專利名稱：一種微生物發(fā)酵生產(chǎn)吡咯喹啉醌的方法及所用的發(fā)酵培養(yǎng)基的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物發(fā)酵技術(shù)研究領(lǐng)域，具體的涉及一種微生物發(fā)酵高效生產(chǎn)吡咯喹啉醌(PQQ)的方法及所用的發(fā)酵培養(yǎng)基。
背景技術(shù)：
卩比咯喹啉醌(Pyrroloquinolinequinone,PQQ)是第三類氧化還原酶的輔酶,也是被稱為一種新的維生素，具有多種生理功能，在防治肝損傷和肝中毒、促進神經(jīng)生長因子生成、調(diào)節(jié)自由基水平，抗輻射損傷、心血管疾病和糖尿病等方面有重要醫(yī)用價值。目前PQQ主要是化學(xué)合成法，微生物合成具有清潔低碳、溫和可控、成本低廉等優(yōu)勢，是一種極具潛力的生產(chǎn)方式。影響微生物發(fā)酵生產(chǎn)PQQ大規(guī)模應(yīng)用的主要因素有:(1)適合于工業(yè)生產(chǎn)的微生物不多；(2)文獻(xiàn)報道的PQQ生產(chǎn)菌株生產(chǎn)周期長，產(chǎn)率不高；(3)PQQ作為一種輔酶，并不是微生物的次級代謝產(chǎn)物，其合成調(diào)控受培養(yǎng)條件和代謝調(diào)控的嚴(yán)格制約。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述問題，本發(fā)明的目的是提供一種能使PQQ合成量增加的培養(yǎng)方法和發(fā)酵培養(yǎng)基，摸索一條行之有效的微生物發(fā)酵生產(chǎn)PQQ的控制方法，實現(xiàn)利用甲基營養(yǎng)菌高效生產(chǎn)PQQ的目的。本發(fā)明的另一目的是提供一種發(fā)酵制備所述PQQ的發(fā)酵培養(yǎng)基。為了實現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明提供了一種微生物發(fā)酵生產(chǎn)吡咯喹啉醌的方法，其包括如下步驟:(I)活化菌種:將原始菌種甲基營養(yǎng)菌Methylovorus sp.MP688接種到固體培養(yǎng)基中，在適合原始菌種生長的條件下進行培養(yǎng)，得活化的菌種；(2)種子液的培養(yǎng):將步驟(I)所得活化好的菌種接種到液體培養(yǎng)基中，在適合菌體生長的條件下進行培養(yǎng)，得種子培養(yǎng)液；(3)發(fā)酵罐發(fā)酵:將步驟(2)所得種子培養(yǎng)液按比例接種到含有發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中；發(fā)酵培養(yǎng)過程中溫度恒定，同時，發(fā)酵罐的pH、溶解氧和攪拌轉(zhuǎn)速采用兩階段控制策略；氮源補料采用PH-氮源聯(lián)控方式進行，碳源補料采用間歇補料方式進行；(4)收獲發(fā)酵液，得吡咯喹啉醌。進一步地，本發(fā)明提供了以下優(yōu)選的技術(shù)方案:其中，所述甲基營養(yǎng)菌Methylovorus sp.MP688，已于2010年8月20日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其保藏號為CGMCCN0.4096。(詳細(xì)信息請參見中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所申請的專利號為201010548511.9的發(fā)明專利)。優(yōu)選的，步驟(I)中所述培養(yǎng)溫度為30 35°C，培養(yǎng)時間為2 3天；所述固體培養(yǎng)基為在基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加瓊脂粉和碳源甲醇，所述瓊脂粉在所述固定培養(yǎng)基中的濃度為I 2g/L，所述甲醇在所述固定培養(yǎng)基中的濃度為7.5 15g/L，其中，所述基本培養(yǎng)基的組分及配比如下:基本培養(yǎng)基(以IL計)MgSO4.7H200.4-lg,(NH4)2SO43_5g，KH2PO41.4g,Na2HPO4.12H20 3g,檸檬酸鐵10_30mg，CaCl210_30mg, MnCl2.4H205-lOmg,ZnSO4.7H205-1 Omg,CuSO4.5H200.5_2mg,葉酸0.02-0.05mg,生物素0.02-0.05mg,核黃素0.02-0.05mg,煙酸0.02-0.05mg,硫辛酸0.02-0.05mg。優(yōu)選的，步驟(2)具體步驟為:步驟(I)所得活化好的菌種挑單菌落，接種到5ml液體培養(yǎng)基中30 35°C搖床振蕩，轉(zhuǎn)速為200 250轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)2 3天，然后取I 2ml前述菌液接種至含有IOOml液體培養(yǎng)基的三角瓶中在相同條件下繼續(xù)擴繁培養(yǎng)，直至得到菌株細(xì)胞密度(0D_)為1.2 1.5的種子液；其中，所述液體培養(yǎng)基為在基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加碳源甲醇，所述甲醇在液體培養(yǎng)基中的濃度為7.5 15g/L。其中，所述基本培養(yǎng)基的組分及配比如下:基本培養(yǎng)基(以IL計)MgSO4.7H200.4-lg,(NH4)2SO43_5g，KH2PO41.4g,Na2HPO4.12H20 3g,檸檬酸鐵10_30mg，CaCl210_30mg,MnCl2.4H205-lOmg,ZnSO4.7H205-1 Omg,CuSO4.5H200.5_2mg,葉酸0.02-0.05mg,生物素0.02_0.05mg，核黃素0.02-0.05mg,煙酸0.02-0.05mg,硫辛酸0.02-0.05mg。
優(yōu)選的，步驟(3)中所述種子培養(yǎng)液與發(fā)酵培養(yǎng)基的體積比為1:50 1:10 ;所述的發(fā)酵培養(yǎng)基，具體組成和配比如下:發(fā)酵培養(yǎng)基(以IL計)MgSO4.7H200.4-lg,(NH4)2SO43_5g，KH2PO42.1-2.8g,Na2HPO4.12H20 4.5_6g，檸檬酸鐵30_80mg，CaCl20.05-0.25mg,MnCl2.4H205-lOmg,ZnSO4.7H205-1 Omg,CuSO4.5H200.5-lmg,葉酸0.02-0.05mg。優(yōu)選的， 步驟(3)中所述發(fā)酵溫度為30 35°C，發(fā)酵時間為6 8天。優(yōu)選的，所述的兩階段控制策略的具體為:(I)初期:接種之后發(fā)酵初期通氣量控制在0.02 5vvm，不控制溶解氧，轉(zhuǎn)速控制在200 300rpm，初始pH值調(diào)整為6.5-7.0后，pH值不再控制；(2)后期:隨著細(xì)菌生長，pH值下降，待pH值下降到5.5 6.0時，通過泵反饋流加氨水將PH控制在此水平；待發(fā)酵罐中的溶解氧下降到飽和溶氧的30%時，通過溶解氧與轉(zhuǎn)速和通氣量關(guān)聯(lián)的策略將溶解氧控制在30% 50%的水平，具體為:優(yōu)先調(diào)整轉(zhuǎn)速，所述轉(zhuǎn)速范圍為200 800rpm,當(dāng)轉(zhuǎn)速達(dá)到上限800rpm時,調(diào)整通氣量,所述通氣量范圍是0.2 5vvm。優(yōu)選的，步驟(3)中所述碳源為甲醇，所述氮源為硫酸銨、氨水中的一種或兩種；所述碳源初始濃度為7.5 15g/L，氮源初始濃度7.5 15g/L ;發(fā)酵過程中碳源的總濃度控制在15g/L以內(nèi)，硫酸銨的總濃度控制在3g/L以內(nèi)；所述pH-氮源聯(lián)控方式為當(dāng)發(fā)酵液pH值隨著細(xì)菌生長下降到6.0時啟動氮源補料程序，通過流加方式進行氮源補料，所述的氮源補料液為0.10 0.25g/ml的氨水或硫酸銨；在線監(jiān)測細(xì)菌的生長速率和氮源補料量曲線，一旦細(xì)菌的生長速率或者氮源補料速率與上一時間段相比有降低，通過間歇補料方式加入碳源甲醇，補料量為每升發(fā)酵液加入5 15g甲醇；所述甲醇為工業(yè)甲醇或分析純。優(yōu)選的，步驟(4)的發(fā)酵液按照武漢大學(xué)趙永芳等專利《吡咯喹啉醌的提取方法》制備吡咯喹啉醌產(chǎn)品(專利授權(quán)號為CN1138776C)。吡咯喹啉醌含量的測定參照Geiger0.等人 1987 年的文獻(xiàn) Enzymatic determination of pyrroloquinoline quinone usingcrude membranes from Escherichia coli。進一步地，本發(fā)明提供了一種吡咯喹啉醌，其是由上述方法生產(chǎn)得到。更進一步地，本發(fā)明提供了一種發(fā)酵培養(yǎng)基，具體組成和配比如下:發(fā)酵培養(yǎng)基(以IL計)MgSO4.7H200.4-lg,
(NH4)2SO43_5g，KH2PO42.1-2.8g,Na2HPO4.12H20 4.5_6g，檸檬酸鐵30_80mg，CaCl20.05-0.25mg,MnCl2.4H205-lOmg,ZnSO4.7H205-lOmg,CuSO4.5H200.5-lmg,葉酸0.02-0.05mg。更進一步地，本發(fā)明提供了上述發(fā)酵培養(yǎng)基在生產(chǎn)吡咯喹啉醌中的應(yīng)用。本發(fā)明的有益效果如下:本發(fā)明采用發(fā)酵培養(yǎng)基，有利于甲基營養(yǎng)菌快速高效的合成吡咯喹啉醌，組分為無機鹽，無復(fù)雜的有機物，因此成本低廉，適合工業(yè)放大生產(chǎn)。本發(fā)明發(fā)酵培養(yǎng)過程中溫度恒定，發(fā)酵罐的pH、溶解氧和攪拌轉(zhuǎn)速采用兩階段控制策略；通過限制溶解氧(30-50%)和控制弱酸性環(huán)境(pH5.5-6.0)，將細(xì)菌生長速率維持在較低水平(低于20D_/24小時)，來協(xié)調(diào)細(xì)菌生長與PQQ的合成兩個過程，使碳源代謝流更多的流向合成PQQ的途徑，從而得到高產(chǎn)量的PQQ;同時，通過PH-氮源聯(lián)控方式進行氮源補料，通過間歇補料方式進行碳源補料，使發(fā)酵過程最優(yōu)。本發(fā)明在7.5L自動發(fā)酵罐中培養(yǎng)6天最終細(xì)胞密度(OD6tltl)超過10，PQQ產(chǎn)量達(dá)到了 2g/L，PQQ生產(chǎn)強度為333.33mg/L/天，產(chǎn)量和生產(chǎn)強度超過已有文獻(xiàn)報道的最高值，并縮短了發(fā)酵周期；同時，本發(fā)明操作簡單，便于實現(xiàn)自動控制和連續(xù)發(fā)酵，為使用甲基營養(yǎng)菌工業(yè)化生產(chǎn)PQQ奠定了堅實的基礎(chǔ)。


圖1本發(fā)明發(fā)酵生產(chǎn)PQQ的結(jié)果。圖中:.表示細(xì)菌生長曲線，■表示PQQ合成曲線。
具體實施例方式下面結(jié)合附圖及其具體實施方式
詳細(xì)介紹本發(fā)明。但本發(fā)明的保護范圍并不局限于以下實例，應(yīng)包含權(quán)利要求書中的全部內(nèi)容。以下實施例中所使用的藥品，購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司，藥品級別為分析純；實施例中使用的儀器均為生物實驗室常規(guī)儀器，所用的發(fā)酵罐型號為B10STARBplus, Germany。實施例1甲基營養(yǎng)菌Methylovorus sp.MP688的活化Methylovorus sp.MP688保藏于中國普通微生物菌種保藏中心CGMCC4096,是一株P(guān)QQ產(chǎn)量達(dá)到生產(chǎn)水平的菌株。用原始菌株(甘油保藏或者凍干 狀態(tài))在固體培養(yǎng)基平板上劃線，30°C培養(yǎng)2天；挑單菌落，接種到5ml液體培養(yǎng)基中，30°C，搖床200轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)48小時作為活化種子。所述固體培養(yǎng)基為在基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加瓊脂粉和碳源甲醇，所述瓊脂粉在所述固定培養(yǎng)基中的濃度為lg/L ;所述液體培養(yǎng)基為在基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加碳源甲醇；其中所述甲醇在固定培養(yǎng)基或液體培養(yǎng)基中的濃度為10g/L ;所述基本培養(yǎng)基的組分及配比如下:基本培養(yǎng)基(以IL計)MgSO4.7H200.4-lg,(NH4)2SO43_5g，KH2PO41.4g,Na2HPO4.12H203g,檸檬酸鐵30mg，CaCl230mg,MnCl2.4H205mg,ZnSO4.7H205mg,CuSO4.5H200.5mg,葉酸0.02mg,生物素0.02mg，核黃素0.05mg,煙酸 0.05mg，硫辛酸0.05mg。實施例2種子液的制備取實施例1得到的菌液2ml，并接種至含有IOOml液體培養(yǎng)基的三角瓶，30°C，搖床200轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)36小時，同樣條件下活化1-2次，使最終細(xì)密度(0D_)為1.2 1.5，制成種子液。所用液體培養(yǎng)基同實施例1。實施例3在5L全自動發(fā)酵罐中進行PQQ生產(chǎn)實例A用實施例2的種子液，按照1:20的比例接種到7.5L自動發(fā)酵罐中。接種后發(fā)酵初期通氣量控制在lvvm，攪拌轉(zhuǎn)速控制在300rpm，溫度控制在0°C，初始pH值設(shè)為7.0 ;所述碳源甲醇初始濃度為7.5g/L，氮源硫酸銨初濃度15g/L ;所述的發(fā)酵培養(yǎng)基，具體組成和配比如下:發(fā)酵培養(yǎng)基(以IL計)MgSO4.7H200.4g,(NH4)2SO43g，KH2PO42.8g,Na2HPO4.12H20 6g,檸檬酸鐵60mg，CaCl20.05mg,MnCl2.4H205mg,ZnSO4.7H205mg,CuSO4.5H200.5mg,葉酸0.02mg。隨著細(xì)菌生長，pH值下降，待下降到6.0時，通過泵反饋流加氨水將pH控制在此水平；待發(fā)酵罐中的溶解氧下降到飽和溶氧的40%時，通過溶解氧與攪拌轉(zhuǎn)速和通氣量關(guān)聯(lián)的策略將溶解氧控制在40%的水平，攪拌轉(zhuǎn)速調(diào)整優(yōu)先(800rpm上限)，轉(zhuǎn)速達(dá)到上限時調(diào)整通氣量，通氣量最大設(shè)置為5vvm。采用pH-氮源聯(lián)控技術(shù)實現(xiàn)氮源氨水的補料，補料液濃度為0.15g/ml ;在線監(jiān)測細(xì)菌的生長速率，當(dāng)細(xì)菌12小時內(nèi)的生長速率曲線與前12小時生長速率降低時，通過間歇補料方式加入碳源甲醇，補料量為每升發(fā)酵液加入IOg甲醇；所述的碳源補料液，具體為工業(yè)甲醇或分析純。每12小時記錄和計算細(xì)胞密度(OD6tltl)和PQQ產(chǎn)量。在這種發(fā)酵條件下，經(jīng)過6天的培養(yǎng)，最終細(xì)胞密度(0D_)可達(dá)到或超過10，PQQ產(chǎn)量達(dá)到或超過2g/L，PQQ生產(chǎn)強度至少為333.33mg/L/天，具體結(jié)果可參見圖1。實施例4在5L全自動發(fā)酵罐中進行PQQ生產(chǎn)實例B用實施例2的種子液和實施例3中的發(fā)酵培養(yǎng)基組成和配比，按照1:50的比例接種到7.5L自動發(fā)酵罐中。接種之后發(fā)酵初期通氣量控制在lvvm，攪拌轉(zhuǎn)速控制在300rpm，溫度控制在30°C，初始pH值設(shè)為6.5后不再控制；所述碳源甲醇初始濃度為7.5g/L，氮源硫酸銨初始濃度15g/L。隨著細(xì)菌生長，pH值下降，待下降到5.8時，通過泵反饋流加氨水將pH控制在此水平；待發(fā)酵罐中的溶解氧下降到飽和溶氧的30%時，通過溶解氧與攪拌轉(zhuǎn)速和通氣量關(guān)聯(lián)的策略將溶解氧控制在30% 的水平，攪拌轉(zhuǎn)速調(diào)整優(yōu)先(800rpm上限)，轉(zhuǎn)速達(dá)到上限時調(diào)整通氣量，通氣量最大設(shè)置為5vvm。采用pH-氮源聯(lián)控技術(shù)實現(xiàn)氮源氨水的補料，補料液濃度為0.15g/ml ;在線監(jiān)測細(xì)菌的生長速率，當(dāng)細(xì)菌12小時內(nèi)的生長速率曲線與前12小時生長速率降低時，通過間歇補料方式加入碳源甲醇，補料量為每升發(fā)酵液加入IOg甲醇；所述的碳源補料液，具體為工業(yè)甲醇或分析純。每12小時記錄和計算細(xì)胞密度(OD6tltl)和PQQ產(chǎn)量。在這種發(fā)酵條件下，經(jīng)過6天的培養(yǎng)，最終細(xì)胞密度(0D_)可達(dá)到或超過10，PQQ產(chǎn)量達(dá)到或超過lg/L，PQQ生產(chǎn)強度至少為166.67mg/L/天。實施例5在5L全自動發(fā)酵罐中進行PQQ生產(chǎn)實例C用實施例2的種子液和實施例3中的發(fā)酵過程的全部參數(shù)控制，改變所用發(fā)酵培養(yǎng)基，具體組成和配比如下:MgSO4.7H20lg,(NH4)2SO45g，KH2PO42.lg,Na2HPO4.12H20 4.5g,檸檬酸鐵80mg，CaCl20.1 mg,MnCl2.4H205mg，ZnSO4.7H205mg，CuSO4.5H200.5mg，葉酸0.05mg。在這種發(fā)酵條件下，經(jīng)過6天的培養(yǎng)，最終細(xì)胞密度(0D_)可達(dá)到或超過10，PQQ產(chǎn)量達(dá)到或超過1.5g/L，PQQ生產(chǎn)強度至少為250mg/L/天。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明技術(shù)原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護范圍。
權(quán)利要求
1.一種微生物發(fā)酵生產(chǎn)吡咯喹啉醌的方法，其特征在于，包括如下步驟: (1)活化菌種:將原始菌種甲基營養(yǎng)菌Methylovorussp.MP688接種到固體培養(yǎng)基中，在適合原始菌種生長的條件下進行培養(yǎng)，得活化的菌種； (2)種子液的培養(yǎng):將步驟(I)所得活化好的菌種接種到液體培養(yǎng)基中，在適合菌體生長的條件下進行培養(yǎng)，得種子培養(yǎng)液； (3)發(fā)酵罐發(fā)酵:將步驟(2)所得種子培養(yǎng)液按比例接種到含有發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中；發(fā)酵培養(yǎng)過程中溫度恒定，同時，發(fā)酵罐的pH、溶解氧和攪拌轉(zhuǎn)速采用兩階段控制策略；氮源補料采用PH-氮源聯(lián)控方式進行，碳源補料采用間歇補料方式進行； (4)收獲發(fā)酵液，得吡咯喹啉醌。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(I)中所述培養(yǎng)溫度為30 35°C，培養(yǎng)時間為2 3天；所述固體培養(yǎng)基為在基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加瓊脂粉和碳源甲醇，所述瓊脂粉在所述固定培養(yǎng)基中的濃度為I 2g/L，所述甲醇在所述固定培養(yǎng)基中的濃度為.7.5 15g/L，其中，所述基本培養(yǎng)基的組分及配比如下: 基本培養(yǎng)基(以IL計) MgSO4.7H200.4-lg, (NH4)2SO43-5g， KH2PO41.4g， Na2HPO4.12H20 3g, 檸檬酸鐵10-30mg， CaCl210-30mg, MnCl2.4H205-10mg, ZnSO4.7H205-1Omg， CuSO4.5H200.5_2mg， 葉酸0.02-0.05mg， 生物素 0.02-0.05mg, 核黃素 0.02-0.05mg, 煙酸 0. 02-0.05mg, 硫辛酸 02-0.05mg。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(2)具體步驟為:步驟(I)所得活化好的菌種挑單菌落，接種到5ml液體培養(yǎng)基中30 35°C搖床振蕩，轉(zhuǎn)速為200-250轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)2 3天，然后取I 2ml前述菌液接種至含有IOOml液體培養(yǎng)基的三角瓶中在相同條件下繼續(xù)擴繁培養(yǎng)，直至得到菌株細(xì)胞密度(OD6tltl)為1.2 1.5的種子液；其中，所述液體培養(yǎng)基為在基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加碳源甲醇，所述甲醇在液體培養(yǎng)基中的濃度為7.5 15g/L。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(3)中所述種子培養(yǎng)液與發(fā)酵培養(yǎng)基的體積比為1:50 1:10 ;所述的發(fā)酵培養(yǎng)基，具體組成和配比如下: 發(fā)酵培養(yǎng)基(以IL計) MgSO4.7H200.4-lg, (NH4)2SO43-5g，KH2PO42.1-2.8g, Na2HPO4.12H20 4.5_6g， 梓檬酸鐵30_80mg, CaCl20.05-0.25mg, MnCl2.4H205-10mg, ZnSO4.7H205-1Omg， CuSO4.5H200.5-lmg, 葉酸0.02-0.05mg。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(3)中所述發(fā)酵溫度為30 35°C，發(fā)酵時間為6 8天。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(3)中所述的兩階段控制策略的具體為: (O初期:接種之后發(fā)酵初期通氣量控制在0.02 5vvm，不控制溶解氧，轉(zhuǎn)速控制在200 300rpm，初始pH值調(diào)整為6.5-7.0后，pH值不再控制； (2)后期:隨著細(xì)菌生長，pH值下降，待pH值下降到5.5 6.0時，通過泵反饋流加氨水或者硫酸銨將PH控制在此水平； 待發(fā)酵罐中的溶解氧下降到飽和溶氧的30%時，通過溶解氧與轉(zhuǎn)速和通氣量關(guān)聯(lián)的策略將溶解氧控制在30% 50%的水平，具體為:優(yōu)先調(diào)整轉(zhuǎn)速，所述轉(zhuǎn)速范圍為200 800rpm,當(dāng)轉(zhuǎn)速達(dá)到上限800rpm時,調(diào)整通氣量,所述通氣量范圍是0.2 5vvm。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(3)中所述碳源為甲醇，所述氮源為硫酸銨、氨水中的一種或兩種；所述碳源初始濃度為7.5 15g/L，氮源初始濃度7.5 15g/L ;發(fā)酵過程中碳源的總濃度控制在15g/L以內(nèi),硫酸銨的總濃度控制在3g/L以內(nèi)； 所述PH-氮源聯(lián)控方式為當(dāng)發(fā)酵液pH值隨著細(xì)菌生長下降到6.0時啟動氮源補料程序，通過流加方式進行氮源補料，通過流加補料液進行氮源補料，所述的氮源補料液為0.10-0.25g/ml的氨水或硫酸銨； 在線監(jiān)測細(xì)菌的生長速率和氮源補料量曲線，一旦細(xì)菌的生長速率或者氮源補料速率與上一時間段相比有降低，通過間歇補料方式加入碳源甲醇，補料量為每升發(fā)酵液加入5 15g甲醇；所述甲醇為工業(yè)甲醇或分析純。
8.—種吡咯喹啉醌，其特征在于，其是由權(quán)利要求1 7任意一項所述方法生產(chǎn)制備得到。
9.一種發(fā)酵培養(yǎng)基，其特征在于，該培養(yǎng)基的具體組成和配比如下: 發(fā)酵培養(yǎng)基(以IL計) MgSO4.7H200.4-lg, (NH4)2SO43-5g， KH2PO42.1-2.8g, Na2HPO4.12H20 4.5_6g， 梓檬酸鐵30_80mg, CaCl20.05-0.25mg， MnCl2.4H205-10mg，ZnSO4.7H205-10mg，CuSO4.5H200.5-lmg,葉酸0.02-0.05mg。
10.權(quán)利要求9所述的培養(yǎng)基在生產(chǎn)制`備吡咯喹啉醌中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種微生物發(fā)酵生產(chǎn)吡咯喹啉醌的方法和所用發(fā)酵培養(yǎng)基。采用控氧發(fā)酵培養(yǎng)法培養(yǎng)甲基營養(yǎng)菌，發(fā)酵培養(yǎng)基中含有的碳源為甲醇、氮源為硫酸銨，在發(fā)酵過程中分階段控制溶解氧水平為飽和溶氧的30-50%，通過補料控制pH在5.5-6.0，通過pH-氮源聯(lián)控技術(shù)實現(xiàn)補料，在7.5L發(fā)酵罐中培養(yǎng)6天最終細(xì)胞密度(OD600)超過10，PQQ產(chǎn)量達(dá)到了2g/L，PQQ生產(chǎn)強度為333.33mg/L/天，本發(fā)明操作簡單，便于實現(xiàn)自動控制和連續(xù)發(fā)酵，為使用甲基營養(yǎng)菌工業(yè)化生產(chǎn)吡咯喹啉醌奠定了堅實的基礎(chǔ)。
文檔編號C12P17/18GK103224965SQ20131010293
公開日2013年7月31日 申請日期2013年3月27日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月27日
發(fā)明者葛欣, 張惟材, 熊向華, 汪建華 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所