黑靈芝真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白的制備方法及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】一種生物基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】的黑靈芝真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白的制備方法及其應(yīng)用，該黑靈芝真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白基因具有SEQ?ID?NO.1所示核苷酸序列。本發(fā)明對(duì)該重組真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白基因表達(dá)于大腸桿菌獲得高表達(dá)量目的蛋白，并且證明其對(duì)乳腺癌細(xì)胞具有很好的凝集作用。這對(duì)于利用基因工程的方法大量生產(chǎn)重組真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白與利用該蛋白開發(fā)成一種新型的抗腫瘤制劑的應(yīng)用提供了一種新的方向，可廣泛用于保健食品及生物醫(yī)藥領(lǐng)域。
【專利說(shuō)明】黑靈芝真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白的制備方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及的是一種分子生物學(xué)、基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】的方法，具體是一種黑靈芝真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白的制備方法及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白(fugal immunomodulatory proteins, FIPs)是從靈芝中分離得到的繼多糖和三萜類化合物后，又一類活性物質(zhì)。在FIPs家族中，目前已經(jīng)報(bào)道有7種蛋白，分別為命名為 LZ-8 (FIP-glu)、FIP-gts、FIP-fve、FIP-vvo、FlP-gja (AY987805)、FlP-gmi和FlP-gsi,分別來(lái)源于赤靈芝(Ganodermalucidum)、松杉靈芝(G.tsugae)、金針恭(Flammulinavelutipes)、草? (Volvarielavolvacea)、紫靈芝(G.japoncium)、小抱靈芝(G.microsporum)及紫芝(G.sinensis) [Li QZ, Wang XF, Zhou Xff.Recent status andprospects of the fungal immunomodulatory protein family.Critical Reviews in Biotechnology.2011, 31 (4):365-375]。該蛋白家族中，直接從天然蕈菌中分離得到的真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白僅有四種，它們分別是:LZ-8 (FIP-glu)、FIP-gts、FIP-fve、FIP-vvo，其余的真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白則是通過(guò)基因重組技術(shù)表達(dá)而來(lái)，其氨基酸序列是由基因序列翻譯后得到的。Wang XF等經(jīng)過(guò)比對(duì)發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)IPs的氨基酸序列同源性較高，一般可達(dá)60-70%左右[Wang XF, Su KQ, Bao Tff, et, al.1mmunomodulation effects of fungal proteins.CurrentTopics in Nutraceutical Research.2012，10 (I):1-11.]。 [0003]FIPs具有一定的免疫調(diào)節(jié)功能，在抗過(guò)敏、抗腫瘤、促進(jìn)淋巴細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞分泌細(xì)胞因子和抗移植排斥等方面均有重要作用，其中抗腫瘤作用尤其引起大家興趣。Lin JW等經(jīng)MTT (四唑鹽)實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞儀檢測(cè)，在畢赤酵母中表達(dá)的FIP-glu可以通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡抑制人類白血病NB4的表達(dá)水平(32ii g/mL FIP-glu可誘導(dǎo)約35%的人類白血病NB4細(xì)胞凋亡)，具有一定的抗癌活性[Lin Jff, Hao LX, Xu GX, et al.Molecularcloning and recombinant expression of a gene encoding a fungal immunomodulatoryprotein from GanodermaIucidum in Pichiapastoris.World Journal of Microbiologyand Biotechnology, 2008，25 (3): 383-390]。Liao CH 等在大腸桿菌中表達(dá)的 FIP-gts 在人類肺腺癌A549細(xì)胞中表現(xiàn)出抗腫瘤活性。當(dāng)FIP-gts的濃度達(dá)到4-10ii g/mL時(shí)，可有效控制癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，具有很好的抗腫瘤效果[Liao CH, Hsiao YM, Lin CH.1nductionof premature senescence in human lung cancer by fungal immunomodulatoryprotein from Ganodermatsugae.Food and Chemical Toxicology, 2008, 46(5):1851-1859]。Liao等(2006)研究認(rèn)為，F(xiàn)IP-gts雖能顯著抑制人類肺腺癌A549癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，但是不會(huì)影響正常MRC-5纖維原細(xì)胞的生長(zhǎng)，它在mRNA水平下調(diào)端粒酶催化亞基的表達(dá)，抑制端粒酶的活性并具有劑量依賴效應(yīng)。端粒酶在正常的體細(xì)胞里一般不被活化，它的活性有無(wú)往往會(huì)成為決定細(xì)胞無(wú)限增殖的關(guān)鍵因素。同時(shí)，F(xiàn)IP-gts可以促進(jìn)NK細(xì)胞(natural killer cell)、巨曬細(xì)胞以及活化血清抗體的生成,有效地調(diào)節(jié)免疫功能,一定程度上也可以抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)[Liao CH, Hsiao YM, Hsu CP, et al.Transcriptionallymediated inhibition of telomerase of fungal immunomodulatory protein fromGanodermatsugae in A549human lung adenocarcinoma cell line.Molecular Carcinogenesis，2006，45(4):220-229]。
[0004]FIPs藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)研究證明，F(xiàn)IPs家族的蛋白在不同藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)時(shí)，不同F(xiàn)IP對(duì)不同實(shí)驗(yàn)樣品起作用而且其作用結(jié)果有劑量依賴性。以[3H]作為標(biāo)記，用LZ-8 (FIP-glu)處理小鼠脾臟細(xì)胞。當(dāng)LZ-8濃度為3.13iig/mL時(shí)，[3H]吸收值達(dá)到最大峰值[Kino K，Yamashita A, Yamaoka K，et al.1solated and characterizationof a new immunomodulatoryprotein Ling Zh1-8(LZ-8), from Ganodermalucidum,Journal of Biological Chemistry, 1989，264(I):472-478]。FIP-fve 和 FIP-vvo 對(duì)人外周血淋巴細(xì)胞增殖活性的最佳濃度分別為lOOiig/mL和5iig/mL (Ko JL, HsuCl,Lin RH,et al.A new fungal immunomodulatoryprotein FlP-fveisolatedfrom the edible mushroom, Flammulianvelutlpesand its complete aminoacid sequence,European Journal of Biochemistry, 1995, 228(2):244-249.HsuHC, HsuCI, Lin RH,et al.Fip-vvo, a new fungalimmunomodulatoryprotein isolatedfrom Volvarielavolvacea, Journal of Biological Chemistry, 1997，323(2):557-565)。Wang等研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)IP-fve表現(xiàn)出促使人外周血淋巴細(xì)胞由G1/G0期向S期過(guò)渡的促有絲分裂的作用。IOOyg FIP-fve與人外周血單核細(xì)胞共同培養(yǎng)72h后，結(jié)果發(fā)現(xiàn)61 %的淋巴細(xì)胞DNA含量與G0/G1期細(xì)胞的DNA含量一致，而26 %和12 %的淋巴細(xì)胞DNA含量，分別相當(dāng)于S和G2/M期細(xì)胞的DNA含量(Wang PH, Hsu Cl，TangSC, et al.Fungal immunomodulatoryprotein from Flammulinavelutipesinducesinterferon-y production through p38mitogen_activated protein kinase signalingpathway, Agricultural and Food Chemistry, 2004，52 (9): 2721-2725)。然而在臨床和醫(yī)藥應(yīng)用的實(shí)踐中，對(duì)蛋白使用的劑量均有一定的要求，因此，把此類蛋白應(yīng)用于醫(yī)藥領(lǐng)域首要的問(wèn)題是如何進(jìn)行規(guī)?；罅可a(chǎn)？由于真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白在天然蘑菇(或蕈菌)中的含量非常低(20-80mg/Kg)(林景衛(wèi)，孫非，張韌，等.真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白的研究進(jìn)展.中華免疫學(xué)雜志.2005，21 (6): 477-480)，加之在蛋白提取過(guò)程中真菌多糖和其它成分的干擾，使得蛋白的獲得的成本較高。因此建立穩(wěn)定的原核(或真核)表達(dá)體系，通過(guò)異源表達(dá)和發(fā)酵工業(yè)過(guò)程大量生產(chǎn)真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白勢(shì)在必行。
[0005]在真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白的異源表達(dá)中，最早被采用進(jìn)行研究的是原核表達(dá)系統(tǒng)，這也是目前掌握最為成熟的表達(dá)系統(tǒng)。常用的表達(dá)載體有pET-28a、pET-28b和pET_30等，表達(dá)的宿主細(xì)胞包括有大腸桿菌TGl細(xì)胞、大腸桿菌M15細(xì)胞、大腸桿菌BL21細(xì)胞等。李奇璋等將來(lái)源于紫芝(Ganodermasineses)的FlP-gsi轉(zhuǎn)入pET_30a表達(dá)載體中同樣可以在大腸桿菌BL21細(xì)胞中得到表達(dá)，獲得了重組的紫芝真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白[李奇璋，王雪飛，黃蕾，等.紫芝免疫調(diào)節(jié)蛋白基因的原核表達(dá)與功能分析.西北植物學(xué)報(bào)，2010，30 (I): 35-40]。大腸桿菌M15細(xì)胞也是目前表達(dá)真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白基因主要宿主之一，LiQZ等把來(lái)源于紅靈芝的真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白基因LZ-8 (FIP-glu)克隆到pQE-30表達(dá)載體中，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌M15細(xì)胞中，同樣獲得了重組的真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白FIP-glu[Li QZ, WangXF, Bao Tff, et al.1n vitro synthesis of a recombinant fungal immunomodulatoryprotein from Lingzhi or Reishi medicinal mushroom, Ganoderma lucidum(ff.Curt.:Fr.)P.Karst.(Aphyllophoromycetideae) and analysis of its immunomodulatoryactivity.1nternational Journal of Medicinal Mushrooms, 2010，12 (4): 347-358]用于進(jìn)一步的科學(xué)研究或產(chǎn)品研發(fā)。同樣，Li QZ等人還把來(lái)源于紫芝(Ganodermasinensis)的真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白基因FlP-gsi，轉(zhuǎn)入pQE-30表達(dá)載體中，同樣在大腸桿菌M15細(xì)胞中表達(dá)，也獲得了重組的紫芝真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白FIP-gsi[Li QZ，Wang XF, Chen YY, etal.Cytokines expression induced by Ganoderma sinensis fungal immunomodulatoryproteins (FlP-gsi)in mouse spleen cells.Applied Biochemistry and Biotechnology,2010,162(5):1403-1413]。于此同時(shí)，在某些時(shí)候大腸桿菌TGl細(xì)胞同樣也可以作為FIPs表達(dá)的宿主細(xì)胞，1997年Lin等人通過(guò)將FIP-gts基因連接到大腸桿菌細(xì)胞TGl中，獲得了與谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶組成融合蛋白標(biāo)記物(GST)，再被凝血酶消化后FIP-gts產(chǎn)量高達(dá) 20mg/L[Lin W H, Hung C H, Hsu Cl, et al.Dimerization of the N-terminalamphipathic a -helix domain of the fungal immunomodulatory protein fromGanoderma tsugae(Fip-gts)defined by a yeast two-hybrid system and site-directedmutagenesis.Journal of Biological Chemistry,1997,272(32):20044-20048]。 綜上述所，現(xiàn)有的真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白基因在大腸桿菌中的表達(dá)，其表達(dá)量大約在約20~30mg/L[葉波平，王凡，梁亦馨，等.LZ-8基因在大腸桿菌中的表達(dá).藥物生物技術(shù)，2002，9 (I):21-23 ;白杰英，曾林，李彥舫，等.真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)及其抗體制備.實(shí)用醫(yī)藥雜志，2006，23 (10): 1205-1207]，表達(dá)的載體和宿主細(xì)胞不同，表達(dá)蛋白的修飾也不盡相同，因而也表現(xiàn)出不同的生理活性。
[0006]在先前的實(shí)驗(yàn)中，我們采用同源克隆方法，以黑靈芝(Ganodermaatrum)基因組DNA為模板，對(duì)真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白(FIPs)基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分析結(jié)果表明:黑靈芝真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白基因序列包含336bp，可編碼111個(gè)氨基酸殘基，命名為FlP-gas。FlP-gas分子量為12.4kDa，理論等電點(diǎn)為4.80， 符合FIPs的特性，是FIPs家族一新成員。對(duì)FlP-gas進(jìn)行序列分析發(fā)現(xiàn)其氨基酸序列具有FIPs的保守序列模式，與紫靈芝(G.japoncium)(AAX98241),紫芝(G.sinensis),小抱靈芝(G.microsporum),赤靈芝(G.lucidum)(AAA33350),松杉靈芝(G.tsugae),金針燕(Flammulinavelutipes) (ADB24832)及草燕(Volvarielavolvacea)的 FIP 序列的同源性分別為 99%, 98%, 87%, 86%, 86%, 61%, 55% (蘇愷琪，王雪飛，周選圍.黑靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白基因的克隆和生物信息學(xué)分析.上海交通大學(xué)學(xué)報(bào)(農(nóng)業(yè)科學(xué)版).2012,30(1):65-71.)。上述黑靈芝FIP基因的克隆和分析為進(jìn)一步的原核表達(dá)提供了基因資源。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的上述不足，提出一種黑靈芝真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白的制備方法及其應(yīng)用，能夠?qū)θ橄侔┘?xì)胞具有很好的凝集作用。這對(duì)于利用基因工程的方法大量生產(chǎn)重組真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白與利用該蛋白開發(fā)成一種新型的抗腫瘤制劑的應(yīng)用提供了一種新的方向，可廣泛用于保健食品及生物醫(yī)藥領(lǐng)域。
[0008]本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:
[0009]本發(fā)明涉及一種FlP-gas蛋白的分離純化方法,所述的FlP-gas基因,其核苷酸序列如Seq ID N0.1所示，通過(guò)同源克隆技術(shù)從黑靈芝(G.atrum)菌絲體中克隆得到，將黑靈芝真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白FlP-gas基因構(gòu)建成原核表達(dá)載體pET-30a-FIP-gas轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)其表達(dá)；原核表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)金屬鎳離子螯合柱純化后得到。
[0010]所述的分離純化方法，具體包括如下步驟:
[0011]I)構(gòu)建表達(dá)載體； [0012]2)轉(zhuǎn)化至大腸桿菌；
[0013]3)擴(kuò)大培養(yǎng)；
[0014]4) IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)；
[0015]5)分離純化；
[0016]所述的黑靈芝真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白為黑靈芝真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白基因FlP-gas的表達(dá)產(chǎn)物，其序列如SEQ ID N0.1所示；
[0017]所述的大腸桿菌宿主細(xì)胞為大腸桿菌BL21菌株。
[0018]優(yōu)選地，所述的步驟I)構(gòu)建表達(dá)載體的具體方法為:
[0019]1.1)根據(jù)黑靈芝真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白基因FlP-gas的序列，設(shè)計(jì)引物，并在上游和下游引物上分別添加限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)Bam H I和Hind III，以構(gòu)建原核表達(dá)載體；
[0020]1.2)以FlP-gas基因?yàn)槟０?，?jīng)PCR擴(kuò)增后，將FlP-gas基因克隆至中間載體；
[0021]1.3)用雙酶切將FlP-gas片斷從中間載體上切下，回收相應(yīng)片段，用T4連接酶16 0C連接過(guò)夜得表達(dá)載體。
[0022]優(yōu)選地，所述的步驟1.2中的所述的中間體為pMD18_T simple vector或pET_30a。
[0023]優(yōu)選地，所述的步驟2)的具體方法為:將所述的表達(dá)載體加入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞冰上放置30min，之后42°C循環(huán)水浴熱擊90s，迅速冰浴2min。加入800 u L LB培養(yǎng)液37°C慢搖復(fù)蘇lh。取200 ii L菌液菌液涂布在含有50mg/mL的卡那霉素的LB平板，篩選轉(zhuǎn)化子并挑取陽(yáng)性克隆。
[0024]優(yōu)選地，所述的步驟3)的具體方法為:將獲得的陽(yáng)性克隆接種于含有50mg/mL的卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C振搖培養(yǎng)過(guò)夜，次日以2%接種量接種，37°C繼續(xù)發(fā)酵。
[0025]優(yōu)選地，所述的步驟4)的具體方法為:當(dāng)發(fā)酵液0D_達(dá)到0.5~0.7時(shí)，加入IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，IPTG的終濃度為ImM。
[0026]優(yōu)選地，所述的步驟5)的具體方法為:
[0027]5.1)將經(jīng)過(guò)IPTG誘導(dǎo)的菌液離心收集細(xì)胞，懸浮于緩沖液中；將混合物置于液氮中冷凍，之后再于冰水中融化；
[0028]5.2 )將融化后的樣品在冰水混合物中超聲波破碎；
[0029]5.3)超聲處理過(guò)的菌液離心取上清，上N1-NTA柱，用緩沖液I洗柱后，用緩沖液2將目的蛋白洗脫出來(lái)；
[0030]所述的緩沖液I 為 50mM NaH2PO4, 300mMNaCl, 20mM imidazole, pH 為 8.0 的水溶液；
[0031]所述的緩沖液2 為 50mM NaH2PO4, 3OOmMNaCI, 25OmM imidazole, pH8.0 的水溶液。
[0032]本發(fā)明涉及上述方法制備得到的FlP-gas蛋白的應(yīng)用，將其用于制備抗腫瘤藥物。
[0033]所述的FlP-gas蛋白，經(jīng)細(xì)胞凝集試驗(yàn)測(cè)定其對(duì)人類乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231(Breast adenocarcinoma)的凝集作用，結(jié)果表明重組基因表達(dá)的真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白FlP-gas,在體外可抑制人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231 (Breast adenocarcinoma)的繁殖,說(shuō)明該蛋白對(duì)這種腫瘤細(xì)胞株有抑制作用。
[0034]本發(fā)明中所涉及的生物材料及試劑除特別注明外，均能夠從市售渠道獲得。
[0035]本發(fā)明中所述的黑靈芝真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白FlP-gas基因序列，已經(jīng)由本實(shí)驗(yàn)室公開報(bào)道，見上海交通大學(xué)學(xué)報(bào)(農(nóng)業(yè)科學(xué)版)，2012年第30卷第I期第65-71頁(yè)，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0036]本發(fā)明中所涉及的大腸桿菌BL21已在(李奇璋，王雪飛，黃蕾，周選圍.紫芝免疫調(diào)節(jié)蛋白基因的原核表達(dá)與功能分析，西北植物學(xué)報(bào)，2010,30(1):0035 - 0040)中公開；BL21大腸桿菌菌株可通過(guò)公開市售的商業(yè)渠道取得，如北京博邁德科技發(fā)展有限公司，公司地址:北京市海淀區(qū)西四環(huán)中路甲59號(hào)。 [0037]本發(fā)明中所述的金屬鎳離子螯合(N1-NTA)柱適用于從細(xì)菌中抽提通常含有連續(xù)
6個(gè)組氨酸尾(His Tag Protein)的具有天然結(jié)構(gòu)的可溶性重組蛋白質(zhì)(Native Protein),可從公開渠道購(gòu)買，如上海浩然生物技術(shù)有限公司，公司地址:上海市徐匯區(qū)石龍路345弄7號(hào)春天商務(wù)樓401室。
[0038]本發(fā)明中所述的細(xì)胞凝集試驗(yàn)按照常規(guī)的細(xì)胞凝集反應(yīng)的操作步驟進(jìn)行。其中選用的人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231 (Breast adenocarcinoma)購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù),地址:上海市徐匯區(qū)岳陽(yáng)路320號(hào)。腫瘤細(xì)胞的培養(yǎng)按照常規(guī)方法進(jìn)行。
[0039]在本發(fā)明中，可包括含有重組真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白基因FlP-gas的載體、所述的載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
[0040]本發(fā)明利用重組基因表達(dá)的真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白FlP-gas，在體外可抑制人和乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231 (Breast adenocarcinoma)的繁殖,說(shuō)明該蛋白對(duì)這種腫瘤細(xì)胞株有抑制作用。該基因?qū)⑼ㄟ^(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)轉(zhuǎn)入大腸桿菌，誘導(dǎo)培養(yǎng)后，通過(guò)蛋白表達(dá)和純化，在抗乳腺癌藥物的開發(fā)中有巨大的應(yīng)用潛力。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0041]圖1為重組黑靈芝真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白電泳圖(A)及Western Blot檢測(cè)圖(B)。
[0042]圖2為重組黑靈芝真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白對(duì)人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231 (Breastadenocarcinoma)細(xì)胞的凝集作用示意圖；
[0043]其中:圖2-1為reFIP-gas蛋白加入6h后乳腺癌細(xì)胞凝集情況，圖2_2為reFIP-gas蛋白加入12h后乳腺癌細(xì)胞凝集情況；圖2_3為reFIP-gas蛋白加入24h后乳腺癌細(xì)胞凝集情況。
【具體實(shí)施方式】
[0044]下面對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例作詳細(xì)說(shuō)明，本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過(guò)程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。
實(shí)施例1
[0045]黑靈芝真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白基因FlP-gas原核表達(dá)載體的構(gòu)建:[0046]1)根據(jù)黑靈芝真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白基因FlP-gas的序列，設(shè)計(jì)能擴(kuò)增出其基因全長(zhǎng)的引物，并在上游和下游引物上分別添加限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)Bam H I和Hind III，以構(gòu)建原核表達(dá)載體。
[0047]2)以黑靈芝真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白基因FlP-gas為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增后，將FlP-gas基因克隆至中間載體(如PMD18-T simple vector),測(cè)序結(jié)果與所報(bào)道的黑靈芝真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白基因FlP-gas序列比較，一致性為100%，表明擴(kuò)增沒(méi)有出現(xiàn)錯(cuò)配。
[0048]3)根據(jù)引物兩端設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)，用雙酶切(pET_30a載體可用Hind III和Bam HI)將FlP-gas片斷從pMD18-T simple vector上切下，回收相應(yīng)片段，用T4連接酶16°C連接過(guò)夜。
[0049]4)連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21宿主細(xì)胞，用含有50mg/mL的卡那霉素的LB平板篩選轉(zhuǎn)化子并挑取陽(yáng)性克隆，測(cè)序。
[0050]5)提取克隆質(zhì)粒，即得到重組靈芝屬內(nèi)真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)載體pET30a-FIP-gaSo
實(shí)施例2
[0051 ] 黑靈芝真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白FlP-gas的誘導(dǎo)表達(dá)與純化
[0052]1.重組靈芝屬內(nèi)真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白FlP-gas的誘導(dǎo)表達(dá)及Western blot檢測(cè)
[0053]1)將實(shí)施例1中獲得的單克隆接種于含有50mg/mL的卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C振搖培養(yǎng)過(guò)夜。
[0054]2)次日以2%接種量接種于較大體積培養(yǎng)液。37°C繼續(xù)培養(yǎng)，至0D_達(dá)到0.5~
0.7時(shí)，加入IPTG，使IPTG的終濃度達(dá)到ImM。
[0055]3)每0、0.5、1、2、3、4、511取出ImL至_20°C保存?zhèn)溆谩⑺〉镁簶悠?，OOOrpm離心 20min 以收集菌體，去上清，菌體用 100 u L2 X SDS-PAGE Sample buffer (IOOmMpH6.8Tris-Cl，4%(ff/V) SDS, 0.2%(ff/V) BPB, 20%(ff/V) glycerine, 2%(ff/V) ^ -ME)懸浮，并在95°C水浴鍋中保溫5min。之后再分別用兩塊15%SDS_PAGE膠檢測(cè)。一塊用于考馬斯亮藍(lán)染色，另一塊用于Western blot檢測(cè)(圖1)。
[0056]圖1所示，上方(A)為含有重組表達(dá)載體pET30-FIP_gas的大腸桿菌BL21細(xì)胞經(jīng)IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)電泳圖，下方(B)為靈芝黑靈芝真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白FlP-gas的WesternBlot檢測(cè)。泳道M為marker，泳道1_7分別為誘導(dǎo)時(shí)間0、0.5、1、2、3、4、5小時(shí)的大腸桿菌細(xì)胞，箭頭所示即為黑靈芝真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白FlP-gas。誘導(dǎo)5小時(shí)時(shí)，重組蛋白表達(dá)量為最高。經(jīng)大腸桿菌發(fā)酵，重組靈芝屬內(nèi)真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白的產(chǎn)量高達(dá)29.76mg/L。
[0057]2.重組真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白的分離純化
[0058]1)將經(jīng)過(guò)IPTG誘導(dǎo)的菌液5，OOOrpm離心20min以收集細(xì)胞，用1/10體積的Lysisbuffer (50mM NaH2PO4, 300mM NaCl, 1OmM imidazole, pH8.0)懸??；將混合物置于液氮中冷凍，之后再于冰水中融化；
[0059]2)將融化后的樣品在冰水混合物中超聲波破碎，200~300W超聲6次，每次10s，期間間隔IOs ；
[0060]3)超聲處理過(guò)的菌液于4°C下12，OOOrpm離心20~30min ;取上清,使用N1-NTA柱純化(預(yù)先用10倍柱體積的Lysis buffer平衡);用20倍柱體積的Wash buffer (50mMNaH2PO4, 300mMNaCl, 20mM imidazole, pH8.0)洗柱；目的蛋白由 Elution buffer (50mMNaH2PO4, 300mMNaCl, 250mM imidazole, pH8.0)洗脫出來(lái)。
實(shí)施例3
[0061]重組靈芝屬內(nèi)真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白FlP-gas對(duì)人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231的細(xì)胞凝集試驗(yàn)。
[0062]1.癌細(xì)胞的培養(yǎng)
[0063]乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，在5%C02、37 °C飽和濕度條件下培養(yǎng)，腫瘤細(xì)胞單層貼壁培養(yǎng)。在細(xì)胞鋪滿瓶后，用0.25%胰蛋白酶和0.04%EDTA的PBS液體消化，制備成單細(xì)胞懸浮于0.5%胎牛血清白蛋白(BSA)的DMEM溶液備用，人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231密度調(diào)整到5-7 X 103/100 y L。
[0064]2.細(xì)胞凝集實(shí)驗(yàn)
[0065]I)將實(shí)施例3.1中細(xì)胞濃度調(diào)整到5-7X 103/100 U L的乳腺癌細(xì)胞加入96孔板， 并在CO2培養(yǎng)箱中37 °C培養(yǎng)過(guò)夜。
[0066]2)將重組蛋白FlP-gas用透析袋進(jìn)行透析除去溶液中的咪唑成份，透析液為PBS(IOmM Na2HPO4,137mM NaCl, 2.7mM KCl,2mM KH2PO4, pH7.4)。用 PBS 和細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋至工作濃度?(20 y g/mL, 15 u g/mL, 10 u g/mL, 5 u g/mL, 200ng/mL)。
[0067]3)在96孔板中加入測(cè)試重組蛋白混合物，混合物有4個(gè)濃度梯度g/mL、10ii g/mL、15 u g/mL和20 u g/mL,每個(gè)梯度3個(gè)重復(fù)，加入PBS溶液作為陰性對(duì)照。并在CO2培養(yǎng)箱中37°C培養(yǎng)，分別在6h、12h和24h觀察。
[0068]4)將在顯微鏡下觀察結(jié)果拍照(圖2-1、2-2、2_3)。
[0069]圖2所示，其中A為PBS陰性對(duì)照；B_E加入的reFIP-gas蛋白濃度分別為:B為5 V- g/mL, C 為 10 V- g/mL, D 為 15 u g/mL, E 為 20 u g/mL ;圖 2-lreFIP-gas 蛋白加入 6h 后乳腺癌細(xì)胞凝集情況，圖2-2reFIP-gas蛋白加入12h后乳腺癌細(xì)胞凝集情況；圖2-3reFIP-gas蛋白加入24h后乳腺癌細(xì)胞凝集情況。
[0070]觀察顯示黑靈芝真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白FlP-gas對(duì)人乳腺癌細(xì)胞的抑制結(jié)果如圖2所示。當(dāng)reFIP-gas濃度為5 u g/mL時(shí)，MDA-MB-231細(xì)胞就出現(xiàn)凝集反應(yīng)，細(xì)胞皺縮或拉長(zhǎng)，部分細(xì)胞簇集成團(tuán)，有些細(xì)胞脫壁，細(xì)胞表面反光性變差。細(xì)胞膜皺縮、外突或粘連，有的小泡破裂，或脫落形成凋亡小體。FlP-gas將MDA-MB-231細(xì)胞阻斷在G1/S期，干擾了腫瘤細(xì)胞的正常增殖活動(dòng)。隨著培養(yǎng)時(shí)間增長(zhǎng)和FlP-gas濃度的增加,細(xì)胞凝集活性增強(qiáng),但增強(qiáng)效果不明顯。
【權(quán)利要求】
1.一種FIP-gas蛋白的分離純化方法,其特征在于,所述的FIP-gas基因,其核苷酸序列如Seq ID N0.1所示,通過(guò)同源克隆技術(shù)從黑靈芝(Ganoderma atrum)菌絲體中克隆得到，將黑靈芝真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白FIP-gas基因構(gòu)建成原核表達(dá)載體pET-30a-FIP-gas轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)其表達(dá)；原核表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)金屬鎳離子螯合柱純化后得到； 所述的分離純化方法，具體包括如下步驟: 1)構(gòu)建表達(dá)載體； 2)轉(zhuǎn)化至大腸桿菌； 3)擴(kuò)大培養(yǎng)； 4)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)； 5)分離純化。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是，所述的步驟I)構(gòu)建表達(dá)載體的具體方法為: 1.1)根據(jù)黑靈芝真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白基因FIP-gas的序列，設(shè)計(jì)引物，并在上游和下游引物上分別添加限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)Bam H I和Hind III，以構(gòu)建原核表達(dá)載體； 1.2)以FIP-gas基因?yàn)槟０?，?jīng)PCR擴(kuò)增后，將FIP-gas基因克隆至中間載體； 1.3)用雙酶切將FIP-gas片斷從中間載體上切下，回收相應(yīng)片段，用T4連接酶16°C連接過(guò)夜得表達(dá)載體。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征是，所述的步驟1.2中的所述的中間體為pMD18_T simple vector 或 pET_30a。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是，所述的步驟2)的具體方法為:將所述的表達(dá)載體加入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞冰上放置30min，之后42°C循環(huán)水浴熱擊90s，迅速冰浴2min ;加入800 μ L LB培養(yǎng)液37°C慢搖復(fù)蘇Ih ;取200 μ L菌液菌液涂布在含有50mg/mL的卡那霉素的LB平板，篩選轉(zhuǎn)化子并挑取陽(yáng)性克隆。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是，所述的步驟3)的具體方法為:將獲得的陽(yáng)性克隆接種于含有50mg/mL的卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C振搖培養(yǎng)過(guò)夜，次日以2%接種量接種，37°C繼續(xù)發(fā)酵。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是，所述的步驟4)的具體方法為:當(dāng)發(fā)酵液0D_達(dá)到0.5~0.7時(shí)，加入IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，IPTG的終濃度為ImM。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是，所述的步驟5)的具體方法為: 5.1)將經(jīng)過(guò)IPTG誘導(dǎo)的菌液離心收集細(xì)胞，懸浮于緩沖液中；將混合物置于液氮中冷凍，之后再于冰水中融化； 5.2)將融化后的樣品在冰水混合物中超聲波破碎； 5.3)超聲處理過(guò)的菌液離心取上清，上N1-NTA柱，用緩沖液I洗柱后，用緩沖液2將目的蛋白洗脫出來(lái)。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是，所述的緩沖液I為50mMNaH2PO4, 300mMNaCl,20mM imidazole, pH 為 8.0 的水溶液；所述的緩沖液 2 為 50mM NaH2PO4, 300mMNaCl, 250mMimidazole, pH8.0 的水溶液。
9.一種根據(jù)上述任一權(quán)利要求所述方法制備得到的FIP-gas蛋白的應(yīng)用，其特征在于，將其用于制備抗腫瘤藥物。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用 ，其特征是，所述的腫瘤是指:人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231。
【文檔編號(hào)】C12N15/70GK103739684SQ201410009107
【公開日】2014年4月23日 申請(qǐng)日期:2014年1月9日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月9日
【發(fā)明者】周選圍, 孔應(yīng)予, 叢蔚然 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)