專利名稱：一種疫苗保護劑、狂犬病疫苗及其制備方法
一種疫苗保護劑、狂犬病疫苗及其制備方法背景技術(shù)
本發(fā)明涉及一種疫苗保護劑，特別涉及一種狂犬病疫苗保護劑。
技術(shù)背景
狂犬病又稱恐水癥，是一種侵害中樞神經(jīng)系統(tǒng)的急性病毒性傳染病。狂犬病是迄今為止人類病死率最高的急性傳染病，一旦發(fā)病，病死率高達100%。全球有87個國家和地區(qū)有狂犬病發(fā)生，但主要分布在亞洲、非洲和拉丁美洲等發(fā)展中國家，其中98%在亞洲，中國的發(fā)病人數(shù)僅次于印度，居世界第二位。自1997年起，我國狂犬病疫情已保持了 10余年的上升趨勢，發(fā)病人數(shù)和病死人數(shù)都不斷增加，2006年-2008年全國共報告狂犬病9045例， 占同期各種傳染病病死總數(shù)的對.9%，位居第三位。其中2007年報告狂犬病例的縣(區(qū)) 數(shù)占全國總數(shù)的34.4%，較2006年上升了 17.3%。我國防控狂犬病的形式依然嚴峻?？袢“Y狀嚴重、死亡率達100%。
一旦發(fā)病目前尚無法醫(yī)治，其控制主要依賴于疫苗接種?？箍袢∶庖呓臃N是早期免疫預防醫(yī)學史中成功的范例之一。1885年首先由巴斯德利用感染了狂犬病毒的狗腦組織通過腦內(nèi)注射感染兔子，再將兔子的脊髓干燥后免疫狗，并通過反復在猴體內(nèi)傳代后狂犬病毒的毒力減弱了。這就是最原始的狂犬病疫苗的免疫。1908年Dr. !^ermi利用酚將兔腦組織中的病毒部分滅活。1911年Dr. Semple將腦組織懸液于37°C用酚固定、滅活，制備了無毒性的kmple苗。1925年Dr. Hempt通過補加乙醚處理，進一步保證了疫苗的無毒性。我國自1949年起，一直使用由羊腦制備Wkmple疫苗，直到1980年停止使用，由原代地鼠腎細胞疫苗取代。為了減少對腦脊髓組織的過敏反應，1959年Dr. Peek采用鴨胚組織和β-丙內(nèi)酯(β-propiolatone)滅活病毒方法制備了鴨胚組織狂犬苗(DEV，Duck Embryo Vaccine)，結(jié)果副反應降低了許多即從神經(jīng)組織苗(NTV，Nerve Tissue Vaccine)引起的副反應為1.5%降至1/25000。但是DEV的效力和保護性不好。另外，由于鴨胚蛋白引起過敏反應也時有報道。1960年以后以培養(yǎng)細胞為基質(zhì)的疫苗有了很大發(fā)展，也是目前正在使用和廣泛使用的。60年代，Dr. Kissling和!^enje首先嘗試用組織細胞培養(yǎng)狂犬病毒。二學者將狂犬病毒在原代地鼠腎細胞和鴨胚細胞培養(yǎng)后，經(jīng)福爾馬林滅活，制備疫苗。1964年， Dr. Wiktor等將巴斯德于1882年從兔腦中分離出的Pitman-Moore (PM)固定株適應至人胚肺二倍體細胞2BS(WiStar-38)，即利用感染了狂犬病毒的細胞與新鮮的細胞混合培養(yǎng)，通過傳代47代后，病毒完全適應到了 2BS細胞，且也可以讓病毒能在無細胞狀態(tài)下傳代。由此制備的疫苗接種后可產(chǎn)生可靠的免疫應答，產(chǎn)生高滴度的中和抗體。在1980年代，法國 Merieux研究所率先研究使用傳代細胞——Vero細胞生產(chǎn)狂犬病疫苗，其后WHO制定看生產(chǎn)疫苗用的傳代細胞規(guī)程，并于1987年制定傳代細胞生產(chǎn)狂犬病疫苗的規(guī)程。我國從1980 年年代末開始進行人用精制Vero細胞培養(yǎng)狂犬病疫苗研制，于1990年代末得到批準生產(chǎn)。 目前用于生產(chǎn)人用的傳代細胞多為Vero細胞，它是非洲綠猴腎細胞的細胞系，經(jīng)多次鑒定是公認安全的。
現(xiàn)在市場上人用狂犬病疫苗的質(zhì)量良莠不齊，關(guān)鍵指標就是效價不穩(wěn)定，這與制備狂犬病使用的劑型以及保護劑不理想有很大的關(guān)系。目前也有文獻報道對狂犬病疫苗保護劑的研究，如沈銘強，等，狂犬病疫苗耐熱保護劑的研究，《中國獸藥雜志》，1990年4期， 報道了采用脫脂牛奶、明膠、蔗糖、乳糖、山梨醇、谷氨酸鈉、檸檬酸鈉、乙二胺四乙酸二鈉、 磷酸鹽緩沖液等作為保護劑材料。由于滅活的病毒蛋白不能在常溫下長時間穩(wěn)定存在，即使在2-8°C的低溫條件下也只有6-12個月的貯存有效期。采用凍干劑型的狂犬病疫苗穩(wěn)定效價理論上可以保存18個月以上，但如果如果凍干保護劑不理想就不能有效的保持效價的穩(wěn)定，疫苗質(zhì)量也大大打折。由于狂犬病疫苗的不穩(wěn)定性，必需在低溫冷藏條件下通過冷鏈運輸、貯存和使用，從而使狂犬病疫苗的大規(guī)模推廣使用，特別是經(jīng)濟不發(fā)達地區(qū)及熱帶和亞熱帶地區(qū)的推廣使用受到廣大的限制。發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述問題，本發(fā)明的目的是提供一種新的疫苗保護劑。本發(fā)明的另一目的是提供了一種狂犬病疫苗。
本發(fā)明提供了一種疫苗保護劑，它包含以下重量配比的成分
二糖50-80份、人血白蛋白20-30份、明膠10份、氨基酸1.5% -1. 65份。
其中，所述的二糖為蔗糖、乳糖、海藻糖或麥芽糖；所述的氨基酸為脯氯酸、精氨酸、甘氨酸或賴氨酸。
進一步優(yōu)選地，所述的二糖為乳糖、麥芽糖；所述的氯基酸為脯氯酸和精氨酸，其成分的重量配比為
麥芽糖40份、乳糖40份、人血白蛋白25份、明膠10份、脯氨酸0.3份、精氨酸1.35 份。
本發(fā)明疫苗保護劑還含有Vc和尿素，重量配比為
海藻糖50份、人血白蛋白20份、明膠10份、脯氨酸0. 25份、精氨酸1. 25份、Vc2. 5份、尿素5份。
本發(fā)明還提供了一種狂犬病疫苗，它是由狂犬病疫苗原液、疫苗保護劑制備而成。
其中，所述的狂犬病疫苗原液采用ELISA法檢測抗原含量> 3IU/mL。所述的狂犬病疫苗原液采用ELISA法檢測抗原含量> 4IU/mL。
所述的狂犬病疫選用的毒株為Pitman-Moore株。
本發(fā)明還提供了一種制備狂犬病疫苗的方法，它包括如下步驟
a、制備的狂犬病病毒原液，采用ELISA法檢測抗原含量> 3IU/mL ；
b、制備明膠溶液將明膠在熱水浴助溶條件下溶于滅菌的PBS緩沖液中，攪拌，待完全溶解、清亮后定容使明膠濃度為5% 15%，滅菌，得明膠溶液；
C、制備糖氨基酸溶液將二糖在熱水浴助溶條件下溶于滅菌的PBS緩沖液中， 攪拌，待完全溶解、清亮，加入氨基酸，定容，使溶液中糖濃度為30 50 %，氨基酸濃度為 0. 5% 2%，得糖氨基酸溶液；
d、將a步驟制備的狂犬病病毒原液加入蛋白含量為20%的人血白蛋白，加入體積比為純化疫苗原液20%人血白蛋白=10 1至5 1，即得疫苗蛋白混合液；再混合入 b步驟制備的明膠溶液和c步驟制備的糖氨基酸液，混合體積比為疫苗蛋白混合液明膠溶液糖氨基酸溶液=5 10 1 4 1 2 ；混勻后得到狂犬病疫苗組合物溶液；
e、將步驟d得到的狂犬病疫苗組合物溶液分裝、冷凍干燥，即得狂犬病疫苗。
其中，e步驟所述的冷凍干燥步驟為
(1)預凍階段疫苗降溫至_40°C以下，保溫2-3小時后轉(zhuǎn)入抽真空階段；
(2)抽真空階段冷凝器溫度降至_45°C以下時，啟動真空泵抽真空，凍干箱壓力控制在131 以內(nèi)
(3)第一階段干燥隔板溫度控制在-50°C至-10°C，疫苗溫度控制在-50°C 至_25°C，干燥13-16小時；第一階段干燥完畢后，待溫度上升至20-30°C，升溫時間約7-8 小時，進入第二階段干燥；
(4)第二階段干燥疫苗在20-30°C下保溫10-13小時，即凍干完畢。
本發(fā)明提供的保護劑明顯提高了狂犬病疫苗的穩(wěn)定性，可大幅度延長疫苗的保質(zhì)期，臨床應用前景良好。
下面通過具體實施方式
對本發(fā)明作進一步描述，但并非對本發(fā)明的限制。


圖1試制凍干狂犬病疫苗注射部位和注射周圍組織病理切片(其中，圖IA注射部位周圍圖；圖IB注射部位圖)具體實施方式
實施例1本發(fā)明保護劑的制備
1、制備方法
稱量、溶解和高壓滅菌潔凈度十萬級車間內(nèi)操作，過濾除菌在潔凈度萬級車間內(nèi)百級層流下操作，包括如下步驟
(1)配制IOOOml濃度為11%明膠稱取明膠110g，在100°C熱水浴助溶下溶于滅菌750ml 0. OlM PBS (pH 7. 6)溶液，實時攪拌，待完全清亮后，定容于1000ml，0. IlMPa 30 分鐘滅菌，再用滅菌0. OlM PBS (pH 7.6)溶液補足液體定容至1000ml，得11 %明膠溶液， 2-8°C保存，一周內(nèi)使用。所用明膠為Fluka公司產(chǎn)品；
(2)配制IOOOml保護劑糖液稱取藥用級麥芽糖179. 9g、乳糖179. 9g在100°C 熱水浴助溶下溶于滅菌750ml 0.01M PBS (pH 7. 6)溶液，實時攪拌，待完全清亮后，100°C 30分鐘。稱取脯氨酸1. 3g、鹽酸精氨酸6. 4g，溶于已冷卻的保護劑糖液后用滅菌0. OlM PBS (pH 7.6)溶液定容于1000ml，采用0.22 μ m濾芯過濾除菌得保護劑糖液。2_8°C保存， 一周內(nèi)使用；
(3)人血白蛋白由成都蓉生藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)的20%人血白蛋白。
實施例2本發(fā)明狂犬病疫苗的制備
1、疫苗制備
(1)、制備保護劑
依照表1所示配方，按照如下步驟制備保護劑
a、配制IOOOml濃度為11 %明膠稱取明膠110g，在100°C熱水浴助溶下溶于滅菌750ml 0. OlM PBS (pH 7. 6)溶液，實時攪拌，待完全清亮后，定容于1000ml，0. IlMPa 30 分鐘滅菌，再用滅菌0. OlM PBS (pH 7.6)溶液補足液體定容至1000ml，得11 %明膠溶液， 2-8°C保存，一周內(nèi)使用。所用明膠為Fluka公司產(chǎn)品；
b、配制IOOOml保護劑糖液稱取藥用級多糖在100°C熱水浴助溶下溶于滅菌 750ml 0.01M PBS(pH 7. 6)溶液，實時攪拌，待完全清亮后，100°C 30分鐘。稱取脯氨酸 1.3g、鹽酸精氨酸6. 4g，溶于已冷卻的保護劑糖液后用滅菌0. OlM PBS(pH 7.6)溶液定容于1000ml，采用0. 22 μ m濾芯過濾除菌得保護劑糖液。2_8°C保存，一周內(nèi)使用；
C、人血白蛋白由成都蓉生藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)的20%人血白蛋白。
(2)制備疫苗
本發(fā)明提供的狂犬病疫苗所選用的毒株為Pitman-Moore株(PM株)。PM株是來自美國Wistar研究所的狂犬病毒固定株，Wistar研究所從NIH獲得PV-Il株，經(jīng)兩代兔腦傳代，在WI-38細胞傳47 52代作為主種子毒，稱為PM株，是現(xiàn)在所使用狂犬病疫苗中免疫保護效果最好的一種，也是世界衛(wèi)生組織WHO在《人用狂犬病疫苗推薦毒種》推薦使用的毒株。取狂犬病疫苗(PM株)病毒原液，經(jīng)過本領(lǐng)域常規(guī)的澄清、濃縮、滅活、層析純化等技術(shù)處理后，獲得病毒原液；
(3)制劑
在潔凈度為百級的房間內(nèi)的百級層流下操作。在于純化疫苗原液加入蛋白含量為 20%的人血白蛋白，加入比例為純化疫苗原液20%人血白蛋白=10 1至5 1，即得疫苗蛋白混合液；再混合入糖液和明膠液，混合比例為疫苗蛋白混合液明膠溶液糖氨基酸溶液=5 10 1 4 1 2，即得狂犬病疫苗組合物溶液，再進行分裝冷凍干燥。冷凍干燥方法
1. 1 預凍
1.1.1溫度疫苗降溫至-40 °C以下，
1. 1. 2時間達到上述溫度后，保溫2-3小時后轉(zhuǎn)入抽真空階段；
1.2抽真空階段
冷凝器溫度降至_45°C以下時，啟動真空泵抽真空，凍干箱壓力控制在13 以內(nèi)
1. 3第一階段干燥
1. 3. 1溫度隔板溫度控制在_50°C至-10°C，疫苗溫度控制在_50°C至_25°C，
1. 3. 2 時間13-16 小時;
1. 3. 3第一階段干燥完畢后，待溫度上升至20-30°C，升溫時間約7-8小時，進入第二階段干燥；
1.4第二階段干燥
疫苗在20_30°C下保溫10-13小時，即凍干完畢。方可停機，壓膠塞后出柜，至此， 即制備凍干狂犬病疫苗。
(4)分裝
在潔凈度為百級的房間內(nèi)的百級層流下操作。將狂犬病疫苗組合物分裝，分裝規(guī)格1. Oml/西林瓶，再冷凍干燥。
2、檢測
對制備的疫苗成品按照《中華人民共和國藥典》2005年版本中記載的指標進行檢測。
3、檢測結(jié)果
實驗結(jié)果如表1所示
表1凍干前狂犬病疫苗組合物溶液中不同配比的保護劑的保護作用比較
權(quán)利要求
1.一種疫苗保護劑，其特征在于它包含以下重量配比的成分二糖50-80份、人血白蛋白20-30份、明膠10份、氨基酸1. 5-1. 65份。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的疫苗保護劑，其特征在于所述的二糖為蔗糖、乳糖、海藻糖或麥芽糖；所述的氨基酸為脯氯酸、精氨酸、甘氨酸或賴氨酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的疫苗保護劑，其特征在于所述的二糖為乳糖、麥芽糖；所述的氯基酸為脯氯酸、精氨酸，重量配比為麥芽糖40份、乳糖40份、人血白蛋白25份、明膠10份、脯氨酸0. 3份、精氨酸1. 35份。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的疫苗保護劑，其特征于它還含有Vc和尿素，其成分的重量配比為海藻糖50份、人血白蛋白20份、明膠10份、脯氨酸0. 25份、精氨酸1. 25份、Vc2. 5份、尿素5份。
5.一種狂犬病疫苗，它是由狂犬病疫苗原液、權(quán)利要求1-4任意一項所述的疫苗保護劑制備而成。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的狂犬病疫苗，其特征在于所述的狂犬病疫苗原液采用ELISA 法檢測抗原含量彡3IU/mL。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的狂犬病疫苗，其特征在于所述的狂犬病疫苗原液采用ELISA 法檢測抗原含量彡4IU/mL。
8.根據(jù)權(quán)利要求5-7任意一項所述的狂犬病疫苗，其特征在于所述的狂犬疫苗選用的毒株為Pitman-Moore株。
9.一種制備權(quán)利要求5-8任意一項所述的狂犬病疫苗的方法，它包括如下步驟a、制備的狂犬病病毒原液，采用ELISA法檢測抗原含量>3IU/mL ；b、制備明膠溶液將明膠在熱水浴助溶條件下溶于滅菌的PBS緩沖液中，攪拌，待完全溶解、清亮后定容使明膠濃度為5% w/w 15% w/w，滅菌，得明膠溶液；C、制備糖氨基酸溶液將二糖在熱水浴助溶條件下溶于滅菌的PBS緩沖液中，攪拌，待完全溶解、清亮，加入氨基酸，定容，使溶液中糖濃度為30 50% w/w，氨基酸濃度為0. 5% w/w 2% w/w，得糖氨基酸溶液；d、將a步驟制備的狂犬病病毒原液加入蛋白含量為20%的人血白蛋白，加入體積比為純化疫苗原液20%人血白蛋白=10 1至5 1，即得疫苗蛋白混合液；再混合入 b步驟制備的明膠溶液和c步驟制備的糖氨基酸液，混合體積比為疫苗蛋白混合液明膠溶液糖氨基酸溶液=5 10 1 4 1 2 ；混勻后得到狂犬病疫苗組合物溶液；e、將步驟d得到的狂犬病疫苗組合物溶液分裝、冷凍干燥，即得狂犬病疫苗。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的制備方法，其特征在于e步驟所述的冷凍干燥步驟為(1)預凍階段疫苗降溫至-40°C以下，保溫2-3小時后轉(zhuǎn)入抽真空階段；(2)抽真空階段冷凝器溫度降至_45°C以下時，啟動真空泵抽真空，凍干箱壓力控制在131 以內(nèi)(3)第一階段干燥隔板溫度控制在_50°C至-10°C，疫苗溫度控制在-50°C至_25°C， 干燥13-16小時；第一階段干燥完畢后，待溫度上升至20-30°C，升溫時間約7-8小時，進入第二階段干燥；(4)第二階段干燥疫苗在20-30°C下保溫10-13小時，凍干完畢。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種疫苗保護劑，它包含以下百分含量的成分二糖50-80份、人血白蛋白20-30份、明膠10份、氨基酸1.5-1.65份。本發(fā)明還提供了一種狂犬病疫苗及其制備方法。本發(fā)明疫苗保護劑可有效增強狂犬病疫苗凍干劑的熱穩(wěn)定性，具有較強的應用價值。
文檔編號A61K47/42GK102512686SQ20111043208
公開日2012年6月27日 申請日期2011年12月21日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月21日
發(fā)明者劉杰, 劉蓉, 吳曼萍, 吳永林, 孫艷, 李玉華, 楊會強, 毛川成, 牟建超, 趙宇 申請人:成都生物制品研究所有限責任公司