加乙醚，用反相HPLC純化沉淀的肽粗產(chǎn)物，得到43毫克C端肽-aaPEG。
將在Freund完全佐劑中乳化的抗原(C端肽-aaPEG)1毫克肌內(nèi)注入2只NZW家兔進(jìn)行免疫，然后每2周用經(jīng)Freund不完全佐劑乳化的同樣量的抗原同樣免疫。給藥后4-8周后，用ELISA法測(cè)定血清的抗體滴度。分離出滴度比對(duì)照血清高10000倍的血清。用Protein A柱(Pharmacia Co.)從血清中純化出抗體，然后用Proton試劑盒(Multiple Peptide System Co.)進(jìn)行親和純化。用500倍稀釋的抗體對(duì)新鮮腎臟切片染色后，用FITC標(biāo)記的抗家兔IgG抗體(DAKO Co.)檢測(cè)蛋白。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，腎小管基底膜被染色，表明該部位局部存在SAC1蛋白(見(jiàn)圖1(b))。
實(shí)施例3cDNA的表達(dá)將表達(dá)綠色熒光蛋白的質(zhì)粒(pEGFP-N1；Clonetech Co.)用作轉(zhuǎn)染標(biāo)記物。為了進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)，使CHO細(xì)胞在添加了10％胎牛血清、100U/ml青霉素和100微克/毫升鏈霉素的HamF-12培養(yǎng)基(Gibco-BRL)中培養(yǎng)。在轉(zhuǎn)化前一日，將105個(gè)CHO細(xì)胞添加到35mm平皿中，平皿內(nèi)放置了涂布有大鼠尾部膠原的條狀蓋板。第二天，每次轉(zhuǎn)染時(shí)將pCMV-SPORT(Gibco-BRL)中的SAC1質(zhì)粒(1微克)和pEGFP-N1(1微克)添加到在室溫下培育5分鐘的FuGENE6(Roche，3微升)和無(wú)血清培養(yǎng)基(97微升)的混合液中。室溫下培育15分鐘后，將該混合液加入含有3毫升血清培養(yǎng)基的平皿中。用條狀蓋板上生長(zhǎng)的細(xì)胞作為膜片鉗樣品。增殖和轉(zhuǎn)染中使用含10％FCS的培養(yǎng)基。電生理學(xué)實(shí)驗(yàn)在24小時(shí)后開(kāi)始，熒光測(cè)定在轉(zhuǎn)染后48小時(shí)進(jìn)行。
實(shí)施例4
SAC1表達(dá)細(xì)胞中的熒光測(cè)定在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前2-3小時(shí)，用無(wú)血清培養(yǎng)基溶解的10μM fura-2AM(Dojin Co.)培育轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。480nm的GFP熒光和360/380nm的fura-2熒光用二向色性O(shè)lympus系統(tǒng)反射鏡(Merlin Co.)以手工交換來(lái)視覺(jué)化。每2秒得到480nm的熒光和360/380nm下熒光的圖象。為了進(jìn)行分析，算出目標(biāo)區(qū)域的熒光強(qiáng)度。將細(xì)胞浸在34℃125mMNaCl、5mM KCl、1.2mM MgSO4、1mM Na2HPO4、1mM CaCl2、3mM HEPES(pH7.4)溶液中。為了產(chǎn)生直接對(duì)細(xì)胞的機(jī)械應(yīng)力，用電控制的顯微操作儀(5170型；EppendorfCo.)使細(xì)胞與玻璃移液管圓形前端接觸。圖2和表1顯示了通過(guò)用玻璃移液管給明亮的細(xì)胞(GFP陽(yáng)性)機(jī)械刺激的結(jié)果。與對(duì)照細(xì)胞相比，確認(rèn)SAC1表達(dá)細(xì)胞fura-2熒光比發(fā)生變化，因此暗示本發(fā)明蛋白質(zhì)具有通道蛋白質(zhì)的功能，明顯使[Ca2+]i(細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度)發(fā)生變動(dòng)。表1

(括號(hào)內(nèi)的數(shù)字表示實(shí)驗(yàn)次數(shù)，**表示與對(duì)照相比在1％有顯著性，*表示與未添加Gd3+時(shí)相比在5％有顯著性)。
實(shí)施例5SAC1表達(dá)細(xì)胞的信號(hào)通道分析根據(jù)以前的報(bào)道(Suzuki，M.，Sato.J.，Kutsuwada，K.，Ooki，G.和Imai，M.(1999)J.Biol.Chem.274，6330-5)進(jìn)行膜片鉗記錄。在490nm下進(jìn)行熒光測(cè)定(CAM2000系統(tǒng)；Jusco Co.，Ltd.)，檢出GFP陽(yáng)性細(xì)胞。在1毫升/毫升的回流溶液流速下將細(xì)胞固定在架上。固定前，為了控制溫度，用DC電源(菊水電子工業(yè)社；LPD型)將溶液加溫至34℃。用140mM NaCl、5mM KCl、1.2mM MgSO4、1mM Na2HPO4、1mM CaCl2、3mMHEPES的溶液作為浸漬液。在單通道分析中，用EPC-7膜片鉗放大器(List-ElectronicCo.，Ltd.)記錄電流，以10KHz保存在DAT記錄儀(DAT-200；Sony Corp)中。施加5KHz濾波器進(jìn)行分析。為了分析打開(kāi)幾率，用Fetchex(Software Axon，6.0版)對(duì)記錄取樣。數(shù)據(jù)用Igor 2.01版和Patch Analysist 1.21版進(jìn)行解析。在2KHz下使用數(shù)字濾波器，通過(guò)電流分布分析來(lái)計(jì)算打開(kāi)幾率。為了計(jì)算GdCl3添加時(shí)的打開(kāi)幾率，在未加試劑時(shí)設(shè)定單通道振幅，從10秒的記錄測(cè)定平均打開(kāi)幾率Po。用壓力計(jì)調(diào)節(jié)移液管壓力，用手工使負(fù)壓變化。為了測(cè)定通道打開(kāi)，用150mM NaCl溶液，通過(guò)細(xì)胞附著移液管施加負(fù)壓。結(jié)果，表達(dá)細(xì)胞上半數(shù)以上的膜片顯示出負(fù)壓引起的通道活性。如圖3A所示，在30mmHg負(fù)壓下，SAC1通道快速打開(kāi)。打開(kāi)幾率突然達(dá)到完全打開(kāi)的狀態(tài)，為了確認(rèn)這一現(xiàn)象，緩慢進(jìn)行抽吸(圖3B)，就象打開(kāi)存在閾值一樣，通道突然打開(kāi)。該閾值是恒定的(33±2.3mmHg)，可再現(xiàn)的。使用各種溶液(氯化鈉、葡糖酸鈉或氯化鉀)以移液管測(cè)定電流-電壓關(guān)系，沒(méi)有觀察到有很大的偏差。單通道電導(dǎo)用細(xì)胞附著模型下的電導(dǎo)梯度來(lái)測(cè)定。即使用葡糖酸鈉或氯化鉀代替氯化鈉，這些參數(shù)也幾乎沒(méi)有受影響，因此表明該通道對(duì)于陽(yáng)離子是非選擇性的。對(duì)壓力有不同敏感性的個(gè)別通道中的全有或全無(wú)(all-or-none)打開(kāi)的積累顯示出伴隨牽張有S形打開(kāi)應(yīng)答。然而，壓力P。不適合Bolzmann函數(shù)。當(dāng)移液管中加入0.5μM GdCl3時(shí)，應(yīng)答不受影響，因此表明該蛋白具有機(jī)械刺激應(yīng)答通道蛋白的功能(圖3C)。
產(chǎn)業(yè)上的利用可能性本發(fā)明提供了在腎臟內(nèi)特異性表達(dá)的衍生自小鼠或人的新的動(dòng)力敏感通道蛋白(機(jī)械刺激應(yīng)答通道蛋白)(SAC1小鼠)和hSAC(人)，該蛋白具有對(duì)機(jī)械刺激應(yīng)答來(lái)非選擇性地將陽(yáng)離子攝入細(xì)胞內(nèi)的功能，本發(fā)明還提供了編碼這些蛋白質(zhì)的DNA，用該蛋白質(zhì)來(lái)篩選促進(jìn)或阻滯陽(yáng)離子通道活性的物質(zhì)的方法，以及針對(duì)該蛋白質(zhì)的抗體。該蛋白質(zhì)、DNA以及針對(duì)該蛋白質(zhì)的抗體可用作高血壓、糖尿病等基于陽(yáng)離子通道異常的疾病的診斷藥或治療藥，或者可用作用來(lái)尋找預(yù)防和/或治療這些疾病的藥物的工具。
保藏的生物材料的信息A.保藏該生物材料的保藏機(jī)構(gòu)的名稱和地址名稱國(guó)立生命科學(xué)和人體技術(shù)研究所地址日本茨城縣Tsukuba市東一區(qū)1番3號(hào)(郵編305-3566)B.交A的機(jī)構(gòu)保藏的日期1999年11月30日(原保藏日)C.A的保藏機(jī)構(gòu)給予的保藏號(hào)FERM BP-7345
序列表<110>雪印乳業(yè)株式會(huì)社<120>新的蛋白質(zhì)及編碼該蛋白質(zhì)的基因<130>SNOW-135<150>JP 48727-2000<151>2000-2-25<160>10<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>871<212>PRT<213>小鼠<400>1Met Ala Asp Pro Gly Asp Gly Pro Arg Ala Ala Pro Gly Glu Val Ala1 510 15Glu Pro Pro Gly Asp Glu Ser Gly Thr Ser Gly Gly Glu Ala Phe Pro202530Leu Ser Ser Leu Ala Asn Leu Phe Glu Gly Glu Glu Gly Ser Ser Ser35 40 45Leu Ser Pro Val Asp Ala Ser Arg Pro Ala Gly Pro Gly Asp Gly Arg50 55 60Pro Asn Leu Arg Met Lys Phe Gln Gly Ala Phe Arg Lys Gly Val Pro65 70 75 80Asn Pro Ile Asp Leu Leu Glu Ser Thr Leu Tyr Glu Ser Ser Val Val85 90 95Pro Gly Pro Lys Lys Ala Pro Met Asp Ser Leu Phe Asp Tyr Gly Thr100 105 110Tyr Arg His His Pro Ser Asp Asn Lys Arg Trp Arg Arg Lys Val Val115 120 125Glu Lys Gln Pro Gln Ser Pro Lys Thr Pro Ala Pro Gln Pro Pro Pro130 135 140Ile Leu Lys Val Phe Asn Arg Pro Ile Leu Phe Asp Ile Val Ser Arg145 150 155 160Gly Ser Thr Ala Asp Leu Asp Gly Leu Leu Ser Phe Leu Leu Thr His165 170 175Lys Lys Arg Leu Thr Asp Glu Glu Phe Arg Glu Pro Ser Thr Gly Lys180 185 190Thr Cys Leu Pro Lys Ala Leu Leu Asn Leu Ser Asn Gly Arg Asn Asp195 200 205Thr Leu Gln Val Leu Leu Asp Ile Ala Glu Arg Thr Gly Asn Met Arg210 215 220Glu Phe Ile Asn Ser Pro Phe Arg Asp Ile Tyr Tyr Arg Gly Gln Thr225 230 235 240Ser Leu His Ile Ala Ile Glu Arg Arg Cys Lys His Tyr Val Glu Leu245 250 255Leu Val Ala Gln Gly Ala Asp Val His Ala Gln Ala Arg Gly Arg Phe260 265 270Phe Gln Pro Lys Asp Glu Gly Gly Tyr Phe Tyr Phe Gly Glu Leu Pro275 280 285Leu Ser Leu Ala Ala Cys Thr Asn Gln Pro His Ile Val Asn Tyr Leu290 295 300Thr Glu Asn Pro His Lys Lys Ala Asp Met Arg Arg Gln Asp Ser Arg305 310 315 320Gly Asn Thr Val Leu His Ala Leu Val Ala Ile Ala Asp Asn Thr Arg325 330 335Glu Asn Thr Lys Phe Val Thr Lys Met Tyr Asp Leu Leu Leu Leu Lys340 345 350Cys Ser Arg Leu Phe Pro Asp Ser Asn Leu Glu Thr Val Leu Asn Asn355 360 365Asp Gly Leu Ser Pro Leu Met Met Ala Ala Lys Thr Gly Lys Ile Gly370 375 380Val Phe Gln His Ile Ile Arg Arg Glu Val Thr Asp Glu Asp Thr Arg385 390 395 400His Leu Ser Arg Lys Phe Lys Asp Trp Ala Tyr Gly Pro Val Tyr Ser405 410 415Ser Leu Tyr Asp Leu Ser Ser Leu Asp Thr Cys Gly Glu Glu Val Ser420 425 430Val Leu Glu Ile Leu Val Tyr Asn Ser Lys Ile Glu Asn Arg His Glu435 440 445Met Leu Ala Val Glu Pro Ile Asn Glu Leu Leu Arg Asp Lys Trp Arg450 455 460Lys Phe Gly Ala Val Ser Phe Tyr Ile Asn Val Val Ser Tyr Leu Cys465 470 475 480Ala Met Val Ile Phe Thr Leu Thr Ala Tyr Tyr Gln Pro Leu Glu Gly485 490 495Thr Pro Pro Tyr Pro Tyr Arg Thr Thr Val Asp Tyr Leu Arg Leu Ala500 505 510Gly Glu Val Ile Thr Leu Phe Thr Gly Val Leu Phe Phe Phe Thr Ser515 520 525Ile Lys Asp Leu Phe Thr Lys Lys Cys Pro Gly Val Asn Ser Leu Phe530 535 540Val Asp Gly Ser Phe Gln Leu Leu Tyr Phe Ile Tyr Ser Val Leu Val545 550 555 560Val Val Ser Ala Ala Leu Tyr Leu Ala Gly Ile Glu Ala Tyr Leu Ala565 570 575Val Met Val Phe Ala Leu Val Leu Gly Trp Met Asn Ala Leu Tyr Phe580 585 590Thr Arg Gly Leu Lys Leu Thr Gly Thr Tyr Ser Ile Met Ile Gln Lys595 600 605Ile Leu Phe Lys Asp Leu Phe Arg Phe Leu Leu Val Tyr Leu Leu Phe610 615 620Met Ile Gly Tyr Ala Ser Ala Leu Val Thr Leu Leu Asn Pro Cys Thr625 630 635 640Asn Met Lys Val Cys Asp Glu Asp Gln Ser Asn Cys Thr Val Pro Thr645 650 655Tyr Pro Ala Cys Arg Asp Ser Glu Thr Phe Ser Ala Phe Leu Leu Asp660 665 670Leu Phe Lys Leu Thr Ile Gly Met Gly Asp Leu Glu Met Leu Ser Ser
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180 185 190Thr Cys Leu Pro Lys Ala Leu Leu Asn Leu Ser Asn Gly Arg Asn Asp195 200 205Thr Ile Pro Val Leu Leu Asp Ile Ala Glu Arg Thr Gly Asn Met Arg210 215 220Glu Phe Ile Asn Ser Pro Phe Arg Asp Ile Tyr Tyr Arg Gly Gln Thr225 230 235 240Ala Leu His Ile Ala Ile Glu Arg Arg Cys Lys His Tyr Val Glu Leu260 265 270Leu Val Ala Gln Gly Ala Asp Val His Ala Gln Ala Arg Gly Arg Phe260 265 270Phe Gln Pro Lys Asp Glu Gly Gly Tyr Phe Tyr Phe Gly Glu Leu Pro275 280 285Leu Ser Leu Ala Ala Cys Thr Asn Gln Pro His Ile Val Asn Tyr Leu290 295 300Thr Glu Asn Pro His Lys Lys Ala Asp Met Arg Arg Gln Asp Ser Arg305 310 315 320Gly Asn Thr Val Leu His Ala Leu Val Ala Ile Ala Asp Asn Thr Arg325 330 335Glu Asn Thr Lys Phe Val Thr Lys Met Tyr Asp Leu Leu Leu Leu Lys340 345 350Cys Ala Arg Leu Phe Pro Asp Ser Asn Leu Glu Ala Val Leu Asn Asn355 360 365Asp Gly Leu Ser Pro Leu Met Met Ala Ala Lys Thr Gly Lys Ile Gly370 375 380Val Phe Gln His Ile Ile Arg Arg Glu Val Thr Asp Glu Asp Thr Arg385 390 395 400His Leu Ser Arg Lys Phe Lys Asp Trp Ala Tyr Gly Pro Val Tyr Ser405 410 415Ser Leu Tyr Asp Leu Ser Ser Leu Asp Thr Cys Gly Glu Glu Ala Ser420 425 430Val Leu Glu Ile Leu Val Tyr Asn Ser Lys Ile Glu Asn Arg His Glu435 440 445Met Leu Ala Val Glu Pro Ile Asn Glu Leu Leu Arg Asp Lys Trp Arg450 455 460Lys Phe Gly Ala Val Ser Phe Tyr Ile Asn Val Val Ser Tyr Leu Cys465 470 475 480Ala Met Val Ile Phe Thr Leu Thr Ala Tyr Tyr Gln Pro Leu Glu Gly485 490 495Thr Val Pro Tyr Pro Tyr Arg Thr Thr Val Asp Tyr Leu Arg Leu Ala500 505 510Gly Glu Val Ile Thr Leu Phe Thr Gly Val Leu Phe Phe Phe Thr Asn515 520 525Ile Lys Asp Leu Phe Met Lys Lys Cys Pro Gly Val Asn Ser Leu Phe530 535 540Ile Asp Gly Ser Phe Gln Leu Leu Ser Phe Ile Tyr Ser Val Leu Val545 550 555 560Ile Val Ser Ala Ala Leu Tyr Leu Ala Gly Ile Glu Ala Tyr Leu Ala565 570 575Val Met Val Phe Ala Leu Val Leu Gly Trp Met Asn Ala Leu Tyr Phe580 585 590Thr Arg Gly Leu Lys Leu Thr Gly Thr Tyr Ser Ile Met Ile Gln Lys595 600 605Val Leu Phe Lys Asp Leu Phe Arg Phe Leu Leu 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660ggcaacatga gggagttcat taactcgccc ttccgtgaca tctactatcg aggtcagaca 720gccctgcaca tcgccattga gcgtcgctgc aaacactacg tggaacttct cgtggcccag 780ggagctgatg tccacgccca ggcccgtggg cgcttcttcc agcccaagga tgaggggggc 840tacttctact ttggtgagct gcccctgtcg ctggctgcct gcaccaacca gccccacatt 900gtcaactacc tgacggagaa cccccacaag aaggcggaca tgcggcgcca ggactcgcga 960ggcaacacag tgctgcatgc gctggtggcc attgctgaca acacccgtga gaacaccaag 1020tttgttacca agatgtacga cctgctgctg ctcaagtgtg cccgcctctt ccccgacagc 1080aacctggagg ccgtgctcaa caacgacggc ctctcgcccc tcatgatggc tgccaagacg 1140ggcaagattg gggtgtttca gcacatcatc cggcgggagg tgacggatga ggacacacgg 1200cacctgtccc gcaagttcaa ggactgggcc tatgggccag tgtattcctc gctttatgac 1260ctctcctccc tggacacgtg tggggaagag gcctccgtgc tggagatcct ggtgtacaac 1320agcaagattg agaaccgcca cgagatgctg gctgtggagc ccatcaatga actgctgcgg 1380gacaagtggc gcaagttcgg ggccgtctcc ttctacatca acgtggtctc ctacctgtgt 1440gccatggtca tcttcactct caccgcctac taccagccgc tggagggcac agtgccgtac 1500ccttaccgca ccacggtgga ctacctgcgg ctggctggcg aggtcattac gctcttcact 1560ggggtcctgt tcttcttcac caacatcaaa gacttgttca tgaagaaatg ccctggagtg 1620aattctctct tcattgatgg ctccttccag ctgctcagct tcatctactc tgtcctggtg 1680atcgtctcag cagccctcta cctggcaggg atcgaggcct acctggccgt gatggtcttt 1740gccctggtcc tgggctggat gaatgccctt tacttcaccc gtgggctgaa gctgacgggg 1800acctatagca tcatgatcca gaaggtactc ttcaaggacc ttttccgatt cctgctcgtc 1860tacttgctct tcatgatcgg ctacgcttca gccctggtct ccctcctgaa cccgtgtgcc 1920aacatgaagg tgtgcaatga ggaccagacc aactgcacag tgcccactta cccctcgtgc 1980cgtgacagcg agaccttcag caccttcctc ctggacctgt ttaagctgac catcggcatg 2040ggcgacctgg agatgctgag cagcaccaag taccccgtgg tcttcatcat cctgctggtg 2100acctacatca tcctcacctt tgtgctgctc ctcaacatgc tcattgccct catgggcgag 2160acagtgggcc aggtctccaa ggagagcaag cacatctgga agctgcagtg ggccaccacc 2220atcctggaca ttgagcgctc cttccccgta ttcctgagga aggccttccg ctctggggag 2280atggtcaccg tgggcaagag ctcggacggc actcctgacc gcaggtggtg cttcagggtg 2340aatgaggtga actggtctca ctggaaccag aacttgggca tcatcaacga ggacccgggc 2400aagaatgaga cctaccagta ttatggcttc tcgcataccg tgggccgcct ccgaatggat 2460cgctggtcct cggtggtacc ccgcgtggtg gaactgaaca agaactcgaa cccggacgag 2520gtggtggtgc ctctggacag catggggaac ccccgctgcg atggccacca gcagggttac 2580ccccgcaagt ggaggactga tgacgccccg ctctag 2616<210>5<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述合成的DNA<400>5gagagaacac caagtttgt 19<210>6<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述合成的DNA<400>6cagcggcccc aatctcttca aagtac 26<210>7<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述合成的DNA<400>7ctacagccag catctcatgg 20<210>8<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述合成的DNA<400>8tcagggtcca gtatggcaga tcctggtgat 30<210>9<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述合成的DNA<400>9gttaatgggc tctacagcca gc 22<210>10<211><212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>10Pro Leu Asp Asn Leu Gly Asn Pro Asn Cys1 5 10
權(quán)利要求
1.一種蛋白質(zhì)，所述蛋白在腎臟中特異性表達(dá)，具有對(duì)機(jī)械刺激應(yīng)答而非選擇性地將陽(yáng)離子攝入細(xì)胞內(nèi)的功能。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)從小鼠衍生獲得。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的蛋白質(zhì)，它具有序列表SEQ ID NO1所示的氨基酸序列。
4.一種DNA，它編碼權(quán)利要求3中所述的氨基酸序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的DNA，它具有序列表SEQ ID NO2所示的核苷酸序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)從人衍生獲得。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的蛋白質(zhì)，它具有序列表SEQ ID NO3所示的氨基酸序列。
8.一種DNA，它編碼權(quán)利要求7所述的氨基酸序列。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的DNA，它具有序列表SEQ ID NO4所示的核苷酸序列。
10.一種蛋白質(zhì)，它具有權(quán)利要求3或7所述的蛋白質(zhì)氨基酸序列中一個(gè)或多個(gè)氨基酸缺失、置換或增加的氨基酸序列。
11.一種DNA，它是與權(quán)利要求4、5、8或9所述的DNA雜交的DNA。
12.一種篩選促進(jìn)或阻滯陽(yáng)離子通道的物質(zhì)的方法，該方法采用權(quán)利要求1、2、3、6或7所述的蛋白質(zhì)。
13.一種抗體，它是針對(duì)權(quán)利要求1、2、3、6或7所述的蛋白質(zhì)的抗體。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的抗體，它是單克隆抗體。
全文摘要
本發(fā)明提供了新的蛋白質(zhì)及其編碼基因。在腎臟內(nèi)特異性表達(dá)的、有對(duì)機(jī)械刺激應(yīng)答而非選擇性地將陽(yáng)離子攝入細(xì)胞內(nèi)的功能的衍生自小鼠或人的新的應(yīng)答機(jī)械刺激的通道蛋白。編碼該蛋白質(zhì)的DNA。用該蛋白質(zhì)篩選促進(jìn)或阻滯陽(yáng)離子通道活性的物質(zhì)的方法。針對(duì)該蛋白質(zhì)的抗體。它可用作高血壓、糖尿病等基于陽(yáng)離子通道異常的疾病的診斷藥或治療藥，或者可用作用來(lái)尋找預(yù)防和/或治療這些疾病的藥物的工具。
文檔編號(hào)C07K16/18GK1432062SQ01805652
公開(kāi)日2003年7月23日 申請(qǐng)日期2001年2月23日 優(yōu)先權(quán)日2000年2月25日
發(fā)明者鈴木誠(chéng), 石橋賢一 申請(qǐng)人:第一制藥株式會(huì)社