轉(zhuǎn)化大豆的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種轉(zhuǎn)化大豆的方法，包括：大豆種子萌發(fā)后去除子葉和第一片真葉，獲得裸露的分生組織；所述裸露的分生組織接種到含有細(xì)胞分裂素的預(yù)處理培養(yǎng)基上進(jìn)行預(yù)處理；農(nóng)桿菌侵染所述預(yù)處理后的分生組織塊。本發(fā)明轉(zhuǎn)化大豆的方法首次公開了將預(yù)處理后的大豆分生組織塊作為外植體材料；在農(nóng)桿菌侵染之前通過對外植體材料進(jìn)行高濃度的細(xì)胞分裂素處理，使得大豆的分生組織處于活躍狀態(tài)，易于外源基因的插入，同時通過分生組織的增值變大，使得侵染過程更加便于操作；在農(nóng)桿菌侵染過程中，加入了超聲波處理，使外源基因插入植物基因組的效率大大增加，大豆的轉(zhuǎn)化效率可達(dá)10%；同時轉(zhuǎn)化周期短、嵌合體少、轉(zhuǎn)化成本低。
【專利說明】轉(zhuǎn)化大豆的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種植物轉(zhuǎn)化的方法，特別是涉及一種轉(zhuǎn)化大豆組織的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]大豆(Glycine max)起源于中國，是植物蛋白質(zhì)的主要來源，也是中國重要的油料作物和高蛋白糧飼兼用作物，種植面積僅次于水稻、玉米和小麥，居第四位。為了提高大豆耐除草劑、抗病蟲害及生理逆境的能力、改善大豆品質(zhì)、增加大豆產(chǎn)量，除了采用傳統(tǒng)的育種方法外，可通過基因工程手段實(shí)現(xiàn)有目的的遺傳工程改良。
[0003]大豆的遺傳轉(zhuǎn)化方法主要有農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、基因槍轟擊法、電擊法、PEG法、顯微注射法、超聲波輔助法和花粉管導(dǎo)入法等，其中農(nóng)桿菌介導(dǎo)法為大豆常用的轉(zhuǎn)基因方法。而農(nóng)桿菌介導(dǎo)法不僅受到植物基因型依賴和菌株特異性的限制，不同的大豆受體系統(tǒng)也是大豆遺傳轉(zhuǎn)化的重要環(huán)節(jié)，目前常用的大豆受體系統(tǒng)主要有:
[0004](I)子葉節(jié)受體系統(tǒng):大豆轉(zhuǎn)化過程中運(yùn)用最早最普遍的就是子葉節(jié)受體系統(tǒng)(Hinchee et al.，1988)。該系統(tǒng)是將發(fā)芽5天左右的大豆在下胚軸離子葉3_5mm處橫切，然后將兩片子葉縱切開，去掉上胚軸部分。這種受體系統(tǒng)的特點(diǎn)是:沒有經(jīng)過愈傷組織階段直接分化成不定芽；得到再生苗時間短，一般3個月就可得到生根的植株；再生頻率高等。由于這些特點(diǎn)，它受到很多大豆分子育種工作者的青睞，但運(yùn)用這種方法在切子葉節(jié)時需要進(jìn)行精心人工操作，且不定芽常起源于多細(xì)胞，所形成的再生植株有較多的嵌合體，加大了后代的篩選難度，子葉節(jié)受體系統(tǒng)的轉(zhuǎn)化效率較低。
[0005](2)大豆胚尖受體系統(tǒng):大豆胚尖受體系統(tǒng)是將發(fā)芽I天的大豆剝?nèi)シN皮，將兩片子葉從胚軸上剝掉，去掉真葉，再用農(nóng)桿菌侵染胚尖。大豆胚尖再生系統(tǒng)既可以用幼胚胚尖，也可以用成熟胚的胚尖。它的特點(diǎn)是得到再生苗時間短，1-2個月就可以得到再生植株，且再生植株嵌合體少?；谏鲜鎏攸c(diǎn)，越來越多的研究者采用這種方法。但這種方法在農(nóng)桿菌侵染階段的技術(shù)難度較高，篩選時較困難，且得到的轉(zhuǎn)化子較少。
[0006](3)體細(xì)胞胚受體系統(tǒng):這種方法是經(jīng)體細(xì)胞發(fā)生形成的在形態(tài)和功能上類似于有性胚的結(jié)構(gòu)，然后以其為轉(zhuǎn)化受體?，F(xiàn)在主要以未成熟胚的子葉為外植體，經(jīng)過誘導(dǎo)后形成體細(xì)胞胚。這種受體系統(tǒng)的特點(diǎn)是:體細(xì)胞胚的形成與大豆基因型有很大關(guān)系，一旦形成體細(xì)胞胚后可以大量擴(kuò)繁，受體數(shù)量多，易于轉(zhuǎn)化，但起源于多細(xì)胞，增加了篩選的難度。
[0007](4)半子葉受體系統(tǒng):用子葉作為受體系統(tǒng)是Paz等于2005年首先提出來的，這種方法是將用水浸泡過夜的大豆種子，剝?nèi)シN皮后，將胚軸部分去掉，留下子葉，然后將子葉與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)。這種方法避免了由于子葉節(jié)劃傷時需要精心操作的人為因素影響，使操作更簡單；但這種轉(zhuǎn)化方法出苗困難，轉(zhuǎn)化效率低。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的是提供一種轉(zhuǎn)化大豆的方法，有效克服現(xiàn)有技術(shù)技術(shù)難度高、篩選難度大、嵌合體較多、轉(zhuǎn)化效率偏低等技術(shù)缺陷。[0009]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種轉(zhuǎn)化大豆的方法，包括:
[0010]大豆種子萌發(fā)后去除子葉和第一片真葉，獲得裸露的分生組織；
[0011]所述裸露的分生組織接種到含有細(xì)胞分裂素的預(yù)處理培養(yǎng)基上進(jìn)行預(yù)處理；
[0012]農(nóng)桿菌侵染所述預(yù)處理后的分生組織塊。
[0013]優(yōu)選地，所述細(xì)胞分裂素為lmg/L6_芐基腺嘌呤和2mg/L玉米素的任意一種或任意組合。
[0014]進(jìn)一步地，所述預(yù)處理培養(yǎng)基還包括乙酰丁香酮。
[0015]更進(jìn)一步地，所述轉(zhuǎn)化大豆的方法還包括所述預(yù)處理后的分生組織塊創(chuàng)傷后進(jìn)行超聲波處理2-4分鐘。
[0016]在上述技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，所述轉(zhuǎn)化大豆的方法還包括超聲波處理后的分生組織塊在含有選擇劑的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，所述選擇劑是草丁膦。
[0017]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種生產(chǎn)穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的大豆植物的方法，包括: [0018]大豆種子萌發(fā)后去除子葉和第一片真葉，獲得裸露的分生組織；
[0019]所述裸露的分生組織接種到含有細(xì)胞分裂素的預(yù)處理培養(yǎng)基上進(jìn)行預(yù)處理；
[0020]農(nóng)桿菌侵染所述預(yù)處理后的分生組織塊；
[0021]侵染后的分生組織塊與所述農(nóng)桿菌共培養(yǎng)；
[0022]在含有選擇劑的培養(yǎng)基上培養(yǎng)并選擇轉(zhuǎn)化的抗性組織；
[0023]轉(zhuǎn)化的抗性組織再生為大豆植物。
[0024]優(yōu)選地，所述細(xì)胞分裂素為lmg/L6_芐基腺嘌呤和2mg/L玉米素的任意一種或任意組合。
[0025]進(jìn)一步地，所述預(yù)處理培養(yǎng)基還包括乙酰丁香酮。
[0026]更進(jìn)一步地，所述選擇劑是草丁膦。
[0027]在上述技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，所述生產(chǎn)穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的大豆植物的方法還包括所述預(yù)處理后的分生組織塊創(chuàng)傷后進(jìn)行超聲波處理2-4分鐘。
[0028]本發(fā)明中的克隆基因、表達(dá)盒、載體(例如質(zhì)粒)、蛋白和蛋白片段、以及轉(zhuǎn)化的細(xì)胞核植物均可使用標(biāo)準(zhǔn)方法生產(chǎn)。
[0029]本發(fā)明可用于在大豆植物中表達(dá)任何目的基因。目的基因可以是耐除草劑基因、抗病基因或抗蟲基因，或者是選擇或評價標(biāo)記，并含有植物可操作的啟動子、編碼區(qū)和終止子區(qū)。耐除草劑基因包括對咪唑啉酮或磺酰脲除草劑耐受的AHAS基因、對草丁膦除草劑耐受的pat或bar基因、對草甘膦除草劑耐受的EPSPS基因等?？共』虬股睾铣擅富颍缦踹量┚睾铣擅富?，植物來源的抗性基因等?？瓜x基因包括蘇云金芽孢桿菌殺蟲基因。目的基因也可以編碼與生物化學(xué)途徑有關(guān)的酶，該酶的表達(dá)可改變食物、飼料、營養(yǎng)藥和/或藥物生產(chǎn)中重要的性狀。目的基因可以位于質(zhì)粒上。適合本發(fā)明使用的質(zhì)?？梢院幸粋€以上目的基因和/或農(nóng)桿菌可含有帶有不同目的基因的不同質(zhì)粒。
[0030]本發(fā)明中所述“大豆”是指Glycine max，所述方法是以農(nóng)桿菌介導(dǎo)的目的基因傳輸?shù)酱蠖辜?xì)胞，之后再生為轉(zhuǎn)化的大豆植物為基礎(chǔ)的。本發(fā)明的方法獨(dú)立于栽培品種。
[0031]在選擇劑存在的情況下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的大豆細(xì)胞。優(yōu)選地，用草丁膦乙酰轉(zhuǎn)移酶(PAT)基因轉(zhuǎn)化，并且轉(zhuǎn)化的基因在草丁膦存在的情況下培養(yǎng)。在含有草丁膦為選擇劑的培養(yǎng)基中，PAT基因轉(zhuǎn)化的大豆細(xì)胞選擇性生長。[0032]含有異源核酸(即含有按照本發(fā)明的方法轉(zhuǎn)化的細(xì)胞或組織)的轉(zhuǎn)基因植物以及通過該轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)生的種子和后代是本發(fā)明所涉及的。將轉(zhuǎn)化的細(xì)胞培養(yǎng)成有用栽培品種的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。植物組織體外培養(yǎng)技術(shù)和整個植株再生技術(shù)也是公知的。相應(yīng)的，所述“種子”包括這些轉(zhuǎn)化植物的種子以及轉(zhuǎn)化植物后代產(chǎn)生的種子。所述“植物”不僅包括轉(zhuǎn)化和再生的植物，還包括通過本發(fā)明的方法產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化和再生植物的后代。
[0033]可以從本發(fā)明的方法產(chǎn)生的植物中篩選成功的轉(zhuǎn)化植物。為了開發(fā)改良的植物和種子品系，可以持續(xù)地篩選和選擇本發(fā)明再生植物的種子和子代植物以使轉(zhuǎn)基因和整合的核酸序列持續(xù)存在。因此，可以將所需要的轉(zhuǎn)基因核酸序列移入(即漸滲或交配)其它的遺傳品系如某些原種或商業(yè)上有用的品系或品種中。漸滲目的基因進(jìn)入遺傳植物品系的方法可通過本領(lǐng)域公知的多種技術(shù)來實(shí)現(xiàn)，包括通過傳統(tǒng)的育種、原生質(zhì)體融合、細(xì)胞核轉(zhuǎn)移以及染色體轉(zhuǎn)移。育種方法和技術(shù)也是本領(lǐng)域公知的。根據(jù)本發(fā)明獲得的轉(zhuǎn)基因植物和自交系可用于生產(chǎn)商業(yè)上有價值的雜交植物和農(nóng)作物。
[0034]本發(fā)明提供了一種轉(zhuǎn)化大豆的方法，具有以下優(yōu)點(diǎn):
[0035]1、新穎的外植體材料。本發(fā)明轉(zhuǎn)化大豆的方法首次公開了將成熟的大豆種子在萌發(fā)培養(yǎng)基中萌發(fā)I天后進(jìn)行預(yù)處理，將預(yù)處理后的大豆分生組織塊作為外植體材料。
[0036]2、農(nóng)桿菌侵染過程簡單便利。本發(fā)明轉(zhuǎn)化大豆的方法在農(nóng)桿菌侵染之前通過對外植體材料進(jìn)行高濃度的細(xì)胞分裂素處理，使得大豆的分生組織處于活躍狀態(tài)，同時通過分生組織的增值變大，使得侵染過程更加便于操作。
[0037]3、轉(zhuǎn)化效率高、轉(zhuǎn)化周期短、嵌合體少。本發(fā)明轉(zhuǎn)化大豆的方法在農(nóng)桿菌侵染之前通過對外植體材料進(jìn)行高濃度的細(xì)胞分裂素處理，使得大豆的分生組織處于活躍狀態(tài)，易于外源基因的插入；同時在農(nóng)桿菌侵染過程中，加入了超聲波處理，使外源基因插入植物基因組的效率大大增加，大豆的轉(zhuǎn)化效率可達(dá)10%。
[0038]4、轉(zhuǎn)化成本低。本發(fā)明轉(zhuǎn)化大豆的方法通過簡便侵染過程，提高轉(zhuǎn)化效率，實(shí)現(xiàn)了遺傳轉(zhuǎn)化過程中各環(huán)節(jié)轉(zhuǎn)化成本的降低。
[0039]下面通過附圖和實(shí)施例，對本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步的詳細(xì)描述。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0040]圖1為本發(fā)明轉(zhuǎn)化大豆的方法的重組克隆載體DBNOl-T構(gòu)建流程圖；
[0041]圖2為本發(fā)明轉(zhuǎn)化大豆的方法的重組表達(dá)載體DBN100024構(gòu)建流程圖；
[0042]圖3為本發(fā)明轉(zhuǎn)化大豆的方法的轉(zhuǎn)化大豆組織的效果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0043]下面通過具體實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明轉(zhuǎn)化大豆的方法的技術(shù)方案。
[0044]第一實(shí)施例、重組表達(dá)載體的構(gòu)建及重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌
[0045]1、構(gòu)建含有目的基因的重組克隆載體
[0046]將PAT 核苷酸序列連入克隆載體 pGEM-T (Promega，Madison，USA，CAT:A3600)上，操作步驟按Promega公司產(chǎn) 品pGEM_T載體說明書進(jìn)行，得到重組克隆載體DBN01-T，其構(gòu)建流程如圖1所示(其中，Amp表示氨芐青霉素抗性基因；fl表示噬菌體fl的復(fù)制起點(diǎn)；LacZ為LacZ起始密碼子；SP6為SP6RNA聚合酶啟動子；T7為T7RNA聚合酶啟動子；ΡΑΤ為草丁膦乙酰轉(zhuǎn)移酶基因核苷酸序列(SEQ ID N0:1) ;MCS為多克隆位點(diǎn))。
[0047]然后將重組克隆載體DBNOl-T用熱激方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌Tl感受態(tài)細(xì)胞(Transgen, Beijing, China, CAT:CD501)，其熱激條件為:50 μ I大腸桿菌Tl感受態(tài)細(xì)胞、10 μ I質(zhì)粒DNA (重組克隆載體DBNOlAb-T)，42 V水浴30秒；37 °C振蕩培養(yǎng)I小時(200rpm轉(zhuǎn)速下?lián)u床搖動)，在表面涂有IPTG (異丙基硫代-β-D-半乳糖苷)和X_gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β -D-半乳糖苷)的氨芐青霉素(100mg/L)的LB平板(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaC110g/L,瓊脂15g/L，用NaOH調(diào)pH至7.5)上生長過夜。挑取白色菌落，在LB液體培養(yǎng)基(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaC110g/L,氨芐青霉素100mg/L，用NaOH調(diào)pH至7.5)中于溫度37°C條件下培養(yǎng)過夜。堿法提取其質(zhì)粒:將菌液在12000rpm轉(zhuǎn)速下離心lmin，去上清液，沉淀菌體用100 μ I冰預(yù)冷的溶液I (25mMTris-HCl, IOmM EDTA (乙二胺四乙酸)，50mM葡萄糖，ρΗ8.0)懸?。患尤?50 μ I新配制的溶液II (0.2Μ NaOH, 1%SDS (十二烷基硫酸鈉))，將管子顛倒4次，混合，置冰上3_5min ;加Λ 150 μ I冰冷的溶液III (4Μ醋酸鉀，2Μ醋酸)，立即充分混勻，冰上放置5_10min ;于溫度4°C、轉(zhuǎn)速12000rpm條件下離心5min，在上清液中加入2倍體積無水乙醇，混勻后室溫放置5min ;于溫度4°C、轉(zhuǎn)速12000rpm條件下離心5min,棄上清液,沉淀用濃度(V/V)為70%的乙醇洗滌后晾干；加入 30μ I 含 RNase (20μ g/ml)的 TE (IOmM Tris-HCl, ImM EDTA,PH8.0)溶解沉淀；于溫度37°C下水浴30min，消化RNA ;于溫度_20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0048]提取的質(zhì)粒經(jīng)ApaI和EcoRV酶切鑒定后，對陽性克隆進(jìn)行測序驗(yàn)證，結(jié)果表明重組克隆載體DBN01-T中插入的PAT基因序列為序列表中SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。
[0049]2、構(gòu)建含有目的基因的重組表達(dá)載體
[0050]用限制性內(nèi)切酶HindIII和KasI分別酶切重組克隆載體DBN01-T和表達(dá)載體DBNBC-01 (載體骨架:pCAMBIA2301 (CAMBIA機(jī)構(gòu)可以提供))，將切下的PAT基因序列插到表達(dá)載體DBNBC-01的HindIII和KasI位點(diǎn)之間，利用常規(guī)的酶切方法構(gòu)建載體是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，構(gòu)建成重組表達(dá)載體DBN100024，其構(gòu)建流程如圖2所示(Kan:卡那霉素基因；RB:右邊界；Ub1:玉米Ubiquitin(泛素)基因啟動子(SEQ ID N0:2)；PAT:草丁膦乙酰轉(zhuǎn)移酶基因核苷酸序列(SEQ ID NO: l)；Nos:胭脂堿合成酶基因的終止子(SEQ ID N0:3)；LB:左邊界)。
[0051]將重組表達(dá)載體DBN100024用熱激方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌Tl感受態(tài)細(xì)胞，其熱激條件為:50μ I大腸桿菌Tl感受態(tài)細(xì)胞、10 μ I質(zhì)粒DNA (重組表達(dá)載體DBN100053)，42 °C水浴30秒；37°C振蕩培養(yǎng)I小時(200rpm轉(zhuǎn)速下?lián)u床搖動)；然后在含50mg/L卡那霉素(Kanamycin)的LB固體平板(胰蛋白胨10g/L,酵母提取物5g/L,NaC110g/L,瓊脂15g/L,用NaOH調(diào)pH至7.5)上于溫度37°C條件下培養(yǎng)12小時，挑取白色菌落，在LB液體培養(yǎng)基(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaC110g/L，卡那霉素50mg/L，用NaOH調(diào)pH至7.5)中于溫度37°C條件下培養(yǎng)過夜。堿法提取其質(zhì)粒。將提取的質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶HindIII和KasI酶切后鑒定，并將陽性克隆進(jìn)行測序鑒定，結(jié)果表明重組表達(dá)載體DBN100024在HindIII和KasI位點(diǎn)間的核苷酸序列為序列表中SEQ ID NO:1所示核苷酸序列，即PAT核苷酸序列。
[0052]3、重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌
[0053]對己經(jīng)構(gòu)建正確的重組表達(dá)載體DBN100024用液氮法轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌LBA4404(Invitrgen, Chicago, USA, CAT:18313-015)中，其轉(zhuǎn)化條件為:100 μ L 農(nóng)桿菌 LBA4404、3 μ L質(zhì)粒DNA (重組表達(dá)載體);置于液氮中10分鐘，37°C溫水浴10分鐘；將轉(zhuǎn)化后的農(nóng)桿菌LBA4404接種于LB試管中于溫度28°C、轉(zhuǎn)速為200rpm條件下培養(yǎng)2小時，涂于含50mg/L的利福平(Rifampicin)和100mg/L的卡那霉素(Kanamycin)的LB平板上直至長出陽性單克隆，挑取單克隆培養(yǎng)并提取其質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶ApaLI和EcoRV酶切后進(jìn)行酶切驗(yàn)證，結(jié)果表明重組表達(dá)載體DBN100024結(jié)構(gòu)完全正確。
[0054]第二實(shí)施例、轉(zhuǎn)基因大豆植株的獲得
[0055]大豆種子萌發(fā):將成熟的大豆種子(中黃13) 100粒接種在大豆萌發(fā)培養(yǎng)基(B5鹽3.lg/L，B5維他命，蔗糖20g/L，瓊脂8g/L，pH5.6)上進(jìn)行萌發(fā)，培養(yǎng)條件為:溫度25±1°C，光周期為16/8h。[0056]預(yù)處理:萌發(fā)I天后，去除子葉和第I片真葉，將該裸露的分生組織接種到含有細(xì)胞分裂素的預(yù)處理培養(yǎng)基(MS鹽4.3g/L、B5維他命、蔗糖20g/L、瓊脂8g/L、2-嗎啉乙磺酸(MES ) 4g/L、玉米素(ZT ) 2mg/L、6-芐基腺嘌呤(6-BAP ) lmg/L、乙酰丁香酮(AS ) 40mg/L,pH5.3)，在此步驟中加入了細(xì)胞分裂素，使分生組織區(qū)的細(xì)胞處于活躍狀態(tài)，同時在培養(yǎng)基還加入了 AS，預(yù)處理3天，將預(yù)處理后的組織塊用解剖刀的刀背進(jìn)行創(chuàng)傷5刀，創(chuàng)傷后進(jìn)行超聲波處理3分鐘。
[0057]農(nóng)桿菌菌液的制備:挑取含有DBN100024的農(nóng)桿菌單菌落，用槍頭在加有卡那霉素(Kanamycin)的固體YP培養(yǎng)板(酵母提取物5g、蛋白胨10g、氯化鈉5g、瓊脂15g、卡那霉素100mg/L)上劃線，在28°C黑暗條件下培養(yǎng)2-3天。刮取YP培養(yǎng)板上的菌斑，在新的YP培養(yǎng)板上再培養(yǎng)I天，刮取培養(yǎng)3-4天的菌落,懸浮在5ml的侵染液(即侵染培養(yǎng)基(MS鹽2.15g/L、B5維他命、蔗糖20g/L、葡萄糖10g/L、乙酰丁香酮(AS) 40mg/L、2_嗎啉乙磺酸(MES) 4g/L、玉米素(ZT) 2mg/L，pH5.3))中，將農(nóng)桿菌菌液混勻，將其濃度調(diào)整為OD660=0.5-0.8。
[0058]農(nóng)桿菌侵染大豆分生組織塊:將農(nóng)桿菌菌液(10_15ml)與大豆分生組織塊(100個)一起放置至少3小時；侵染結(jié)束后將農(nóng)桿菌菌液吸出，并用濾紙將附著在大豆分生組織塊上的農(nóng)桿菌菌液徹底吸干。
[0059]農(nóng)桿菌與大豆分生組織塊共培養(yǎng):將吸干農(nóng)桿菌菌液的分生組織塊轉(zhuǎn)移到共培養(yǎng)培養(yǎng)基(MS鹽4.3g/L、B5維他命、蔗糖20g/L、葡萄糖10g/L、2_嗎啉乙磺酸(MES) 4g/L、玉米素(ZT) 2mg/L、瓊脂8g/L，pH5.6)上，分生組織塊與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)3天。
[0060]大豆分生組織塊的恢復(fù):將共培養(yǎng)后的分生組織塊轉(zhuǎn)移到恢復(fù)培養(yǎng)基(B5鹽
3.lg/L、B5維他命、2-嗎啉乙磺酸(MES) lg/L、蔗糖30g/L、玉米素(ZT) 2mg/L、瓊脂8g/L，頭孢霉素150mg/L,谷氨酸100mg/L,天冬氨酸100mg/L,pH5.6)上,恢復(fù)3天,以消除農(nóng)桿菌并為侵染細(xì)胞提供恢復(fù)期。
[0061]大豆分生組織塊的篩選:恢復(fù)期結(jié)束后，將分生組織塊轉(zhuǎn)移到篩選培養(yǎng)基(B5鹽3.lg/L、B5維他命、2-嗎啉乙磺酸(MES)lg/L、蔗糖30g/L、6_芐基腺嘌呤(6_BAP)lmg/L、瓊脂8g/L,頭孢霉素150mg/L,谷氨酸100mg/L,天冬氨酸100mg/L,草丁膦6mg/L, pH5.6)上，導(dǎo)致轉(zhuǎn)化的細(xì)胞選擇性生長，篩選3周后獲得抗性組織塊(100個)。
[0062]大豆抗性組織塊再生成植物:將抗性組織塊轉(zhuǎn)移到B5分化培養(yǎng)基(B5鹽3.lg/L、B5維他命、2-嗎啉乙磺酸(MES) lg/L、蔗糖30g/L、玉米素(ZT) lmg/L、瓊脂8g/L、頭孢霉素150mg/L、谷氨酸50mg/L、天冬氨酸50mg/L、赤霉素lmg/L、生長素lmg/L、草丁膦6mg/L,pH5.6)上，25°C下培養(yǎng)分化3周；分化出來的小苗轉(zhuǎn)移到B5生根培養(yǎng)基(B5鹽3.lg/L、B5維他命、2-嗎啉乙磺酸(MES) lg/L、蔗糖30g/L、瓊脂8g/L、頭孢霉素150mg/L、吲哚-3-丁酸(IBA) lmg/L)上，25°C下培養(yǎng)至約IOcm高，移至溫室培養(yǎng)。在溫室中，每天于26°C下培養(yǎng)16小時，再于20°C下培養(yǎng)8小時，可以獲得轉(zhuǎn)基因植株。
[0063]第三實(shí)施例、用TaqMan驗(yàn)證轉(zhuǎn)入PAT核苷酸序列的大豆植株
[0064]取轉(zhuǎn)入PAT核苷酸序列的大豆植株的葉片約IOOmg作為樣品,用Qiagen的DNeasyPlant Maxi Kit提取其基因組DNA，通過Taqman探針熒光定量PCR方法檢測PAT基因的拷貝數(shù)。同時以野生型大豆植株作為對照，按照上述方法進(jìn)行檢測分析。實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)，取平均值 。
[0065]檢測PAT基因拷貝數(shù)的具體方法如下:
[0066]步驟11、取轉(zhuǎn)入PAT核苷酸序列的大豆植株和野生型大豆植株的葉片各lOOmg，分別在研缽中用液氮研成勻漿，每個樣品取3個重復(fù)；
[0067]步驟12、使用Qiagen的DNeasy Plant Mini Kit提取上述樣品的基因組DNA,具體方法參考其產(chǎn)品說明書；
[0068]步驟13、用NanoDrop2000 (Thermo Scientific)測定上述樣品的基因組DNA濃度；
[0069]步驟14、調(diào)整上述樣品的基因組DNA濃度至同一濃度值，所述濃度值的范圍為80_100ng/μ I ；
[0070]步驟15、采用Taqman探針熒光定量PCR方法鑒定樣品的拷貝數(shù)，以經(jīng)過鑒定已知拷貝數(shù)的樣品作為標(biāo)準(zhǔn)品，以野生型大豆植株的樣品作為對照，每個樣品3個重復(fù)，取其平均值；熒光定量PCR引物和探針序列分別是:
[0071]以下引物和探針用來檢測PAT核苷酸序列:
[0072]引物I (PFl):CAGTTGAGATTAGGCCAGCTACAG 如序列表中 SEQ ID N0:4 所示；
[0073]引物2 (PRl):TTCACTGTAGACGTCTCAATGTAATGG 如序列表中 SEQ ID N0:5 所示；
[0074]探針I(yè) (PPl):CAGCTGATATGGCCGCGGTTTGTG 如序列表中 SEQ ID NO:6 所示；
[0075]PCR反應(yīng)體系為:
[0076]
【權(quán)利要求】
1.一種轉(zhuǎn)化大豆的方法，其特征在于，包括: 大豆種子萌發(fā)后去除子葉和第一片真葉，獲得裸露的分生組織； 所述裸露的分生組織接種到含有細(xì)胞分裂素的預(yù)處理培養(yǎng)基上進(jìn)行預(yù)處理； 農(nóng)桿菌侵染所述預(yù)處理后的分生組織塊。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述轉(zhuǎn)化大豆的方法，其特征在于，所述細(xì)胞分裂素為lmg/L6-芐基腺嘌呤和2mg/L玉米素的任意一種或任意組合。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述轉(zhuǎn)化大豆的方法，其特征在于，所述預(yù)處理培養(yǎng)基還包括乙酰丁香酮。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述轉(zhuǎn)化大豆的方法，其特征在于，還包括所述預(yù)處理后的分生組織塊創(chuàng)傷后進(jìn)行超聲波處理2-4分鐘。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述轉(zhuǎn)化大豆的方法，其特征在于，還包括超聲波處理后的分生組織塊在含有選擇劑的 培養(yǎng)基上培養(yǎng)，所述選擇劑是草丁膦。
6.一種生產(chǎn)穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的大豆植物的方法，其特征在于，包括: 大豆種子萌發(fā)后去除子葉和第一片真葉，獲得裸露的分生組織； 所述裸露的分生組織接種到含有細(xì)胞分裂素的預(yù)處理培養(yǎng)基上進(jìn)行預(yù)處理； 農(nóng)桿菌侵染所述預(yù)處理后的分生組織塊； 侵染后的分生組織塊與所述農(nóng)桿菌共培養(yǎng)； 在含有選擇劑的培養(yǎng)基上培養(yǎng)并選擇轉(zhuǎn)化的抗性組織； 轉(zhuǎn)化的抗性組織再生為大豆植物。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述生產(chǎn)穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的大豆植物的方法，其特征在于，所述細(xì)胞分裂素為lmg/L6-芐基腺嘌呤和2mg/L玉米素的任意一種或任意組合。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述生產(chǎn)穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的大豆植物的方法，其特征在于，所述預(yù)處理培養(yǎng)基還包括乙酰丁香酮。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述生產(chǎn)穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的大豆植物的方法，其特征在于，所述選擇劑是草丁膦。
10.根據(jù)權(quán)利要求6所述生產(chǎn)穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的大豆植物的方法，其特征在于，還包括所述預(yù)處理后的分生組織塊創(chuàng)傷后進(jìn)行超聲波處理2-4分鐘。
【文檔編號】C12N15/84GK103525864SQ201310546099
【公開日】2014年1月22日 申請日期:2013年11月6日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月6日
【發(fā)明者】賈志偉, 劉雁華 申請人:北京大北農(nóng)科技集團(tuán)股份有限公司, 北京大北農(nóng)科技集團(tuán)股份有限公司生物技術(shù)中心