專利名稱：通過n端替換提高gh10木聚糖酶熱穩(wěn)定性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及GHlO木聚糖酶改造及突變酶的高效表達(dá)方法，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
木聚糖酶是可將木聚糖降解成低聚木糖和木糖的一類酶的總稱。狹義上木聚糖酶特指 β _1，4-內(nèi)切木聚糖酶(endo-β-1,4-xylanase, EC 3· 2·1. 8)。β-1,4-內(nèi)切木聚糖酶可以從主鏈內(nèi)部作用于木糖苷鍵，是木聚糖降解過程中最重要的酶之一。目前所克隆的木聚糖酶大多屬于F/10和G/11家族，第10家族木聚糖酶與第11家族相比具有底物特異性低、水解速度快、水解產(chǎn)物聚合度低，具有較大的研究和應(yīng)用價(jià)值。木聚糖酶在造紙、食品、能源、飼料及環(huán)境等領(lǐng)域中具有廣闊的應(yīng)用前景，特別是在紙漿生物漂白中的巨大應(yīng)用潛力早已引起各界的高度關(guān)注。然而，目前工業(yè)生產(chǎn)的大多為原始菌直接發(fā)酵所得到的木聚糖酶，其最適反應(yīng)溫度大多在45-55°C左右，且熱穩(wěn)定性較差，大大制約了木聚糖酶在飼料、造紙等行業(yè)中高溫環(huán)境下的應(yīng)用，如Alves-Prado等在巴西塞拉多地區(qū)的土壤中分離到一株高產(chǎn)木聚糖酶的細(xì)菌Lysinibacillussp. strain P5B1,該木聚糖酶的最適作用溫度為55°C ;Menon等從印度海洋化工研究院實(shí)驗(yàn)鹽農(nóng)場(chǎng)的沉積物中篩選分離出一株產(chǎn)耐鹽木聚糖酶的短小芽孢桿菌GESF1，并對(duì)該木聚糖酶進(jìn)行了分離純化和酶學(xué)性質(zhì)研究，該酶的最適作用溫度為40°C，雖然這些木聚糖酶其它酶學(xué)性質(zhì)較好，但由于熱穩(wěn)定性問題較難被應(yīng)用在高溫制造行業(yè)。因此尋找有效途徑和手段，提高木聚糖酶在高溫環(huán)境中的穩(wěn)定性及催化活性已成為國(guó)內(nèi)木聚糖酶工業(yè)的當(dāng)務(wù)之急。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種GHlO木聚糖酶Aus XynlOA熱穩(wěn)定性改造及重組突變酶的高效表達(dá)和純化方法?！?br> 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案提供了一種提高GHlO木聚糖酶最適溫度及熱穩(wěn)定性的方法，其特征在于，依據(jù)Aus XynlOA(源于Aspergillus usamii E001)與耐熱木聚糖酶(源于Thermoascus Aurantiacus 751K6A)蛋白質(zhì)序列比對(duì)及計(jì)算機(jī)預(yù)測(cè)分析結(jié)果，運(yùn)用基因工程的方法將耐熱酶的N端區(qū)域序列替換Aus XynlOA的相應(yīng)序列。獲得的突變酶命名為ATxlOAM，其對(duì)應(yīng)的基因和蛋白質(zhì)序列分別為SEQ ID NO 1和SEQ ID NO :2。
所述的木聚糖酶的活性測(cè)定方法
于25mL具塞試管A和B中，各加入用pH 4. 6、檸檬酸-Na2HPO4緩沖液配制的質(zhì)量濃度為O. 5%的樺木木聚糖(Sigma, USA)溶液2. 4mL, 50°C預(yù)熱lOmin,在A管中加入O.1mL 適當(dāng)稀釋的酶液，50°C準(zhǔn)確反應(yīng)15min;立即各加入2. 5mL 3'，5' - 二硝基水楊酸(DNS) 試劑，在B管中再補(bǔ)加O.1mL酶液，A和B管均煮沸7min ;冷卻后各加去離子水5mL，搖勻； 540nm處以B管為空白對(duì)照測(cè)定A管吸光度值，并從木糖標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)的還原糖 (以木糖計(jì))含量并折算成酶活性單位。酶活性單位定義在本測(cè)定條件下，以每分鐘產(chǎn)生I μ mol還原糖所需的酶量定義為I個(gè)木聚糖酶活性單位(IU)。
所述突變酶的構(gòu)建和表達(dá)方法
(I)突變酶的構(gòu)建依據(jù) Aus XynlOA 與來源于 Thermoascus Aurantiacus 751K6A 的耐熱木聚糖酶蛋白質(zhì)序列比對(duì)及計(jì)算機(jī)預(yù)測(cè)分析結(jié)果選擇NRLTTGKNA(SEQ ID NO 3)作為擬替換序列，并依此設(shè)計(jì)突變弓 I物XynCHNRl (5' -CGGCCTTGATAATGGCAGCGTTCTTACCAGTAG TCAATC-3')。
提取包含Aus XynlOA基因的T載體(pUCm-T-Aus xynl0A)，依此為模板使用引物 AusXynlOA 基因的成熟肽引物 XynlOA-Fl (5' -GAATTCCAGGCTTCAGTGAGTATTGA-3 ')和引物XynCHNRl進(jìn)行第一輪PCR，其后依pUCm-T-Aus xynlOA為模板，利用大引物PCR使用Xy nlOA-Rl(5/ -GCGGCCGCCTAGAGAGCATTTGCGATAG-3')和第一輪PCR產(chǎn)物作為引物進(jìn)行第二輪PCR。將兩輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳分析，割膠回收目的條帶并與pUCm-T 載體連接(pUCm-T-ATxlOAM)，轉(zhuǎn)化JM109，經(jīng)酶切鑒定正確后送上海生工測(cè)序，得到突變酶的成熟妝基因序列。
(2)含編碼ATxlOAM成熟肽基因的表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
使用EcoR I和Not I對(duì)割膠回收的目的基因與pPIC9K分別進(jìn)行雙酶切，割膠回收的酶切產(chǎn)物在T4DNA連接酶的作用下進(jìn)行連接，得到重組質(zhì)粒pPIC9K-ATxlOAM(圖1)，并對(duì)重組表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行序列測(cè)定。
(3) GSl 15/ATxIOAM重組子的構(gòu)建、表達(dá)、產(chǎn)物純化及活性測(cè)定用Sal I對(duì) pPIC9K-ATxlOAM 進(jìn)行線性化，按照畢赤酵母表達(dá)手冊(cè)進(jìn)行電轉(zhuǎn)、篩選，得到高拷貝的畢赤酵母重組子GS115/ATxlOAM ;按照手冊(cè)上的標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，用DNS法測(cè)定重組木聚糖酶活性；發(fā)酵液經(jīng)冷凍離心、超濾、離子交換層析和凝膠過濾層析，獲得了電泳純的重組木聚糖酶。
本發(fā)明的有益效果本發(fā)明的目的是提供一種GHlO木聚糖酶Aus XynlOA改造及重組突變酶的高效表達(dá)和純化方法。依據(jù)Aus XynlOA與來源于Thermoascus Aurantiacus 751K6A的耐熱木聚糖酶蛋白質(zhì)序列比對(duì)結(jié)果，運(yùn)用基因工程的方法將耐熱酶的N末端區(qū)域序列替換Aus XynlOA的對(duì)應(yīng)區(qū)域。獲得的突變酶命名為ATxlOAM。ATxlOAM較原酶最適溫度和熱穩(wěn)定性都有了一定幅度的提高，具有一定的工業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用潛力以及經(jīng)濟(jì)價(jià)值， 也為其它木聚糖酶的研究奠定了基礎(chǔ)。


圖1 :重組質(zhì)粒pPIC9K_ATxlOAM示意圖具體實(shí)施方式
以下結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明的操作方法。但是這些實(shí)施例僅用于詳細(xì)說明本發(fā)明，而不用于限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1突變酶的構(gòu)建
提取包含Aus XynlOA基因的T載體(pUCm-T-Aus xynl0A)，依此為模板使用Aus XynlOA基因的成熟肽引物XynlOA-Fl和引物XynCHNRl進(jìn)行第一輪PCR，其反應(yīng)條件為 940C 5min ;2 個(gè)循環(huán)，94°C 30s, 45°C 30s, 72°C 70s ；28 個(gè)循環(huán) 94°C 30s, 55°C 30s, 72°C 30s ；720C IOmin ;10°C保存；其后依pUCm-T-AusxynlOA為模板，利用大引物PCR使用XynlOA-Rl (5' -GCGGCCGCCTAGAGAGCATTTGCGATAG-3')和第一輪 PCR 產(chǎn)物作為引物進(jìn)行第二輪 PCR， 其反應(yīng)條件為94°C 5min ；2 個(gè)循環(huán)，94°C 30s, 45 °C 30s, 72 °C 70s ；28 個(gè)循環(huán) 94°C 30s, 55°C 30s, 72°C 70s ；72°C IOmin ;10°C保存。將兩輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳分析，割膠回收目的條帶并與PUCm-T載體連接(pUCm-T-ATxlOAM)，轉(zhuǎn)化JM109，經(jīng)酶切鑒定正確后送上海生工測(cè)序，得到突變酶的成熟肽基因序列。
實(shí)施例2含編碼ATxlOAM成熟肽基因的表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
使用EcoR I和Not I對(duì)割膠回收的目的基因與pPIC9K分別進(jìn)行雙酶切，酶切時(shí)間為4h，割膠回收的酶切產(chǎn)物在T4DNA連接酶的作用下連接過夜(> 12h)，得到重組質(zhì)粒 pPIC9K-ATxlOAM(圖1)，并對(duì)重組表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行序列測(cè)定。
實(shí)施例3GS115/ATx IOAM的構(gòu)建、表達(dá)、產(chǎn)物純化及活性測(cè)定
用Sal I對(duì)pPIC9K-ATxlOAM進(jìn)行線性化，按照畢赤酵母表達(dá)手冊(cè)進(jìn)行電轉(zhuǎn)化、篩選，得到高拷貝的畢赤酵母重組子GSl 15/ATx IOAM。該工程菌用O. 5%甲醇誘導(dǎo)72h，DNS法測(cè)得發(fā)酵液中重組木聚糖酶活性達(dá)521IU/mL。離心上清液為重組木聚糖酶粗酶液，經(jīng)截留分子量為IOkDa的超濾膜濃縮,再經(jīng)DEAE-Sepharose Fast Flow離子交換層析和Sephadex G-75凝膠過濾層析純化，純化后經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)為單一條帶，并顯示重組木聚糖酶分子量為42kDa。該重組木聚糖酶最適作用溫度55°C，較原酶提高了 10°C，60°C下保 溫IOmin殘余酶活仍大于40%。
權(quán)利要求
1.一種改造后的源自宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)E001、歸屬于GHlO家族的木聚糖酶基因ATxlOAM，其對(duì)應(yīng)的基因和蛋白質(zhì)序列分別為SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2。
2.突變酶的構(gòu)建方法 依據(jù)Aus XynlOA與來源于Thermoascus Aurantiacus 751K6A的耐熱木聚糖酶蛋白質(zhì)序列比對(duì)結(jié)果選擇NRLTTGKNA(SEQ ID NO 3)作為擬替換序列，并依此設(shè)計(jì)突變引物XynCHNRl(5' CGGCCTTGATAATGGCAGCGTTCTTACCAGTAGTCAATC-3')； 提取包含Aus XynlOA基因的T載體(pUCm-T-Aus xynlOA)，依此為模板使用引物AusXynlOA 基因的成熟肽引物 XynlOA-Fl (5 ' -GAATTCCAGGCTTCAGTGAGTATTGA-3 ')和引物XynCHNRl進(jìn)行第一輪PCR，其后依pUCm-T-Aus xynlOA為模板，利用大引物PCR使用XynlOA-Rl (5' -GCGGCCGCCTAGAGAGCATTTGCGATAG-3')和第一輪PCR產(chǎn)物作為弓I物進(jìn)行第二輪PCR ;將兩輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，割膠回收目的條帶并與pUCm-T載體連接(pUCm-T-ATxlOAM)，轉(zhuǎn)化JM109，經(jīng)酶切鑒定正確后送上海生工測(cè)序，得到突變酶的成熟妝基因序列。
3.ATxIOAM表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建、表達(dá)及純化 使用EcoR I和Not I對(duì)割膠回收的目的基因與PPIC9K分別進(jìn)行雙酶切，割膠回收的酶切產(chǎn)物在T4DNA連接酶的作用下進(jìn)行連接，得到重組質(zhì)粒pPIC9K-ATxlOAM，并對(duì)重組表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行序列測(cè)定； 用Sal I對(duì)pPIC9K-ATxlOAM進(jìn)行線性化，按照畢赤酵母表達(dá)手冊(cè)進(jìn)行電轉(zhuǎn)、篩選，得到高拷貝的畢赤酵母重組子GS115/ATxlOAM ;按照手冊(cè)上的標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，用DNS法測(cè)定重組木聚糖酶活性；發(fā)酵液經(jīng)冷凍離心、超濾、離子交換層析和凝膠過濾層析，獲得了電泳純的重組木聚糖酶。
全文摘要
本發(fā)明的目的是提供一種GH10木聚糖酶Aus Xyn10A熱穩(wěn)定性改造及重組突變酶的高效表達(dá)和純化方法。依據(jù)Aus Xyn10A(源于Aspergillus usamii E001)與耐熱木聚糖酶(源于Thermoascus Aurantiacus 751K6A)蛋白質(zhì)序列比對(duì)結(jié)果，運(yùn)用基因工程的方法將耐熱酶的N末端區(qū)域序列替換Aus Xyn10A的對(duì)應(yīng)序列。獲得的突變酶命名為ATx10AM。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明突變后該酶的最適溫度和熱穩(wěn)定性有了明顯的提高，作為一種耐熱型的酶制劑，該木聚糖酶具有較大的工業(yè)化生產(chǎn)潛力和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。
文檔編號(hào)C12N15/81GK102994529SQ201210562519
公開日2013年3月27日 申請(qǐng)日期2012年12月24日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月24日
發(fā)明者鄔敏辰, 汪俊卿, 殷欣, 李劍芳 申請(qǐng)人:江南大學(xué)