一種草菇免疫調(diào)節(jié)蛋白FIP-vvo80及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白領(lǐng)域，特別涉及一種草菇免疫調(diào)節(jié)蛋白FIP-VVO80 及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 利用大型真菌（蘑菇）及其活性物質(zhì)治療人類疾病在亞洲國(guó)家有著悠久的歷史， 可以追溯到公元前3000年，由于其在免疫調(diào)節(jié)和抗癌方面的出色表現(xiàn)，近十年來(lái)在西方國(guó) 家也逐漸受到重視。過(guò)去對(duì)于大型真菌活性物質(zhì)的研宄多集中在多糖和三萜，對(duì)于蛋白質(zhì) 的研宄相對(duì)較少，但隨著生物技術(shù)在藥物研宄和開發(fā)中的應(yīng)用，特別是對(duì)中草藥中基因、蛋 白和藥理作用之間關(guān)系研宄的逐漸深入，真菌蛋白逐步得到了重視，其中真菌免疫調(diào)節(jié)蛋 白（Fungalimmunomodulatoryprotein，F(xiàn)IP)，由于其具有廣泛的免疫生物活性，而備受國(guó) 內(nèi)外關(guān)注。
[0003] 真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白（Fungalimmunomodulatoryprotein，F(xiàn)IP)是從高等擔(dān)子菌中 分離得到的一類具有免疫調(diào)節(jié)活性的小分子蛋白質(zhì)，其結(jié)構(gòu)與功能與植物凝集素和免疫球 蛋白重鏈可變區(qū)相似，具有促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖、調(diào)控細(xì)胞周期、誘發(fā)細(xì)胞凋亡、影響細(xì)胞因 子的表達(dá)、活化細(xì)胞粘附分子和抗過(guò)敏反應(yīng)等免疫調(diào)節(jié)作用，擁有良好的臨床應(yīng)用前景和 藥用保健價(jià)值。自1989年，日本人Kino從靈芝（Ganodermalucidum)子實(shí)體中分離到第一 個(gè)真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白，命名為L(zhǎng)ingZhi-8 (LZ-8)，并對(duì)其基因序列，氨基酸順序和免疫生理 活性進(jìn)行了測(cè)定。到目前為止，共有8種FIPs被分離純化出來(lái)，它們來(lái)自于靈芝（Ganoderma lucidium)，松杉靈芝（G.tsugae)，紫芝（G.japoncium)，小孢子靈芝（G.microsporum)，甜 靈芝（G.sinense)拱狀靈芝（G.fornicatum)，金針葫（Flammulinavelutipes)和草葫 (Volvariellavolvacea)，分別被命名為L(zhǎng)Z-8 (FIP-glu)，F(xiàn)IP-gts，F(xiàn)IP-gja(AY987805)，F(xiàn)I P-gmi,FlP-sin,FIP-gfo，F(xiàn)IP-fve和FIP-vvo,共同組成了一個(gè)新的蛋白質(zhì)家族 _FIPs。在 FIPs家族中除了金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白（FlP-fve)和草菇免疫調(diào)節(jié)蛋白（FIP-vvo)以外，其 他的FIPs都是從不同種靈芝中分離得到的，這說(shuō)明雖然都是靈芝但由于種類的不同，而具 有不同的免疫調(diào)節(jié)蛋白，甚至同種靈芝中就存在多種免疫調(diào)節(jié)蛋白。例如葉波平等從靈芝 (G.microsporum)中分離到3個(gè)蛋白質(zhì)：LZP-l、LZP-2和LZP-3。體外實(shí)驗(yàn)表明3種靈芝蛋 白具有較強(qiáng)的促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖活性，而且SDS-PAGE表明其分子量與LZ-8不同，所以他們 獲得了 3種新的靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白。這樣的情況同樣發(fā)生在草菇中。除了 1997年Hsu，H. C.等人在草菇子子實(shí)體中通過(guò)分離純化和驗(yàn)證，并經(jīng)過(guò)直接氨基酸測(cè)序得到由112個(gè)氨基 酸組成的分子量約為12. 67KDa的一種草菇免疫調(diào)節(jié)蛋白（FIP-vvo)以外，還有可能存在其 它種草菇免疫調(diào)節(jié)蛋白。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種草菇免疫調(diào)節(jié)蛋白FIP-vvo80及其制備 方法，通過(guò)比較基因組等生物信息學(xué)方法篩選到一種同樣來(lái)源于草菇，但基因序列和氨基 酸序列都不同于FIP-vvo的具有免疫調(diào)節(jié)作用的免疫調(diào)節(jié)蛋白FIP-vvo80,其適用于在保 健品和醫(yī)藥中使用。
[0005] 本發(fā)明提供了一種草菇免疫調(diào)節(jié)蛋白FIP-WO80,所述蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO. 1所示。該草菇免疫調(diào)節(jié)蛋白FIP-wo80全長(zhǎng)113個(gè)氨基酸，理論分子量為12. 79kDa。
[0006] 本發(fā)明還提供并合成了編碼上述草菇免疫調(diào)節(jié)蛋白FIP-VVO80的基因。該基因 cDNA序列如SEQIDNO. 2所示。
[0007] 本發(fā)明通過(guò)一對(duì)引物卩1卩-"〇80-卩(制615'-〇六14丁61'(^4〇：6六(：11^4-3'）和 FIP-vvo80-R(EcoRI5'-CTTAAGTTAITCCACTGGGCA-3'）。用基因克隆的方法得到了這 一草菇免疫調(diào)節(jié)蛋白FIP-VV〇80的基因序列，DNA全序列分析結(jié)果表明，F(xiàn)IP-VV〇80基因全 長(zhǎng) 339bp。
[0008] 該蛋白屬于一種草菇免疫調(diào)節(jié)蛋白。將其cDNA序列在GenBank中進(jìn)行BLAST比 對(duì)，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)與其相似的基因序列，而將其氨基酸序列在NCBI的無(wú)冗余蛋白序列數(shù)據(jù)庫(kù) (nr)中進(jìn)行BLAST比對(duì)發(fā)現(xiàn)，該蛋白與來(lái)源于平蓋靈芝（G.applanatum)和小孢子靈芝 (G.microsporum)免疫調(diào)節(jié)蛋白的相似性達(dá)到63%，與來(lái)自于赤芝（G.lucidum)免疫調(diào)節(jié) 蛋白LZ-8的相似性為62%，與金針菇（F.velutipes)免疫調(diào)節(jié)蛋白FlP-fve為57%。說(shuō) 明FIP-VV〇80是一種新的真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白，其編碼的基因是一個(gè)新的基因。并為此編碼 此蛋白的基因改造和在各種外源基因表達(dá)系統(tǒng)中高效表達(dá)提供優(yōu)良的基因資源。
[0009] 本發(fā)明還提供了包含上述草菇免疫調(diào)節(jié)蛋白FIP-VVO80基因的重組載體，優(yōu)先選 為pET-28b(+)。將本發(fā)明的草菇免疫調(diào)節(jié)蛋白FIP-VV〇80基因插入到表達(dá)載體合適的限制 性酶切位點(diǎn)之間，使其核苷酸序列可操作的與表達(dá)調(diào)控序列相連接。作為本發(fā)明的一個(gè)最 優(yōu)選的方案，優(yōu)選為將草菇免疫調(diào)節(jié)蛋白FIP-VV〇80基因插入到pET-28b(+)上的EcoRI和 Ndel限制性酶切位點(diǎn)之間，得到重組大腸表達(dá)質(zhì)粒pET-FIP-vv〇80。
[0010] 本發(fā)明還提供了包含了上述草菇免疫調(diào)節(jié)蛋白FIP-VVO80基因的重組菌株，優(yōu)選 為重組菌株BL21-FIP-vvo80。
[0011] 本發(fā)明還提供了一種制備草葫免疫調(diào)節(jié)蛋白FIP-vvo80的方法，包括以下步驟：
[0012] 1.上述重組載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，得到重組菌株；
[0013] 2.培養(yǎng)重組菌株，誘導(dǎo)重組草菇免疫調(diào)節(jié)蛋白FIP-VV〇80的表達(dá)；
[0014] 3.超聲破碎獲取所表達(dá)的草菇免疫調(diào)節(jié)蛋白FIP-VV〇80。
[0015] 其中，優(yōu)選所述宿主細(xì)胞為大腸桿菌BL21(DE3)細(xì)胞，優(yōu)選將重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化 大腸桿菌細(xì)胞BL21 (DE3)，得到重組菌株BL21-FIP-VV〇80。運(yùn)用基因工程手段來(lái)產(chǎn)業(yè)化生 產(chǎn)草菇免疫調(diào)節(jié)蛋白FIP-VV〇80產(chǎn)品還未見報(bào)道。本發(fā)明首次提供了一個(gè)真菌免疫調(diào)節(jié)蛋 白FIP-VV〇80,可作應(yīng)用于保健品和醫(yī)藥等工業(yè)。根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案就可以實(shí)現(xiàn)利用基 因工程手段生產(chǎn)草菇免疫調(diào)節(jié)蛋白FIP-VV〇80。
[0016] 本發(fā)明利用生物信息學(xué)的方法，在草菇基因組中發(fā)現(xiàn)了一種與已知草菇免疫調(diào)節(jié) 蛋白（FIP-vvo)差異性達(dá)到5%即相似性為95%的新的草菇免疫調(diào)節(jié)蛋白？1?-^〇80及其 編碼基因序列。并利用分子生物學(xué)和生物工程技術(shù)，構(gòu)建高效表達(dá)這種草菇免疫調(diào)節(jié)蛋白 的工程菌株，利用超聲破碎得到重組草菇免疫調(diào)節(jié)蛋白FIP-VV〇80,對(duì)其進(jìn)行了免疫學(xué)功能 鑒定。本發(fā)明不僅豐富了FIPs的種類，而且為深入開展全新草菇免疫調(diào)節(jié)蛋白的開發(fā)及應(yīng) 用奠定基礎(chǔ)。
[0017] 有益效果
[0018] 根據(jù)本發(fā)明的對(duì)機(jī)體具有免疫調(diào)節(jié)作用的真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白及其基因序列，可以 制備出提高人體免疫力的保健食品，防治由于免疫力下降所導(dǎo)致的疾病的危害。
【附圖說(shuō)明】
[0019] 圖1為本發(fā)明的草菇免疫調(diào)節(jié)蛋白FIP-VVO80在大腸桿菌中表達(dá)的SDS-PAGE分 析；其中，1為表達(dá)載體蛋白；2為分子量標(biāo)準(zhǔn)；3為重組菌株蛋白BL21-FIP-VV〇80。
【具體實(shí)施方式】
[0020] 下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人 員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定 的范圍。
[0021] 1.細(xì)胞株：Jurkat細(xì)胞。
[0022] 2.試劑盒、酶類、生化試劑和儀器：
[0023] 試劑盒：ELISAKIT96THumanIL-2試劑盒購(gòu)自北京四正柏生物科技有限公司。 96孔培養(yǎng)板，血球計(jì)數(shù)板。
[0024] PCR引物合成和基因測(cè)序均由上海生工生物公司完成。
[0025] 酶類：內(nèi)切酶購(gòu)自TaKaRa公司，連接酶購(gòu)自Invitrogen公司。
[0026] 儀器：離心機(jī)；振蕩搖床；顯微鏡；酶標(biāo)儀。
[0027] 生化試劑：氨芐青霉素，卡那霉素，青霉素，鏈霉素，胎牛血清（FBS)。
[0028] 3.培養(yǎng)基：RP