專利名稱：一種鴨甲肝病毒js株及其在鴨病毒性肝炎防治中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種分離得到的病毒株及其應(yīng)用，特別涉及一種鴨甲肝病毒JS株及其在鴨病毒性肝炎防治中的應(yīng)用。屬于生物疫苗防治領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
鴨肝炎病毒(duck hepatitis virus, DHV)是鴨病毒性肝炎的致病病原。國(guó)際病毒分類系統(tǒng)于2010年4月修訂鴨肝炎病毒命名為鴨甲肝病毒(DHAV)，屬小RNA病毒科，禽肝炎病毒屬。目前鴨甲肝病毒分為3個(gè)血清型，S卩血清I型，血清2型和血清3型。其中血清I型為傳統(tǒng)鴨肝炎病毒，血清2型和血清3型為近幾年發(fā)現(xiàn)的新型病毒株，對(duì)應(yīng)臺(tái)灣新型和韓國(guó)新型，3個(gè)血清型之間無(wú)交叉反應(yīng)。
隨著鴨甲肝病毒I型雞胚化弱毒疫苗、高免卵黃抗體的研制成功及臨床應(yīng)用，使本病在很大程度上的很好的控制。近幾年，在山東、河北、廣東等地免疫接種過I型鴨肝炎弱毒疫苗或注射過I型鴨肝炎高免卵黃抗體的鴨群中仍發(fā)生鴨肝炎，死亡率為20%-80%，經(jīng)病毒分離鑒定為血清3型，即韓國(guó)新型。目前市場(chǎng)上還未見鴨甲肝病毒3型疫苗，因此對(duì)于鴨甲肝病毒3型的防治，國(guó)內(nèi)還為空白。對(duì)于鴨甲肝病毒3型疫苗的研制刻不容緩。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的之一是提供一株新分離的鴨甲肝病毒；本發(fā)明目的之二是將上述鴨甲肝病毒制備新型鴨甲肝病毒滅活疫苗。本發(fā)明目的之三是提供一種制備上述新型鴨甲肝病毒滅活疫苗的方法。本發(fā)明的上述目的是通過以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的一株新分離的鴨甲肝病毒毒株由專利發(fā)明人自行分離得到，通過毒種的分離培養(yǎng)、鴨胚中和試驗(yàn)、病毒的PCR檢測(cè)及病毒的測(cè)序檢測(cè)實(shí)驗(yàn)，確定該毒株為一株新型鴨甲肝病毒，并命名為鴨甲肝病毒JS株(DHAV-JS)，微生物保藏編號(hào)是CGMCCNo. 6852。分類名是鴨甲肝病毒；保藏時(shí)間是2012年11月13日；保藏單位是中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心；保藏地址是北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所。本發(fā)明鴨甲肝病毒(DHAV)JS株的分離結(jié)果顯示病毒盲傳5代，多數(shù)鴨胚于48 120h死亡。剖檢鴨胚可見絨毛尿囊膜水腫，胚頭，頸部、胸部、爪、翅尖及喙旁均有出血。收獲的鴨胚尿囊液經(jīng)紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)檢測(cè)無(wú)血凝活性。本發(fā)明鴨甲肝病毒(DHAV) JS株的鴨胚中和試驗(yàn)結(jié)果顯示試驗(yàn)組鴨胚全部存活，而對(duì)照組經(jīng)5d全部死亡，死亡鴨胚出血。說(shuō)明血清3型鴨甲肝病毒抗血清可中和該病毒。本發(fā)明鴨甲肝病毒(DHAV)JS株的病毒的PCR檢測(cè)結(jié)果顯示通過鴨甲肝病毒特異性引物和相應(yīng)的PCR試驗(yàn)，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，約在714bp處出現(xiàn)了特異性的DNA條帶。見附圖1。本發(fā)明鴨甲肝病毒(DHAV) JS株的測(cè)序檢測(cè)，其中鴨甲肝病毒JS株VPl基因序列為SEQ ID NO.1所示，結(jié)果顯示利用DNA MAN軟件，將JS株VPl基因序列與參考毒株的相應(yīng)序列進(jìn)行比較表明，JS3與DHAV血清I型VPl的基因序列核苷酸同源性在62. 0% 64. 4%之間，JS3與DHAV血清2型VPl的基因序列核苷酸同源性在63. 6% 63. 8%之間，JS3與DHAV血清3型VPl的基因序列核苷酸同源性在92. 3% 98. 5%之間。進(jìn)化樹分析表明，所分離到的JS3株與SD02 (DHAV血清3型病毒)株的親緣關(guān)系較近。見附圖2、3。進(jìn)一步的，本發(fā)明還提出了所述的鴨甲肝病毒JS株在制備鴨甲肝病毒滅活疫苗中的應(yīng)用。本發(fā)明的一種鴨甲肝病毒滅活疫苗，其特征在于有效成分為滅活后的鴨甲肝病毒JS株，所述的鴨甲肝病毒JS株保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，微生物保藏編號(hào)為CGMCC No. 6852。更進(jìn)一步的，本發(fā)明還提供了一種制備以上所述的鴨甲肝病毒滅活疫苗的方法， 其特征在于包括以下步驟培養(yǎng)上述鴨甲肝病毒JS株，得到鴨甲肝病毒抗原液，將鴨甲肝病毒抗原液滅活，濃縮，分別配制油相和水相，將油相和水相混合在一起后乳化，即得鴨甲肝病毒滅活疫苗。在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述的抗原液按照以下方法制備將所述的鴨甲肝病毒JS株(保藏編號(hào)為CGMCC No. 6852)接種10日齡SPF鴨胚，挑選在孵育48 120小時(shí)之間死亡的胚胎，收集抗原液。優(yōu)選的，進(jìn)一步的，將得到的抗原液進(jìn)行10倍濃縮。更優(yōu)選的，將抗原液中加入福爾馬林溶液使得福爾馬林溶液的終濃度為O.1 %，置滅活罐中37°C溫箱16小時(shí)滅活。在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述的油相按照以下方法制備白油94份(以毫升為單位)，司本-806份(以毫升為單位)，混合后加熱，加入硬脂酸鋁2份(以克為單位)，混合均勻，SP得油相。在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述的水相按照以下方法制備吐溫-804份(以毫升為單位)，滅活濃縮后的病毒抗原液96份(以毫升為單位)，混合均勻，即得水相。在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述水相和油相按體積比I '2混合，并加入1% (w/v)硫柳汞溶液，使其最終濃度為O. 01% (w/v)0此處“w/v”表示的是質(zhì)量(g)與體積(ml)的比，1% (w/v)硫柳萊溶液即IOOml水中含有硫柳汞的量為lg。相較于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有點(diǎn)在于1、采用濃縮工藝，從而減少疫苗注射劑量，降低動(dòng)物的應(yīng)激反應(yīng)，提高生產(chǎn)性能。2、本發(fā)明不同劑量及批次滅活疫苗對(duì)雛鴨的免疫試驗(yàn)，注射O. 05mL該滅活疫苗，對(duì)雛鴨的保護(hù)率為98. 9%。3、本發(fā)明滅活疫苗免疫I日齡雛鴨后，當(dāng)雛鴨血清中和抗體效價(jià)> 25 5時(shí)，雛鴨抗1000LD50/0. 2mL的鴨甲肝病毒JS株攻擊，保護(hù)率為100%。4、本發(fā)明滅活疫苗免疫種鴨，種鴨血清中和抗體效價(jià)> 26·0時(shí)，其下一代雛鴨可獲得有效被動(dòng)免疫保護(hù)。5、本發(fā)明滅活疫苗安全性試驗(yàn)，按照一次單劑量、重復(fù)單劑量和一次大劑量(O. 5mL/只)注射雛鴨，在觀察時(shí)間內(nèi)，均無(wú)任何不良反應(yīng)，表明制備的新型鴨甲肝病毒滅活疫苗安全性良好。


圖1為PCR檢測(cè)結(jié)果；圖2為不同毒株的VPl基因序列比較分析；圖3為鴨甲肝病毒JS株和其它幾株DHAV VPl的進(jìn)化樹分析；圖4為鴨甲肝病毒滅活疫苗的方法流程圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而更為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù) 人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。實(shí)施例1 :鴨甲肝病毒JS株的分離培養(yǎng)I病料采集無(wú)菌采集雛鴨的肝、脾等組織病料，將病料剪碎，磨細(xì)，用無(wú)菌pH7. 4PBS作1:5稀釋，經(jīng)3000rpm離心30min，取上清液加入抗生素，2000IU青霉素和2000 μ g/mL鏈霉素，于37°C作用30min，將離心的上清液按4 1加入三氯甲烷，充分混勻后，置37 °C作用60min，經(jīng)3000rpm離心30min，取上清液加入抗生素，2000IU青霉素和2000 μ g/mL鏈霉素，于37°C作用30min作為分離病毒材料。2分離培養(yǎng)將上述病毒分離材料接種10日齡SPF鴨胚，O. 2mL/胚，置37°C 38 °C孵化箱內(nèi)孵化，每天照胚2 4次，觀察5d，將48 120h死亡的胚胎放置4°C 8°CS夜冷卻收縮血管，吸取尿囊液及胚體保存和作無(wú)菌檢驗(yàn)，并觀察胚胎病變。反復(fù)凍融3次，4000rpm離心30min,吸取上清,凍結(jié)保存。實(shí)施例2:鴨甲肝病毒滅活疫苗的制備1、基礎(chǔ)種子批建立取分離的凍干毒種，以pH7. 4PBS作1:100稀釋，接種10日齡SPF鴨胚，O. 2mL/胚，每日照胚2 4次，觀察5d，收集48 120h死亡的鴨胚，取尿囊液及胚體保存和作無(wú)菌檢驗(yàn)，并觀察胎兒病變。反復(fù)凍融3次，4000rpm離心30min，吸取上清，分裝，凍干保存。2、生產(chǎn)種子批建立取12日齡SPF鴨胚，接種基礎(chǔ)毒種，37 38°C孵育，每天照胚2 4次，觀察5d，收集48 120h死亡的鴨胚，取尿囊液及胚體保存和作無(wú)菌檢驗(yàn),并觀察胎兒病變。反復(fù)凍融3次，4000rpm離心30min，吸取上清，定量分裝于玻瓶?jī)?nèi)，置-80°C冰箱內(nèi)保存，按生產(chǎn)種子批指定的檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行檢驗(yàn)，即得生產(chǎn)毒種。將合格后用作生產(chǎn)毒種的鴨甲肝病毒JS株保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，微生物保藏編號(hào)是=CGMCC No. 6852。3、制苗用病毒液的制備取生產(chǎn)用鵝甲肝病毒JS株毒種(保藏編號(hào)為=CGMCC No. 6852)，用滅菌生理鹽水稀釋至10_3 10Λ尿囊腔內(nèi)接種10日齡SPF鴨胚，O. 2mL/胚，接種后密封針孔，置37°C孵育，不必翻蛋。雞胚接種后，每天照蛋2次，將48小時(shí)前死亡的鴨胚棄去。此后，每6小時(shí)照蛋I次，死亡的胚隨時(shí)取出，直至120小時(shí)，將48-120小時(shí)死亡鴨胚置于4°C冷卻4 24小時(shí)。用碘酊消毒氣室部位，然后以無(wú)菌方法剝除氣室部位卵殼，揭去卵殼膜，挑破絨毛尿囊膜及羊膜，收取鴨胚尿囊液及胚體，反復(fù)凍融3次，4000rpm離心30min,吸取上清,冷藏保存。4、濃縮取出冷藏的病毒液，在無(wú)菌條件下，用裝有10層紗布和I層300目銅紗的無(wú)菌漏斗過濾制苗用病毒液，除去尿囊液殘?jiān)推渌诸w粒雜質(zhì)。選用合適孔徑的濃縮膜，按照病毒濃縮機(jī)操作要求，在2 8°C條件下濃縮病毒液。病毒液濃縮到10倍。5、滅活將病毒液注入滅活灌，開啟滅活罐的攪拌器，準(zhǔn)確量取10%的福爾馬林溶液，在不斷攪拌時(shí)加入含抗原液的滅活灌中，使其充分?jǐn)嚢杈鶆颉８栺R林溶液終濃度為
0.1%。將滅活罐升溫至37°C (以罐內(nèi)溫度達(dá)到37°C開始計(jì)時(shí))，維持滅活時(shí)間16小時(shí)，期間不停緩慢攪拌。滅活結(jié)束后，取樣10mL，用于做滅活檢驗(yàn)和無(wú)菌檢驗(yàn)。 6、油佐劑滅活疫苗的配制6.1油相制備取優(yōu)質(zhì)白油94mL，加司本_806mL，混合后加熱，另加硬脂酸鋁2g，一邊加一邊攪拌，直至透明為止，高壓滅菌，冷卻后備用。6. 2水相制備取4mL吐溫_80，加入到滅活的病毒胚液96mL中，使吐溫-80充分溶解。6. 3配苗及乳化取60mL油相加入乳化灌內(nèi)，開動(dòng)電機(jī)慢速攪拌，同時(shí)徐徐加入上述30mL水相，加完后繼續(xù)攪拌，同時(shí)加入1% (w/v)硫柳汞溶液，使其最終濃度為O. 01% (w/V);然后通過均質(zhì)機(jī)乳化。制成鴨甲肝病毒滅活疫苗。乳化后，取樣3 5mL，以3000rpm離心15min，若有分層現(xiàn)象，應(yīng)重復(fù)乳化I次。實(shí)施例3 :鴨甲肝病毒滅活疫苗的應(yīng)用1、對(duì)雛鴨不同劑量及批次的鴨甲肝病毒滅活疫苗免疫試驗(yàn)三批鴨甲肝病毒滅活疫苗(按照實(shí)施例2方法制備)，按O. 02mL/只、O. 05mL/只和O.1OmL/只，接種I日齡易感雛鴨，于接種后24h后攻擊鴨甲肝病毒JS株，1000LD5Q/0. 2mL,觀察雛鴨的保護(hù)情況，結(jié)果見表I。表I不同劑量鴨甲肝病毒滅活疫苗的免疫試驗(yàn)結(jié)果
鴨甲肝病毒劑量/mL
雛鴨數(shù)日齡觀察時(shí)-
批號(hào)JS株劑量對(duì)照
/只 (天)間/日 U 02OO^U 10
LD50/0.2mL
20120130 IIOuuIu 26/30 29/30 30/30
20 i 202 30 I100010 25/30 30/30 30/30 0/10
201203 30 I100010 26/30 30/30 30/30注分母為試驗(yàn)數(shù)，分子為存活數(shù)。結(jié)果顯示，本發(fā)明中鴨甲肝病毒滅活疫苗具有良好的預(yù)防鴨甲肝病毒作用。三批次不同劑量鴨甲肝病毒滅活疫苗的免疫試驗(yàn)，分別注射O. 02mL/只、O. 05mL/只和O.1OmL/只，攻擊鴨甲肝病毒JS株后，雛鴨耐受強(qiáng)毒攻擊，O. 05mL/只能保護(hù)89/90，保護(hù)率為98. 9%，而O. 02mL/只僅能保護(hù)77/90雛鴨，保護(hù)率為85. 6%。因此以O(shè). 05mL/只接種鴨甲肝病毒滅活疫苗，能保護(hù)率可達(dá)95%以上。2、免疫雛鴨中和抗體水平與免疫保護(hù)力關(guān)系實(shí)驗(yàn)三批鴨甲肝病毒滅活疫苗(201201,201202和201203)分別免疫I日齡雛鴨，對(duì)每批次血清中和抗體效價(jià)分別為23 7、24 5、25 5、和26_°的雛鴨進(jìn)行分組，對(duì)每只雛鴨攻毒1000LD5(i/0. 2mL的鴨甲肝病毒JS株，觀察5天，記錄結(jié)果。三批疫苗免疫雛鴨后不同血清中和抗體效價(jià)雛鴨抗鴨甲肝病毒JS株攻擊結(jié)果見表2。表2三批疫苗免疫雛鴨后不同血清中和抗體效價(jià)雛鴨抗鴨甲肝病毒JS株攻擊結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種新型鴨甲肝病毒JS株，其特征在于所述的鴨甲肝病毒JS株保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏日期為2012年11月13日，微生物保藏編號(hào)為 CGMCC No. 6852。
2.權(quán)利要求1所述的鴨甲肝病毒JS株在制備預(yù)防鴨甲肝病毒藥物中的應(yīng)用。
3.一種鴨甲肝病毒滅活疫苗，其特征在于有效成分為滅活后的鴨甲肝病毒JS株，所述的鴨甲肝病毒JS株保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，微生物保藏編號(hào)為CGMCC No. 6852。
4.一種制備權(quán)利要求3所述的鴨甲肝病毒滅活疫苗的方法，其特征在于包括以下步驟將所述的鴨甲肝病毒JS株進(jìn)行培養(yǎng)，得到鴨甲肝病毒抗原液，將鴨甲肝病毒抗原液滅活，濃縮，分別配制油相和水相，將油相和水相混合后乳化，即得鴨甲肝病毒滅活疫苗。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述的抗原液按照以下方法制備取所述的鴨甲肝病毒JS株毒種，接種10日齡SPF鴨胚，挑選孵育48-120小時(shí)后死亡的胚胎，收集抗原液。
6.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于將得到的抗原液進(jìn)行10倍濃縮。
7.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述的抗原液中加入福爾馬林溶液，使得福爾馬林溶液的終濃度為O. 1%，置滅活罐中37°C溫箱16小時(shí)滅活。
8.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述的油相按照以下方法制備白油94份 (以毫升為單位)，司本-806份(以毫升為單位)，混合后加熱，加入硬脂酸鋁2份(以克為單位)，混合均勻，即得油相。
9.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述水相按照以下方法制備吐溫-804份 (以毫升為單位)，滅活濃縮后的病毒抗原液96份(以毫升為單位)，混合均勻，即得水相。
10.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述水相和油相按體積比1:2混合，并加入 1% (w/v)硫柳汞溶液，使其最終濃度為0.01% (w/v)0
全文摘要
本發(fā)明公開了一種新型鴨甲肝病毒JS株及其在鴨病毒性肝炎防治中的應(yīng)用。所述的鴨甲肝病毒JS株經(jīng)分離培養(yǎng)、鴨胚中和試驗(yàn)、病毒的PCR檢測(cè)及病毒的測(cè)序檢測(cè)實(shí)驗(yàn)獲得，并確定所述毒株為鴨甲肝病毒血清3型，微生物保藏編號(hào)為CGMCC No.6852。本發(fā)明將新型鴨甲肝病毒JS株作為生產(chǎn)疫苗的病毒株，接種10日齡SPF鴨胚，挑選在孵育48小時(shí)之后死亡的胚胎，收集胚液，滅活后經(jīng)乳化制備新型鴨甲肝病毒滅活疫苗。臨床應(yīng)用證實(shí)，制備的滅活疫苗安全性良好。該疫苗有利于新型鴨甲肝病毒病的防控，可有針對(duì)性的防治新型鴨甲肝病毒的感染與爆發(fā)，可規(guī)?；a(chǎn)并應(yīng)用于臨床。
文檔編號(hào)C12N7/00GK103013931SQ20121056215
公開日2013年4月3日 申請(qǐng)日期2012年12月21日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月21日
發(fā)明者王彬, 藏玉婷, 鄔立權(quán), 柴華, 王琪, 宋揚(yáng), 劉洪斌, 涂映霞, 王峰, 張楊, 丁國(guó)杰 申請(qǐng)人:哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司