具有運(yùn)鐵蛋白肽的外切體的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及在其表面上包括運(yùn)鐵蛋白靶向部分的外切體，產(chǎn)生它們的方法，和此類外切體用于體內(nèi)遞送遺傳物質(zhì)和/或生物治療性蛋白或肽或化療試劑的用途，尤其涉及此類外切體在基因療法或基因沉默、或遞送其他治療劑的方法中的用途。
【專利說(shuō)明】具有運(yùn)鐵蛋白肽的外切體 【技術(shù)領(lǐng)域】
[〇〇〇1] 本發(fā)明涉及將外切體靶向期望的細(xì)胞類型或組織。具體而言，本發(fā)明涉及外切體， 和產(chǎn)生它們的方法，所述外切體包括在外切體的表面上表達(dá)的靶向部分。 【背景技術(shù)】
[0002] 核酸常規(guī)上用于基因療法用于替換非功能基因[1]，并且經(jīng)RNA干擾（RNAi)效應(yīng) 器分子比如miRNAs[2]、 ShRNAs[3]和siRNAs[4]用于抵消致病的突變。由于快速清除[5]、 核酸酶[6]、缺乏器官特異性分布和低效的細(xì)胞攝取，裸露DNA和RNA難以在體內(nèi)遞送，通常 專用的基因遞送載體用于遞送。
[0003] 病毒載體和陽(yáng)離子脂質(zhì)體是最前沿的遞送載體技術(shù)并且已經(jīng)是相對(duì)成功的，大量 的這些遞送載體已經(jīng)在臨床試驗(yàn)中[7]。盡管這些成功，仍有明顯的局限限制許多應(yīng)用，最 顯著的局限是對(duì)于大部分病毒載體的免疫識(shí)別[8,9,10]和對(duì)于病毒比如慢病毒的誘變整 合[11];和炎癥毒性和對(duì)于脂質(zhì)體的快速清除[12,13,14,15]。通過(guò)先天免疫系統(tǒng)的識(shí)別 導(dǎo)致急性炎癥反應(yīng)，其可需要使用免疫抑制策略以克服現(xiàn)有策略潛在地將患者暴露于機(jī)會(huì) 性感染的冒險(xiǎn)的攝取和再施用問(wèn)題[16,17,18]。針對(duì)遞送媒介產(chǎn)生的抗體也使得在隨后的 施用中轉(zhuǎn)基因表達(dá)急劇地減少[19]。
[0004] 現(xiàn)有策略的固有風(fēng)險(xiǎn)和限制已經(jīng)通常將它們限于治療的益處明顯超過(guò)風(fēng)險(xiǎn)的威 脅人類生命的疾病，比如重癥聯(lián)合免疫缺陷[20]，限于特定環(huán)境比如類似眼的免疫豁免部 位中的疾病[1]，或用于基因接種[21]。但是，對(duì)于慢性的和使人虛弱但不是危及生命的遺 傳疾病，比如肌強(qiáng)直性營(yíng)養(yǎng)不良，需要相當(dāng)更低的風(fēng)險(xiǎn)特征并且維持矯正基因治療的能力 幾十年，不是幾年，用于治療介入。對(duì)于次類疾病潛在地不可接受的風(fēng)險(xiǎn)的例子是以上討論 的免疫抑制策略，突出的是由于試驗(yàn)管理員未知的對(duì)象服用的免疫抑制劑[22]引起的機(jī) 會(huì)性感染，在最近的風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的AAV基因治療試驗(yàn)中健康患者的死亡。隨著逐漸增多 數(shù)量的疾病顯示具有遺傳成分，包括肥胖、心臟疾病和精神疾病，有很大的可能性修飾易感 基因用于預(yù)先的遺傳方案，但是僅僅如果風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)一步下降并且實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)期的維持能力。因此， 需要開發(fā)這樣的技術(shù)，其能夠避免免疫識(shí)別和炎癥，同時(shí)保留好的遞送效率，以便擴(kuò)展基因 療法在致死疾病之外的用途。
[0005] 方案之一可能在于使用特異性靶向待治療的細(xì)胞類型或器官的外切體用于基因 遞送。外切體是內(nèi)吞起源的小膜結(jié)合囊泡（30-100nm)，其在多泡體與質(zhì)膜融合之后釋放進(jìn) 入細(xì)胞外環(huán)境。已經(jīng)對(duì)許多免疫細(xì)胞，包括B細(xì)胞、T細(xì)胞和樹突細(xì)胞（DC)描述了外切體 產(chǎn)生。衍生自B淋巴細(xì)胞和成熟DC的外切體表達(dá)MHC-II、MHC-I、⑶86和ICAM-1 [23, 24]， 并且在實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ秃团R床試驗(yàn)中已經(jīng)用于誘導(dǎo)特定的抗腫瘤T細(xì)胞毒素應(yīng)答和抗腫瘤免疫 [24, 25]。外切體介導(dǎo)的基因遞送的潛能已經(jīng)由遞送鼠 mRNAs和miRNAs至人肥大細(xì)胞顯示 [26]，并且神經(jīng)膠質(zhì)瘤衍生的外切體[27]已經(jīng)表明將外源DNA質(zhì)粒產(chǎn)生的mRNA轉(zhuǎn)移至異 源細(xì)胞。也已經(jīng)公開了具有外源DNA、siRNA和其他修飾寡核苷酸的外切體[28]。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明人也已成功地將靶向部分引入外切體，從而外切體可被靶向所選擇的組 織。尤其，本發(fā)明人已成功地將運(yùn)鐵蛋白（Tf)肽靶向部分引入外切體，從而外切體可被靶 向表達(dá)運(yùn)鐵蛋白受體（TfR)的組織或細(xì)胞。本發(fā)明人已經(jīng)顯示表達(dá)Tf肽靶向部分的外切 體具有與商業(yè)上可獲得的常規(guī)的轉(zhuǎn)染試劑比如lipofectamine和RNAi max相當(dāng)?shù)臄z取效 率。因此，本發(fā)明涉及在表面上包括Tf肽靶向部分的外切體、包括外切體跨膜蛋白和靶向 部分的融合蛋白，并且涉及編碼此類融合蛋白的核酸構(gòu)建體。Tf靶向外切體可用貨物比如 外源遺傳物質(zhì)或生物治療性蛋白和/或肽、和/或化療試劑裝載并且用于貨物的遞送，尤其 用于核酸的遞送用于基因治療和基因沉默，以及生物治療性蛋白和肽和化療試劑的遞送用 于治療。
[0007] 根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了包括外切體的組合物，其中外切體包括在外切體 的表面上表達(dá)的靶向部分，并且所述靶向部分是運(yùn)鐵蛋白（Tf)多肽或肽。Tf多肽靶向部分 或Tf肽靶向部分可以是保留與TfR結(jié)合的能力的任何Tf多肽或Tf肽。
[0008] 在另一方面中，本發(fā)明提供包括外切體的組合物，其用于體內(nèi)遞送遺傳物質(zhì)、蛋白 質(zhì)和/或肽的方法中，該外切體包括在外切體的表面上表達(dá)的Tf多肽靶向部分或Tf肽靶 向部分，其中該外切體衍生自不成熟的樹突細(xì)胞。
[0009] 在另一方面中，本發(fā)明提供產(chǎn)生外切體的方法，該外切體包括在外切體的表面上 表達(dá)的Tf多肽靶向部分或Tf肽靶向部分，該方法包括在用于產(chǎn)生外切體的細(xì)胞中表達(dá)包 括靶向部分和外切體跨膜蛋白的融合蛋白，其中隨著該細(xì)胞產(chǎn)生融合蛋白，表達(dá)的融合蛋 白并入外切體。
[0010] 在另一方面中，本發(fā)明提供包括外切體跨膜蛋白和異源靶向蛋白、多肽或肽的多 肽，其中靶向蛋白、多肽或肽是與在待靶向的細(xì)胞表面上存在的TfR結(jié)合的Tf多肽或Tf 肽，并且其中當(dāng)多肽存在于外切體中時(shí)，該靶向Tf多肽或Tf肽存在于外切體的表面上。
[0011] 在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供編碼多肽的多核苷酸構(gòu)建體，其中該構(gòu)建體包括 編碼5'外切體跨膜信號(hào)序列的多核苷酸，例如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)靶向信號(hào)肽，其可操作地連接至編碼 本發(fā)明多肽的多核苷酸。
[0012] 在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供將外切體靶向所選擇的組織或細(xì)胞類型的方法， 所述方法包括用根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，在宿主細(xì)胞中表達(dá)構(gòu)建體， 和從已經(jīng)表達(dá)該構(gòu)建體的宿主細(xì)胞中獲得外切體。 【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0013] 圖1.用外切體介導(dǎo)的siRNA遞送敲低GAPDH: (a，b)是將Cy5-標(biāo)記的GAPDH siRNA應(yīng)用至具有電穿孔的（E)非靶向的外切體（Exo非靶向的）、Tf-靶向的外切體（Exo Tf)或RVG靶向的外切體（Exo RVG)的HEK細(xì)胞的代表性圖像。添加非電穿孔的外切體和 siRNA (NE)作為陰性對(duì)照并且添加 siRNA和常規(guī)的轉(zhuǎn)染試劑（LIP0和RNAi max)作為陽(yáng)性 對(duì)照。
[0014] 圖2.用外切體介導(dǎo)的siRNA遞送敲低GAPDH: (a，b)是將Cy5-標(biāo)記的GAPDH siRNA 應(yīng)用至具有電穿孔的（E)非祀向的外切體（Exo非祀向的）、Tf-祀向的外切體（Exo Tf) 或RVG靶向的外切體（Exo RVG)的B2M17細(xì)胞的代表性圖像。添加非電穿孔的外切體和 siRNA(NE)作為陰性對(duì)照并且添加 siRNA和常規(guī)的轉(zhuǎn)染試劑（LIPO和RNAi max)作為陽(yáng)性 對(duì)照。
[0015] 圖3.用外切體介導(dǎo)的siRNA遞送敲低GAPDH: (a，b)是將Cy5-標(biāo)記的GAPDH siRNA 應(yīng)用至具有電穿孔的（E)非祀向的外切體（Exo非祀向的）、Tf-祀向的外切體（ExoTf)或 RVG靶向的外切體（Exo RVG)的腦神經(jīng)瘤細(xì)胞（Neur〇2a)的代表性圖像。添加非電穿孔的 外切體和siRNA (NE)作為陰性對(duì)照并且添加 siRNA和常規(guī)的轉(zhuǎn)染試劑（LIP0和RNAi max) 作為陽(yáng)性對(duì)照。
[0016] 圖4.用外切體介導(dǎo)的siRNA遞送敲低GAPDH: (a，b)是將Cy5-標(biāo)記的GAPDH siRNA 應(yīng)用至具有電穿孔的（E)非祀向的外切體（Exo非祀向的）、Tf-祀向的外切體（Exo Tf)或 RVG靶向的外切體（Exo RVG)的小鼠骨髓樹突細(xì)胞的代表性圖像。添加非電穿孔的外切體 和siRNA (NE)作為陰性對(duì)照并且添加 siRNA和常規(guī)的轉(zhuǎn)染試劑（LIP0和RNAi max)作為陽(yáng) 性對(duì)照。 【具體實(shí)施方式】
[0017] 本發(fā)明涉及外切體，以及它們作為遞送媒介的用途。外切體是內(nèi)吞起源的小膜結(jié) 合囊泡，其在多泡體與質(zhì)膜融合之后被釋放進(jìn)入細(xì)胞外環(huán)境。因此，本申請(qǐng)涉及包括此類外 切體的組合物。典型地，外切體的直徑在30和100nm之間，但是可包括多達(dá)200nm的相似 起源的膜顆粒。如本文所使用，外切體指由多泡體分泌的內(nèi)體起源的納米顆粒。
[0018] 外切體由許多不同類型的細(xì)胞產(chǎn)生，包括免疫細(xì)胞比如B淋巴細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、 樹突細(xì)胞（DC)和肥大細(xì)胞。外切體也由以下產(chǎn)生，例如神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞、血小板、網(wǎng)織紅細(xì) 胞、神經(jīng)元、小腸上皮細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、HELA細(xì)胞、人胚胎腎細(xì)胞（HEK細(xì)胞）、B2M17細(xì)胞、 Bend3細(xì)胞、原代骨髓衍生的樹突細(xì)胞、BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞和腦神經(jīng)瘤（NEUR02A)細(xì)胞。根據(jù) 本申請(qǐng)使用的外切體可衍生自任何適合的細(xì)胞，包括以上識(shí)別的細(xì)胞。外切體也已經(jīng)從生 理液體分離，比如血漿、尿、羊膜液和惡性積液。
[0019] 在本發(fā)明的優(yōu)選方面中，外切體衍生自DC，優(yōu)選不成熟的DC。由不成熟的DC產(chǎn)生 的外切體不表達(dá)MHC-II、MHC-I或⑶86。如此，此類外切體不明顯刺激幼稚T細(xì)胞并且不 能在混合的淋巴細(xì)胞反應(yīng)中誘導(dǎo)應(yīng)答。因此，由不成熟的樹突細(xì)胞產(chǎn)生的外切體是用于遞 送貨物，比如遺傳物質(zhì)，尤其用于體內(nèi)使用，例如基因療法中的理想候選物。
[0020] 因此，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供衍生自樹突細(xì)胞的外切體，用于貨物--比如 遺傳物質(zhì)和蛋白質(zhì)和/或肽生物治療劑或化療劑--的體內(nèi)靶向遞送。在優(yōu)選的實(shí)施方式 中，本發(fā)明的外切體衍生自樹突細(xì)胞并且提供用于遺傳物質(zhì)、蛋白質(zhì)或肽生物治療劑或化 療劑的體內(nèi)靶向遞送。
[0021] 如上所概述，外切體由許多不同類型的細(xì)胞產(chǎn)生并且也已經(jīng)從生理液體分離。因 此，根據(jù)本發(fā)明，外切體可從以上討論的任何合適的細(xì)胞類型獲得，或通過(guò)從生理液體分離 獲得。典型地，本發(fā)明的方法包括從細(xì)胞培養(yǎng)基或組織上清液分離外切體。
[0022] 可通過(guò)任何合適的方法從培養(yǎng)基收集由細(xì)胞產(chǎn)生的外切體。典型地，外切體的 制品可通過(guò)離心、過(guò)濾或這些方法的組合從細(xì)胞培養(yǎng)物或組織上清液制備。例如，外切體 可通過(guò)如下制備：差速離心，即低速（<20000g)離心以使較大顆粒成團(tuán)，接著通過(guò)高速 OlOOOOOg)離心以使外切體成團(tuán)、用合適的過(guò)濾器（例如，0.22 μ m過(guò)濾器）的粒度過(guò)濾、 梯度超速離心（例如，蔗糖梯度）或這些方法的組合。
[0023] 根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明的外切體可用外源遺傳物質(zhì)、蛋白質(zhì)或肽或化療劑裝載。尤 其，根據(jù)本發(fā)明，可制備外切體并且然后用期望的遺傳物質(zhì)、蛋白質(zhì)或肽、或化療劑裝載，用 于靶向遞送。外切體也可用外源遺傳物質(zhì)或生物治療性蛋白或肽裝載，通過(guò)在細(xì)胞中過(guò)表 達(dá)編碼遺傳物質(zhì)或蛋白質(zhì)或肽的合適的構(gòu)建體，從而將物質(zhì)裝載進(jìn)入外切體。
[0024] 相比遞送這種分子的常規(guī)手段，Tf_靶向的外切體遞送外源遺傳物質(zhì)、蛋白質(zhì)或肽 的用途提供了許多優(yōu)勢(shì)。例如，當(dāng)化合物使用外切體遞送時(shí)，它們被保護(hù)避免降解并且更 穩(wěn)定；化合物可被遞送至靶組織，比如特定類型的癌癥，比如果沒有封裝在外切體內(nèi)更有效 和/或更特異；和/或該貨物可能不太可能引起免疫應(yīng)答，因?yàn)樗谕馇畜w中并且所以 不能自由地被免疫細(xì)胞探測(cè)到，和/或結(jié)合抗體。Tf-靶向的外切體遞送外源遺傳物質(zhì)、蛋 白質(zhì)或肽或化療劑用途的其他潛在的優(yōu)勢(shì)包括在外切體的全身性遞送之后繞過(guò)肝細(xì)胞和/ 或避免耐藥性，比如藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體比如ABC-轉(zhuǎn)運(yùn)體的上調(diào)。
[0025] 用于遞送的適合的遺傳物質(zhì)包括外源DNA質(zhì)粒和siRNA。合適的遺傳物質(zhì)也包括 修飾的寡核苷酸和其他RNA干擾效應(yīng)器部分比如miRNA和shRNA。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面， 裝載進(jìn)入外切體的遺傳物質(zhì)不是通常與外切體相關(guān)的遺傳物質(zhì)，例如，核酸優(yōu)選地不是當(dāng) 其由細(xì)胞產(chǎn)生時(shí)并入外切體的mRNA或miRNA。尤其，遺傳物質(zhì)可裝載進(jìn)入已經(jīng)與細(xì)胞分離 的外切體制品。可選地遺傳物質(zhì)可以在細(xì)胞中過(guò)表達(dá)，例如通過(guò)將合適的構(gòu)建體引入細(xì)胞， 并且隨后裝載進(jìn)入外切體。因此，外源遺傳物質(zhì)指包括通常與外切體不相關(guān)的核酸的遺傳 物質(zhì)。在尤其優(yōu)選的實(shí)施方式中，核酸物質(zhì)是通常不出現(xiàn)在外切體中的質(zhì)粒DNA或其他核 酸比如siRNA和修飾的寡核苷酸。
[0026] 相似地，優(yōu)選地裝載進(jìn)入外切體的蛋白質(zhì)或肽不是通常與外切體相關(guān)的蛋白質(zhì)或 肽，例如，蛋白質(zhì)或肽優(yōu)選地不是當(dāng)其由細(xì)胞--比如未修飾的細(xì)胞--產(chǎn)生時(shí)被并入外 切體的蛋白質(zhì)或肽。外源蛋白質(zhì)或肽指包括通常與外切體不相關(guān)的蛋白質(zhì)或肽的蛋白質(zhì)或 肽。此類外源蛋白質(zhì)或肽可裝載進(jìn)入已經(jīng)與細(xì)胞分離的外切體，或通過(guò)在宿主細(xì)胞中過(guò)表 達(dá)合適的構(gòu)建體，以便蛋白質(zhì)或肽被裝載進(jìn)入外切體。在尤其優(yōu)選的實(shí)施方式中，待裝載進(jìn) 入外切體的蛋白質(zhì)或肽是抗體或抗體片段，更優(yōu)選地是單克隆抗體或其片段。
[0027] 用于并入外切體的核酸可以是單鏈的或雙鏈的。單鏈核酸包括具有磷酸二酯、 2' 0-甲基、2'甲氧乙基、氨基磷酸酯、甲基膦酸酯和/或磷酸酯骨架化學(xué)的那些。通常，引 入的雙鏈核酸包括例如質(zhì)粒DNA和小干擾RNAs (siRNAs)。
[0028] 用于病況、疾病或不適的治療和/或預(yù)防的任何生物治療性蛋白和/或肽可并入 根據(jù)本發(fā)明的外切體。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，并入外切體的蛋白質(zhì)或肽是抗體或抗體片段。 在更優(yōu)選的實(shí)施方式中，抗體是單克隆抗體或其片段。
[0029] 外切體也可用化療劑--比如治療藥劑--裝載，用于化療劑的遞送。合適的藥 劑的例子包括細(xì)胞毒素劑，例如用于癌癥的治療。
[0030] 基于遺傳物質(zhì)、蛋白質(zhì)或肽對(duì)其期望遞送進(jìn)入細(xì)胞的效果和進(jìn)行該效果的機(jī)理選 擇待裝載進(jìn)入外切體的遺傳物質(zhì)、蛋白質(zhì)或肽。例如，核酸可用于基因治療，例如為了在細(xì) 胞或細(xì)胞組中表達(dá)期望的基因。此類核酸通常以編碼期望基因的質(zhì)粒DNA或病毒載體的形 式，并且其可操作地連接至合適的調(diào)節(jié)序列比如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子等，使得一旦其被遞送至待 治療的細(xì)胞，則表達(dá)質(zhì)粒DNA。對(duì)基因治療易感的疾病的例子包括血友病B (因子IX)、囊性 纖維化（CTFR)和脊髓性肌萎縮（SMN-1)。
[0031] 核酸可也用于例如免疫以表達(dá)期望針對(duì)其產(chǎn)生免疫應(yīng)答的一種或多種抗原。因 此，待裝載進(jìn)入外切體的核酸可編碼期望針對(duì)其產(chǎn)生免疫應(yīng)答的一種或多種抗原，包括但 不限于腫瘤抗原，來(lái)自病原體比如病毒、細(xì)菌或真菌病原體的抗原。
[0032] 核酸也可用于基因沉默。這種基因沉默可在治療中用于關(guān)閉異?；虮磉_(dá)或在 動(dòng)物模型研究中用于產(chǎn)生單個(gè)或更多個(gè)遺傳敲除。通常，此類核酸以siRNAs的形式提供。 例如，包括siRNAs的RNAi分子可用于在肌細(xì)胞中敲低具有多個(gè)CUG重復(fù)的DMPK以治療 肌強(qiáng)直性營(yíng)養(yǎng)不良。在其他實(shí)施例中，表達(dá)減少造成亨廷頓病的突變體亨廷頓基因（htt) 的shRNA的質(zhì)?？捎蒙窠?jīng)元特異外切體遞送。其他靶基因包括用于治療阿爾茨海默氏疾病 的BACE-1。一些癌基因也可用siRNA或shRNAs比如ras、c-myc和VEGFR-2靶向。腦靶向 siRNA裝載的外切體可尤其用于阿爾茨海默氏疾病中BACE-1的沉默、帕金森疾病中α -突 觸核蛋白（synuclein)的沉默、亨廷頓疾病中htt的沉默和用于治療中風(fēng)以降低缺血損壞 的神經(jīng)元胱冬酶-3的沉默。
[0033] 可使用包括2' -Ο-Me化合物和PNA的反義修飾的寡核苷酸。例如，此類寡核苷酸 可設(shè)計(jì)為誘導(dǎo)外顯子跳躍，例如突變體抗肌萎縮蛋白基因可被遞送至肌細(xì)胞用于治療杜興 氏肌營(yíng)養(yǎng)不良癥，例如抑制發(fā)夾環(huán)的反義寡核苷酸用于治療肌強(qiáng)直性營(yíng)養(yǎng)不良和例如反式 剪接寡核苷酸用于治療脊髓性肌萎縮。
[〇〇34] 作為用遺傳物質(zhì)裝載本發(fā)明外切體的可選項(xiàng)，可裝載蛋白質(zhì)或肽。用于病況、疾病 或不適的治療和/或預(yù)防的任何生物治療性蛋白和/或肽可并入根據(jù)本發(fā)明的外切體。在 優(yōu)選的實(shí)施方式中，并入外切體的蛋白質(zhì)或肽是抗體或抗體片段。單個(gè)蛋白質(zhì)或肽可并入 外切體?？蛇x地，多于一種的蛋白質(zhì)和/或肽可并入外切體。多于一種的蛋白質(zhì)和/或肽 可作用在相同的或不同的靶上以帶來(lái)其治療和/或預(yù)防效果。
[0035] 待并入外切體的蛋白質(zhì)和/或肽可例如用于癌癥的治療和/或預(yù)防?？墒褂玫鞍?質(zhì)或肽生物治療劑治療的癌癥的例子包括白血病、結(jié)直腸癌、頭頸癌、非霍奇金氏淋巴瘤、 乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、胃癌、胰腺癌、腺癌和實(shí)體腫瘤。此類生物治療性蛋白和/或肽 典型地是抗體或其片段，尤其是單克隆抗體或其片段。
[〇〇36] 蛋白質(zhì)和/或肽生物治療也可用于自身免疫性疾病的治療和/或預(yù)防。自身免疫 性疾病起因于身體對(duì)通常存在于身體中的物質(zhì)、組織和器官的過(guò)度活躍的免疫應(yīng)答。
[0037] 裝載進(jìn)入根據(jù)本發(fā)明的外切體的生物治療性蛋白和/或肽也可用于治療和/或預(yù) 防其他病況，包括心血管疾病、血友病、膿毒、中風(fēng)、包括杜興氏肌營(yíng)養(yǎng)不良（DMD)的肌營(yíng)養(yǎng) 不良、黃斑變性和阿爾茨海默氏疾病。
[0038] 在優(yōu)選的實(shí)施方式中，裝載進(jìn)入根據(jù)本發(fā)明的外切體的生物治療劑是治療性 抗體。在更優(yōu)選的實(shí)施方式中，治療性抗體選自用于封閉Bace-Ι和b-淀粉樣蛋白 (b-amyloids)的活化位點(diǎn)的單克隆抗體；針對(duì)成膠質(zhì)細(xì)胞瘤激酶的單克隆抗體和針對(duì)α4 整聯(lián)蛋白質(zhì)用于治療MS的抗體，例如那他珠單抗（Natalizumab)。
[0039] 在優(yōu)選的實(shí)施方式中，裝載進(jìn)入根據(jù)本發(fā)明的外切體的生物治療劑是肽。在 更優(yōu)選的實(shí)施方式中，肽選自用于引起對(duì)病毒和/或腫瘤抗原的免疫應(yīng)答的免疫顯性 (immune-dominant)肽；神經(jīng)保護(hù)肽，比如δ -阿片樣物質(zhì)受體配體，例如Biphalin ;用于 神經(jīng)炎癥的免疫抑制肽，例如腎上腺髓質(zhì)素和結(jié)合并且抑制NfKB信號(hào)傳導(dǎo)的NBD肽。
[0040] 外源遺傳物質(zhì)、蛋白質(zhì)或肽或化療劑可通過(guò)許多不同的技術(shù)引入外切體。例如，夕卜 切體可通過(guò)電穿孔或使用轉(zhuǎn)染試劑裝載。盡管外切體的小尺寸，仍可能使用電穿孔用外源 遺傳物質(zhì)裝載外切體[W02010/119256]?？紤]到與細(xì)胞相比外切體的小尺寸，這是令人吃驚 的。考慮外切體的尺寸，用于細(xì)胞電穿孔的電壓的外推將提示外切體的電穿孔將需要超高 電壓。但是，令人吃驚地，使用電穿孔用質(zhì)粒DNA和siRNA裝載外切體是可能的。電穿孔條 件可根據(jù)貨物的電荷和尺寸而改變。典型的電壓范圍為20V/cm至1000V/cm，比如20V/cm 至100V/cm，電容通常在25 μ F和250 μ F之間，比如25 μ F和125 μ F之間。對(duì)于用抗體裝 載本發(fā)明的外切體，范圍為150mV至250mV，具體地200mV的電壓是優(yōu)選的。
[0041] 外切體也可使用轉(zhuǎn)染劑裝載。盡管外切體的小尺寸，常規(guī)的轉(zhuǎn)染試劑可用于用遺 傳物質(zhì)轉(zhuǎn)染外切體。根據(jù)本發(fā)明使用的優(yōu)選的轉(zhuǎn)染試劑包括陽(yáng)離子脂質(zhì)體。
[0042] 外切體也可通過(guò)用核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞裝載，所述核酸構(gòu)建體表達(dá)感 興趣的遺傳物質(zhì)或生物治療性蛋白或肽，以便隨著在細(xì)胞中產(chǎn)生外切體，遺傳物質(zhì)、生物治 療性蛋白或肽攝入外切體。
[0043] 靶向
[0044] 根據(jù)本發(fā)明，外切體靶向期望的細(xì)胞類型或組織。通過(guò)在外切體的表面上表達(dá)靶 向部分實(shí)現(xiàn)該靶向，所述靶向部分結(jié)合在待靶向的細(xì)胞表面上表達(dá)的細(xì)胞表面部分。根據(jù) 本發(fā)明，靶向部分是運(yùn)鐵蛋白（Tf)多肽或肽。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，靶向部分是Tf肽。典 型地，Tf多肽靶向部分或Tf肽靶向部分表達(dá)為與通常在外切體的表面上表達(dá)的跨膜蛋白 的融合蛋白。
[0045] Tf是糖蛋白，其以高親和力可逆地結(jié)合鐵。人運(yùn)鐵蛋白（Tf-h)由具有698個(gè)氨 基酸殘基的單條多肽鏈組成并且分子量為約80kDa。Tf-h的多肽序列顯示在SEQ ID NO: 1 中。人Tf基因的多核苷酸序列顯示在SEQIDN0:2中。Tf-h以高親和力結(jié)合兩個(gè)Fe3+離 子。四個(gè)不同的具有不同鐵含量的同種型Tf共存在血漿中 ：（l)ap〇-運(yùn)鐵蛋白（APOTf，沒 有鐵離子）；（2)單鐵運(yùn)鐵蛋白（鐵在C-末端結(jié)構(gòu)域）；（3)單鐵運(yùn)鐵蛋白（鐵在N-末端結(jié) 構(gòu)域）和（4)二鐵運(yùn)鐵蛋白（鐵在兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)）。在本發(fā)明的上下文中，Tf包括任何這 四個(gè)同種型，單獨(dú)或彼此組合。
[0046] Tf受體（TfR)是二硫化物-連接的同型二聚體糖蛋白，其在許多腫瘤的細(xì)胞表面 高度表達(dá)。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，存在于待被本發(fā)明的外切體靶向的細(xì)胞上的部分 是TfR，其結(jié)合在外切體的表面上表達(dá)的Tf多肽或Tf肽靶向部分。
[0047] 更詳細(xì)地，本發(fā)明的外切體可通過(guò)在它們表面上表達(dá)Tf多肽靶向部分或Tf肽靶 向部分，靶向具體的細(xì)胞類型或組織。合適的肽是結(jié)合在待靶向細(xì)胞的細(xì)胞表面上出現(xiàn)的 細(xì)胞表面部分比如受體或它們的配體的那些。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，Tf多肽靶向部分或Tf 肽靶向部分結(jié)合待靶向細(xì)胞的細(xì)胞表面上的TfR。合適的靶向部分的例子是短肽和完整的 Tf蛋白，只要靶向部分可在外切體的表面上表達(dá)并且不干擾膜蛋白插入外切體。典型地，靶 向肽相對(duì)于跨膜外切體蛋白是異源的。肽靶向部分的長(zhǎng)度可通常小于100個(gè)氨基酸，例如 小于50個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度，小于30個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度，至10、5或4個(gè)氨基酸的最小長(zhǎng)度。
[0048] 在優(yōu)選的實(shí)施方式中，最小Tf靶向部分的氨基酸序列為SEQ ID NO: 1的Tf蛋白的 氨基酸50至56,即氨基酸序列PSDGPSV(SEQ ID N0:4)。
[0049] 在尤其優(yōu)選的實(shí)施方式中，Tf靶向多肽或肽由下述組成或包括下述：氨基酸序列 CRTIGPSVC(SEQ ID N0:3)和/或SEQ ID N0:1的Tf蛋白的氨基酸50至56,即氨基酸序列 PSDGPSV(SEQ ID N0:4)〇
[0050] 包括SEQ ID N0S:3或4的氨基酸序列的肽片段可用作本發(fā)明的靶向部分。這些片 段的長(zhǎng)度可為10個(gè)氨基酸或更短，20個(gè)氨基酸或更短的長(zhǎng)度，30個(gè)氨基酸或更短的長(zhǎng)度， 50個(gè)氨基酸或更短的長(zhǎng)度，100個(gè)氨基酸或更短的長(zhǎng)度或更多。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，片段 的長(zhǎng)度為10個(gè)氨基酸或更短。片段優(yōu)選地是SEQ ID NO: 1的Tf蛋白片段。全長(zhǎng)Tf蛋白可 也用作本發(fā)明外切體中的靶向部分。
[0051] TfR在不成熟的紅系細(xì)胞、胎盤組織和快速分裂的正常和惡性細(xì)胞中高度表達(dá)。因 此，比如例如Tf蛋白、多肽和肽靶向部分可用于靶向具體的組織類型，或靶向患病的組織 比如腫瘤。在本發(fā)明尤其優(yōu)選的實(shí)施方式中，外切體靶向腫瘤。
[0052] 本發(fā)明的Tf靶向外切體可特別有利地使貨物能夠遞送至所有的細(xì)胞類型并且跨 物種。這是因?yàn)門f在跨物種中是高度保守的并且TfR在許多細(xì)胞類型的表面上普遍表達(dá)。 因此，例如，本發(fā)明的小鼠外切體可被人細(xì)胞攝取并且本發(fā)明的人外切體可被小鼠細(xì)胞攝 取。如此，Tf靶向外切體可認(rèn)為是通用的體外轉(zhuǎn)染試劑。另外，體內(nèi)Tf靶向外切體理想地 用于靶向具有提高的TfR表達(dá)的靶向組織，比如血腦屏障（BBB)的內(nèi)皮細(xì)胞，腫瘤細(xì)胞和局 部缺氧的位點(diǎn)（如在心臟的局部缺血或中風(fēng)后的局部缺血）。
[0053] 因此，本發(fā)明的Tf靶向外切體的潛在用途包括橫跨BBB的遺傳和非遺傳貨物的靶 向；癌癥療法對(duì)腫瘤的靶向，因?yàn)橄鄬?duì)于周圍組織，腫瘤細(xì)胞表達(dá)顯著提高水平的TfR ;和 療法對(duì)涉及局部缺血的疾病的靶向，比如其中也具有提高水平的TfR表達(dá)的缺血性心臟病 和中風(fēng)。
[0054] 與非靶向的外切體相比，在根據(jù)本發(fā)明的外切體的表面上Tf靶向部分的表達(dá)可 增加由靶細(xì)胞對(duì)所述外切體和其貨物的攝取至少兩倍、至少三倍、至少四倍、至少五倍、至 少十倍或至少二十倍。與使用常規(guī)商業(yè)上可獲得的轉(zhuǎn)染試劑比如lipofectamine或RNAi max遞送相同的貨物的攝取水平相比，在根據(jù)本發(fā)明的外切體的表面上Tf靶向部分的表達(dá) 可產(chǎn)生的靶細(xì)胞對(duì)外切體貨物的攝取水平相當(dāng)?？蛇x地，與使用常規(guī)商業(yè)上可獲得的轉(zhuǎn)染 試劑遞送相同的貨物的攝取水平相比，在根據(jù)本發(fā)明的外切體的表面上Tf靶向部分的表 達(dá)可增加通過(guò)靶細(xì)胞對(duì)外切體貨物的攝取至少兩倍、至少三倍、至少四倍、至少五倍、至少 十倍或至少二十倍。
[0055] 通過(guò)將其表達(dá)為與外切體跨膜蛋白的融合蛋白，Tf多肽靶向部分或Tf肽靶向部 分在外切體的表面上表達(dá)。已知許多蛋白質(zhì)與外切體相關(guān)；即隨著其形成，它們被并入外 切體。根據(jù)本發(fā)明使用的優(yōu)選的蛋白質(zhì)是跨膜蛋白的那些。例子包括但不限于Lamp-1、 Lamp-2、CD13、CD86、Flotillin、Syntaxin-3、CD2、CD36、CD40、CD40L、CD41a、CD44、CD45、 ICAM-1、整合蛋白 a4、LiCAM、LFA-l、Mac-la 和 @、Vti-lA 和B、CD3e 和 4、CD9、CD18、 CD37、CD53、CD63、CD81、CD82、CXCR4、FcR、GluR2/3、HLA-DM(MHC II)、免疫球蛋白、MHC-I 或MHC-II組分、TCRi3和四次跨膜蛋白。在本發(fā)明尤其優(yōu)選的實(shí)施方式中，跨膜蛋白選自 Lamp-1、Lamp-2、0)13、0)86、Floti 11 in、Syntaxin-3。在尤其優(yōu)選的實(shí)施方式中，跨膜蛋白 是Lamp-2。Lamp-2的序列在SEQ ID N0:5中示出。
[0056] 以下部分涉及本發(fā)明的所有多肽的一般特征，并且尤其涉及包括在本發(fā)明的多肽 內(nèi)的氨基酸序列的變體、改變、修飾或衍生。應(yīng)當(dāng)理解，本文所述的多肽的此類變體、改變、 修飾或衍生遵守這樣的要求，使多肽保留如可在本公開的隨后部分詳細(xì)說(shuō)明的任何進(jìn)一步 要求的活性或特征。
[0057] 本發(fā)明多肽的變體可通過(guò)具體水平的氨基酸同一性限定，其在本公開隨后部分詳 細(xì)描述。氨基酸同一性可使用任何適合的算法計(jì)算。例如PILEUP和BLAST算法可用于 計(jì)算同源性或排列（line up)序列（比如鑒定等同或相應(yīng)的序列（通常根據(jù)它們的缺省 設(shè)置），例如如在 Altschul S.F. (1993) J Mol Evol36:290-300 ;Altschul，S，F(xiàn) 等（1990) J Mol Biol215:403-10中描述。用于進(jìn)行BLAST分析的軟件是通過(guò)國(guó)立生物技術(shù)信息中心 (http://www. ncbi. nlm. nih. gov/)公眾可獲得的。該算法涉及首先通過(guò)鑒定查詢序列中 的短字長(zhǎng)W鑒定高打分序列對(duì)（HSPs)，當(dāng)與數(shù)據(jù)庫(kù)序列中相同的長(zhǎng)度的字比對(duì)時(shí)，所述長(zhǎng) 度W的短字匹配或滿足一些正值閾值打分T。T稱為鄰近字打分閾值（Altschul等，見上）。 這些初始鄰近詞命中用作開始搜索的種子，以發(fā)現(xiàn)包含它們的HSP。詞命中沿著每條序列 的兩個(gè)方向延伸，只要積累的比對(duì)打分可以增加。在下述情況下，停止在每個(gè)方向上詞擊 中的延伸：積累比對(duì)打分從其最大達(dá)到的值減少了 X值；由于一個(gè)或多個(gè)負(fù)打分殘基比對(duì) 的積累，積累打分變成零或更?。换虻竭_(dá)任一序列的末端。BLAST算法參數(shù)W、T和X決定比 對(duì)的靈敏度和速度。BLAST程序使用11的字長(zhǎng)（W)、BL0SUM62打分矩陣（見Henikoff和 Henikoff (1992) Proc. Natl. Acad. Sci.USA89 :10915-10919)、50 的比對(duì)（B)、10 的期望（E)、 Μ = 5、N = 4,和比較兩條鏈作為缺省。
[0058] BLAST算法進(jìn)行兩條序列之間的相似度的統(tǒng)計(jì)分析；見例如，Karl in和 Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA90 :5873-5787。BLAST 算法提供的相似度的一種 測(cè)量是最小和概率（P (N))，其提供兩個(gè)核苷酸序列或者氨基酸序列之間偶然發(fā)生匹配的概 率的指示。例如，如果比較第一序列與第二序列，最小和概率小于約1，更優(yōu)選小于約0.01， 以及最優(yōu)選小于約〇. 001，那么認(rèn)為序列與另一序列相似?？蛇x地，UWGCG包提供BESTFIT 程序，其可用于計(jì)算同源性（例如使用其缺省設(shè)置）（Devereux等（1984)Necleic Acids Researchl2,387-395)。
[0059] 應(yīng)當(dāng)理解多肽的變體也包括替代變體。替代變體優(yōu)選地涉及一個(gè)或多個(gè)氨基酸用 相同數(shù)量的氨基酸的替代并且產(chǎn)生保守氨基酸替代。例如，氨基酸可用具有類似性質(zhì)的可 選氨基酸替代，例如，另一堿性氨基酸，另一酸性氨基酸，另一中性氨基酸，另一帶電的氨基 酸，另一親水性氨基酸，另一疏水性氨基酸，另一極性氨基酸，另一芳族氨基酸或另一脂肪 族氨基酸。20種主要氨基酸的可用于選擇合適替代的一些性質(zhì)如下：
【權(quán)利要求】
1. 包括外切體的組合物，其中所述外切體包括在所述外切體的表面上表達(dá)的靶向部 分，并且所述靶向部分是運(yùn)鐵蛋白（Tf)多肽或肽。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述Tf多肽包括與SEQ ID NO: 1具有至少80% 序列同一性的多肽序列或所述Tf肽來(lái)自所述多肽。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的組合物，其中所述Tf肽包括來(lái)自SEQ ID NO: 1的所述多 肽序列的至少10個(gè)連續(xù)氨基酸殘基。
4. 根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的組合物，其中所述肽選自：CRTIGPSVC(SEQIDN0:3) 或PSDGPSV(SEQ ID N0:4)。
5. 根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的組合物，其中所述靶向部分包括與存在于待靶向的 細(xì)胞上的部分結(jié)合的肽。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的組合物，其中所述存在于待靶向的細(xì)胞上的部分是運(yùn)鐵蛋白 受體（TfR)。
7. 根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的組合物，其中所述外切體包括外切體跨膜蛋白，其已經(jīng)被 修飾以并入所述肽靶向部分。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的組合物，其中所述外切體跨膜蛋白選自Lamp-1、Lamp-2、 CD13、CD86、Flotillin、Syntaxin_3〇
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的組合物，其中所述外切體跨膜蛋白是Lamp-2b。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的組合物，其中所述靶向部分存在于Lamp-2b的N-末端處或 其附近并且用接頭序列與Lamp-2b分開。
11. 根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的組合物，其中所述外切體衍生自樹突細(xì)胞。
12. 根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的組合物，其中所述外切體用外源遺傳物質(zhì)、蛋白質(zhì) 和/或肽或化療劑裝載。
13. 根據(jù)權(quán)利要求12所述的組合物，其中所述外源遺傳物質(zhì)是編碼治療性蛋白或免疫 原的DNA質(zhì)粒。
14. 根據(jù)權(quán)利要求12所述的組合物，其中所述外源遺傳物質(zhì)是siRNA。
15. 根據(jù)權(quán)利要求13所述的組合物，其中所述質(zhì)粒編碼用于基因治療方法中的治療性 蛋白。
16. 根據(jù)權(quán)利要求13所述的組合物，其中所述質(zhì)粒編碼免疫原，其用于對(duì)所述免疫原 產(chǎn)生免疫應(yīng)答的方法中。
17. 根據(jù)權(quán)利要求12至16的任一項(xiàng)所述的組合物，其中所述外切體衍生自不成熟的樹 突細(xì)胞，其用于體內(nèi)遞送所述遺傳物質(zhì)、蛋白質(zhì)和/或肽或化療劑的方法中。
18. 產(chǎn)生外切體的方法，所述外切體包括在所述外切體的表面上表達(dá)的Tf多肽靶向部 分或Tf肽靶向部分，所述方法包括在用于產(chǎn)生外切體的細(xì)胞中表達(dá)包括所述靶向部分和 外切體跨膜蛋白的融合蛋白，其中隨著所述細(xì)胞產(chǎn)生所述融合蛋白，表達(dá)的所述融合蛋白 并入所述外切體。
19. 根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中編碼所述融合蛋白的多核苷酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)染進(jìn)入 所述細(xì)胞，所述多核苷酸構(gòu)建體進(jìn)一步包括啟動(dòng)子和信號(hào)肽序列。
20. 根據(jù)權(quán)利要求18或19所述的方法，其中所述細(xì)胞是樹突細(xì)胞。
21. 包括外切體跨膜蛋白和異源靶向Tf多肽或Tf肽的多肽，其中所述靶向Tf多肽或 Tf肽與待靶向的細(xì)胞表面上存在的Tf受體（TfR)結(jié)合，并且其中當(dāng)所述多肽存在于外切體 中時(shí)，所述靶向Tf多肽或Tf肽存在于所述外切體的表面上。
22. 編碼如權(quán)利要求22所限定的多肽的多核苷酸構(gòu)建體，其中所述構(gòu)建體包括編碼5' 外切體跨膜信號(hào)序列的多核苷酸，其可操作地連接至編碼本發(fā)明所述多肽的多核苷酸。
23. 根據(jù)權(quán)利要求22所述的多核苷酸構(gòu)建體，其中所述外切體跨膜信號(hào)序列是內(nèi)質(zhì)網(wǎng) 革巴向信號(hào)肽。
24. 將外切體靶向所選擇的組織或細(xì)胞類型的方法，所述方法包括用如權(quán)利要求22或 23所限定的多核苷酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，在所述宿主細(xì)胞中表達(dá)所述構(gòu)建體，和從其中 已經(jīng)表達(dá)所述構(gòu)建體的所述宿主細(xì)胞中獲得外切體。
25. 在非人動(dòng)物模型中基因沉默的方法，所述方法包括向所述動(dòng)物施用根據(jù)權(quán)利要求 14所述的外切體，其中所述siRNA引向待沉默的所述基因。
【文檔編號(hào)】C12N15/11GK104066453SQ201280060555
【公開日】2014年9月24日 申請(qǐng)日期:2012年12月7日 優(yōu)先權(quán)日:2011年12月7日
【發(fā)明者】M·伍德斯, S·拉卡爾-利特雷頓, S·伊蘭德魯斯 申請(qǐng)人:Isis創(chuàng)新公司