專利名稱：：一種動(dòng)物用長效狂犬病疫苗及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：-.本發(fā)明屬于動(dòng)物免疫疫苗制備
技術(shù)領(lǐng)域：
，尤其是提供一種動(dòng)物用長效狂犬病疫苗及其制備方法，利用復(fù)制缺陷性逆轉(zhuǎn)錄病毒為載體，通過改造，克隆進(jìn)狂犬病病毒糖蛋白基因的表達(dá)盒，通過轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞獲得的重組病毒，以該重組病毒溶液免疫動(dòng)物，可使被免疫動(dòng)物產(chǎn)生長期免疫保護(hù)的新型狂犬病疫苗。技術(shù)背景-狂犬病是由狂犬病病毒感染引起的一種重要人獸共患傳染病，一旦發(fā)病，即可導(dǎo)致100%死亡。我國每年因狂犬病死亡的人數(shù)在20003000例之間。人狂犬病的發(fā)生均由動(dòng)物咬傷引起，現(xiàn)行的用于動(dòng)物狂犬病預(yù)防的疫苗包括滅活疫苗和弱毒疫苗，滅活疫苗雖然免疫效果較好，但是一般在制備時(shí)需要進(jìn)行濃縮，成本較高，由于免疫期較短，通常每年進(jìn)行一次加強(qiáng)免疫，這在實(shí)際使用中尤其是在廣大的農(nóng)村地區(qū)存在使用不方便等問題；弱毒活疫苗制備容易，但在易感動(dòng)物體內(nèi)存在毒力返祖的潛在可能，對(duì)于生態(tài)環(huán)境和人類健康都是嚴(yán)重的威脅。近年來，采用基因工程等手段，相繼研制了一系列的狂犬病亞單位疫苗、多肽疫苗、抗獨(dú)特性抗體疫苗、重組活載體疫苗和DNA疫苗等。這些疫苗均以狂犬病病毒糖蛋白或其部分為目的抗原，應(yīng)用時(shí)安全，并具有一定的免疫保護(hù)效果。但是這些疫苗誘導(dǎo)的抗體免疫應(yīng)答往往持續(xù)時(shí)間較短，由于犬具有較長的生命周期，需要進(jìn)行多次再免疫或加強(qiáng)免疫。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種動(dòng)物用長效狂犬病疫苗，可以對(duì)犬和貓?zhí)峁╅L期的狂犬病免疫保護(hù)作用，具有免疫時(shí)間長的特點(diǎn)。本發(fā)明還提供上述動(dòng)物用長效狂犬病疫苗的制備方法，以逆轉(zhuǎn)錄病毒為載體，將狂犬病病毒保護(hù)性抗原基因克隆到逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的兩個(gè)長末端重復(fù)序列中間，通過轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞獲得重組病毒，制成疫苗。本發(fā)明的長效狂犬病疫苗，可用下述方法得到以復(fù)制缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒為載體，表達(dá)狂犬病病毒糖蛋白基因，通過擴(kuò)大培養(yǎng)重組病毒制成疫苗。本發(fā)明動(dòng)物用長效狂犬病疫苗的制備方法如下將狂犬病病毒糖蛋白基因表達(dá)盒克隆入商品化的復(fù)制缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，通過商品化的轉(zhuǎn)染試劑，在敏感細(xì)胞中包裝重組病毒，通過轉(zhuǎn)染細(xì)胞的藥物篩選和擴(kuò)大培養(yǎng)，收集細(xì)胞培養(yǎng)物制成疫苗。重組病毒在感染機(jī)體后，其基因組會(huì)整合到宿主基因組中，在整合甜后均可持續(xù)表達(dá)狂犬病病毒糖蛋白，從而刺激機(jī)體產(chǎn)生長期的狂犬病保護(hù)性抗體。本疫苗可用于犬、貓、小鼠多種哺乳動(dòng)物的狂犬病預(yù)防，并能提供長期有效的免疫保護(hù)。具體步驟制備方法如下1.狂犬病病毒糖蛋白cDNA的獲得狂犬病病毒糖蛋白cDNA可通過常規(guī)的RT-PCR技術(shù)，由任一狂犬病病毒株獲得，如狂犬病病毒SRV9株的糖蛋白cDNA全長1575bp，將RT-PCR產(chǎn)物克隆入pMD18-T載體中，進(jìn)行序列測(cè)定。2.狂犬病病毒糖蛋白表達(dá)盒的構(gòu)建以PWI和Wo/I酶切位點(diǎn)，將糖蛋白基因克隆入pVAXl載體，獲得重組質(zhì)粒pVAX-G，該重組質(zhì)粒中含有狂犬病病毒糖蛋白的表達(dá)盒。3.重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建將含有狂犬病病毒糖蛋白及CMV啟動(dòng)子的表達(dá)盒通過^W7"I和M/I雙酶切，獲得狂犬病病毒糖蛋白表達(dá)盒片段，采用Klenow大片段酶和dNTPs對(duì)該片段進(jìn)行補(bǔ)平。同時(shí)，制備質(zhì)粒pLCNL，以BamHI酶切該質(zhì)粒，采用Klenow大片段酶和dNTPs對(duì)載體部分進(jìn)行補(bǔ)平。通過T4DNA連接酶連接兩條片段，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌JM109，獲得重組質(zhì)粒pLCN-G。4.狂犬病病毒糖蛋白-重組逆轉(zhuǎn)錄病毒的獲得以含有10。/。小牛血清的MEM培養(yǎng)基按照常規(guī)方法培養(yǎng)PA317細(xì)胞。轉(zhuǎn)染前一天進(jìn)行傳代，第二天長成單層時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染步驟取上述的狂犬病病毒糖蛋白-重組逆轉(zhuǎn)錄病毒重組質(zhì)粒4微克，溶解在0.5毫升的無血清培養(yǎng)基中，同時(shí)取50微升脂質(zhì)體(Lipofectamine),混入0.5毫升無血清培養(yǎng)基中，將含質(zhì)粒的培養(yǎng)基和含有脂質(zhì)體的培養(yǎng)基混合，室溫孵育20分鐘，將轉(zhuǎn)染混合液加到長滿單層的PA317細(xì)胞上。37"感作6小時(shí)，棄轉(zhuǎn)染液，加入含有10n/。小牛血清和適量抗生素的MEM完全培養(yǎng)基，同時(shí)加入350-400微克/ml的G418(Geneticin)，37。C維持2周，期間可以根據(jù)細(xì)胞生長情況適時(shí)換液，待形成克隆時(shí)，將克隆移至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，長成單層后逐歩5擴(kuò)大培養(yǎng)至細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，對(duì)部分細(xì)胞凍存以保留重組病毒毒種。其他部分用于收集細(xì)胞培養(yǎng)上清和細(xì)胞裂解液，作為重組疫苗溶液。5.重組疫苗的使用對(duì)狂犬病病毒糖蛋白-重組逆轉(zhuǎn)錄病毒進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)以后，按每個(gè)劑量l-2毫升，肌肉注射或口服免疫犬、貓和小鼠等哺乳動(dòng)物，只需免疫一次。免疫后采集血清，進(jìn)行狂犬病中和抗體測(cè)定，當(dāng)中和抗體水平降至0.5IU/ml以下時(shí)，再以相同劑量加強(qiáng)免疫一次。該重組疫苗可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生良好的體液免疫應(yīng)答，抗體陽轉(zhuǎn)率100%，免疫動(dòng)物80%以上可以抵抗狂犬病病毒的致死性感染。本發(fā)明的積極效果在于以復(fù)制缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒為載體，該載體在形成病毒感染機(jī)體以后可以整合到宿主細(xì)胞的染色體內(nèi)；以表達(dá)狂犬病病毒糖蛋白的表達(dá)盒作為外源性目的基因，該目的基因表達(dá)的蛋白可刺激機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)狂犬病病毒的免疫應(yīng)答；通過轉(zhuǎn)化逆轉(zhuǎn)錄病毒的包裝細(xì)胞，可以持續(xù)產(chǎn)生重組病毒，以重組病毒免疫動(dòng)物，可使動(dòng)物獲得長期的針對(duì)狂犬病的免疫保護(hù)效果。本重組疫苗適用動(dòng)物范圍廣泛，使用安全，誘導(dǎo)的免疫有效期持續(xù)時(shí)間長，是一種長效的預(yù)防狂犬病的新型疫苗。圖l.狂犬病病毒糖蛋白基因表達(dá)盒的構(gòu)建(在糖蛋白基因上游具有巨細(xì)胞病毒早期啟動(dòng)子CMV);圖2重組質(zhì)粒pLNC-G構(gòu)建流程圖。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一歩說明實(shí)施例l狂犬病病毒糖蛋白-重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建含lacZ基因的pLNCL載體及質(zhì)粒載體pVAX-G，由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建保存；包裝細(xì)胞系PA317，大腸桿菌(五.co/Z)JM109，以商品購進(jìn)，本實(shí)驗(yàn)室保存。重組質(zhì)粒構(gòu)建的主要過程為(1)Bmn//I酶切pLNCL后，回收5812bp的線性化片段，Klenow酶補(bǔ)平，而后用堿性磷酸酶(CIAP)對(duì)其進(jìn)行脫磷酸作用，從而得到兩端均為平端的pLNCX空載體。(2)&^//1、MAI和Af/wI三酶并用對(duì)pVAX-G進(jìn)行酶切，回收2326bp片段，同樣用Klenow酶補(bǔ)平，從而得到兩狂犬病病毒SRV9株G蛋白基因的核酸片段。(3)將2326bp含有狂犬病病毒SRV9株G蛋白基因的核酸片段用T4DNALigase連接到pLNCX空載體中，從而得到重組質(zhì)粒pLNC-G。具體操作與結(jié)果(1)酶切與回收①用BamHI酶切pLNCL，酶切體系如下BamHI1^1buffer5^1pLNCL15^1四餾水29…50|ul作用2個(gè)小時(shí)后，在體系中加入1^1dNTP和0.5plKlenow酶，在37'C水浴中作用30分鐘使其載體兩端補(bǔ)平，之后在75'C水浴中作用20分鐘使其Klenow酶滅活，之后再向體系中加入0.5^1CIAP，在37'C水浴作用30分鐘，對(duì)載體進(jìn)行脫磷酸作用。用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒回收5812bp的線性化片段。②5^/n、A^I和M/wI三酶并用對(duì)其pVAX-G進(jìn)行酶切。具體體系如下淑IlplM/wI1^1~沼1^1buffer5|ulBSA5^1pVAX-G15pl四餾水_22^15(^1先加入&p/n酶，讓其單獨(dú)對(duì)體系作用40分鐘后，再加入另外兩個(gè)酶對(duì)體系在消化兩個(gè)小時(shí)，使體系充分反應(yīng)后，在體系中加入dNTP和0.5plKlenow酶，37"作用半個(gè)小時(shí)，使片段兩端補(bǔ)平，再將體系放入75X:水浴，消化20分鐘。用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒回收2326bp的線性化片段。(2)連接取純化回收產(chǎn)物，按載體與片段1:3比例連接，連接體系如下T4DNALigasebuffer1^1DNA片段6nlVector2^1T4DNALigase__于16'C低溫連接過夜。(3)轉(zhuǎn)化無菌條件下取連接產(chǎn)物9pl，加入10(^1JM109感受態(tài)細(xì)胞中，混合均勻，冰浴放置30分鐘(冰水混合物);42T:、90秒，迅速轉(zhuǎn)入冰浴維持5分鐘;加400(ilLB培養(yǎng)基，37°。搖床上培養(yǎng)30分鐘，4000r/min離心3分鐘，棄400pl上清，用剩下的100(il培養(yǎng)基重新懸浮沉淀;將菌液均勻涂布于含氨芐青霉素抗性的LB固體培養(yǎng)基待吸收后，將其置于37'C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16h。(4)挑斑隨機(jī)挑取生長與LB平板上的8個(gè)白色菌落(共8個(gè))，分別接種于含Amp的LB液體培養(yǎng)基中，37'C搖床振蕩過夜。(5)重組質(zhì)粒pLNC-G的提取小量質(zhì)粒提取按常規(guī)方法進(jìn)行操作(6)重組質(zhì)粒pLNC-G的酶切鑒定將陽性重組質(zhì)粒分別用三組酶作酶切進(jìn)行鑒定，酶切反應(yīng)體系如下0.5pl2.￡c。WI0.5nl3.I0.5^1buffer1.5plbuffer1.5nlbuffer1.5|_dBSA1.5iulBSA.5^1BSAi.5nl重組質(zhì)粒4pl巫組質(zhì)?；痩歪組質(zhì)粒4^1四餾水7.5|_il四餾水7.5ul四餾水7.5ul15nl15pl15pl混勻瞬時(shí)離心后，于37'C水浴消化lh，反應(yīng)結(jié)束后用1%瓊脂糖凝膠電泳檢査結(jié)果。5YwI酶切重組質(zhì)粒后，將其線性化為8138bp;^W7//I酶切重組質(zhì)粒后，出現(xiàn)705bp和7433bp兩條片段；五coiI酶切重組質(zhì)粒后，出現(xiàn)1613bp、1911bp和4614bp三條片段。實(shí)施例2重組病毒的包裝用0.20.7g/L不同濃度的G418，測(cè)定G418對(duì)于包裝細(xì)胞系PA317的最小致死劑量。參照Lipofectamine2000的說明書，以脂質(zhì)體為介質(zhì)，將重組病毒載體導(dǎo)入包裝細(xì)胞系PA317。并以最小致死量的G418進(jìn)行篩選。(1)PA317對(duì)G418最小致死劑量的測(cè)定及其結(jié)果24孔板接種適量的PA317細(xì)胞，待細(xì)胞長成75%匯片時(shí)，加入含有不同濃度的G418(0.2、0.3、0.35、0.4、0.5、0.6、0.7g/L)選擇培養(yǎng)液，每個(gè)梯度設(shè)置三個(gè)重復(fù)，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照。每3天換液一次，1014天根據(jù)細(xì)胞死亡情況確定G418對(duì)于PA3178細(xì)胞的最小致死濃度。在第10天觀察發(fā)現(xiàn)G418濃度為400|ag/ml壓力下的細(xì)胞已剩下極少存活，兩周時(shí)間可以完全死亡，而在小于此壓力下的細(xì)胞還有極少數(shù)存活，但到第14天也均不能形成克隆。(2)脂質(zhì)體介導(dǎo)的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)染PA317細(xì)胞質(zhì)粒DNA經(jīng)苯酚/氯仿反復(fù)抽提，OD26Q/OD28Q=1.8,用前過濾除菌。取30ml細(xì)胞培養(yǎng)瓶中處于旺盛生長期的PA317細(xì)胞傳至12孔板中的兩個(gè)孔(一個(gè)用做轉(zhuǎn)染，一個(gè)作對(duì)照)，37°C，5%C02飽和濕度條件下培養(yǎng)12小時(shí)，待細(xì)胞長成75%單層時(shí)，準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染。脂質(zhì)體/DNA復(fù)合物的制備在1.5ml無菌Eppendorf管中配置A液將6plDNA稀釋于200W無血清無雙抗的DMEM營養(yǎng)液中。在青霉素小瓶中配置B液將8^1LipofectamineTM2000稀釋于200pl無血清無雙抗的DMEM營養(yǎng)液中。待A液與B液分別作用5分鐘后，將A液加到含B液的小瓶中，輕微震蕩，充分混勻后，室溫放置30分鐘。在DNA和脂質(zhì)體作用過程中，將75%單層細(xì)胞用無血清無雙抗的DMEM營養(yǎng)液清洗三次，加入lml無血清無雙抗的DMEM營養(yǎng)液。將作用完畢的DNA/Lipofectamine混合物，加入到細(xì)胞上清中，輕晃搖勻，37°C，5%C02，飽和濕度培養(yǎng)12小時(shí)后，換入5%血清的DMEM營養(yǎng)液。(3)G418抗性細(xì)胞的篩選轉(zhuǎn)染后的PA317細(xì)胞在37°C，5%C02飽和濕度培養(yǎng)36h后，將細(xì)胞按1:5，分傳至12孔板中，空白對(duì)照也同樣按1:5分傳至12孔板中。12h后，待轉(zhuǎn)染孔細(xì)胞貼壁后，加入終濃度400pg/mlG418的DMEM營養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。同時(shí)空白對(duì)照孔也隨機(jī)選擇三個(gè)空加入同等濃度的含G418的DMEM營養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，根據(jù)轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞生長情況，每三天換一次液，隨著時(shí)間的延長，死亡細(xì)胞增加，大約在第10天，在轉(zhuǎn)染孔中可見數(shù)個(gè)細(xì)胞克隆形成。實(shí)施例3產(chǎn)毒細(xì)胞的克隆和重組病毒的擴(kuò)大培養(yǎng)將96孔板中每孔加入飼養(yǎng)細(xì)胞，把長出細(xì)胞克隆的12孔板，用記號(hào)筆標(biāo)記克隆的位置，在超凈工作臺(tái)上用無菌槍頭挑取細(xì)胞克隆，打入96孔板，待細(xì)胞貼壁后，將96孔板中的一半液體換為終濃度400Hg/LG418的DMEM營養(yǎng)液，待細(xì)胞長多后再將其液體全部換為終濃度400Pg/LG418的DMEM營養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，長滿后，依次傳入24孔板，6孔板，30ml細(xì)胞培養(yǎng)瓶，50ml細(xì)胞培養(yǎng)瓶，逐歩擴(kuò)大培養(yǎng)。擴(kuò)大培養(yǎng)時(shí)，G418的濃度為400l^g/ml，血清添加量為10%。實(shí)施例4狂犬病病毒糖蛋白-重組逆轉(zhuǎn)錄病毒對(duì)犬的肌注免疫取10條未免疫的家犬，通過熒光抗體病毒中和試驗(yàn)(FAVN)測(cè)定每條犬血清中的狂犬病中和抗體，在確定無抗體時(shí)，按每條取l毫升重組病毒溶液，肌肉注射免疫。2周后分別采集免疫犬的血清，通過FAVN測(cè)定血清中的中和抗體，以O(shè)IE的標(biāo)準(zhǔn)血清作為對(duì)照。結(jié)果，免疫前10條犬的中和抗體均為0。免疫后10條犬的中和抗體水平分別如下:通過FAVN測(cè)定的肌肉注射免疫犬的狂犬病中和抗體水平(IU/ml)<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>說明重組病毒在免疫犬后，犬獲得了有效的針對(duì)狂犬病病毒的保護(hù)性免疫。實(shí)施例5狂犬病病毒糖蛋白-重組逆轉(zhuǎn)錄病毒對(duì)犬的口服免疫取10條未免疫的家犬，通過熒光抗體病毒中和試驗(yàn)(FAVN)測(cè)定每條犬血清中的狂犬病中和抗體，在確定無抗體時(shí)，按每條取2毫升重組病毒溶液，口服免疫。2周后分別采集免疫犬的血清，通過FAVN測(cè)定血清中的中和抗體，以O(shè)IE的標(biāo)準(zhǔn)血清作為對(duì)照。結(jié)果，免疫甜10條犬的中和抗體均為0。免疫后10條犬的中和抗體水平分別如下:通過FAVN測(cè)定的口服免疫犬的狂犬病中和抗體水平(IU/ml)<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>說明重組病毒在免疫犬后，犬獲得了有效的針對(duì)狂犬病病毒的保護(hù)性免疫。實(shí)施例6狂犬病病毒糖蛋白-重組逆轉(zhuǎn)錄病毒對(duì)貓的肌注免疫取10只未免疫的家貓，通過熒光抗體病毒中和試驗(yàn)(FAVN)測(cè)定每只貓血清中的狂犬病中和抗體，在確定無抗體時(shí)，按每條取l毫升重組病毒溶液，肌肉注射免疫。2周后分別采集免疫貓的血清，通過FAVN測(cè)定血清中的中和抗體，以0IE的標(biāo)準(zhǔn)血清作為對(duì)照。結(jié)果，免疫前10只貓的中和抗體均為0。免疫后中和抗體水平分別如下:通過FAVN測(cè)定的肌肉注射免疫貓的狂犬病中和抗體水平(IU/ml)<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>說明重組病毒在免疫貓以后，貓獲得了有效的針對(duì)狂犬病病毒的保護(hù)性免疫。實(shí)施例7狂犬病病毒糖蛋白-重組逆轉(zhuǎn)錄病毒對(duì)鼠的肌注免疫取20只未免疫的小鼠(昆明鼠)，通過熒光抗體病毒中和試驗(yàn)(FAVN)測(cè)定每只鼠血清中的狂犬病中和抗體，在確定無抗體時(shí)，按每只鼠取0.2毫升重組病毒溶液，肌肉注射免疫。2周后分別采集免疫鼠的血清，通過FAVN測(cè)定血清中的中和抗體，以O(shè)IE的標(biāo)準(zhǔn)血清作為對(duì)照。結(jié)果，免疫前20只鼠的中和抗體均為0。免疫后20只鼠的中和抗體水平分別如下通過FAVN測(cè)定的肌肉注射免疫鼠的狂犬病中和抗體水平(IU/ml)<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>說明重組病毒在免疫鼠以后，小鼠獲得了有效的針對(duì)狂犬病病毒的保護(hù)性免疫。權(quán)利要求1.一種長效的狂犬病疫苗，可用下述方法得到以復(fù)制缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒為載體，表達(dá)狂犬病病毒糖蛋白基因，通過擴(kuò)大培養(yǎng)重組病毒制成。2、權(quán)利要求1所述疫苗的制備方法，其特征如下將狂犬病病毒糖蛋白基因表達(dá)盒克隆入復(fù)制缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，通過轉(zhuǎn)染試劑，在敏感細(xì)胞中包裝重組病毒，通過轉(zhuǎn)染細(xì)胞的藥物篩選和擴(kuò)大培養(yǎng)，收集細(xì)胞培養(yǎng)物制成疫苗。3、權(quán)利要求1所述疫苗的制備方法，包括以下步驟1)狂犬病病毒糖蛋白CDNA的獲得將RT-PCR產(chǎn)物克隆入pMD18-T載體中，進(jìn)行序列測(cè)定，通過RT-PCR技術(shù)由狂犬病病毒株獲得狂犬病病毒糖蛋白cDNA;2)狂犬病病毒糖蛋白表達(dá)盒的構(gòu)建以PstI和NotI酶切位點(diǎn)，將糖蛋白基因克隆入pVAXl載體，獲得重組質(zhì)粒pVAX-G，該重組質(zhì)粒中含有狂犬病病毒糖蛋白的表達(dá)盒；3)重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建將含有狂犬病病毒糖蛋白及CMV啟動(dòng)子的表達(dá)盒通過MluI和NotI雙酶切，獲得狂犬病病毒糖蛋白表達(dá)盒片段，采用Klenow大片段酶和dNTPs對(duì)該片段進(jìn)行補(bǔ)平；同時(shí)，制備質(zhì)粒pLCNL，以BamHI酶切該質(zhì)粒，采用Klenow大片段酶和dNTPs對(duì)載體部分進(jìn)行補(bǔ)平。通過T4DNA連接酶連接兩條片段，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌JM109，獲得重組質(zhì)粒pLCN-G;4)狂犬病病毒糖蛋白-重組逆轉(zhuǎn)錄病毒的獲得以含有10。/。小牛血清的MEM培養(yǎng)基按照常規(guī)方法培養(yǎng)PA317細(xì)胞；轉(zhuǎn)染前一天進(jìn)行傳代，第二天長成單層時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染；37。C感作6小時(shí)，棄轉(zhuǎn)染液，加入含有10。/。小牛血清和適量抗生素的MEM完全培養(yǎng)基，同時(shí)加入350-400微克/ml的G418(Geneticin)，37。C維持2周，根據(jù)細(xì)胞生長情況適時(shí)換液，待形成克隆時(shí)，將克隆移至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，長成單層后逐步擴(kuò)大培養(yǎng)至細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，對(duì)部分細(xì)胞凍存以保留重組病毒毒種；其他部分用于收集細(xì)胞培養(yǎng)上清和細(xì)胞裂解液，作為重組疫苗溶液。全文摘要本發(fā)明涉及一種長效動(dòng)物用狂犬病疫苗及其制備方法，以復(fù)制缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒為載體，該載體在形成病毒感染機(jī)體以后可以整合到宿主細(xì)胞的染色體內(nèi)；以表達(dá)狂犬病病毒糖蛋白的表達(dá)盒作為外源性目的基因，該目的基因表達(dá)的蛋白可刺激機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)狂犬病病毒的免疫應(yīng)答；通過轉(zhuǎn)化逆轉(zhuǎn)錄病毒的包裝細(xì)胞，可以持續(xù)產(chǎn)生重組病毒，以重組病毒免疫動(dòng)物，可使動(dòng)物獲得長期的針對(duì)狂犬病的免疫保護(hù)效果。本重組疫苗適用動(dòng)物范圍廣泛，使用安全，誘導(dǎo)的免疫有效期持續(xù)時(shí)間長，是一種長效的預(yù)防狂犬病的新型疫苗。文檔編號(hào)C12N15/867GK101537179SQ20091006650公開日2009年9月23日申請(qǐng)日期2009年2月6日優(yōu)先權(quán)日2009年2月6日發(fā)明者曄劉,菲張,張守峰,扈榮良,娜趙申請(qǐng)人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所