一種提取純化Tth DNA聚合酶的方法
【專利摘要】本發(fā)明提出了一種提取純化TthDNA聚合酶的方法。包括如下步驟：取TthDNA聚合酶工程菌進行活化和IPTG誘導(dǎo)表達；用溶菌酶室溫處理后加入DTT，吐溫-20，冰上處理一段時間，離心得到粗蛋白；粗蛋白中緩慢加入二氧化硅顆粒，磁力攪拌器上攪拌，離心去除沉淀；上清液補足NaCl后流過已螯合Ni2+的Ni-NTA柱，再用5倍床體積洗滌緩沖溶液依次洗滌，最后用洗脫液洗脫目的蛋白，接收含目的蛋白的洗脫液；脫鹽后即得到純化的TthDNA聚合酶；得到的TthDNA聚合酶加入甘油使體積分?jǐn)?shù)為50%，-20℃保存。本發(fā)明的方法簡單，酶活性損失小，回收蛋白的純度和回收量高。
【專利說明】—種提取純化Tth DNA聚合酶的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種提取純化Tth DNA聚合酶的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]Tth DNA Polymerase (Tth DNA聚合酶)是一種熱穩(wěn)定性酶，分子量為94kDa，原始酶的來源是從嗜熱棲熱菌(Thermus thermophilus)HB-8中分離得到。該酶在74°C是可進行DNA復(fù)制。Tth DNA聚合酶在鎂離子存在的條件下可催化核苷酸5’-3’方向發(fā)生聚合反應(yīng)，形成雙鏈DNA，也可在錳離子存在的條件下，以RNA為模板沿5’ -3’方向發(fā)生核苷酸聚合反應(yīng)。該酶也具有5’-3’外切酶活性。Tth DNA聚合酶可用于PCR、逆轉(zhuǎn)錄、RT-PCR和較高溫度條件下的引物延伸反應(yīng)。特別適合應(yīng)用于一步法qRT-PCR試劑盒的開發(fā)。
[0003]最初Tth DNA聚合酶的來源是從嗜熱棲熱菌(Thermus thermophilus) HB-8中分離得到，由于嗜熱棲熱菌培養(yǎng)所需要的設(shè)備昂貴、培養(yǎng)基配置復(fù)雜、培養(yǎng)溫度高、培養(yǎng)周期長，在培養(yǎng)過程中容易出現(xiàn)誤差導(dǎo)致培養(yǎng)效率低下，不易于大規(guī)模培養(yǎng)，再加上純化過程中需要漫長的層析過程，導(dǎo)致酶活性大量下降，因此酶的產(chǎn)能極其有限。
[0004]目前，因活性蛋白容易變性失活因而純化都是要求在低溫條件下進行(冰上操作)，常規(guī)純化Tth DNA聚合酶方法采用低溫超聲破碎，反復(fù)通過硫酸銨沉淀、離子交換、層析和脫鹽進行純化，不僅高達50%的蛋白會在純化初期就會損失，而且部分基因組蛋白很難完全去除，再加上基因組蛋白的存在會導(dǎo)致上柱速度緩慢，延長純化時間，純化得到的蛋白酶活降低，影響了后期酶的擴增和逆轉(zhuǎn)錄活性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種簡單，酶活性損失小，回收蛋白的純度和回收量高的活性蛋白酶的提取方法。
[0006]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種提取純化Tth DNA聚合酶的方法，其步驟為，
O工程菌的活化和表達:取Tth DNA聚合酶工程菌接種到含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)
基中，370C，200rpm振蕩培養(yǎng)過夜；取活化好的菌液轉(zhuǎn)接到同樣的LB液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)后加入IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)8小時；離心收集菌體；收集的菌體用緩沖液A洗滌一次，離心；再用緩沖液A重懸得到表達的工程菌；
2)粗蛋白制備:將所述表達的工程菌用溶菌酶室溫處理后加入DTT，再加入吐溫-20，冰上處理一段時間，15000g/4°C /20分鐘，得到的上清即為粗蛋白；
3)粗蛋白中緩慢加入 二氧化硅顆粒，磁力攪拌器上攪拌，離心去除沉淀；
4)上清液補足NaCl后流過已螯合Ni2+的N1-NTA柱，該柱先用10倍床體積結(jié)合緩沖液平衡；所述結(jié)合緩沖液為20mM Tris-HCL, 0.5MNaCl, PH8.0,5mM咪唑；再用5倍床體積洗滌緩沖溶液依次洗滌，所述洗滌緩沖液為20mM Tris-HCL, 0.5MNaCl, PH8.0,15mM/50mM咪唑；最后用洗脫液洗脫目的蛋白，所述洗脫液為20mM Tris-HCL, 0.1MNaCl, PH8.0, 200mM咪唑，接收含目的蛋白的洗脫液；含目的蛋白的洗脫液用sephadexG25脫鹽，脫鹽緩沖液為緩沖液 B:1OmM Tris-HCl ,pH 7.5，25° C，300mM KC1，ImM DTT，0.1mM EDTA，0.5mg/mlBSA ;脫鹽后即得到純化的Tth DNA聚合酶；
任選的， 得到的Tth DNA聚合酶加入甘油使體積分?jǐn)?shù)為50%，-20°C保存。
[0007]所述Tth DNA聚合酶工程菌為從嗜熱棲熱菌HB-8中PCR擴增得到PCR產(chǎn)物，所得PCR產(chǎn)物經(jīng)Nde 1、Sal I雙酶切后克隆入經(jīng)Nde 1、Sal I雙酶切的PET28a載體上，構(gòu)建表達載體PET28a_taq，將上述質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達菌BL21 (DE3)，即獲得生產(chǎn)重組Tth DNA聚合酶的工程菌株。
[0008]所述PCR擴增所用的引物為SEQ ID NO:1和SEQ ID N0:2。
[0009]所述步驟I)為取Tth DNA聚合酶工程菌接種到含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，370C，200rpm振蕩培養(yǎng)過夜；取活化好的菌液轉(zhuǎn)接到同樣的LB液體培養(yǎng)基中，37°C，250轉(zhuǎn)/分振蕩培養(yǎng)4小時后加入IM IPTG至終濃度1.0mmol/L，28°C、250 rpm件下培養(yǎng)8小時；用離心管超聲洗滌30min，并用雙蒸水潤洗一次；12000rpm，4°C離心5分鐘收集菌體；收集的菌體用緩沖液A洗滌一次，12000rpm，4°C離心5分鐘；再用緩沖液A重懸得到表達的工程菌；所述緩沖液 A 為 20mM Tris-HCL, 0.2MNaCl, PH8.0。
[0010]所述步驟2)為將所述表達的工程菌用4mg/ml終濃度溶菌酶室溫處理20分鐘后加入DTT使終濃度為ImM，加入吐溫-20使體積百分比為0.5%，冰上處理45分鐘，15000g/4°C /20分鐘，得到的上清即為粗蛋白。
[0011]所述步驟3)為粗蛋白中緩慢加入體積系數(shù)5%的二氧化硅顆粒，磁力攪拌器上攪拌10分鐘，15000g，4°C離心20分鐘，去除沉淀。
[0012]所述步驟4)為上清液補足NaCl至終濃度為0.5M。
[0013]本發(fā)明生產(chǎn)工藝合理簡單，僅需要溶菌酶破碎菌體，二氧化硅吸附雜蛋白和核酸，親和層析進行純化，避免了常規(guī)耐熱聚合酶純化中加熱處理、反復(fù)通過離子交換，層析和脫鹽進行純化。保證酶活性得到很好的保持，保證了產(chǎn)品產(chǎn)量和純度，后期使用過程中基因擴增和逆轉(zhuǎn)錄效果良好。
[0014]1.產(chǎn)品的確認(rèn)
(I)基因來源
Tth DNA聚合酶基因為從嗜熱棲熱菌(Thermus thermophilus) HB-8中擴增得到。
[0015]擴增引物為:
Tth F:ataCATATGATGGAGGCGATGCTTCCGCTCTTTG SEQ ID NO:1
Tth R:ataGTCGACCTAACCCTTGGCGGAAAGCCAGTCC SEQ ID NO:2
基因序列信息:Thermus thermophilus gene for DNA polymerase I, complete cds,strain: Ml
GenBank: AB744210.1 SEQ ID NO:3 ；
(2)載體來源
PET-28a表達質(zhì)粒購自美國Novagen公司。該質(zhì)粒在克隆位點前有I個T7啟動子，在T7啟動子前有I個6XHis_Tag coding序列，是T7的增強子，多克隆位點上有NcoI—Xholll個酶切位點，載體上還有I個卡那霉素(Kan)的篩選標(biāo)記；
(3)宿主菌
宿主菌為BL21 (DE3)菌株，即宿主菌BL21經(jīng)噬菌體DE3溶源化后，DE3的lacUV5強啟動子及位于其下游的T7 RNA聚合酶基因被整合到宿主菌的基因組DNA中。宿主菌在非代謝性乳糖類似物IPTG的誘導(dǎo)作用下能產(chǎn)生大量的T7RNA聚合酶，而T7RNA聚合酶能特異性地識別Pet-28a表達載體中的T7啟動子序列，從而高效地表達目的重組蛋白。由于IPTG不會被宿主菌利用，因此向培養(yǎng)液中加入少量的IPTG就能對lacUV5強啟動子產(chǎn)生持久的誘導(dǎo)作用；
(4)Tth DNA聚合酶工程菌株
Tth DNA聚合酶基因的per產(chǎn)物經(jīng)Nde 1、Sal I雙酶切經(jīng)Nde 1、Sal I雙酶切的PET28a載體上，構(gòu)建表達載體PET28a_taq，將上述質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達菌BL21 (DE3)，即獲得生產(chǎn)重組Tth D NA聚合酶的工程菌株。
[0016]2.產(chǎn)品的制備
①用50ml 緩沖液 A (20mM Tris-HCL, 0.2MNaCl, PH8.0)重懸菌體(生產(chǎn)重組 Tth DNA聚合酶的工程菌株)，4mg/ml終濃度溶菌酶室溫處理20分鐘，加入DTT使終濃度為ImM，加入吐溫-20使體積百分比為0.5%，冰上處理45分鐘，15000g/4°C /20分鐘，得到的上清即粗蛋白；
②粗蛋白中緩慢加入體積系數(shù)5%的二氧化硅顆粒，磁力攪拌器上攪拌10分鐘(吸附基因組DNA和雜蛋白)，15000g/4°C /20分鐘，去除沉淀；
③上清液補足NaCl至終濃度為0.5M，流過已螯合Ni2+的N1-NTA柱，該柱先用10倍床體積結(jié)合緩沖液(20mM Tris-HCL, 0.5MNaCl, PH8.0, 5mM咪唑)平衡；再用5倍床體積洗滌緩沖溶液(20mM Tris-HCL, 0.5MNaCl, PH8.0,15mM/50mM咪唑)依次洗滌；最后用洗脫液(20mM Tris-HCL, 0.1MNaCl, PH8.0, 200mM咪唑)洗脫目的蛋白。含目的蛋白的洗脫液用s印hadexG25 脫鹽，脫鹽緩沖液為緩沖液 B:(10mM Tris-HCl (pH 7.5 at 25° C)，300mMKCl7ImM DTT,0.1mM EDTA,0.5mg/ml BSA)。脫鹽后加入甘油使體積分?jǐn)?shù)為50%，_20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0017]3.產(chǎn)品的用途
本酶具有在Mn2+離子存在的條件下顯示逆轉(zhuǎn)錄活性的獨有的特性。利用該特性，可用同一酶在同一管中進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)與PCR(one-STEP RT-PCR )反應(yīng)。
[0018]特點1:擴增高GC含量具有高效率
與Taq DNA polymerase相比,對GC-rich目的片段及粗樣品的擴增效率更出色。
[0019]特點2:可用單酶完成RT-PCR
由于本酶在Mn2+離子存在條件下顯示RTase活性，優(yōu)化反應(yīng)緩沖液后只用本酶即可完成RT-PCR并且本酶在55-60°C時可進行RT反應(yīng)，因此適用于容易形成高級結(jié)構(gòu)的目的片段的逆轉(zhuǎn)錄及后續(xù)擴增。
[0020]有益效果:
1.和傳統(tǒng)DNA聚合酶提取方法對比，本發(fā)明只需要親和層析柱和脫鹽柱，步驟少，操作簡單，避免反復(fù)使用離子交換柱和層析柱，容易在普通實驗室進行蛋白純化并且有效保障蛋白回收率。
[0021]2.和傳統(tǒng)DNA聚合酶提取方法對比，提取純化過程不需要75°C加熱步驟，最大限度降低Tth DNA聚合酶提取過程的酶活性損失，保障后續(xù)的逆轉(zhuǎn)錄和基因擴增效果。
[0022]3.和傳統(tǒng)DNA聚合酶提取方法對比，提取純化過程加入二氧化硅進行基因組和雜雜蛋白的吸附，去除大部分核酸和雜蛋白，上柱速度快，有效減少親和層析柱中核酸和雜蛋白的非特異性吸附機會，有利于保證回收蛋白的純度和回收量。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0023]圖1是SDS-PAGE純度檢測電泳圖。
[0024]圖2是Tth DNA聚合酶活性檢測結(jié)果圖。
[0025]圖3是不加Tth DNA聚合酶的活性檢測對照實驗結(jié)果圖。
【具體實施方式】
[0026]下面詳細描述本發(fā)明的實施例，所述實施例的示例在附圖中示出，其中自始至終相同或類似的標(biāo)號表示相同或類似的元件或具有相同或類似功能的元件。下面通過參考附圖描述的實施例是示例性的，旨在用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對本發(fā)明的限制。實施例中未注明具體技術(shù)或條件者，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻所描述的技術(shù)或條件或者按照產(chǎn)品說明書進行。所用試劑或儀 器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。
[0027]實施例1:
一、主要試劑準(zhǔn)備
1.LB液體培養(yǎng)基(1000 mL)
NaCl:10g
蛋白胨:10g 酵母粉:5g
2.緩沖液A (20mM Tris-HCl, 0.2M NaCl，pH 8.0) (1000 mL)
Trizma-HCl:1.7651g
Trizma-Base: 1.066g
NaCl:11.688g
3.緩沖液B (20mM Tris-HCl，0.5M NaCl，pH 8.0) (1000 mL)
Trizma-HCl:1.7651g
Trizma-Base: 1.066g
NaCl:29.22g
4.洗滌緩沖液C:(20mMTris-HCl,0.5M NaCl,5mM 咪唑，0.5%Tween_20 ,pH 8.0)(100
mL)
緩沖液B:1OOmL 3M 咪唑:167uL Tween-20:500 uL
5.洗滌緩沖液D:(20mM Tris-HCl,0.5M NaCl,5mM 咪唑，pH 8.0) (100 mL)
緩沖液B:1OOmL
3M 咪唑:167uL
二、TthDNA聚合酶工程菌的構(gòu)建和表達 UTth DNA聚合酶工程菌的構(gòu)建
模板為含嗜熱棲熱菌(Thermus thermophilus) HB-8DNA聚合酶(Tth)基因質(zhì)粒。(Invitrogen全基因人工合成，序列見SEQ ID NO: 3。
[0028]擴增引物為:
Tth F:ataCATATGATGGAGGCGATGCTTCCGCTCTTTG SEQ ID NO:1
Tth R:ataGTCGACCTAACCCTTGGCGGAAAGCCAGTCC SEQ ID NO:2
PCR反應(yīng)體系配置見表1
【權(quán)利要求】
1.一種提取純化Tth DNA聚合酶的方法，其步驟為， O工程菌的活化和表達:取Tth DNA聚合酶工程菌接種到含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，370C，200rpm振蕩培養(yǎng)過夜；取活化好的菌液轉(zhuǎn)接到同樣的LB液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)后加入IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)8小時；離心收集菌體；收集的菌體用緩沖液A洗滌一次，離心；再用緩沖液A重懸得到表達的工程菌； 2)粗蛋白制備:將所述表達的工程菌用溶菌酶室溫處理后加入DTT，再加入吐溫-20，冰上處理一段時間，15000g/4°C /20分鐘，得到的上清即為粗蛋白； 3)粗蛋白中緩慢加入二氧化硅顆粒，磁力攪拌器上攪拌，離心去除沉淀； 4)上清液補足NaCl后流過已螯合Ni2+的N1-NTA柱，該柱先用10倍床體積結(jié)合緩沖液平衡；所述結(jié)合緩沖液為20mM Tris-HCL, 0.5MNaCl, PH8.0,5mM咪唑；再用5倍床體積洗滌緩沖溶液依次洗滌，所述洗滌緩沖液為20mM Tris-HCL, 0.5MNaCl, PH8.0,15mM/50mM咪唑；最后用洗脫液洗脫目的蛋白，所述洗脫液為20mM Tris-HCL, 0.1MNaCl, PH8.0, 200mM咪唑，接收含目的蛋白的洗脫液；含目的蛋白的洗脫液用sephadexG25脫鹽，脫鹽緩沖液為緩沖液 B:1OmM Tris-HCl ,pH 7.5，25° C，300mM KCl, ImM DTT, 0.1mM EDTA,0.5mg/mlBSA ;脫鹽后 即得到純化的Tth DNA聚合酶； 任選的，得到的Tth DNA聚合酶加入甘油使體積分?jǐn)?shù)為50%，-20°C保存。
2.權(quán)利要求1所述的提取純化TthDNA聚合酶的方法，其特征在于，所述Tth DNA聚合酶工程菌為從嗜熱棲熱菌HB-8中PCR擴增得到PCR產(chǎn)物，所得PCR產(chǎn)物經(jīng)Nde 1、Sal I雙酶切后克隆入經(jīng)Nde I ,Sal I雙酶切的PET28a載體上，構(gòu)建表達載體PET28a_taq，將上述質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達菌BL21 (DE3)，即獲得生產(chǎn)重組Tth DNA聚合酶的工程菌株。
3.權(quán)利要求2所述的提取純化TthDNA聚合酶的方法，其特征在于，所述PCR擴增所用的引物為SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示序列。
4.權(quán)利要求1或2所述的提取純化TthDNA聚合酶的方法，其特征在于，所述步驟I)為取Tth DNA聚合酶工程菌接種到含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，370C，200rpm振蕩培養(yǎng)過夜；取活化好的菌液轉(zhuǎn)接到同樣的LB液體培養(yǎng)基中，37°C，250轉(zhuǎn)/分振蕩培養(yǎng)4小時后加AIM IPTG至終濃度1.0mmol/L，28°C、250 rpm件下培養(yǎng)8小時；用離心管超聲洗滌30min，并用雙蒸水潤洗一次；12000rpm，4°C離心5分鐘收集菌體；收集的菌體用緩沖液A洗滌一次，12000rpm, 4°C離心5分鐘；再用緩沖液A重懸得到表達的工程菌；所述緩沖液A為20mMTris-HCL, 0.2MNaCl, PH8.0。
5.權(quán)利要求1或2所述的提取純化TthDNA聚合酶的方法，其特征在于，所述步驟2)為將所述表達的工程菌用4mg/ml終濃度溶菌酶室溫處理20分鐘后加入DTT使終濃度為ImM,加入吐溫-20使體積百分比為0.5%，冰上處理45分鐘，15000g/4°C /20分鐘，得到的上清即為粗蛋白。
6.權(quán)利要求1或2所述的提取純化TthDNA聚合酶的方法，其特征在于，所述步驟3)為粗蛋白中緩慢加入體積系數(shù)5%的二氧化硅顆粒，磁力攪拌器上攪拌10分鐘，15000g, 4°C離心20分鐘，去除沉淀。
7.權(quán)利要求1或2所述的提取純化TthDNA聚合酶的方法，其特征在于，所述步驟4)為上清液補足NaCl至終濃度為0.5M。
【文檔編號】C12R1/19GK103966182SQ201410179490
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2014年4月30日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月30日
【發(fā)明者】林家旺, 魏超, 魏劭 申請人:廈門安普利生物工程有限公司