經(jīng)與碳儲存相關(guān)的CoA依賴性碳鏈延長制備6碳化學(xué)品的方法
【專利摘要】本申請描述了通過在C6脂族主鏈底物中形成兩個末端官能團(tuán)（包括羧基、胺或者羥基基團(tuán)）制備己二酸、己內(nèi)酰胺、6-氨基己酸、六亞甲基二胺或者1，6-己二醇的生物化學(xué)途徑。本申請所述的這些途徑、代謝工程和培養(yǎng)策略取決于與聚羥基烷酸酯累積細(xì)菌的碳儲存途徑相關(guān)的CoA依賴性延長酶或者類似的酶。
【專利說明】經(jīng)與碳儲存相關(guān)的CoA依賴性碳鏈延長制備6碳化學(xué)品的 方法
[0001] 相關(guān)申請的交叉引用
[0002] 本申請要求2011年12月16日提交的美國申請61/576, 401的優(yōu)先權(quán)。將該申請 公開的全部內(nèi)容通過引用的方式并入本申請。

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0003] 本發(fā)明涉及使用一種或者多種分離的酶如酮硫解酶、脫氫酶、還原酶、水合 酶、單氧化酶、ω-羥化酶和轉(zhuǎn)氨酶或者使用表達(dá)一種或者多種所述酶的重組宿主細(xì)胞生物 合成己二酸、6-氨基己酸、六亞甲基二胺、己內(nèi)酰胺和1，6-己二醇的方法。

【背景技術(shù)】
[0004] 尼龍是聚酰胺，其通常通過二胺與二羧酸的縮聚合成。類似地，尼龍可通過內(nèi)酰胺 的縮聚制備。一種無處不在的尼龍是尼龍6, 6,其通過六亞甲基二胺（HMD)和己二酸的反 應(yīng)制備。尼龍6通過己內(nèi)酰胺的開環(huán)聚合制備。因此，己二酸、六亞甲基二胺和己內(nèi)酰胺是 尼龍制備中的重要中間體（Anton&Baird,PolyamidesFibers,EncyclopediaofPolymer ScienceandTechnology, 2001)〇
[0005] 在產(chǎn)業(yè)上，己二酸和己內(nèi)酰胺經(jīng)環(huán)己烷的空氣氧化制備。環(huán)己烷的空氣氧化 在一系列步驟中產(chǎn)生環(huán)己酮（K)和環(huán)己醇（A)的混合物，其被指定為KA油。KA油的硝 酸氧化產(chǎn)生己二酸（Musser，Adipicacid,Ullmann'sEncyclopediaofIndustrial Chemistry, 2000)。己內(nèi)酰胺由環(huán)己酮經(jīng)它的廂重排和隨后的酸重排制備（Fuchs,Kieczka andMoran,Caprolactam,Ullmann,sEncyclopediaofIndustrialChemistry, 2000)〇
[0006] 在產(chǎn)業(yè)上，六亞甲基二胺（HMD)通過以下方法制備：將C6結(jié)構(gòu)單元氫氰化成己二 臆，然后氫化成HMD(HerzogandSmileyjHexamethylenediamine jUllmanr^sEncyclopedia ofIndustrialChemistry, 2012)〇
[0007] 鑒于對石油化學(xué)原料的依賴；生物技術(shù)提供可選擇的經(jīng)生物催化的途徑。生物催 化是使用生物催化劑如酶實施有機化合物的生物化學(xué)轉(zhuǎn)換。
[0008] 對于生物催化方法，生物衍生的原料和石油化學(xué)原料均為可行的起始原料。
[0009] 從而，在這樣的背景下，很明顯，需要用于制備己二酸、己內(nèi)酰胺、6_氨基己酸、六 亞甲基二胺和1，6-己二醇的可持續(xù)的方法（下文稱為"C6結(jié)構(gòu)單元")，其中所述方法是基 于生物催化劑的（Jangetal.，Biotechnology&Bioengineering，2012，109(10)，2437 - 24 59)。
[0010] 然而，沒有野生型原核生物或者真核生物天然地向細(xì)胞外環(huán)境過度生成或者 分泌C6結(jié)構(gòu)單元。不過，己二酸和己內(nèi)酰胺的代謝已有報道（Ramsayetal. ,Appl. Environ.Microbiol.,1986,52(1), 152 - 156 ； 和Kulkarni和Kanekar,Current Microbiology, 1998, 37, 191 - 194)。 toon] 該二羧酸，己二酸，被大量的細(xì)菌和酵母作為碳源經(jīng)β-氧化有效地轉(zhuǎn)化成 中心代謝產(chǎn)物。己二酸β-氧化成3-氧代己二酸促進(jìn)經(jīng)例如與芳族底物降解相關(guān) 的鄰位裂解途徑進(jìn)一步代謝。已經(jīng)充分表征了 3-氧代己二?；?CoA被數(shù)種細(xì)菌和 真菌代謝成乙醜基-CoA和玻拍醜基-CoA(Harwood和Parales,AnnualReviewof Microbiology, 1996, 50, 553 - 590)。己二酸和6-氨基己酸是己內(nèi)酰胺代謝中的中間體，最 后經(jīng)3-氧代己二?；?CoA降解成中心代謝產(chǎn)物。
[0012] 已經(jīng)提出了由生物質(zhì)-糖制備己二酸的潛在的代謝途徑：（1)以生物化學(xué)的方式 經(jīng)鄰位裂解芳烴降解途徑從葡萄糖轉(zhuǎn)化成順式，順式-粘康酸，然后化學(xué)催化成己二酸； (2)經(jīng)琥珀?；?CoA和乙?；?CoA的縮合的可逆的己二酸降解途徑和（3)組合β-氧化、 脂肪酸合成酶和ω-氧化。然而，沒有報道過使用這些策略的信息（Jangetal.，Biotech nology&Bioengineering, 2012, 109(10), 2437 - 2459)〇
[0013] 最優(yōu)性原理指出，微生物調(diào)節(jié)它們的生物化學(xué)網(wǎng)絡(luò)以支持最大生物質(zhì)生長。除了 在宿主生物體中表達(dá)異源性途徑的需要之外，將碳通量引導(dǎo)至用作碳源而非用作生物質(zhì)生 長組分的C6結(jié)構(gòu)單元與最優(yōu)性原理矛盾。例如，與天然制造者的生產(chǎn)性能相比，將1-丁 醇途徑從梭菌屬物種轉(zhuǎn)移至其它生產(chǎn)菌株中經(jīng)常下降一個數(shù)量級（Shenetal.，Appl. Environ.Microbiol. , 2011, 77(9), 2905 - 2915)〇
[0014] 在C6脂族主鏈上形成末端官能團(tuán)如羧基、胺或者羥基基團(tuán)之前，六碳的脂族主鏈 前體的有效合成是合成C6結(jié)構(gòu)單元中的重要考慮因素。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0015] 本申請至少部分地基于以下發(fā)現(xiàn)：可構(gòu)建用于制備六碳的鏈?zhǔn)街逯麈溓绑w的 生物化學(xué)途徑，在所述六碳的鏈?zhǔn)街逯麈溓绑w中可形成兩個官能團(tuán)如羧基、胺或者羥基， 導(dǎo)致合成以下物質(zhì)中的一個或者多個：己二酸、6-氨基己酸、六亞甲基二胺、己內(nèi)酰胺和 1，6-己二醇（下文稱為"C6結(jié)構(gòu)單元"）。本申請所述的這些途徑、代謝工程和培養(yǎng)策略依 賴于與聚羥基烷酸酯累積細(xì)菌如鉤蟲貪銅菌的碳儲存途徑相關(guān)的CoA依賴性延長酶或者 其類似物。
[0016] 面對最優(yōu)性原理，意料不到地發(fā)現(xiàn)，可將適當(dāng)?shù)姆翘烊煌緩?、原料、宿主微生物、?宿主的生物化學(xué)網(wǎng)絡(luò)的弱化策略和培養(yǎng)策略組合起來，從而有效率地制備C6結(jié)構(gòu)單元。
[0017] 在一些實施方案中，用于轉(zhuǎn)化成C6結(jié)構(gòu)單元的C6脂族主鏈可由乙?；?CoA經(jīng)兩 個CoA依賴性碳鏈延長循環(huán)使用NADH或者NADPH依賴性酶形成。參見圖1和圖2。
[0018] 在一些實施方案中，在產(chǎn)生C6脂族主鏈的CoA依賴性碳鏈延長途徑中的酶催化不 可逆酶促步驟。
[0019] 在一些實施方案中，所述末端羧基基團(tuán)可使用?；?CoA水解酶、醛脫氫酶、6-氧 代己酸脫氫酶或者細(xì)胞色素P450/ω-羥化酶酶促形成。參見圖3和圖4。
[0020] 在一些實施方案中，所述末端胺基團(tuán)可使用ω-轉(zhuǎn)氨酶或者二胺轉(zhuǎn)氨酶酶促形 成。參見圖5和圖6。
[0021] 在一些實施方案中，所述末端羥基基團(tuán)可使用細(xì)胞色素Ρ450、單氧化酶或者醇脫 氫酶酶促形成。參見圖7和圖8。
[0022] 在一個方面，本申請的特征在于生物合成一種或者多種產(chǎn)物的方法，所述產(chǎn)物選 自己二酸、6-氨基己酸、六亞甲基二胺、己內(nèi)酰胺和1，6-己二醇。所述方法包括酶促合成六 碳的鏈?zhǔn)街逯麈湥ɡ?，己?；?CoA)和在一個或者多個步驟中在主鏈中酶促形成兩個 選自羧基、胺和羥基基團(tuán)的末端官能團(tuán)，從而直接制備產(chǎn)物或者在隨后的步驟中制備產(chǎn)物。 所述兩個末端官能團(tuán)可相同或者可不同。
[0023] 己酰基-CoA可由乙?；?CoA經(jīng)兩個循環(huán)的CoA依賴性碳鏈延長使用NADH或者 NADPH依賴性酶酶促合成。己酰基-CoA可通過以下方法形成：通過歸類在EC1. 3. 1. 44、 EC1. 3. 1. 38或者EC1. 3. 1. 8下的烯酰基-CoA還原酶如ter或者tdter的基因產(chǎn)物轉(zhuǎn)化 己-2-烯?；?CoA。己-2-烯?；?CoA可通過以下方法形成：通過歸類在EC4. 2. 1. 17下 的反式-2-烯?；?CoA水合酶轉(zhuǎn)化（S) 3-羥基己酰基-CoA或者通過歸類在EC4. 2. 1. 119 下的反式-2-烯?；?CoA水合酶轉(zhuǎn)化（R) 3-羥基己?；?CoA。反式-2-烯?；?CoA水 合酶可為crt的基因產(chǎn)物。（S) 3-羥基己?；?CoA可通過以下方法形成：通過歸類在EC I.I. 1. 35下的3-羥基?；?CoA脫氫酶如由fadB編碼的3-羥基?；?CoA脫氫酶轉(zhuǎn)化 3-氧代己酰基-CoA。3-氧代己酰基-CoA可通過以下方法形成：通過歸類在EC2. 3. 1. 16 下的乙?；?CoAC-?；D(zhuǎn)移酶如由bktB編碼的乙酰基-CoAC-?；D(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)化丁酰 基-CoA。丁?；?CoA可通過以下方法形成：通過歸類在EC1.3. 1.44、EC1.3. 1.38或者EC 1. 3. 1. 8下的烯?；?CoA還原酶轉(zhuǎn)化巴豆?；?CoA。巴豆?；?CoA可通過以下方法形成： 通過歸類在EC4. 2. 1. 17下的反式-2-烯?；?CoA水合酶轉(zhuǎn)化（S) 3-羥基丁?；?CoA。 (S) 3-羥基丁?；?CoA可通過以下方法形成：通過歸類在ECI.I. 1. 157下的3-羥基丁酰 基-CoA脫氫酶如由hbd編碼的3-羥基丁?；?CoA脫氫酶轉(zhuǎn)化乙酰乙?；?CoA。乙酰乙 ?；?CoA可通過以下方法形成：通過歸類在EC2. 3. 1. 9下的乙?；?CoAC-?；D(zhuǎn)移酶 如由atoB或者phaA編碼的乙?；?CoAC-酰基轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)化乙?；?CoA。乙酰乙?；?CoA 可通過以下方法形成：通過歸類在EC2. 3. 1. 194下的乙酰乙?；?CoA合成酶轉(zhuǎn)化丙二酸 單酰基-CoA。丙二酸單?；?CoA可通過以下方法形成：通過歸類在EC6.4. 1.2下的乙酰 基-CoA羧化酶轉(zhuǎn)化乙?；?CoA。反式-2-烯酰基-CoA水合酶可為phaj的基因產(chǎn)物。
[0024] (R) 3-羥基己?；?CoA可通過以下方法形成：通過歸類在ECI.I.L100下的 3_氧代酰基-CoA還原酶如由fabG編碼的3-氧代?；?CoA還原酶轉(zhuǎn)化3-氧代己酰 基-CoA。巴豆?；?CoA可通過以下方法形成：通過歸類在EC4. 2. 1. 119下的反式-2-烯 ?；?CoA水合酶轉(zhuǎn)化（R) 3-羥基丁酰基-CoA。（R) 3-羥基丁酰基-CoA可通過以下方法形 成：通過歸類在ECI.I. 1. 36下的乙酰?；?CoA還原酶如由phaB編碼的乙酰?；?CoA還 原酶轉(zhuǎn)化乙酰乙?；?CoA。
[0025] 在本申請所述的任何方法中，所述方法可包括通過以下方法產(chǎn)生己酸 (hexanoate):使用酰基-CoA水解酶和醒脫氫酶或者硫酯酶在己?；鵆oA中形成第一末端 羧基基團(tuán)。?；?CoA水解酶或者硫酯酶可由YciA、tesB或者Acotl3編碼。
[0026] 己酸可通過以下方法產(chǎn)生：通過歸類在EC1.2. 1.4下的醛脫氫酶在己醛中形成 第一末端羧基基團(tuán)。己醛可通過以下方法形成：通過歸類在EC1. 2. 1. 57下的丁醛脫氫酶 轉(zhuǎn)化己?；?CoA。
[0027] 在本申請所述的任何方法中，所述方法可包括使用一種或者多種酶促轉(zhuǎn)化將己酸 轉(zhuǎn)化成己二酸、6-氨基己酸、六亞甲基二胺、ε己內(nèi)酰胺或者1，6己二醇，其中所述酶促轉(zhuǎn) 化中的一種引入第二末端官能團(tuán)。方法可包括使用細(xì)胞色素Ρ450/ω-羥化酶如來自家族 CYP153如CYP152A6的那些將己酸轉(zhuǎn)化成6-羥基己酸。使用⑴醇脫氫酶如由YMR318C編 碼的那些、（ii) 6-羥基己酸脫氫酶如由ChnD編碼的那些，或者（iii)細(xì)胞色素P450/ω-羥 化酶，可將6-羥基己酸轉(zhuǎn)化成己二酸半醛。
[0028] 在本申請所述的任何方法中，己二酸可通過以下方法產(chǎn)生：使用（i)歸類在EC 1.2. 1.3下的醛脫氫酶、（ii)歸類在EC1.2. 1.63下的6-氧代己酸脫氫酶如由ChnE編碼 的那些或者iii)細(xì)胞色素Ρ450/ω-羥化酶，在己二酸半醛中形成第二末端官能團(tuán)。
[0029] 在本申請所述的任何方法中，6-氨基己酸可通過以下方法產(chǎn)生：使用歸類在EC 2. 61. 18、EC2. 6. 1. 19或者EC2. 6. 1. 48下的ω-轉(zhuǎn)氨酶，在己二酸半醛中形成第二末端 官能團(tuán)。
[0030] 在本申請所述的任何方法中，己內(nèi)酰胺可由6-氨基己酸使用歸類在EC 3. 5. 2.-下的內(nèi)酰胺酶產(chǎn)生。與己內(nèi)酰胺有關(guān)的酰胺鍵是首先具有末端羧基基團(tuán)和末端胺 基團(tuán)然后形成鍵的結(jié)果。使用歸類在EC1.2. 99. 6下的羧酸還原酶如連同npt的基因產(chǎn)物 由car編碼的那些，t或者由GriC&GriD編碼的那些，可將6-氨基己酸轉(zhuǎn)化成6-氨基己醛。
[0031] 在本申請所述的任何方法中，六亞甲基二胺可通過以下方法產(chǎn)生：使用歸類在EC 2. 6. 1.29或者EC2. 6. 1.82下的二胺轉(zhuǎn)氨酶，在6-氨基己醛中形成第二末端官能團(tuán)。
[0032] 在本申請所述的任何方法中，1，6己二醇可通過以下方法產(chǎn)生：使用歸類在EC I.I. 1. -(1，2, 21，184)下的醇脫氫酶在6-羥基己醛中形成第二末端官能團(tuán)。
[0033] 在一些實施方案中，所述生物原料為以下物質(zhì)，包含以下物質(zhì)，或者衍生自以下物 質(zhì)：單糖、二糖、木質(zhì)纖維素、半纖維素、纖維素、木質(zhì)素如Y-戊酮酸和糠醛、木質(zhì)素、甘油 三酯如甘油和脂肪酸、農(nóng)業(yè)廢物或者城市廢物。
[0034] 在一些實施方案中，所述非生物原料為或者衍生自：天然氣、合成氣、C02/H2、甲醇、 乙醇、來自環(huán)己烷氧化過程的非揮發(fā)性殘留物（NVR)或者堿洗廢物流。
[0035] 在一些實施方案中，所述宿主微生物為原核生物。例如，所述原核生物可來自 埃希氏菌屬如大腸桿菌；來自梭狀芽胞桿菌屬如楊氏梭菌、自產(chǎn)乙醇梭菌（Clostridium autoethanogenum)或者克魯佛梭菌；來自棒狀桿菌屬如谷氨酸棒狀桿菌；來自貪銅菌屬如 鉤蟲貪銅菌或者耐金屬貪銅菌（Cupriavidusmetallidurans);來自假單胞菌屬如突光假 單胞菌、惡臭假單胞菌或者食油假單胞菌（Pseudomonasoleavorans);來自代爾夫特菌屬 如食酸代爾夫特菌；來自芽孢桿菌屬如枯草芽胞桿菌；來自乳桿菌屬如德氏乳桿菌；或者 來自乳球菌屬如乳酸乳球菌。這種原核生物也可為用于構(gòu)建本申請所述的能夠產(chǎn)生C6結(jié) 構(gòu)單元的重組宿主細(xì)胞的基因來源。
[0036] 在一些實施方案中，所述宿主微生物為真核生物（例如，真菌如酵母）。例如，真核 生物可來自真菌曲霉菌屬如黑曲霉菌；來自酵母菌屬如釀酒酵母菌；來自畢赤氏酵母屬如 巴斯德畢赤酵母（Pichiapastoris);來自耶羅維亞酵母屬如解脂耶羅維亞酵母（Yarrowia Iipolytica);來自伊薩酵母屬如東方伊薩酵母；來自德巴利酵母屬如漢遜德巴利酵母 (Debaryomyceshansenii);來自Arxula酵母屬如Arxulaadenoinivorans;或者來自克魯 維酵母菌屬如乳酸克魯維酵母菌（KluyveromycesIactis)。這種真核生物也可為用于構(gòu)建 本申請所述的能夠產(chǎn)生C6結(jié)構(gòu)單元的重組宿主細(xì)胞的基因來源。
[0037] 在一些實施方案中，所述宿主微生物對高濃度的一種或者多種C6結(jié)構(gòu)單元的耐 受性通過在選擇性環(huán)境中的連續(xù)培養(yǎng)而改善。
[0038] 在一些實施方案中，將所述宿主微生物的生物化學(xué)網(wǎng)絡(luò)弱化或者強化以（1)確保 乙?；?CoA的細(xì)胞內(nèi)可用度，（2)創(chuàng)造NADH或者NADPH不平衡，其僅可經(jīng)一種或者多種C6 結(jié)構(gòu)單元的形成來平衡，（3)防止降解導(dǎo)致和包含C6結(jié)構(gòu)單元的中心代謝產(chǎn)物、中心前體 和（4)確保來自細(xì)胞的有效外向通量。
[0039] 在一些實施方案中，非循環(huán)培養(yǎng)策略用于實現(xiàn)缺氧的、微需氧的或者需氧的培養(yǎng) 條件。
[0040] 在一些實施方案中，循環(huán)培養(yǎng)策略用于在缺氧的和需氧的培養(yǎng)條件之間交替。
[0041] 在一些實施方案中，所述培養(yǎng)策略包括限制養(yǎng)分，例如限制氮、磷酸鹽 (phosphate)或者氧。
[0042] 在一些實施方案中，一種或者多種C6結(jié)構(gòu)單元通過單一類型的微生物（例如，含 有一種或者多種外源性核酸的重組宿主），使用非循環(huán)或者循環(huán)發(fā)酵策略產(chǎn)生。
[0043] 在一些實施方案中，一種或者多種C6結(jié)構(gòu)單元通過以下方法產(chǎn)生：使用非循環(huán) 或者循環(huán)發(fā)酵策略，共同培養(yǎng)超過一種類型的微生物，例如，兩種或者更多種不同的重組宿 主，每一宿主含有一組特定的外源性核酸。
[0044] 在一些實施方案中，一種或者多種C6結(jié)構(gòu)單元通過以下方法產(chǎn)生：連續(xù)發(fā)酵，其 中將來自前發(fā)酵的肉湯或者離心濾液作為原料、中心代謝產(chǎn)物或者中心前體的來源供料至 相繼的發(fā)酵；最后產(chǎn)生C6結(jié)構(gòu)單元。
[0045] 本申請的特征還在于重組宿主，其包含至少一種外源性核酸，所述外源性核酸 編碼例如以下物質(zhì)中的一種或者多種：甲酸脫氫酶、烯?；?CoA還原酶、反式-2-烯酰 基-CoA水合酶、3-羥基丁酰基-CoA脫氫酶、乙?；?CoAC-?；D(zhuǎn)移酶、乙酰酰基-CoA還 原酶、乙?；?CoA合成酶、乙酰基-CoA羧化酶、蘋果酸酶、批陡（puridine)核苷酸轉(zhuǎn)氫酶、 甘油醛-3P-脫氫酶、酰基-CoA水解酶、醛脫氫酶、硫酯酶、細(xì)胞色素P450/ω-羥化酶、醇脫 氫酶、6-羥基己酸脫氫酶、6-氧代己酸脫氫酶、二胺轉(zhuǎn)氨酶、丙酰基-CoA合成酶和羧酸還 原酶，其中所述宿主包含以下的一種或者多種缺乏，例如，6-磷酸葡萄糖異構(gòu)酶、乙酸激酶、 將丙酮酸降解至乳酸的酶、介導(dǎo)磷酸烯醇丙酮酸降解至琥珀酸的酶、醇脫氫酶、丙酮酸脫羧 酶、2-酮酸脫羧酶、磷酸丙糖異構(gòu)酶、谷氨酸脫氫酶。
[0046] 除非另外定義，本申請使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語的定義與本發(fā)明所述領(lǐng)域的普 通技術(shù)人員所通常理解的含義相同。下面描述適合的方法和材料，不過與本申請所述的方 法和材料相似或者相同的方法和材料也可用于實踐本發(fā)明。將本申請?zhí)峒暗乃泄_、專 利申請、專利和其它參考文獻(xiàn)的全部內(nèi)容通過引用的方式并入本申請。在沖突的情況下，以 本發(fā)明說明書（包括定義）為準(zhǔn)。另外，材料、方法和實施例僅為說明性的并且不意圖限制 本發(fā)明。
[0047] 本發(fā)明的一個或者多個實施方案的細(xì)節(jié)在附圖和下面的描述中闡明。根據(jù)說明書 和附圖，并根據(jù)權(quán)利要求，本發(fā)明的其它特征、目的和優(yōu)點將顯而易見。根據(jù)專利法的標(biāo)準(zhǔn) 實踐，詞語"包含"在權(quán)利要求中可被"基本上由…組成"或者"由…組成"替代。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0048] 圖1是示例性生物化學(xué)途徑的示意圖，其使用NADH依賴性酶導(dǎo)致己?；?CoA并 以乙?；?CoA作為中心代謝產(chǎn)物。
[0049] 圖2是示例性生物化學(xué)途徑的示意圖，其使用NADPH依賴性酶導(dǎo)致己?；?CoA并 以乙?；?CoA作為中心代謝產(chǎn)物。
[0050] 圖3是示例性生物化學(xué)途徑的示意圖，其使用己?；?CoA作為中心代謝產(chǎn)物導(dǎo)致 己酸。
[0051] 圖4是示例性生物化學(xué)途徑的示意圖，其使用己酸作為中心前體導(dǎo)致己二酸。
[0052] 圖5是示例性生物化學(xué)途徑的示意圖，其使用己酸作為中心前體導(dǎo)致6-氨基己 酸。
[0053] 圖6是示例性生物化學(xué)途徑的示意圖，其使用6-氨基己酸作為中心前體導(dǎo)致六亞 甲基二胺。
[0054] 圖7是示例性生物化學(xué)途徑的示意圖，其使用己酸作為中心前體導(dǎo)致6-羥基己 酸。
[0055] 圖8是示例性生物化學(xué)途徑的示意圖，其使用6-羥基己酸作為中心前體導(dǎo)致 1，6_己二醇。

【具體實施方式】
[0056] 總的來說，本申請?zhí)峁┟?、非天然途徑、培養(yǎng)策略、原料、宿主微生物和對宿主的 生物化學(xué)網(wǎng)絡(luò)的弱化，其從中心代謝產(chǎn)物產(chǎn)生六碳的鏈?zhǔn)街逯麈?，在所述中心代謝產(chǎn)物 中可形成兩個末端官能團(tuán)，從而合成己二酸、己內(nèi)酰胺、6_氨基己酸、六亞甲基二胺或者 1，6-己二醇（本申請中稱為"C6結(jié)構(gòu)單元"）。本申請使用的術(shù)語〃中心前體〃用于表示 導(dǎo)致C6結(jié)構(gòu)單元的合成的途徑中的重要代謝產(chǎn)物。術(shù)語"中心代謝產(chǎn)物"在本申請中用 于表不在所有微生物中產(chǎn)生以支持生長的代謝產(chǎn)物。
[0057] 因此，本申請所述的宿主微生物可包括可操縱使得可產(chǎn)生一種或多種C6結(jié)構(gòu)單 元的內(nèi)源性途徑。在內(nèi)源性途徑中，宿主微生物天然地表達(dá)催化在該途徑內(nèi)的反應(yīng)的所有 酶。含有工程化途徑的宿主微生物不天然地表達(dá)催化在該途徑內(nèi)反應(yīng)的所有酶，但是已經(jīng) 被工程化以使得在宿主中表達(dá)在途徑內(nèi)的所有酶。在工程化途徑內(nèi)，酶可來自單一來源， 即，來自一個物種或者屬，或者可來自多個來源，即，不同物種或者屬。編碼本申請所述的 酶的核酸已經(jīng)從各種生物鑒別出并可在公開資料數(shù)據(jù)庫如GenBank或者EMBL中容易地得 至IJ。工程化宿主不可天然地表達(dá)本申請所述途徑的酶，或者可天然地表達(dá)本申請所述途徑 的酶中的一些（例如，一種或者多種，兩種或者更多種，三種或者更多種，四種或者更多種， 五種或者更多種，或者六種或者更多種）。也可將工程化宿主的內(nèi)源性基因破壞以防止形 成不希望的代謝物，或者防止在途徑中的中間體通過作用于這種中間體的其它酶導(dǎo)致的損 失?？蓪⒐こ袒拗鞣Q為重組宿主或者重組宿主細(xì)胞。因此，如本申請所述，重組宿主可 包含核酸，所述核酸編碼以下物質(zhì)中的一種或者多種：酮硫解酶、脫氫酶、還原酶、水合 酶、單氧化酶、ω-羥化酶或者轉(zhuǎn)氨酶，如下面更詳細(xì)地描述。
[0058] 另外，C6結(jié)構(gòu)單元的產(chǎn)生可在體外使用本申請所述的分離的酶，使用宿主微生物 的溶胞產(chǎn)物（例如，細(xì)胞溶解產(chǎn)物）作為酶源，或者使用來自不同宿主微生物的多種溶胞產(chǎn) 物作為酶源進(jìn)行。
[0059] 本申請所述的途徑的反應(yīng)可在一種或者多種宿主菌株中進(jìn)行，所述宿主菌株（a) 天然表達(dá)一種或者多種相關(guān)的酶，（b)被基因工程化以表達(dá)一種或者多種相關(guān)的酶，或者 (C)天然表達(dá)一種或者多種相關(guān)的酶并被基因工程化以表達(dá)一種或者多種相關(guān)的酶?？?選擇地，可將相關(guān)的酶從上述類型的宿主細(xì)胞中提取出來并以純化的或者半純化的形式使 用。而且，這種提取物包括可用作相關(guān)的酶的來源的溶胞產(chǎn)物（例如細(xì)胞裂解物）。在本申 請?zhí)峁┑姆椒ㄖ校胁襟E可在宿主細(xì)胞中進(jìn)行，所有步驟可使用提取的酶進(jìn)行，或者一些 步驟可在細(xì)胞中進(jìn)行并且其它步驟可使用提取的酶進(jìn)行。
[0060] 4. 1產(chǎn)生用于轉(zhuǎn)化成C6結(jié)構(gòu)單元的C6脂族主鏈的酶
[0061] 如圖1和圖2中所示，用于轉(zhuǎn)化成C6結(jié)構(gòu)單元的C6脂族主鏈可由乙?；?CoA經(jīng) 兩個循環(huán)的CoA依賴性碳鏈延長使用NADH或者NADPH依賴性酶形成。在一些實施方案中， CoA依賴性碳鏈延長循環(huán)包含乙?；?CoAC-?；D(zhuǎn)移酶（其將乙?；?CoA轉(zhuǎn)化成乙酰 乙醜基_CoA和將丁醜基-CoA轉(zhuǎn)化成3-氧代己醜基-CoA)，或者乙醜基-CoA羧化酶（其 將乙?；?CoA轉(zhuǎn)化成丙二酸單?；?CoA)，以及乙酰乙?；?CoA合成酶（其將丙二酸單 ?；?CoA轉(zhuǎn)化成乙酰乙?；?CoA)，3-羥基丁?；?CoA脫氫酶（其將乙酰乙?；?CoA轉(zhuǎn) 化成3-羥基丁?；鵆oA)或者3-氧代?；?CoA還原酶/3-羥基?；?CoA脫氫酶（其將 3-氧代己?；?CoA轉(zhuǎn)化成3-羥基己酰基-CoA)，烯?；?CoA水合酶（其將3-羥基丁酰 基-CoA轉(zhuǎn)化成巴?醜基-CoA和將3_輕基己醜基-CoA轉(zhuǎn)化成己_2_稀醜基-CoA)和反 式-2_稀醜基-CoA還原酶（其將巴?醜基-CoA轉(zhuǎn)化成丁醜基-CoA和將己_2_稀醜基-CoA 轉(zhuǎn)化成己酰基-CoA)。
[0062] 在一些實施方案中，乙?；?CoAC-?；D(zhuǎn)移酶可歸類在EC2. 3. 1.9下，例如 atoB或者phaA的基因產(chǎn)物，或者歸類在EC2. 3. 1. 16下，例如bktB的基因產(chǎn)物。
[0063] 由atoB或者phaA編碼的β-酮硫解酶接受乙?；?CoA作為底物，從而形成 丁醜基_CoA(Haywoodetal·，F(xiàn)EMSMicrobiologyLetters，1988,52,91_96;Slateret al.，JournalofBacteriology, 1998, 180(8)，1979-1987)。
[0064] 來自鉤蟲貪銅菌的由bktB編碼的β-酮硫解酶接受乙?；?CoA和丁?；?CoA 作為底物，從而形成CoA活化的C6脂族主鏈（Haywoodetal.，F(xiàn)EMSMicrobiology Letters, 1988, 52, 91-96；Slateretal. ,JournalofBacteriology, 1998, 180(8), 1979-1987)。
[0065] 在一些實施方案中，乙?；?CoA羧化酶可歸類在EC6. 4.I. 2下。
[0066] 已經(jīng)顯示，通過乙?；?CoA羧化酶將乙?；?CoA轉(zhuǎn)化成丙二酸單酰基-CoA提高 脂肪酸合成速率（Davisetal·，TheJournalofBiologicalChemistry, 2000, 275 (37)， 28593 - 28598)。
[0067] 在一些實施方案中，乙酰乙?；?CoA合成酶可歸類在EC2. 3.I. 194下。
[0068] 已經(jīng)證實，乙酰乙?；?CoA合成酶在與多羥基丁酸合成相關(guān)的碳鏈延長中 可用作phaA的基因產(chǎn)物的不可逆替代物（irreversiblesubstitute)(Matsumotoet al.，Biosci.Biotechnol.Biochem.，2011，75 (2)，364 - 366)。
[0069] 在一些實施方案中，3_輕基?；?CoA脫氫酶可歸類在ECI.I. 1. 35下，例如 fadB的基因產(chǎn)物，或者3-羥基丁?；?CoA脫氫酶可歸類在ECI.I. 1. 157下，例如hbd的 基因產(chǎn)物，或者乙酰乙?；?CoA還原酶可歸類在ECI.I. 1. 36下，例如phaB的基因產(chǎn)物 (Liu&Chen,Appl.Microbiol.Biotechnol. , 2007, 76(5), 1153 - 1159；Shenetal. ,Appl. Environ.Microbiol. , 2011, 77(9), 2905 - 2915；Buddeetal. ,JournalofBacteriology ,2010,192(20), 5319 - 5328) 〇
[0070] 在一些實施方案中，3-氧代?；?CoA還原酶可歸類在ECI.I.I. 100下，例如 fabG的基因產(chǎn)物（Buddeetal·，JournalofBacteriology, 2010, 192 (20) ,5319 - 5328; Nomuraetal. ,Appl.Environ.Microbiol. , 2005, 71(8), 4297 - 4306) 〇
[0071] 在一些實施方案中，烯?；?CoA水合酶可歸類在EC4. 2.I. 17下，例如crt的基 因產(chǎn)物，或者歸類在EC4·2·l·119下，例如phaJ的基因產(chǎn)物（Shenetal·，Appl·Environ· Microbiol. , 2011, 77(9), 2905 - 2915；Fukuietal. ,JournalofBacteriology, 1998, 18 0(3), 667 - 673).
[0072] 在一些實施方案中，反式-2-烯?；?CoA還原酶可歸類在EC1.3.I. 38、EC I. 3. 1. 8 或者ECI. 3. 1. 44 下，例如ter或者tdter的基因產(chǎn)物（附811；[1]^1^6七31.，]\ Biochem. , 1984, 95, 1315 - 1321；Shenetal.,Appl.Environ.Microbiol. , 2011, 77(9), 29 05 - 2915) ;Bond_Wattsetal·,Biochemistry, 2012, 51，6827-6837)。
[0073] 4. 2在C6結(jié)構(gòu)單元的生物合成中產(chǎn)生末端羧基基團(tuán)的酶
[0074] 如圖3和圖4中所示，末端羧基基團(tuán)可使用酰基-CoA水解酶、醛脫氫酶、6-氧代己 酸脫氫酶或者細(xì)胞色素P450/ω-羥化酶酶促形成。
[0075] 在一些實施方案中，導(dǎo)致C6結(jié)構(gòu)單元的合成的第一末端羧基基團(tuán)通過歸類在EC 3. 1. 2.-下的?；?CoA水解酶或者硫酯酶在己酰基-CoA中酶促形成，從而導(dǎo)致己酸的 生成。?；?CoA水解酶或者硫酯酶可為YciA、tesB或者Acotl3的基因產(chǎn)物（Cantuet al.,ProteinScience, 2010, 19, 1281 - 1295；Zhuangetal.,Biochemistry, 2008, 47(9), 2789 - 2796；Naggertetal. ,JournalofBiologicalChemistry, 1991, 266 (17), 11044 -11050)。
[0076] 在一些實施方案中，導(dǎo)致C6結(jié)構(gòu)單元的合成的第一末端羧基基團(tuán)通過歸類在EC I. 2. 1. 4下的醒脫氫酶在己醒中酶促形成（Ho&Weiner,JournalofBacteriology, 2005, 18 7 (3)，1067 - 1073)，從而導(dǎo)致己酸的生成。
[0077] 在一些實施方案中，導(dǎo)致己二酸的合成的第二末端羧基基團(tuán)通過歸類在EC I. 2. 1.3下的醒脫氫酶在己二酸半醒中酶促形成（Guerrillot&Vandecasteele,Eur. J. Biochem.，1977, 81，185 - 192)。
[0078] 在一些實施方案中，導(dǎo)致己二酸的合成的第二末端羧基基團(tuán)通過歸類在EC 1. 2. 1. 63下的6-氧代己酸脫氫酶如ChnE的基因產(chǎn)物在己二酸半醒中酶促形成（Iwakiet al.，Appl.Environ.Microbiol.，1999, 65(11)，5158-5162)〇
[0079] 在一些實施方案中，導(dǎo)致己二酸的合成的第二末端羧基基團(tuán)通過 細(xì)胞色素P450在己二酸半醒中酶促形成（Sandersetal.，Journalof LipidResearch, 2005,46 (5), 1001-1008；SandersetaI. ,TheFASEB Journal, 2008, 22(6), 2064 - 2071)〇
[0080] 在將羧基基團(tuán)引入烷烴中ω-氧化的利用已經(jīng)在酵母熱帶念珠菌中證實，從而導(dǎo) 致己二酸的合成（Okuharaetal.，Agr.Boil.Chem.，1971，35 (9)，1376 - 1380)。
[0081] 4. 3在C6結(jié)構(gòu)單元的生物合成中產(chǎn)生末端胺基團(tuán)的酶
[0082] 如圖5和圖6中所示，末端胺基團(tuán)可使用ω-轉(zhuǎn)氨酶或者二胺轉(zhuǎn)氨酶酶促形成。
[0083] 在一些實施方案中，通過歸類在EC2. 6. 1. 18下的ω-轉(zhuǎn)氨酶如得自河流弧菌或 者青紫色素桿菌的那些，或者歸類在EC2.6. 1.19下的ω-轉(zhuǎn)氨酶如得自灰色鏈霉菌的那 些，或者歸類在2. 6.I. 48下的ω-轉(zhuǎn)氨酶如得自Clostridiumviride的那些，導(dǎo)致6-氨 基己酸的合成的第一末端胺基團(tuán)在己二酸半醛中酶促形成。
[0084]來自青紫色素桿菌的可逆ω-轉(zhuǎn)氨酶具有已證實的接受6-氨基己酸作為氨基 供體的活性，由此在己二酸半醒中形成第一末端胺基團(tuán)（Kaulmannetal.，Enzymeand MicrobialTechnology, 2007, 41，628 - 637)。
[0085] 來自灰色鏈霉菌的可逆4-氨基丁酸：2-氧代戊二酸轉(zhuǎn)氨酶具有已證實的將6-氨 基己酸轉(zhuǎn)化成己二酸半醒的活性（Yonahaetal.，Eur.J.Biochem.，1985, 146, 101-106)。
[0086] 來自Clostridiumviride的可逆5-氨基戊酸轉(zhuǎn)氨酶具有已證實的將6-氨基己 酸轉(zhuǎn)化成己二酸半醒的活性（Barkeretal·，TheJournalofBiologicalChemistry, 19 87, 262(19)，8994 - 9003)。
[0087] 在一些實施方案中，導(dǎo)致六亞甲基二胺的合成的第二末端胺基團(tuán)通過歸類在EC 2. 6. 1. 29下的二胺轉(zhuǎn)氨酶或者歸類在EC2. 6. 1. 82下的二胺轉(zhuǎn)氨酶如YgjG的基因產(chǎn)物在 6_氨基己醛中酶促形成。
[0088] ygjG的基因產(chǎn)物接受寬范圍的二胺碳鏈長度底物，例如腐胺、尸胺和精脒 (Samsonova et al.，BMC Microbiology, 2003,3:2)。
[0089] 來自大腸桿菌菌株B的二胺轉(zhuǎn)氨酶具有已證實的針對1，5二氨基戊烷和 1，7二氨基庚烷的活性，1，6二氨基己烷（HMD)預(yù)期是活性的（Kim，TheJournalOf Chemistry, 1963, 239(3)，783 - 786)。
[0090] 4. 4在C6結(jié)構(gòu)單元的生物合成中產(chǎn)生末端羥基基團(tuán)的酶
[0091] 如圖7和圖8中所示，末端羥基基團(tuán)可使用細(xì)胞色素P450、單氧化酶或者醇脫氫酶 酶促形成。
[0092] 在一些實施方案中，導(dǎo)致C6結(jié)構(gòu)單元的合成的第一末端羥基基團(tuán)通過單氧化酶、 細(xì)胞色素P450或者ω-羥化酶如來自CYP153家族如CYP153A6的那些在己酸中酶促形成 (VanBeilen&Funhoff,CurrentOpinioninBiotechnology, 2005, 16, 308 - 314；Kochet al.,Appl.Environ.Microbiol.,2009, 75(2),337-344;Nieder和Shapiro,JournalofBa cteriology, 1975, 122(I)，93-98)。
[0093] 末端ω-輕化酶的底物特異性已經(jīng)成功地加寬（1(〇(3116七31.，4口口1』11￥；[1'011· Microbiol.，2009, 75 (2)，337-344)。不過，
[0094] 在一些實施方案中，導(dǎo)致1，6己二醇的合成的第二末端羥基基團(tuán)通過歸類在EC I.I. 1.-(例如，1，2, 21，或者184)下的醇脫氫酶在6-羥基己醛中酶促形成。盡管在體外觀 察到CYP153A6的非末端羥基化，在體內(nèi)僅1-羥基化發(fā)生（Funhoffetal.，JournalofB acteriology, 2006, 188(14), 5220 - 5227)〇
[0095] 4. 5生物化學(xué)途徑
[0096] 4. 5. 1得到己?；?CoA的途徑，所述己?；?CoA為導(dǎo)致C6結(jié)構(gòu)單元的中心前體 的前體
[0097] 在一些實施方案中，己酰基-CoA由中心代謝產(chǎn)物乙?；?CoA通過以下方法合成： 通過乙酰乙?；?CoA硫解酶（EC2. 3. 1. 9)如atoB或者phaA的基因產(chǎn)物，或者通過乙酰 基-CoA羧化酶（EC6. 4. 1. 2)和乙酰乙?；?CoA合成酶（EC2. 3. 1. 194)經(jīng)丙二酸單酰 基-CoA將乙酰基-CoA轉(zhuǎn)化成乙酰乙?；?CoA;然后通過3-羥基丁酰基-CoA脫氫酶（EC I.I.I. 157)如hbd的基因產(chǎn)物將乙酰乙?；?CoA轉(zhuǎn)化成⑶3-羥基丁酰基-CoA;然后通 過烯?；?CoA水合酶（EC4. 2. 1. 17)如crt的基因產(chǎn)物將（S) 3-羥基丁酰基-CoA轉(zhuǎn)化成 巴豆?；?CoA;然后通過反式-2-烯?；?CoA還原酶（EC1. 3. 1. 44)如ter的基因產(chǎn)物將 巴豆酰基-CoA轉(zhuǎn)化成丁?；?CoA;然后通過乙?；?CoAC-酰基轉(zhuǎn)移酶（EC2. 3. 1. 16)如 bktB的基因產(chǎn)物將丁?；?CoA轉(zhuǎn)化成3-氧代-己?；?CoA;然后通過3-輕基酰基-CoA 脫氫酶（ECI.I. 1. 35)如fabB的基因產(chǎn)物將3-氧代-己?；?CoA轉(zhuǎn)化成（S) 3-羥基己酰 基-CoA;然后通過烯?；?CoA水合酶（EC4. 2. 1. 17)如crt的基因產(chǎn)物將（S) 3-羥基己酰 基-CoA轉(zhuǎn)化成己_2_稀醜基-CoA;然后通過反式_2_稀醜基-CoA還原酶（EC1. 3. 1. 44) 如ter或者tdter的基因產(chǎn)物將己-2-烯酰基-CoA轉(zhuǎn)化成己?；?CoA。參見圖1。
[0098] 在一些實施方案中，己?；?CoA由中心代謝產(chǎn)物乙酰基-CoA通過以下方法合成： 通過乙酰乙?；?CoA硫解酶（EC2. 3. 1. 9)如atoB或者phaA的基因產(chǎn)物，或者通過乙酰 基-CoA羧化酶（EC6. 4. 1. 2)和乙酰乙酰基-CoA合成酶（EC2. 3. 1. 194)經(jīng)丙二酸單酰 基-CoA將乙醜基-CoA轉(zhuǎn)化成乙醜乙醜基-CoA;然后通過3_乙醜乙醜基-CoA還原酶（EC I.I. 1. 36)如phaB的基因產(chǎn)物將乙酰乙?；?CoA轉(zhuǎn)化成（R) 3-羥基丁酰基-CoA;然后通 過烯?；?CoA水合酶（EC4. 2. 1. 119)如phaj的基因產(chǎn)物將（R) 3-羥基丁?；?CoA轉(zhuǎn)化 成巴豆?；?CoA;然后通過反式-2-烯?；?CoA還原酶（EC1. 3. 1. 38)將巴豆?；?CoA 轉(zhuǎn)化成丁?；?CoA;然后通過乙?；?CoAC-?；D(zhuǎn)移酶（EC2. 3. 1. 16)如bktB的基因 產(chǎn)物將丁?；?CoA轉(zhuǎn)化成3-氧代-己?；?CoA;然后通過3-氧代?；?CoA還原酶（EC I.I. 1. 100)如fabG的基因產(chǎn)物將3-氧代-己酰基-CoA轉(zhuǎn)化成（R) 3-羥基己?；?CoA; 然后通過烯?；?CoA水合酶（EC4.2. 1. 119)如phaj的基因產(chǎn)物將（R)3-羥基己酰 基-CoA轉(zhuǎn)化成己_2_稀醜基-CoA;然后通過反式_2_稀醜基-CoA還原酶（EC1. 3. 1. 38) 將己_2_稀醜基-CoA轉(zhuǎn)化成己醜基-CoA。參見圖2。
[0099] 4. 5. 2使用己?；?CoA作為導(dǎo)致中心前體己酸的前體的途徑
[0100] 在一些實施方案中，己酸由中心代謝產(chǎn)物己?；?CoA通過以下方法合成：通過酰 基-CoA水解酶或者硫酯酶（EC3. 1. 2.-)如YciA、tesB或者Acotl3的基因產(chǎn)物將己酰 基-CoA轉(zhuǎn)化成己酸。
[0101] 在一些實施方案中，己酸由中心代謝產(chǎn)物己?；?CoA通過以下方法合成：通過丁 醛脫氫酶（EC1. 2. 1. 57)將己?；?CoA轉(zhuǎn)化成己醛；然后通過醛脫氫酶（EC1. 2. 1. 4)將 己醛轉(zhuǎn)化成己酸。參見圖3。
[0102] 對于NADH和NADPH作為輔因子，己酰基-CoA轉(zhuǎn)化成己醒已經(jīng)被證實（Palosaari 和Rogers,JournalofBacteriology, 1988, 170 (7)，2971 - 2976)。
[0103] 4. 5. 3.使用己酸作為己二酸的中心前體的途徑
[0104] 在一些實施方案中，己二酸由中心前體己酸通過以下方法合成：通過單氧化酶或 者細(xì)胞色素P450如來自CYP153家族如CYP153A6的那些將己酸轉(zhuǎn)化成6-羥基己酸；然后 通過醇脫氫酶（ECI.I. 1. 2)如YMR318C的基因產(chǎn)物將6-羥基己酸轉(zhuǎn)化成己二酸半醛；然 后通過6-氧代己酸脫氫酶（EC1. 2. 1. 63)將己二酸半醛轉(zhuǎn)化成己二酸。參見圖4。
[0105] 由YMR318C編碼的醇脫氫酶具有寬的底物特異性，包括C6醇的氧化。
[0106] 在一些實施方案中，己二酸由中心前體己酸通過以下方法合成：通過單氧化酶或 者細(xì)胞色素P450如來自CYP153家族如CYP153A6的那些將己酸轉(zhuǎn)化成6-羥基己酸；然后 通過6-輕基己酸脫氫酶（ECI.I.I. 258)如ChnD的基因產(chǎn)物將6-輕基己酸轉(zhuǎn)化成己二酸 半醒（Iwakietal·，Appl.Environ.Microbiol. ,1999, 65 (11) ,5158-5162);然后通過醒脫 氫酶（EC1. 2. 1. 3)將己二酸半醛轉(zhuǎn)化成己二酸。參見圖4。
[0107]在一些實施方案中，己二酸由中心前體己酸通過以下方法合成：通過單氧 化酶或者細(xì)胞色素P450如來自CYP153家族如CYP153A6的那些將己酸轉(zhuǎn)化成6-羥 基己酸；然后通過細(xì)胞色素P450將6-輕基己酸轉(zhuǎn)化成己二酸半醒（Sanderset al. ,JournalofLipidResearch, 2005, 46(5), 1001-1008；Sandersetal. ,TheFASEB Journal, 2008, 22 (6)，2064 - 2071);然后通過細(xì)胞色素P450將己二酸半醛轉(zhuǎn)化成己二酸。 參見圖4。
[0108] 4. 5. 4使用己酸作為6_氨基己酸（6-aminohexanoate)和e-己內(nèi)酰胺的中心前 體的途徑
[0109] 在一些實施方案中，6-氨基己酸由中心前體己酸通過以下方法合成：通過單氧化 酶或者細(xì)胞色素P450如來自CYP153家族如CYP153A6的那些將己酸轉(zhuǎn)化成6-羥基己酸； 然后通過醇脫氫酶（ECI.I. 1. 2)或者6-羥基己酸脫氫酶（ECI.I. 1. 258)將6-羥基己酸 轉(zhuǎn)化成己二酸半醛；然后通過ω-轉(zhuǎn)氨酶（EC2. 6.I. 18、EC2. 6.I. 19、EC2. 6. 1. 48)將己 二酸半醛轉(zhuǎn)化成6-氨基己酸。參見圖5。
[0110] 在一些實施方案中，e-己內(nèi)酰胺由中心前體己酸通過以下方法合成：通過單氧 化酶或者細(xì)胞色素P450如來自CYP153家族如CYP153A6的那些將己酸轉(zhuǎn)化成6-羥基己酸； 然后通過醇脫氫酶（ECI.I. 1. 2)或者6-羥基己酸脫氫酶（ECI.I. 1. 258)將6-羥基己酸 轉(zhuǎn)化成己二酸半醛；然后通過ω-轉(zhuǎn)氨酶（EC2. 6. 1. 18、EC2. 6. 1. 19、EC2. 6. 1. 48)將己 二酸半醛轉(zhuǎn)化成6-氨基己酸；然后通過水解酶（EC3. 5. 2.-)將6-氨基己酸轉(zhuǎn)化成e-己 內(nèi)酰胺。參見圖5。
[0111] 4. 5. 5使用6-氨基己酸作為六亞甲基二胺的中心前體的途徑
[0112] 在一些實施方案中，六亞甲基二胺由中心前體6-氨基己酸通過以下方法 合成：通過羧酸還原酶（EC1.2. 99. 6)，如car的基因產(chǎn)物連同npt的基因產(chǎn)物，或 者GriC&GriD的基因產(chǎn)物，將6-氨基己酸轉(zhuǎn)化成6-氨基己醛（Suzukietal.，J. Antibiot.，2007, 60 (6)，380 - 387);然后通過二胺轉(zhuǎn)氨酶（EC2. 6.L29,EC2. 6.L82)將 6_氨基己醛轉(zhuǎn)化成六亞甲基二胺。參見圖6。
[0113] 由car和增強子npt的基因產(chǎn)物編碼的羧酸還原酶具有寬的底物特異性，包 括末端二官會泛C4 和C5 竣酸(Venkitasubramanianetal. ,EnzymeandMicrobial Technology,2008, 42, 130 - 137)。
[0114] 4. 5. 6使用己酸作為1，6-己二醇的中心前體的途徑
[0115] 在一些實施方案中，6-羥基己酸由中心前體己酸通過以下方法合成：通過單氧化 酶或者細(xì)胞色素P450如來自CYP153家族如CYP153A6的那些將己酸轉(zhuǎn)化成6-羥基己酸。 參見圖7。
[0116] 在一些實施方案中，1，6己二醇由中心前體6-羥基己酸通過以下方法合成：通過 羧酸還原酶（EC1. 2. 99. 6)如car的基因產(chǎn)物連同npt的基因產(chǎn)物將6-羥基己酸轉(zhuǎn)化成 6-羥基己醛；然后通過醇脫氫酶（例如，ECLLLUECI.I.L2、ECI.I.L21或者EC I.LL184)將 6-羥基己醛轉(zhuǎn)化成 1，6 己二醇（Liuetal.，Microbiology, 2009, 155, 2078 -2085)〇
[0117] 4.6培養(yǎng)策略
[0118] 在一些實施方案中，一種或者多種C6結(jié)構(gòu)單元在重組宿主中使用缺氧的、需氧的 或者微需氧的培養(yǎng)條件生物合成。非循環(huán)或者循環(huán)培養(yǎng)策略可用于實現(xiàn)希望的培養(yǎng)條件。 例如，非循環(huán)策略可用于實現(xiàn)缺氧的、需氧的或者微需氧的培養(yǎng)條件。
[0119] 在一些實施方案中，循環(huán)培養(yǎng)策略可用于在缺氧的培養(yǎng)條件和需氧的培養(yǎng)條件之 間交替。
[0120] 在一些實施方案中，所述培養(yǎng)策略經(jīng)氮、磷酸鹽或者氧限制進(jìn)行養(yǎng)分限制。
[0121] 在一些實施方案中，一種或者多種C6結(jié)構(gòu)單元通過單一微生物經(jīng)非循環(huán)或者循 環(huán)發(fā)酵策略產(chǎn)生。
[0122] 在一些實施方案中，一種或者多種C6結(jié)構(gòu)單元通過以下方法產(chǎn)生：經(jīng)非循環(huán)或者 循環(huán)發(fā)酵策略共同培養(yǎng)超過一種微生物。
[0123] 在一些實施方案中，一種或者多種C6結(jié)構(gòu)單元通過以下方法產(chǎn)生：連續(xù)發(fā)酵，其 中將來自前發(fā)酵的肉湯或者離心濾液作為原料供料至相繼的發(fā)酵；最后產(chǎn)生C6結(jié)構(gòu)單元。
[0124] 在一些實施方案中，使用例如陶瓷中空纖維膜的細(xì)胞保留策略用于在分批補料或 者連續(xù)補料發(fā)酵期間實現(xiàn)和維持高細(xì)胞密度。
[0125] 在一些實施方案中，在C6結(jié)構(gòu)單元的合成中供料至發(fā)酵的主要碳源衍生自生物 或者非生物原料。
[0126] 在一些實施方案中，所述生物原料是，包含，或者衍生自以下物質(zhì)：單糖、二糖、木 質(zhì)纖維素、半纖維素、纖維素、木質(zhì)素如Y-戊酮酸和糠醛、木質(zhì)素、甘油三酯如甘油和脂肪 酸、農(nóng)業(yè)廢物或者城市廢物。
[0127] 來自生化柴油生產(chǎn)的粗甘油的有效分解代謝已經(jīng)在數(shù)種微生物如大腸桿菌、 鉤蟲貪銅菌、假單胞菌屬、惡臭假單胞菌和解脂耶羅維亞酵母（YarrowiaIipolytica) 中被證實（Leeetal·，Appl.Biochem.Biotechnol. ,2012, 166, 1801 - 1813;Yanget al. ,BiotechnologyforBiofuels，2012,5:13;MeijnenetaI. ,Appl.Microbiol. Biotechnol.，2011，90, 885-893)。
[0128] 木質(zhì)纖維素衍生的Y-戊酮酸的有效分解代謝已經(jīng)在經(jīng)前體丙?；?CoA合 成3-羥基戊酸中在數(shù)種有機體如鉤蟲貪銅菌和惡臭假單胞菌中被證實（Jaremko和 Yu,JournalofBiotechnology, 2011，155, 2011，293 - 298 ;Martin和Prather,Journalof Biotechnology,2009,139, 61 - 67)〇
[0129] 木質(zhì)素衍生的芳族化合物如苯甲酸類似物（benzoateanalogues)的有效分解 代謝已經(jīng)在數(shù)種微生物如惡臭假單胞菌、鉤蟲貪銅菌中被證實（Buggetal.,Current OpinioninBiotechnology, 2011, 22, 394 - 400 ；Perez-Pantojaetal. ,FEMSMicrobiol. Rev.，2008, 32, 736 - 794)。
[0130] 農(nóng)業(yè)廢物如橄欖油廠廢水的有效利用已經(jīng)在數(shù)種微生物（包 括YarrowiaIipolytica)中被證 實(Papanikolaouetal.,Bioresour. Technol.，2008, 99(7)，2419-2428)。
[0131] 對于數(shù)種微生物如大腸桿菌、谷氨酸棒狀桿菌和德氏乳桿菌和乳酸乳 球菌，衍生自纖維素、半纖維素、蔗糖蜜和甜菜糖蜜、木薯、玉米和其它農(nóng)業(yè)來 源的可發(fā)酵糖如單糖和二糖的有效利用已經(jīng)被證實（參見，例如，Hermannet al,JournalofBiotechnology, 2003, 104, 155 - 172；Weeetal. ,FoodTechnol. Biotechnol.，2006,44(2)，163 - 172 ;0hashietal. ,JournalofBioscienceandBioen gineering，1999, 87 (5)，647-654)。
[0132] 對于鉤蟲貪銅菌，衍生自多種農(nóng)業(yè)木質(zhì)纖維來源的糠醛的有效利用已經(jīng)被證實 (Li et al·，Biodegradation，2011，22, 1215 - 1225)。
[0133] 在一些實施方案中，所述非生物原料是或者衍生自天然氣、合成氣、C02/H2、甲醇、 乙醇、來自環(huán)己烷氧化過程的非揮發(fā)性殘留物（NVR)或者堿洗廢物流。
[0134]對于巴斯德畢赤酵母（Pichiapastoris)，甲醇的有效分解代謝已經(jīng)被證實。
[0135] 對于克氏梭狀芽胞桿菌，乙醇的有效分解代謝已經(jīng)被證實（Seedorfet al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2008, 105 (6) 2128-2133)。
[0136] 對于鉤蟲貪銅菌，0)2和氏（其可衍生自天然氣和其它化學(xué)和石油化學(xué)來 源）的有效分解代謝已經(jīng)被證實（Prybylskietal·，Energy，Sustainabilityand Society，2012, 2:11)。
[0137]對于大量微生物如ClostridiumIjungdahlii和Clostridiumautoethanogenum， 合成氣的有效分解代謝已經(jīng)被證實（K6pkeetal.,AppliedandEnvironmentalMicro biology，2011，77(15)，5467 - 5475) ?
[0138] 對于大量微生物如食酸代爾夫特菌和鉤蟲貪銅菌，來自環(huán)己烷工藝的非揮發(fā)性殘 留物廢物流的有效分解代謝已經(jīng)被證實（Ramsayetal·，AppliedandEnvironmentalMi crobiology，1986, 52(1)，152 - 156)。
[0139] 在一些實施方案中，所述宿主為原核生物。例如，所述原核生物可來自埃希氏菌屬 如大腸桿菌；來自梭狀芽胞桿菌屬如楊氏梭菌、自產(chǎn)乙醇梭菌或者克魯佛梭菌；來自棒狀 桿菌屬如谷氨酸棒狀桿菌；來自貪銅菌屬如鉤蟲貪銅菌或者耐金屬貪銅菌；來自假單胞菌 屬如熒光假單胞菌、惡臭假單胞菌或者食油假單胞菌；來自代爾夫特菌屬如食酸代爾夫特 菌；來自芽孢桿菌屬如枯草芽胞桿菌；來自乳桿菌屬如德氏乳桿菌；或者來自乳球菌屬如 乳酸乳球菌。這種原核生物也可為構(gòu)建本申請所述的能夠產(chǎn)生C6結(jié)構(gòu)單元的重組宿主細(xì) 胞的基因來源。
[0140] 在一些實施方案中，所述宿主為真核生物。例如，所述真核生物可來自曲霉菌屬如 黑曲霉菌；來自酵母菌屬如釀酒酵母菌；來自畢赤氏酵母屬如巴斯德畢赤酵母；或者來自 耶羅維亞酵母屬如解脂耶羅維亞酵母；來自伊薩酵母屬如東方伊薩酵母；來自德巴利酵母 屬如漢遜德巴利酵母；來自Arxula屬如Arxulaadenoinivorans;或者來自克魯維酵母菌 屬如乳酸克魯維酵母菌。這種真核生物也可為構(gòu)建本申請所述的能夠產(chǎn)生C6結(jié)構(gòu)單元的 重組宿主細(xì)胞的基因來源。
[0141] 4. 7代謝工程
[0142] 本文件提供方法，所述方法包括對所有上面途徑所述的少于所有步驟。這種方法 可包括，例如，這些步驟中的一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或者 更多。在這種方法包含少于所有步驟的情況下，第一步驟可為所列步驟中的任何步驟。
[0143] 而且，本申請所述的重組宿主可包括上面的酶中的任何組合，使得所述步驟中的 一個或者多個，例如，這些步驟中的一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十 個或者更多可在重組宿主內(nèi)實施。本申請?zhí)峁┧谐龅暮突蚬こ袒员磉_(dá)本申請列舉的 任何酶的一個或者多個（例如，兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、10個、11個、 12個或者更多）重組形式的任何屬和種的宿主細(xì)胞。因此，例如，宿主細(xì)胞可含有外源性核 酸，所述外源性核酸編碼催化本申請所述途徑的任何一個或者多個步驟的酶。
[0144] 另外，本申請認(rèn)識到，在酶已經(jīng)被描述為接受CoA活化的底物的情況下，存在與 [acp]結(jié)合底物相關(guān)的相似的酶活性，其不一定為相同的酶種類。
[0145] 此外，本申請認(rèn)識到，在酶已經(jīng)被描述為接受底物的（R)-對映異構(gòu)體的情況下， 存在與底物的（S)-對映異構(gòu)體相關(guān)的相似的酶活性，其不一定為相同的酶種類。
[0146] 本申請還認(rèn)識到，在酶已經(jīng)顯示接受特定輔助因子如NADPH或者輔助底物如乙酰 基-CoA的情況下，許多酶在催化特定酶活性中在接受大量不同輔因子或者輔助底物方面 是泛宿主性的。此外，本申請認(rèn)識到，在酶對例如特定輔助因子如NADH具有高特異性的情 況下，對輔助因子NADPH具有高特異性的具有相似或者相同活性的酶可為不同的酶種類。
[0147] 在一些實施方案中，在4. 5節(jié)中所述的途徑中的酶是經(jīng)非直接或者合理酶設(shè)計方 法酶工程的結(jié)果，目的在于改善活性、改善特異性、降低反饋抑制、降低阻抑、改善酶溶解 性、改變立體特異性，或者改變輔助因子特異性。
[0148] 在一些實施方案中，將在4. 5節(jié)中所述的途徑中的酶經(jīng)附加型或者染色體整合方 法基因給予（即，過表達(dá)）至所得的基因修飾的有機體內(nèi)。
[0149] 在一些實施方案中，使用基因組級別（genome-scale)的系統(tǒng)生物學(xué)技術(shù)如通量 平衡分析來設(shè)計用于將碳通量導(dǎo)至C6結(jié)構(gòu)單元的基因組級別的弱化或者敲除策略。
[0150] 弱化策略包括但不限于使用轉(zhuǎn)座子、同源重組（雙交叉的方法）、誘變、酶抑制劑 和RNAi干擾。
[0151]在一些實施方案中，使用通量組（fluxomic)、代謝組（metabolomic)和轉(zhuǎn)錄組 (transcriptomal)數(shù)據(jù)告知或者支持基因組級別的系統(tǒng)生物學(xué)技術(shù)，由此在將碳通量導(dǎo)向 C6結(jié)構(gòu)單元中設(shè)計基因組級別的弱化或者敲除策略。
[0152] 在一些實施方案中，所述宿主微生物的對高濃度的C6結(jié)構(gòu)單元的耐受性通過在 選擇性環(huán)境中的連續(xù)培養(yǎng)來改善。
[0153] 在一些實施方案中，將所述宿主微生物的生物化學(xué)網(wǎng)絡(luò)弱化或者強化以（1)確保 乙?；?CoA的細(xì)胞內(nèi)可用度，（2)創(chuàng)造NADH或者NADPH不平衡，其僅可經(jīng)C6結(jié)構(gòu)單元的 形成來平衡，（3)防止降解導(dǎo)致和包含C6結(jié)構(gòu)單元的中心代謝產(chǎn)物，中心前體和（4)確保 來自細(xì)胞的有效率的外向通量。
[0154] 在需要用于C6結(jié)構(gòu)單元合成的乙?；?CoA的細(xì)胞內(nèi)可用度的一些實施方案中， 產(chǎn)生乙酸的憐酸乙酸轉(zhuǎn)移酶如pta弱化（Shenetal·，Appl.Environ.Microbiol. ,2011，7 7(9), 2905 - 2915) 〇
[0155] 在需要用于C6結(jié)構(gòu)單元合成的乙酰基-CoA的細(xì)胞內(nèi)可用度的一些實施方案中， 在乙酸合成途徑中編碼乙酸激酶的基因如ack弱化。
[0156] 在需要用于C6結(jié)構(gòu)單元合成的乙?；?CoA和NADH的細(xì)胞內(nèi)可用度的一些實施 方案中，編碼降解丙酮酸至乳酸的基因如IdhA弱化（Shenetal·，Appl.Environ.Microbi ol.，2011，77(9)，2905-2915)。
[0157] 在需要用于C6結(jié)構(gòu)單元合成的乙酰基-CoA和NADH的細(xì)胞內(nèi)可用度的一些實 施方案中，編碼降解磷酸烯醇丙酮酸至琥珀酸的基因如frdBC弱化（參見例如，Shenet al.，2011，如上）。
[0158] 在需要用于C6結(jié)構(gòu)單元合成的乙?；?CoA和NADH的細(xì)胞內(nèi)可用度的一些實 施方案中，編碼降解乙酰基-CoA至乙醇的基因如由adhE編碼的醇脫氫酶弱化（Shenet al.，2011，如上）。
[0159] 在一些實施方案中，編碼降解丙酮酸至乙醇的基因如丙酮酸脫羧酶弱化。
[0160] 在一些實施方案中，編碼生成異丁醇的基因如2-酮酸脫羧酶弱化。
[0161] 在需要用于C6結(jié)構(gòu)單元合成的乙?；?CoA的細(xì)胞內(nèi)可用度的一些實施方案 中，乙酰基-CoA合成酶如acs的基因產(chǎn)物在微生物中過表達(dá)（Satohetal.，Journalof BioscienceandBioengineering, 2003,95(4)，335 - 341) 〇
[0162] 在一些實施方案中，通過弱化6-磷酸葡萄糖異構(gòu)酶將碳通量導(dǎo)至磷酸戊糖循環(huán) 中（EC5. 3. 1. 9)。
[0163] 在一些實施方案中，在途徑需要用于C6結(jié)構(gòu)單元合成的過量NADH輔助因子的情 況下，甲酸脫氫酶基因在所述宿主有機體中過表達(dá)（Shenetal.，2011，如上）。
[0164] 在一些實施方案中，在途徑在合成C6結(jié)構(gòu)單元中需要過量NADPH輔助因子的情況 下，批陡核苷酸轉(zhuǎn)氫酶基因如UdhA在所述宿主有機體中過表達(dá)（Brighametal.,Advanced BiofuelsandBioproducts，2012,Chapter39, 1065-1090)。
[0165] 在一些實施方案中，在途徑在合成C6結(jié)構(gòu)單元中需要過量NADPH輔助因子的情況 下，甘油醛-3P-脫氫酶基因如GapN在所述宿主有機體中過表達(dá)（Brighametal·，2012， 如上）。
[0166] 在一些實施方案中，在途徑在合成C6結(jié)構(gòu)單元中需要過量NADPH輔助因子的情況 下，蘋果酸酶基因如maeA或者maeB在所述宿主有機體中過表達(dá)（Brighametal.，2012， 如上）。
[0167] 在一些實施方案中，在途徑在合成C6結(jié)構(gòu)單元中需要過量NADPH輔助因子的情況 下，6-磷酸葡糖脫氫酶基因如zwf在所述宿主有機體中過表達(dá)（Limetal.，Journalof Bioscience和Bioengineering, 2002, 93(6)，543-549)。
[0168] 在一些實施方案中，在途徑在合成C6結(jié)構(gòu)單元中需要過量NADPH輔助因子的情況 下，果糖1,6二磷酸酶基因如fbp在所述宿主有機體中過表達(dá)（Beckeretal.，Journalof Biotechnology, 2007, 132, 99-109)〇
[0169] 在一些實施方案中，在途徑在合成C6結(jié)構(gòu)單元中需要過量NADPH輔助因子的情況 下，磷酸丙糖異構(gòu)酶（EC5. 3.I. 1)弱化。
[0170] 在一些實施方案中，在途徑在合成C6結(jié)構(gòu)單元中需要過量NADPH輔助因子的情況 下，葡萄糖脫氫酶如gdh的基因產(chǎn)物在所述宿主有機體中過表達(dá)（Satohetal.,Journal ofBioscienceandBioengineering, 2003,95(4)，335 - 341)〇
[0171] 在一些實施方案中，促進(jìn)NADPH轉(zhuǎn)化成NADH的酶弱化，例如可經(jīng)ECI. 4.I. 2(NADH 特異性）和ECI. 4.I. 4 (NADPH特異性）中的谷氨酸脫氫酶的相互轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的NADH生成循 環(huán)。
[0172] 在一些實施方案中，利用NADH和NADPH輔因子的谷氨酸脫氫酶（EC1. 4. 1.3)弱 化。
[0173] 在一些實施方案中，膜結(jié)合細(xì)胞色素Ρ450/ω-羥化酶經(jīng)截短將P450錨 定至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的N-端區(qū)域而增溶（Schelleretal.，TheJournalofBiological Chemistry, 1994, 269(17)，12779 0 12783)。
[0174] 在使用天然積累聚羥基烷酸酯的宿主的一些實施方案中，聚合物合成酶酶可在所 述宿主菌株中弱化。
[0175] 在需要用于C6結(jié)構(gòu)單元合成的丁酰基-CoA的細(xì)胞內(nèi)可用度的一些 實施方案中，丙?；?CoA合成酶如PrpE-RS的基因產(chǎn)物在微生物中過表達(dá) (Rajashekhara&Watanabe，F(xiàn)EBSLetters, 2004, 556, 143 - 147)。
[0176] 在一些實施方案中，降解中心代謝產(chǎn)物的氧化酶和導(dǎo)致和包含C6結(jié)構(gòu)單元的 中心前體弱化。
[0177] 在一些實施方案中，經(jīng)輔酶A酯化而活化C6結(jié)構(gòu)單元的酶如CoA-連接酶弱化。
[0178] 在一些實施方案中，通過對細(xì)胞膜的基因工程結(jié)構(gòu)修飾或者提高用于C6結(jié)構(gòu)單 元的任何相關(guān)的轉(zhuǎn)運蛋白活性，C6結(jié)構(gòu)單元穿越細(xì)胞膜到達(dá)細(xì)胞外介質(zhì)的外向通量強化或 者放大。
[0179] 本發(fā)明將在下面的實施例中進(jìn)一步描述，這些實施例不限制權(quán)利要求中所述的本 發(fā)明的范圍。
[0180] 實施例
[0181] 實施例1
[0182] 用于在釀酒酵母菌中由葡萄糖循環(huán)合成己二酸的基因組級別的弱化策略
[0183] 基因組級別的通量平衡分析使用指定為iMM904的釀酒酵母菌的基因組級別的模 型來進(jìn)行（Moetal·，BMCSystemsBiology, 2009, 3 (37) ,1-17)。
[0184]IMM904模型通過以下方法擴展：包含發(fā)表的作品中所概述的用于真核有機體的 ^^-氧化途徑（Sandersetal·，JournalofLipidResearch, 2005, 46 (5) ,1001 - 1008)。 而且，在iMM904模型的過氧化物酶體中的β-氧化反應(yīng)被擴展并且包含相關(guān)的膜轉(zhuǎn)運反 應(yīng)。在驗證擴展的模型期間需要富馬酸還原酶的鈍化，以使模型通量與實驗通量數(shù)據(jù)協(xié)調(diào)。
[0185] 將在圖1中所述的NADH特異性酶反應(yīng)結(jié)合至模型中。
[0186] 允許己酸和己二酸膜轉(zhuǎn)運至細(xì)胞外介質(zhì)以及己酸和己二酸從細(xì)胞外介質(zhì)膜轉(zhuǎn)運。
[0187] 當(dāng)過表達(dá)甲酸脫氫酶時，在大腸桿菌中產(chǎn)生1- 丁醇中NADH的化學(xué)計量平衡更加 有效率（Shenetal·，Appl.Environ.Microbiol. ,2011,77 (9) ,2905 - 2915)。iMM904 模型 包含甲酸脫氫酶，但是缺乏丙酮酸甲酸裂解酶活性，其包含在釀酒酵母菌模型中。
[0188] 評估了NAD(H)或者NADP(H)依賴性酶的輔助因子特異性，并且在已公開的文獻(xiàn)在 特異性方面不明確的情況下，假定了泛宿主性的酶。
[0189] 使用代謝工程工作臺Optflux搜索與用于弱化策略的生物化學(xué)網(wǎng)絡(luò)相關(guān)的解空 間，所述弱化策略（1)以缺氧的方式由葡萄糖產(chǎn)生己酸，然后（2)以需氧的方式由細(xì)胞外己 酸產(chǎn)生己二酸，同時共同供料葡萄糖作為碳和能量來源。
[0190] 優(yōu)化試驗發(fā)現(xiàn)四種有利的弱化；即，（1)弱化6-磷酸葡萄糖異構(gòu)酶，從而將通量 導(dǎo)至磷酸戊糖循環(huán)中；（2)弱化丙酮酸脫羧酶或者醇脫氫酶，從而防止乙醇產(chǎn)生；（3)弱化 2_酮酸脫羧酶，從而防止異丁醇產(chǎn)生和（4)鈍化β-氧化，從而防止中心前體、中心代謝產(chǎn) 物和己二酸降解。
[0191] 在這種使用葡萄糖作為碳和能量來源的釀酒酵母突變體中的弱化有利于作為最 大化生物質(zhì)生長手段的經(jīng)己酸的產(chǎn)生平衡NADH。
[0192] 甲酸脫氫酶在釀酒酵母突變體中的過表達(dá)消除甲酸（formate)和丙酮酸 (pyruvate)的副產(chǎn)物形成，從而以0. 62的摩爾收率[(mol己酸）/(mol葡萄糖）]產(chǎn)生己 酸。
[0193] 從缺氧培養(yǎng)循環(huán)至需氧培養(yǎng)，同時維持葡萄糖供料速率以匹配在缺氧條件下的生 長速率，得到0. 38的總摩爾收率[(mol己二酸）Amol總葡萄糖）]。
[0194] 使用經(jīng)驗證的模型在計算機上進(jìn)行的生物化學(xué)網(wǎng)絡(luò)弱化確定（In-silico attenuationofthebiochemicalnetworkusingavalidatedmodeldetermined that)，在缺氧條件和需氧條件之間循環(huán)的培養(yǎng)策略從供料的葡萄糖主要產(chǎn)生己二酸。
[0195] 實施例2
[0196] 在釀酒酵母菌中使用NADH不平衡以將碳通量導(dǎo)向己二酸的用于從葡萄糖開始的 微需氧合成的基因組級別的弱化策略
[0197] 使用實施例1中所述的iMM904模型評估使用葡萄糖作為碳和能量來源在微需氧 的、底物氧化和生長限制培養(yǎng)條件下的己二酸的非循環(huán)制備。
[0198] 通過使用擴展的iMM904模型和代謝工程工作臺Optflux，優(yōu)化試驗發(fā)現(xiàn)了優(yōu) 化的弱化策略，所述優(yōu)化的弱化策略包括（1)弱化向細(xì)胞外介質(zhì)的己酸轉(zhuǎn)運；（2)弱 化向細(xì)胞外介質(zhì)的乙醇分泌；（3)弱化2-輕基丁酸氧化還原酶（2-hydroxybutyrate oxidoreductase),從而防止 2_ 輕基丁酸（2-hydroxybutyrate)產(chǎn)生；（4)弱化DL甘 油-3-磷酸酶，從而防止甘油產(chǎn)生和（5)弱化蘋果酸脫氫酶，從而防止NADH與NADPH的相 互轉(zhuǎn)化。
[0199] 所得的釀酒酵母突變體產(chǎn)生己二酸作為最有利的平衡NADH的手段以最大化生物 質(zhì)生長，從而以0.71的摩爾收率[(mol己二酸）Amol葡萄糖）]產(chǎn)生己二酸。
[0200] 使用經(jīng)驗證的模型在計算機上進(jìn)行的生物化學(xué)網(wǎng)絡(luò)弱化確定，在微需氧條件下的 非循環(huán)培養(yǎng)策略從供料的葡萄糖主要產(chǎn)生己二酸。
[0201] 實施例3
[0202] 在釀酒酵母菌中使用NADPH不平衡以將碳通量導(dǎo)向己二酸的用于從葡萄糖開始 的需氧合成的基因組級別的弱化策略
[0203] 使用實施例1中所述的iMM904模型評價使用葡萄糖作為碳和能量來源在需氧培 養(yǎng)和生長限制條件下的己二酸的非循環(huán)制備。
[0204] 圖1中所述的NADH特異性酶促反應(yīng)被圖2中所述的相當(dāng)?shù)腘ADPH特異性酶促反 應(yīng)替代。
[0205] 通過使用擴展的iMM904模型和代謝工程工作臺Optflux，優(yōu)化試驗發(fā)現(xiàn)了優(yōu)化的 弱化策略，所述優(yōu)化的弱化策略包括（1)弱化磷酸丙糖異構(gòu)酶/磷酸葡糖異構(gòu)酶，從而將通 量改向至磷酸戊糖循環(huán)中；（2)通過弱化NADH依賴性谷氨酸脫氫酶和脯氨酸氧化酶，防止 NADPH與NADH的相互轉(zhuǎn)化。
[0206] 所得的釀酒酵母突變體產(chǎn)生己二酸作為最有利的平衡NADPH的手段以最大化生 物質(zhì)生長，從而以0.4的摩爾收率[(mol己二酸V(mol葡萄糖）]產(chǎn)生己二酸。
[0207] 使用經(jīng)驗證的模型在計算機上進(jìn)行的生物化學(xué)網(wǎng)絡(luò)弱化確定，在需氧條件下的非 循環(huán)培養(yǎng)策略從供料的葡萄糖主要產(chǎn)生己二酸。
[0208] 其它實施方案
[0209] 應(yīng)理解的是，盡管協(xié)同發(fā)明的具體描述描述了本發(fā)明，但是前面的描述意圖說明 并且不限制發(fā)明的范圍，發(fā)明的范圍由所附權(quán)利要求的范圍限定。其它方面、優(yōu)點和修飾也 在權(quán)利要求的范圍內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1. 生物合成選自己二酸、6-氨基己酸、六亞甲基二胺、己內(nèi)酰胺和1，6-己二醇的一種 或者多種產(chǎn)物的方法，所述方法包括酶促合成六碳的鏈?zhǔn)街逯麈満驮谝粋€或者多個步驟 中在所述主鏈中酶促形成兩個選自羧基、胺和羥基基團(tuán)的末端官能團(tuán)，從而直接產(chǎn)生所述 產(chǎn)物或者在后續(xù)步驟中產(chǎn)生所述產(chǎn)物。
2. 權(quán)利要求1的方法，其中所述兩個末端官能團(tuán)是相同的。
3. 權(quán)利要求1的方法，其中所述兩個末端官能團(tuán)是不同的。
4. 權(quán)利要求1的方法，其中所述六碳的鏈?zhǔn)街逯麈湠榧乎；?CoA。
5. 權(quán)利要求4的方法，其中所述己酰基-CoA是由乙?；?CoA經(jīng)兩個CoA依賴性碳鏈 延長循環(huán)使用NADH或者NADPH依賴性酶酶促合成的。
6. 權(quán)利要求4或者5的方法，其中所述己酰基-CoA通過以下方法形成：通過歸類在EC I. 3.I. 44、EC1. 3. 1. 38或者EC1. 3. 1. 8下的烯酰基-CoA還原酶轉(zhuǎn)化己-2-烯?；?CoA。
7. 權(quán)利要求6的方法，其中所述烯?；?CoA還原酶是ter或者tdter的基因產(chǎn)物。
8. 權(quán)利要求6的方法，其中己-2-烯酰基-CoA通過以下方法形成：通過歸類在EC 4. 2. 1. 17下的反式-2-烯?；?CoA水合酶轉(zhuǎn)化（S) 3-羥基己?；?CoA，或者通過歸類在 EC4. 2. 1. 119下的反式-2-烯?；?CoA水合酶轉(zhuǎn)化（R) 3-羥基己?；?CoA。
9. 權(quán)利要求8的方法，其中所述反式-2-烯酰基-CoA水合酶是crt的基因產(chǎn)物。
10. 權(quán)利要求8或者權(quán)利要求9的方法，其中⑶3-羥基己酰基-CoA通過以下方法形 成：通過歸類在ECI.I. 1. 35下的3-羥基?；?CoA脫氫酶轉(zhuǎn)化3-氧代己?；?CoA。
11. 權(quán)利要求10的方法，其中所述3-羥基?；?CoA脫氫酶是通過fadB編碼的。
12. 權(quán)利要求10或者權(quán)利要求11的方法，其中3-氧代己酰基-CoA通過以下方法形 成：通過歸類在EC2. 3. 1. 16下的乙?；?CoAC-酰基轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)化丁?；?CoA。
13. 權(quán)利要求12的方法，其中所述乙?；?CoAC-?；D(zhuǎn)移酶是通過bktB編碼的。
14. 權(quán)利要求12或者權(quán)利要求13的方法，其中丁?；?CoA通過以下方法形成：通過 歸類在EC1.3. 1.44、EC1.3. 1.38或者EC1.3. 1.8下的烯?；?CoA還原酶轉(zhuǎn)化巴豆酰 基 _CoA。
15. 權(quán)利要求14的方法，其中所述巴豆酰基-CoA通過以下方法形成：通過歸類在EC 4. 2. 1. 17下的反式-2-烯?；?CoA水合酶轉(zhuǎn)化（S) 3-羥基丁?；?CoA。
16. 權(quán)利要求15的方法，其中（S) 3-羥基丁酰基-CoA通過以下方法形成：通過歸類在ECI.I. 1. 157下的3-羥基丁?；?CoA脫氫酶轉(zhuǎn)化乙酰乙?；?CoA。
17. 權(quán)利要求16的方法，其中所述3-羥基丁酰基-CoA脫氫酶是通過hbd編碼的。
18. 權(quán)利要求16或者權(quán)利要求17的方法，其中乙酰乙?；?CoA通過以下方法形成： 通過歸類在EC2. 3. 1. 9下的乙?；?CoAC-?；D(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)化乙酰基-CoA。
19. 權(quán)利要求18的方法，其中所述乙酰基-CoAC-?；D(zhuǎn)移酶是通過atoB或者phaA 編碼的。
20. 權(quán)利要求18或者權(quán)利要求19的方法，其中乙酰乙?；?CoA通過以下方法形成： 通過歸類在EC2. 3. 1. 194下的乙酰乙?；?CoA合成酶轉(zhuǎn)化丙二酸單?；?CoA。
21. 權(quán)利要求20的方法，其中丙二酸單?；?CoA通過以下方法形成：通過歸類在EC 6. 4. 1. 2下的乙?；?CoA羧化酶轉(zhuǎn)化乙酰基-CoA。
22. 權(quán)利要求8的方法，其中所述反式-2-烯酰基-CoA水合酶是phaj的基因產(chǎn)物。
23. 權(quán)利要求8或者權(quán)利要求22的方法，其中（R) 3-羥基己?；?CoA通過以下方法形 成：通過歸類在ECI.I. 1. 100下的3_氧代醜基-CoA還原酶轉(zhuǎn)化3_氧代己醜基-CoA。
24. 權(quán)利要求23的方法，其中所述3-氧代?；?CoA還原酶是通過fabG編碼的。
25. 權(quán)利要求14的方法，其中巴豆?；?CoA通過以下方法形成：通過歸類在EC 4. 2. 1. 119下的反式-2-烯?；?CoA水合酶轉(zhuǎn)化（R) 3-羥基丁?；?CoA。
26. 權(quán)利要求25的方法，其中（R) 3-羥基丁?；?CoA通過以下方法形成：通過歸類在ECI.I. 1. 36下的乙酰酰基-CoA還原酶轉(zhuǎn)化乙酰乙?；?CoA。
27. 權(quán)利要求26的方法，其中所述乙酰?；?CoA還原酶是通過phaB編碼的。
28. 權(quán)利要求1-4中的任一項的方法，其包括通過以下方法產(chǎn)生己酸：使用?；?CoA 水解酶和醛脫氫酶或者硫酯酶在己?；鵆oA中形成第一末端羧基基團(tuán)。
29. 權(quán)利要求28的方法，其中所述酰基-CoA水解酶或者硫酯酶是通過YciA、tesB或 者Acot13編碼的。
30. 權(quán)利要求1-4中的任一項的方法，其包括通過以下方法產(chǎn)生己酸：通過歸類在EC 1. 2. 1. 4下的醛脫氫酶在己醛中形成第一末端羧基基團(tuán)。
31. 權(quán)利要求30的方法，其中己醛通過以下方法形成：通過歸類在EC1.2. 1.57下的 丁醛脫氫酶轉(zhuǎn)化己?；?CoA。
32. 權(quán)利要求29-31中的任一項的方法，其還包括使用一種或者多種酶促轉(zhuǎn)化將己酸 轉(zhuǎn)化成己二酸、6-氨基己酸、六亞甲基二胺、ε己內(nèi)酰胺或者1，6己二醇，其中所述酶促轉(zhuǎn) 化中的一種引入第二末端官能團(tuán)。
33. 權(quán)利要求32的方法，其包括使用細(xì)胞色素Ρ450/ω-羥化酶將己酸轉(zhuǎn)化成6-羥基 己酸。
34. 權(quán)利要求33的方法，其中所述細(xì)胞色素Ρ450/ω-羥化酶來自家族CYP153如 CYP152A6。
35. 權(quán)利要求33或者權(quán)利要求34的方法，其包括使用（i)醇脫氫酶、（ii) 6-羥基己酸 脫氫酶或者（iii)細(xì)胞色素Ρ450/ω-羥化酶將6-羥基己酸轉(zhuǎn)化成己二酸半醛。
36. 權(quán)利要求35的方法，其中所述醇脫氫酶是通過YMR318C編碼的。
37. 權(quán)利要求35或者權(quán)利要求36的方法，其中所述6-羥基己酸脫氫酶是通過ChnD編 碼的。
38. 權(quán)利要求1-3或者32中的任一項的方法，其包括通過以下方法產(chǎn)生己二酸：使用 (i)歸類在EC1. 2. 1. 3下的醛脫氫酶、（ii)歸類在EC1. 2. 1. 63下的6-氧代己酸脫氫酶 或者（iii)細(xì)胞色素Ρ450/ω-羥化酶在己二酸半醛中形成第二末端官能團(tuán)。
39. 權(quán)利要求38的方法，其中所述6-氧代己酸脫氫酶是通過ChnE編碼的。
40. 權(quán)利要求32或者33的方法，其包括通過以下方法產(chǎn)生6-氨基己酸：使用歸類在 EC2. 61. 18、EC2. 6. 1. 19或者EC2. 6. 1. 48下的ω-轉(zhuǎn)氨酶在己二酸半醛中形成第二末 端官能團(tuán)。
41. 權(quán)利要求1、32或者40的方法，其包括使用歸類在EC3. 5. 2.-下的內(nèi)酰胺酶由 6_氨基己酸產(chǎn)生己內(nèi)酰胺。
42. 權(quán)利要求41的方法，其包括使用歸類在EC1.2. 99. 6下的羧酸還原酶將6-氨基己 酸轉(zhuǎn)化成6-氨基己醛。
43. 權(quán)利要求1、32或者42的方法，其包括通過以下方法產(chǎn)生六亞甲基二胺：使用歸類 在EC2. 6. 1.29或者EC2. 6. 1.82下的二胺轉(zhuǎn)氨酶在6-氨基己醛中形成第二末端官能團(tuán)。
44. 權(quán)利要求42或者43的方法，其中所述羧酸還原酶是連同npt的基因產(chǎn)物通過car 編碼的。
45. 權(quán)利要求42或者43的方法，其中所述羧酸還原酶是通過GriC&GriD編碼的。
46. 權(quán)利要求1、33或者34中的任一項的方法，其包括通過以下方法產(chǎn)生1，6己二醇： 使用歸類在ECI.I. 1.-(1，2, 21，184)下的醇脫氫酶在6-羥基己醛中形成第二末端官能 團(tuán)。
47. 前述權(quán)利要求中的任一項的方法，其中所述方法使用包含所述酶的細(xì)胞裂解物實 施。
48. 前述權(quán)利要求中的任一項的方法，其中所述方法在重組宿主中實施。
49. 權(quán)利要求48的方法，其中所述宿主在缺氧的、需氧的或者微需氧的培養(yǎng)條件下培 養(yǎng)。
50. 權(quán)利要求48的方法，其中所述宿主經(jīng)受循環(huán)培養(yǎng)策略，以使所述宿主在缺氧的培 養(yǎng)條件和需氧的培養(yǎng)條件之間交替。
51. 權(quán)利要求48的方法，其中所述宿主經(jīng)氮、磷酸鹽或者氧的限制在營養(yǎng)限制的條件 下培養(yǎng)。
52. 權(quán)利要求48-51中的任一項的方法，其中所述C6結(jié)構(gòu)單元通過單一微生物菌株經(jīng) 非循環(huán)或者循環(huán)發(fā)酵策略產(chǎn)生。
53. 權(quán)利要求48-51中的任一項的方法，其中所述C6結(jié)構(gòu)單元通過共同培養(yǎng)兩種或者 更多種微生物菌株經(jīng)非循環(huán)或者循環(huán)發(fā)酵策略產(chǎn)生。
54. 權(quán)利要求48-50中的任一項的方法，其中所述C6結(jié)構(gòu)單元通過連續(xù)發(fā)酵產(chǎn)生，其中 將來自前發(fā)酵的肉湯或者離心濾液作為原料、中心代謝產(chǎn)物或者中心前體的來源供料至相 繼的發(fā)酵；最后產(chǎn)生所述C6結(jié)構(gòu)單元。
55. 權(quán)利要求48-51中的任一項的方法，其中將所述重組宿主細(xì)胞保留在陶瓷中空纖 維膜中以在發(fā)酵期間維持高細(xì)胞密度。
56. 權(quán)利要求49或者50的方法，其中供料至發(fā)酵的主要碳源來源于生物或者非生物原 料。
57. 權(quán)利要求56的方法，其中所述生物原料是或者來源于：單糖、二糖、木質(zhì)纖維素、半 纖維素、纖維素、木質(zhì)素如Y-戊酮酸和糠醛、木質(zhì)素、甘油三酯如甘油和脂肪酸、農(nóng)業(yè)廢物 或者城市廢物。
58. 權(quán)利要求56的方法，其中所述非生物原料是或者來源于：天然氣、合成氣、C02/H2、 甲醇、乙醇、來自環(huán)己烷氧化過程的非揮發(fā)性殘留物（NVR)或者堿洗廢物流。
59. 權(quán)利要求49的方法，其中所述宿主為原核生物或者真核生物。
60. 權(quán)利要求59的方法，其中所述宿主為原核生物，所述原核生物來自埃希氏菌屬如 大腸桿菌；來自梭狀芽胞桿菌屬如楊氏梭菌、自產(chǎn)乙醇梭菌或者克魯佛梭菌；來自棒狀桿 菌屬如谷氨酸棒狀桿菌；來自貪銅菌屬如鉤蟲貪銅菌或者耐金屬貪銅菌；來自假單胞菌屬 如熒光假單胞菌、惡臭假單胞菌或者食油假單胞菌；來自代爾夫特菌屬如食酸代爾夫特菌； 來自芽孢桿菌屬如枯草芽胞桿菌；來自乳桿菌屬如德氏乳桿菌；或者來自乳球菌屬如乳酸 乳球菌。
61.權(quán)利要求59的方法，其中所述宿主為真核生物，所述真核生物來自曲霉菌屬如黑 曲霉菌；來自酵母菌屬如釀酒酵母菌；來自畢赤氏酵母屬如巴斯德畢赤酵母；來自耶羅維 亞酵母屬如解脂耶羅維亞酵母；來自伊薩酵母屬如東方伊薩酵母；來自德巴利酵母屬如漢 遜德巴利酵母；來自Arxula屬如Arxula adenoinivorans ;或者來自克魯維酵母菌屬如乳 酸克魯維酵母菌。
62.權(quán)利要求59的方法，其中所述宿主對高濃度的C6結(jié)構(gòu)單元的耐受性通過在選擇性 環(huán)境中的連續(xù)培養(yǎng)而得到改善。
63.權(quán)利要求59的方法，其中所述宿主天然地累積聚羥基烷酸酯，并且其中聚合物合 成酶在宿主菌株中弱化。
64.權(quán)利要求51的方法，其中通過弱化降解乙酰基-CoA的基因，用于C6結(jié)構(gòu)單元的生 物合成的乙?；?CoA的細(xì)胞內(nèi)濃度在所述宿主中提高。
65.權(quán)利要求48的方法，其中產(chǎn)生NADH的不平衡，其僅可經(jīng)C6結(jié)構(gòu)單元的形成來平 衡。
66. 權(quán)利要求65的方法，其中編碼甲酸脫氫酶的基因過表達(dá)，編碼丙酮酸甲酸裂解酶 的基因過表達(dá)，2-羥基丁酸氧化還原酶活性弱化，DL甘油-3-磷酸酶活性弱化，和/或蘋果 酸脫氫酶活性弱化。
67.權(quán)利要求65的方法，其中通過弱化歸類在EC 5. 3. 1.9下的6-磷酸葡萄糖異構(gòu)酶， 將碳通量導(dǎo)入所述宿主中的磷酸戊糖循環(huán)中。
68.權(quán)利要求64或者65的方法，其中編碼乙酸激酶的基因如ack在所述宿主中弱化。
69.權(quán)利要求64或者65的方法，其中編碼介導(dǎo)丙酮酸降解至乳酸的酶的基因如IdhA 在所述宿主中弱化。
70.權(quán)利要求64或者65的方法，其中編碼介導(dǎo)磷酸烯醇丙酮酸降解至琥珀酸的酶的基 因如frdBC在所述宿主中弱化。
71.權(quán)利要求64或者65的方法，其中編碼介導(dǎo)乙?；?CoA降解至乙醇的酶如通過 adhE編碼的醇脫氫酶的基因在所述宿主中弱化。
72.權(quán)利要求64或者65的方法，其中編碼介導(dǎo)丙酮酸降解至乙醇的酶如丙酮酸脫羧酶 的基因在所述宿主中弱化。
73.權(quán)利要求64或者65的方法，其中編碼介導(dǎo)異丁醇的生成的酶如2-酮酸脫羧酶的 基因在所述宿主中弱化。
74.權(quán)利要求48的方法，其中通過過表達(dá)形成乙?；?CoA的基因，用于C6結(jié)構(gòu)單元的 生物合成的乙酰基-CoA的細(xì)胞內(nèi)濃度在所述宿主中提高。
75.權(quán)利要求74的方法，其中乙?；?CoA合成酶如acs的基因產(chǎn)物在所述宿主中過表 達(dá)。
76.權(quán)利要求48的方法，其中在所述宿主中產(chǎn)生NADPH的不平衡，其僅可經(jīng)C6結(jié)構(gòu)單 元的形成來平衡。
77.權(quán)利要求76的方法，其中吡啶核苷酸轉(zhuǎn)氫酶基因如UdhA在所述宿主中過表達(dá)。
78.權(quán)利要求76的方法，其中甘油醛-3P-脫氫酶基因如GapN在所述宿主中過表達(dá)，蘋 果酸酶基因如maeA或者maeB在所述宿主中過表達(dá)，6_磷酸葡糖脫氫酶基因如zwf在所述 宿主中過表達(dá)，果糖1，6二磷酸酶基因如fbp在所述宿主中過表達(dá)，磷酸丙糖異構(gòu)酶的活性 在所述宿主中弱化，和/或蘋果酸脫氫酶的活性弱化。
79. 權(quán)利要求76的方法，其中膜結(jié)合細(xì)胞色素P450/ω-羥化酶經(jīng)將所述P450錨定至 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的N-端區(qū)域的截短在所述宿主中增溶。
80. 權(quán)利要求76的方法，其中葡萄糖脫氫酶如gdh的基因產(chǎn)物在所述宿主中過表達(dá)。
81. 權(quán)利要求76的方法，其中促進(jìn)NADPH轉(zhuǎn)化至NADH的酶在所述宿主中弱化或者己酸 向細(xì)胞外介質(zhì)的轉(zhuǎn)運弱化。
82. 權(quán)利要求76的方法，其中可經(jīng)ECI. 4.I. 2 (NADH特異性的）和ECI. 4.I. 4(NADPH 特異性的）中的谷氨酸脫氫酶的互變產(chǎn)生的NADH生成循環(huán)在所述宿主中弱化。
83. 權(quán)利要求76的方法，其中利用NADH和NADPH作為輔因子的谷氨酸脫氫酶（EC 1. 4. 1. 3)在所述宿主中弱化。
84. 權(quán)利要求48的方法，其中導(dǎo)致己酰基-CoA形成的中心代謝產(chǎn)物的降解在所述宿主 中弱化。
85. 權(quán)利要求84的方法，其中丙?；?CoA合成酶如PrpE-RS的基因產(chǎn)物在所述宿主中 過表達(dá)。
86. 權(quán)利要求84的方法，其中降解中心代謝產(chǎn)物和中心前體的β-氧化酶在所述宿主 中弱化,所述中心代謝產(chǎn)物和中心前體導(dǎo)致和包括C6結(jié)構(gòu)單元。
87. 權(quán)利要求84的方法，其中經(jīng)輔酶A酯化活化C6結(jié)構(gòu)單元的酶如CoA-連接酶弱化。
88. 權(quán)利要求48的方法，其中通過對細(xì)胞膜的基因工程結(jié)構(gòu)修飾或者提高對C6結(jié)構(gòu)單 元的任何相關(guān)轉(zhuǎn)運蛋白活性，增強或者放大C6結(jié)構(gòu)單元穿越細(xì)胞膜到達(dá)細(xì)胞外介質(zhì)的外 向通量。
89.重組宿主，其包含至少一種外源性核酸，所述外源性核酸編碼以下物質(zhì)中的一種 或者多種：甲酸脫氫酶、烯?；?CoA還原酶、反式-2-烯?；?CoA水合酶、3-羥基丁酰 基-CoA脫氫酶、乙?；?CoA C-?；D(zhuǎn)移酶、乙酰?；?CoA還原酶、乙酰基-CoA合成酶、 乙酰基-CoA羧化酶、蘋果酸酶、吡啶核苷酸轉(zhuǎn)氫酶、甘油醛-3Ρ-脫氫酶、?；?CoA水解酶、 醛脫氫酶、硫酯酶、細(xì)胞色素Ρ450/ω-羥化酶、醇脫氫酶、6-羥基己酸脫氫酶、6-氧代己酸 脫氫酶、二胺轉(zhuǎn)氨酶、丙酰基-CoA合成酶和羧酸還原酶，其中所述宿主包含以下的一種或 者多種缺乏：6_磷酸葡萄糖異構(gòu)酶、乙酸激酶、將丙酮酸降解至乳酸的酶、介導(dǎo)磷酸烯醇丙 酮酸降解至琥珀酸的酶、醇脫氫酶、丙酮酸脫羧酶、2-酮酸脫羧酶、磷酸丙糖異構(gòu)酶、谷氨酸 脫氫酶。
【文檔編號】C12P13/00GK104220601SQ201280069823
【公開日】2014年12月17日 申請日期:2012年12月14日 優(yōu)先權(quán)日:2011年12月16日
【發(fā)明者】A.波蒂斯, A.V.E.康拉蒂 申請人:英威達(dá)技術(shù)有限責(zé)任公司