一種模擬體內微環(huán)境的干細胞培養(yǎng)體系及用途
【專利摘要】本發(fā)明屬于細胞生物學領域，涉及一種模擬體內微環(huán)境的干細胞培養(yǎng)體系及用途；本發(fā)明利用瓊脂糖構建三維支架材料，模擬體內微環(huán)境動態(tài)培養(yǎng)干細胞，使干細胞維持自我更新、增殖、歸巢及向內皮細胞定向分化。本發(fā)明還比較二維培養(yǎng)及三維干細胞在正常及低氧環(huán)境下的生物學功能差異，利用EGFP基因示蹤的方法和成像技術，體內移植修復Apo?E基因敲除小鼠內皮損傷，從多能轉錄因子表達、生長因子分泌、細胞外基質成分、細胞膜內信號分子活化等多個方面，測定三維干細胞維持自我更新、增殖、歸巢及向內皮細胞定向分化的遂平。本發(fā)明能用于血管損傷修復中，以及為干細胞療法促進損傷血管的早期再內皮化的應用奠定理論基礎及實驗依據(jù)。
【專利說明】一種模擬體內微環(huán)境的干細胞培養(yǎng)體系及用途
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于細胞生物學領域，涉及干細胞培養(yǎng)體系，具體涉及一種模擬體內微環(huán)境的干細胞培養(yǎng)體系及其及其在血管損傷修復中的用途，尤其涉及一種模擬體內微環(huán)境的干細胞三維培養(yǎng)體系，該培養(yǎng)體使干細胞維持自我更新、增殖、歸巢及向內皮細胞定向分化，能為干細胞療法促進損傷血管的早期再內皮化的廣泛應用奠定理論基礎及實驗依據(jù)。
【背景技術】
[0002]隨著人口的老齡化和飲食結構的改變，動脈粥樣硬化所導致的心腦血管疾病已成為人類死亡的首要原因；目前臨床治療中，血管成形術及支架植入術等已成為治療心腦血管疾病的重要手段之一。有研究發(fā)現(xiàn)，不論是單純的球囊擴張、金屬裸支架還是藥物涂層支架(DES)，其術后再狹窄和支架內血栓的形成仍有一定的發(fā)生率，部分患者的遠期療效尚不理想；研究還進一步證實，腔內治療術所造成的靶血管管壁內皮細胞損傷并于術后3天大部分脫落，以及藥物支架對損傷血管內皮再生的抑制是導致術后血管再狹窄、血栓形成的重要原因。還有研究亦證實，支架術后再內皮化延遲與晚期血栓形成密切相關。因此，及早恢復損傷血管內皮細胞結構及生物學功能即早期再內皮化對防治腔內治療術后血管再狹窄及血栓形成的發(fā)生具有重要的意義。由于自體分化的內皮細胞來源缺乏，且研究發(fā)現(xiàn)老齡患者受損血管內皮的再生能力下降，因此急需尋找一種新的治療方法來促進損傷血管內皮細胞的再生。
[0003]傳統(tǒng)觀點認 為，血管損傷后修復主要依賴于鄰近成熟內皮細胞的增殖和遷移，但越來越多的研究證實，骨髓和外周血中內皮祖細胞(EPC)歸巢于損傷血管內皮局部，并分化為成熟內皮細胞，參與損傷血管的再內皮化，在血管內皮損傷修復中起重要作用。當前臨床上采集外周血或骨髓干細胞風險較大，且患者多為老年人，其骨髓干細胞及外周血中EPC不僅數(shù)量減少，且增殖分化能力均顯著降低，較難滿足臨床的廣泛應用。所述的胚胎干細胞(ESC)雖然具有較強的增殖分化能力，可在體內外向內皮細胞分化，然而ESC尚存在定向分化及純化的技術障礙，且面臨倫理及免疫排斥反應，移植后有形成畸胎瘤的可能，臨床應用受到一定的限制；因此，目前急需尋找一種“供區(qū)更豐富、損傷更微小、獲取更方便”的新的種子細胞，來促進損傷血管內皮細胞的再生?，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，與自體骨髓和外周血干細胞相比，脂肪組織供區(qū)豐富，間充質干細胞更原始，體外擴增能力更強，向血管內皮、肌肉、骨、神經細胞的分化能力更強，具有更加有效的干細胞特性，且細胞采集方便、免疫源性相對較低，因此，脂肪干細胞(ADSC)有望成為治療內皮損傷性疾病新的種子細胞來源。
[0004]傳統(tǒng)的ADSC培養(yǎng)方法使干細胞單層生長于二維環(huán)境，ADSC雖數(shù)量迅速擴增，但在培養(yǎng)傳代的過程中出現(xiàn)干細胞的去分化或老化現(xiàn)象而失去其原有的細胞表型，干細胞的生長特性及多向分化能力受到極大影響，限制了 ADSC臨床治療的廣泛應用；如何在體外建立適合ADSC生長和多向分化的微環(huán)境對ADSC自我更新及定向分化的研究至關重要。研究發(fā)現(xiàn)，三維培養(yǎng)技術通過模擬體內細胞生長的微環(huán)境，建立細胞之間及胞外基質間的廣泛聯(lián)系，通過形成一定的三維立體結構，促進細胞近似于在機體內的基因表達、胞外基質分泌及細胞生物學功能活性，故其在干細胞再生醫(yī)學及臨床轉化醫(yī)學應用方面有著非常大的發(fā)展前景。
[0005]Bartosh等通過三維培養(yǎng),模擬機體條件的獨特干細胞及其他組織生長技術，使干細胞在一種更接近體內細胞生長環(huán)境的三維培養(yǎng)環(huán)境中生長，結果顯示，細胞結構與生物學功能和在人體中發(fā)現(xiàn)的細胞較為相似。本申請發(fā)明人的前期研究發(fā)現(xiàn)通過模擬體內微環(huán)境的三維培養(yǎng)方法，成功分離出高表達多能轉錄因子Nanog、Sox2及0ct4的脂肪干細胞(3DADSC)。研究還發(fā)現(xiàn)，Nanog、Sox2及Oct-4是維持干細胞多能性和自我更新的轉錄因子，其通過結合靶基因調控區(qū)，選擇性地抑制分化基因表達或促進多能性基因表達。Eiraku等采用微膠囊三維細胞培養(yǎng)技術培養(yǎng)未分化小鼠胚胎干細胞，細胞活力檢測和組織學觀察、以及細胞內0ct4基因的表達，均表明微膠囊中的小鼠胚胎干細胞呈未分化狀態(tài)，且維持了正常的生長形態(tài)，顯示該方法便于胚胎干細胞的大量培養(yǎng)和優(yōu)化。2006年以來，日美科學家利用病毒載體轉染不同轉錄因子(0ct4，Sox2, Klf4，c-Myc等)，成功將體細胞重編程為誘導多能干細胞(iPS)。篩選表達Nanog的iPS，其DNA甲基化水平(包括動態(tài)的去甲基化/重新甲基化狀態(tài))、組蛋白修飾以及基因表達和功能均與ES細胞類似。有學者發(fā)現(xiàn)Nanog、Sox2及0ct4通常只在多能干細胞中表達，在分化細胞中不表達。雖然多能轉錄因子Nanog、Sox2及0ct4是三個很關鍵的核心調控因子，但目前對于其調節(jié)三維培養(yǎng)干細胞自我更新、高度增殖和多向分化的機制仍不清楚，關鍵轉錄因子所介導的信號轉導途徑尚未完全闡明。
[0006]研究發(fā)現(xiàn)血管成形術及支架植入術不可避免的導致血管內皮細胞的損傷，受損的內皮細胞NOS和PGI 2的分泌減少，炎癥細胞浸潤，抗血小板聚集和抗血栓形成的作用減弱，血管平滑肌細胞在內皮缺失的部位移行和過度增殖，導致血管內膜重構從而導致血管再狹窄及血栓形成的發(fā)生；因此，早期快速再內皮化對防治腔內治療術后血管再狹窄及血栓形成的發(fā)生具有重要意義。如何定向調控干細胞向內皮細胞的分化，一直以來都是再生醫(yī)學中的難點。最近，有學者建立了三維球形細胞培養(yǎng)系統(tǒng)，該系統(tǒng)能調控骨髓間充質干細胞分化的相關基因表達，促進骨髓間充質干細胞定向分化，使骨髓間充質干細胞的分化效率大大提高，為工程化三維細胞培養(yǎng)分化效率機制的研究，以及再生醫(yī)學和藥物選擇研究提供有意義的參考依據(jù)。本申請發(fā)明人擬在前期的研究基礎上提供一種模擬體內微環(huán)境的干細胞三維培養(yǎng)體系，使干細胞維持自我更新、增殖、歸巢及向內皮細胞定向分化，以為干細胞療法促進損傷血管的早期再內皮化的廣泛應用提供有參考一級的實驗依據(jù)。

【發(fā)明內容】

[0007]本發(fā)明的目的是提供一種干細胞培養(yǎng)體系，具體涉及一種模擬體內微環(huán)境的干細胞培養(yǎng)體系及其及其在血管損傷修復中的用途，尤其涉及一種模擬體內微環(huán)境的干細胞三維培養(yǎng)體系，該培養(yǎng)體使干細胞維持自我更新、增殖、歸巢及向內皮細胞定向分化，能用于血管損傷修復中，以及為干細胞療法促進損傷血管的早期再內皮化的廣泛應用奠定理論基礎及實驗依據(jù)。
[0008]本發(fā)明在二維培養(yǎng)的ADS的基礎上進一步完善并建立模擬體內微環(huán)境的脂肪干細胞三維培養(yǎng)體系，比較二維培養(yǎng)及3DADSC在正常及低氧環(huán)境下的生物學功能差異，利用EGFP基因示蹤的方法和成像技術，體內移植修復Apo E基因敲除小鼠內皮損傷，從多能轉錄因子表達、生長因子分泌、細胞外基質成分、細胞膜內信號分子活化等多個方面，探討3DADSC維持自我更新、增殖、歸巢及向內皮細胞定向分化的分子機制，為脂肪干細胞療法促進損傷血管的早期再內皮化的廣泛應用奠定理論基礎及實驗依據(jù)。
[0009]本發(fā)明的模擬體內微環(huán)境的干細胞培養(yǎng)體系，其特征在于，利用瓊脂糖構建三維支架材料，并模擬體內微環(huán)境動態(tài)培養(yǎng)干細胞，使干細胞維持自我更新、增殖、歸巢及向內皮細胞定向分化，其包括步驟:
[0010](I)構建干細胞培養(yǎng)的三維支架材料
[0011]稱取瓊脂糖，高溫溶解，低溫冷卻，制備三維膠原支架材料，檢測其硬度及生物相容性；
[0012](2)建立干細胞三維培養(yǎng)體系
[0013]建立一套穩(wěn)定的模擬體內微環(huán)境的干細胞三維培養(yǎng)體系；通過流式分析、免疫熒光、RT-PCR、Elisa等方法鑒定并比較二維和三維培養(yǎng)的干細胞在不同培養(yǎng)條件下的表型、生長特性及旁分泌因子或蛋白的差異；
[0014](3)檢測三維培養(yǎng)干細胞自我更新調控能力
[0015]利用基因芯片技術對二維及三維培養(yǎng)的干細胞進行比較，分析在不同培養(yǎng)條件下干細胞的基因表達差異，利用qRT-PCR、:ffestern blot、Confocal共定位、RNA干擾等技術檢測Nanog、Sox2、0ct4等多能轉錄因子的功能及調控；
[0016](4)測定三維培養(yǎng)脂肪干細胞向內皮細胞誘導分化
[0017]將二維和三維培養(yǎng)的干細胞在不同培養(yǎng)條件下進行多向誘導(內皮、骨、軟骨、月旨肪等)分化，檢測其向內皮細胞誘導分化過程中的細胞表型、標志蛋白表達及再生內皮細胞功能等的差異；
[0018](5)檢測三維培養(yǎng)干細胞向內皮定向分化的調控能力
[0019]利用EGFP基因示蹤二維及三維培養(yǎng)的干細胞體內移植修復Apo E基因缺陷小鼠內皮損傷模型，觀察干細胞的存活、遷移、歸巢及分化，從分子基因、蛋白、細胞與組織水平，檢測三維培養(yǎng)脂肪干細胞自我更新及向內皮細胞定向分化的分子的能力。
[0020]本發(fā)明方法中，步驟(1)中的三維膠原支架材料主要采用瓊脂糖構建，所述瓊脂糖濃度為0.01% -10% ;本發(fā)明的一個實施例中，所述瓊脂糖濃度為0.1% ;
[0021]本發(fā)明方法的步驟(1)中，三維膠原支架材料高溫溶解的溫度為50~200°C ；
[0022]所述三維膠原支架材料低溫冷卻的溫度為-20~20°C ；
[0023]所述三維膠原支架材料其形態(tài)為圓形、方形或不規(guī)則形；
[0024]所述三維膠原支架材料的厚度為1mm~50mm ；
[0025]本發(fā)明方法步驟⑴中，三維膠原支架材料的降解時間為Ih-1年；
[0026]本發(fā)明方法步驟(1)中，三維膠原支架材料培養(yǎng)體系培養(yǎng)的干細胞為各種干細胞，包括成體干細胞、胚胎干細胞和誘導的全能干細胞；
[0027]本發(fā)明方法步驟(5)中，部分標本進行組織學觀察觀察內皮細胞的連續(xù)性及完整性，其方法為HE、油紅、免疫熒光染色或透射電鏡；
[0028]本發(fā)明方法步驟(5)中，通過Western-blot和Realtime-PCR檢測脂肪源細胞快速內皮化。
[0029]本發(fā)明中，比較二維培養(yǎng)及三維干細胞在正常及低氧環(huán)境下的生物學功能差異，利用EGFP基因示蹤的方法和成像技術，體內移植修復Apo E基因敲除小鼠內皮損傷，從多能轉錄因子表達、生長因子分泌、細胞外基質成分、細胞膜內信號分子活化等多個方面，結果顯示:將EGFP轉基因小鼠腹股溝脂肪組織中分離獲得脂肪干細胞經二維及三維培養(yǎng)后，P3代三維培養(yǎng)ADSC成球形立體生長；WB檢測二維及三維培養(yǎng)ADSC表達多能轉錄因子Nanog、Sox2及0ct4的差異，結果顯示，三維培養(yǎng)的ADSC高表達多能轉錄因子；三維培養(yǎng)ADSC向內皮細胞誘導分化CD31免疫熒光染色，及WB檢測二維及三維培養(yǎng)的ADSC誘導后表達CD31的差異，結果顯示，三維培養(yǎng)ADSC具有更高的誘導效率；Apo E基因敲除小鼠動脈粥樣硬化血管內皮損傷后透射電鏡及掃描電鏡檢測，結果顯示，內皮細胞脫落、功能受損，血管平滑肌細胞分泌細胞外基質蛋白導致血管內膜重構；EGFP示蹤三維培養(yǎng)的ADSC修復ApoE小鼠下肢缺血，4w后免疫熒光染色見EGFP脂肪干細胞向損傷區(qū)聚集且再內皮化CD31+ ；檢測結果表明了三維干細胞維持自我更新、增殖、歸巢及向內皮細胞定向分化水水平。
[0030]本發(fā)明能用于血管損傷修復中，以及為干細胞療法促進損傷血管的早期再內皮化的應用奠定理論基礎及實驗依據(jù)。
[0031]為了便于理解，以下將通過具體的附圖和實施例對本發(fā)明進行詳細地描述。需要特別指出的是，具體實例和附圖僅是為了說明，顯然本領域的普通技術人員可以根據(jù)本文說明，在本發(fā)明的范圍內對本發(fā)明做出各種各樣的修正和改變，這些修正和改變也納入本發(fā)明的范圍內。
【專利附圖】

【附圖說明】 [0032]圖1:將EGFP轉基因小鼠腹股溝脂肪組織中分離獲得脂肪干細胞經二維及三維培養(yǎng)后；其中，
[0033]A為P3代EGFP脂肪干細胞，細胞成單層生長，部分老化；
[0034]B為熒光顯微鏡下呈綠色熒光；C、D為P3代三維培養(yǎng)ADSC成球形立體生長；
[0035]圖2:二維及三維培養(yǎng)的ADSC多能轉錄因子Sox2及細胞外基質Fibronectin的免疫熒光染色。
[0036]圖3 =WB檢測二維及三維培養(yǎng)ADSC表達多能轉錄因子Nanog、Sox2及0ct4的差異；其中顯示，三維培養(yǎng)的ADSC高表達多能轉錄因子；
[0037]圖4:三維培養(yǎng)ADSC向內皮細胞誘導分化⑶31免疫熒光染色，及WB檢測二維及三維培養(yǎng)的ADSC誘導后表達⑶31的差異，其中，
[0038]A為三維培養(yǎng)ADSC向內皮細胞誘導分化⑶31免疫熒光染色；
[0039]B為WB檢測二維及三維培養(yǎng)的ADSC誘導后表達⑶31的差異，結果顯示，三維培養(yǎng)ADSC具有更高的誘導效率。
[0040]圖5:Apo E基因敲除小鼠動脈粥樣硬化血管內皮損傷后透射電鏡及掃描電鏡檢測，可見內皮細胞脫落、功能受損(淺色箭頭所示)，血管平滑肌細胞分泌細胞外基質蛋白導致血管內膜重構(深色箭頭所示)。
[0041]圖6:EGFP示蹤三維培養(yǎng)的ADSC修復Apo E小鼠下肢缺血，4w后免疫熒光染色見EGFP脂肪干細胞向損傷區(qū)聚集且再內皮化CD31+ ;其中，
[0042]E為SM染色；F為CD31染色；G為F4/80染色；H為MAC-3染色?！揪唧w實施方式】
[0043]實施例1
[0044]建立模擬體內微環(huán)境的干細胞培養(yǎng)體系，包括以下步驟:
[0045](I)構建干細胞培養(yǎng)的三維支架材料
[0046]稱取瓊脂糖，高溫溶解，低溫冷卻，制備三維膠原支架材料，檢測其硬度及生物相容性；
[0047](2)建立干細胞三維培養(yǎng)體系
[0048]建立一套穩(wěn)定的模擬體內微環(huán)境的干細胞三維培養(yǎng)體系；通過流式分析、免疫熒光、RT-PCR、Elisa等方法鑒定并比較二維和三維培養(yǎng)的干細胞在不同培養(yǎng)條件下的表型、生長特性及旁分泌因子或蛋白的差異；
[0049](3)研究三維培養(yǎng)干細胞自我更新調控機制
[0050]利用基因芯片技術對二維及三維培養(yǎng)的干細胞進行比較，分析在不同培養(yǎng)條件下干細胞的基因表達差異，利用qRT-PCR、:ffestern blot、Confocal共定位、RNA干擾等技術揭示Nanog、Sox2、0ct4等多能轉錄因子的功能及調控機制；
[0051](4)研究 三維培養(yǎng)脂肪干細胞向內皮細胞誘導分化
[0052]將二維和三維培養(yǎng)的干細胞在不同培養(yǎng)條件下進行多向誘導(內皮、骨、軟骨、月旨肪等)分化，揭示其向內皮細胞誘導分化過程中的細胞表型、標志蛋白表達及再生內皮細胞功能等的差異；
[0053](5)研究三維培養(yǎng)干細胞向內皮定向分化的調控機制
[0054]利用EGFP基因示蹤二維及三維培養(yǎng)的干細胞體內移植修復Apo E基因缺陷小鼠內皮損傷模型，觀察干細胞的存活、遷移、歸巢及分化，從分子基因、蛋白、細胞與組織水平，揭示三維培養(yǎng)脂肪干細胞自我更新及向內皮細胞定向分化的分子機制。
[0055]步驟(1)中的三維膠原支架材料主要采用瓊脂糖構建，所述瓊脂糖濃度0.1% ;
[0056]步驟(2)中通過流式分析、免疫熒光、RT-PCR、Elisa等方法鑒定并比較二維和三維培養(yǎng)的干細胞在不同培養(yǎng)條件下的表型、生長特性及旁分泌因子或蛋白的差異；
[0057]步驟(3)中利用基因芯片技術對二維及三維培養(yǎng)的干細胞進行比較，分析在不同培養(yǎng)條件下干細胞的基因表達差異，利用qRT-PCR、:ffestern blot、Confocal共定位、RNA干擾等技術揭示Nanog、Sox2、0ct4等多能轉錄因子的功能及調控機制；
[0058]步驟(4)中將二維和三維培養(yǎng)的干細胞在不同培養(yǎng)條件下進行多向誘導(內皮、骨、軟骨、脂肪等)分化，重點揭示其向內皮細胞誘導分化過程中的細胞表型、標志蛋白表達及再生內皮細胞功能等的差異。
[0059]步驟(5)中利用EGFP基因示蹤二維及三維培養(yǎng)的干細胞體內移植修復Apo E基因缺陷小鼠內皮損傷模型，觀察干細胞的存活、遷移、歸巢及分化，從分子基因、蛋白、細胞與組織水平研究三維培養(yǎng)脂肪干細胞自我更新及向內皮細胞定向分化的分子機制。
[0060]其中，
[0061]步驟(1)中的三維膠原支架材料主要采用瓊脂糖構建，所述瓊脂糖濃度為為
0.1 %;該三維膠原支架材料高溫溶解的溫度為50~200°C，低溫冷卻的溫度為-20~20°C ；所述三維膠原支架材料其形態(tài)為圓形、方形或不規(guī)則形；該三維膠原支架材料的厚度為Imm~50mm,其降解時間為Ih-1年。[0062]三維膠原支架材料培養(yǎng)體系培養(yǎng)的干細胞為各種干細胞，包括成體干細胞、胚胎干細胞和誘導的全能干細胞。
[0063]步驟(5)中，部分標本進行組織學觀察觀察內皮細胞的連續(xù)性及完整性，其方法為HE、油紅、免疫熒光染色或透射電鏡；同時，通過Western-blot和Realtime-PCR探討脂肪源細胞快速內皮化的分子機制。
【權利要求】
1.一種模擬體內微環(huán)境的干細胞培養(yǎng)體系，其特征在于，利用瓊脂糖構建三維支架材料，并模擬體內微環(huán)境動態(tài)培養(yǎng)干細胞，使干細胞維持自我更新、增殖、歸巢及向內皮細胞定向分化；其包括步驟: (1)構建干細胞培養(yǎng)的三維支架材料 稱取瓊脂糖，高溫溶解，低溫冷卻，制備三維膠原支架材料，檢測其硬度及生物相容性； (2)建立干細胞三維培養(yǎng)體系 建立模擬體內微環(huán)境的干細胞三維培養(yǎng)體系；通過流式分析、免疫熒光、RT_PCR、Elisa方法鑒定并比較二維和三維培養(yǎng)的干細胞在不同培養(yǎng)條件下的表型、生長特性及旁分泌因子或蛋白的差異； (3)檢測三維培養(yǎng)干細胞自我更新調控能力 利用基因芯片技術對二維及三維培養(yǎng)的干細胞進行比較，分析在不同培養(yǎng)條件下干細胞的基因表達差異，利用qRT-PCR、=Western blot、Confocal共定位和RNA干擾技術檢測Nanog、Sox2、0ct4多能轉錄因子的功能及調控能力； (4)檢測三維培養(yǎng)脂肪干細胞向內皮細胞誘導分化 將二維和三維培養(yǎng)的干細胞在不同培養(yǎng)條件下進行多向誘導內皮、骨、軟骨、脂肪分化，測定其向內皮細胞誘導分化過程中的細胞表型、標志蛋白表達及再生內皮細胞功能等的差異； (5)檢測三維培養(yǎng)干細胞向內皮定向分化的調控水平 利用EGFP基因示蹤二維及三維培養(yǎng)的干細胞體內移植修復Apo E基因缺陷小鼠內皮損傷模型，觀察干細胞的存活、遷移、歸巢及分化，從分子基因、蛋白、細胞與組織水平，確定三維培養(yǎng)脂肪干細胞自我更新及向內皮細胞定向分化的水平。
2.如權利要求1所述的模擬體內微環(huán)境的干細胞培養(yǎng)體系，其特征在于，所述步驟(1)中，三維膠原支架材料采用瓊脂糖構建，瓊脂糖濃度為0.01% -10%。
3.如權利要求1所述的模擬體內微環(huán)境的干細胞培養(yǎng)體系，其特征在于，所述步驟(1)中，三維膠原支架材料高溫溶解的溫度為50~200°C。
4.如權利要求1所述的模擬體內微環(huán)境的干細胞培養(yǎng)體系，其特征在于，所述步驟(1)中，三維膠原支架材料低溫冷卻的溫度為-20~20°C。
5.如權利要求1所述的模擬體內微環(huán)境的干細胞培養(yǎng)體系，其特征在于，所述步驟(1)中，三維膠原支架材料其形態(tài)為圓形、方形或不規(guī)則形。
6.如權利要求1所述的模擬體內微環(huán)境的干細胞培養(yǎng)體系，其特征在于，所述步驟(1)中，三維膠原支架材料的厚度為1mm~50mm。
7.如權利要求1所述的模擬體內微環(huán)境的干細胞培養(yǎng)體系，其特征在于，所述步驟(1)中，三維膠原支架材料的降解時間為Ih-1年。
8.如權利要求1所述的模擬體內微環(huán)境的干細胞培養(yǎng)體系，其特征在于，所述步驟(1)中，三維膠原支架材料培養(yǎng)體系培養(yǎng)的干細胞為成體干細胞、胚胎干細胞或誘導的全能干細胞。
9.如權利要求1所述的模擬體內微環(huán)境的干細胞培養(yǎng)體系，其特征在于，所述步驟(5)中，采用HE、油紅、免疫熒光染色或透射電鏡方法觀察標本的內皮細胞的連續(xù)性及完整性。
10.權利要求1的模擬體內微環(huán)境的干細胞培養(yǎng)體系在制備修復血管損傷的制劑中的用 途。
【文檔編號】C12N5/0735GK103966161SQ201310041348
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2013年2月1日 優(yōu)先權日:2013年2月1日
【發(fā)明者】陸信武, 秦金保, 葉開創(chuàng), 李祥祥, 楊心蕊, 蔣米爾 申請人:上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院