一種高油脂含量的四尾柵藻及其構(gòu)建方法
【專利摘要】一種高油脂含量的四尾柵藻及其構(gòu)建方法。它涉及一種高油脂含量的微藻及其構(gòu)建方法。它解決了現(xiàn)有四尾柵藻含油量低，影響生物柴油產(chǎn)量的問(wèn)題。高油脂含量的四尾柵藻中含有人工DGAT1基因，人工DGAT1基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO：1所示。構(gòu)建方法：一、構(gòu)建質(zhì)粒pMD-DGAT1；二、獲得重組質(zhì)粒pBI121-DGAT1；三、電擊轉(zhuǎn)化；四、黑暗環(huán)境培養(yǎng)。本發(fā)明可用于水處理和生物柴油生產(chǎn)領(lǐng)域。
【專利說(shuō)明】一種高油脂含量的四尾柵藻及其構(gòu)建方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種高油脂含量的微藻及其構(gòu)建方法。
【背景技術(shù)】
[0002]生物柴油具有能量高、燃燒充分、潤(rùn)滑性好、含硫量低等優(yōu)良性能，還具有儲(chǔ)運(yùn)安全、抗爆性能好、易生物降解等特點(diǎn)，可作為優(yōu)質(zhì)的化石能源替代品然而傳統(tǒng)的生物柴油以大豆、玉米、棕櫚樹(shù)、麻風(fēng)樹(shù)等農(nóng)作物為原料，由于原料成本占到生產(chǎn)生物柴油總成本的70%~85%這不僅導(dǎo)致糧食價(jià)格上漲也大大增加了生產(chǎn)成本。[0003]我國(guó)大慶地區(qū)地?zé)崴Y源較為豐富，地?zé)崴菑牡乇頋B透或地下抽取上來(lái)，可直接地用于溫泉沐浴、采暖、理療等方面。使用后的地?zé)釓U水，大多不經(jīng)處理而直接排入附近的溝渠之中。大慶地區(qū)地?zé)崴械暮}量比較高，而且還含有氟、砷、汞等有害的化學(xué)成分，尤其是氟，其含量最高達(dá)6mg/L左右。地?zé)釓U水若不經(jīng)過(guò)適當(dāng)處理而隨意排放，廢水中較高含鹽量會(huì)造成土壤鹽堿化加重，并且其中的氟及其它有害成分就會(huì)因?yàn)闈B透、遷移、富集作用而造成土壤侵蝕、地下水污染等許多環(huán)境問(wèn)題，甚至進(jìn)入食物鏈直接危害人體健康。
[0004]微藻環(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng)、種類繁多、生長(zhǎng)周期短、光合效率高，可以利用地?zé)釓U水培養(yǎng)微藻生產(chǎn)生物柴油，即可實(shí)現(xiàn)廢水凈化，又能生產(chǎn)生物柴油，可謂是一舉兩得。
[0005]四尾柵藻學(xué)名Scenedesmus quadricauda,柵藻科,柵藻屬，是淡水中常見(jiàn)的浮游藻類，分布極廣，極喜在營(yíng)養(yǎng)豐富的靜水中繁殖，夏秋可大量繁殖，繁殖速度快；對(duì)有機(jī)污染物具有較強(qiáng)的耐性，是乙型中污帶的指示種，能耐受高氟、砷、汞等有害的化學(xué)成分。因此四尾柵藻是利用大慶地區(qū)地?zé)崴Y源制備生物柴油的合適微藻。但是四尾柵藻本身含油量低，所以導(dǎo)致利用四尾柵藻生產(chǎn)生物柴油的產(chǎn)量一直受到影響。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明是為了解決現(xiàn)有四尾柵藻含油量低，影響生物柴油產(chǎn)量的問(wèn)題，而提供的一種高油脂含量的四尾柵藻及其構(gòu)建方法。
[0007]本發(fā)明高油脂含量的四尾柵藻中含有人工DGATl基因，人工DGATl基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0008]上述高油脂含量的四尾柵藻的構(gòu)建方法，其特征在于高油脂含量的四尾柵藻按以下步驟構(gòu)建:
[0009]一、用質(zhì)粒pMD19-T載體和人工DGATl基因構(gòu)建質(zhì)粒pMD-DGATl ；
[0010]二、提取質(zhì)粒pMD-DGATl和質(zhì)粒pBI121分別用Xba I和BamH I進(jìn)行雙酶切，回收目的基因人工DGATl基因和載體pBI 121，然后連接人工DGATl基因和載體pBI121，獲得重組質(zhì)粒 pBI 121-DGATI ；
[0011]三、取培養(yǎng)至對(duì)數(shù)中期的四尾柵藻藻液放入離心管中8000r/min離心5min收集藻體細(xì)胞并用預(yù)冷的滲透液洗滌藻體，然后加入滲透液冰上放置lh，再8000r/min離心5min，重懸直至四尾柵藻細(xì)胞密度達(dá)到IO8ceIlsAiL ;然后將四尾柵藻懸液放入水浴鍋中42°C熱激lOmin、冰浴5min并沿管壁加入重組質(zhì)粒pBI121_DGATl與鮭精DNA，之后吹打混勻置于冰上lOmin，再用脈沖電壓為1500v、脈沖持續(xù)時(shí)間為2ms的脈沖電擊；
[0012]四、將步驟三電擊轉(zhuǎn)化的四尾柵藻細(xì)胞用微藻培養(yǎng)液清洗兩次，再置于微藻培養(yǎng)液中于22~25°C黑暗環(huán)境中培養(yǎng)24h，即獲得高油脂含量的四尾柵藻；
[0013]其中，步驟一中人工DGATl基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0014]本發(fā)明高油脂含量的四尾柵藻的油脂含量達(dá)細(xì)胞干重的11.8%，是未基因重組的四尾柵藻的油脂含量的近2倍，可顯著提高用四尾柵藻的生物柴油產(chǎn)量，為工業(yè)化生物柴油生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。而且，本發(fā)明高油脂含量的四尾柵藻對(duì)地?zé)釓U水中的污染物具有良好的耐受性和去除率，特別是是對(duì)氟的去除率更是達(dá)到了 81%。
【具體實(shí)施方式】
[0015]本發(fā)明技術(shù)方案不局限于以下所列舉【具體實(shí)施方式】，還包括各【具體實(shí)施方式】間的任意組合。[0016]【具體實(shí)施方式】一:本實(shí)施方式高油脂含量的四尾柵藻中含有人工DGATl基因，人工DGATl基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0017]本實(shí)施方式對(duì)天然紫蘇的DGATl基因進(jìn)行了人為的改造，與天然紫蘇DGATl基因的同源性為97%。
[0018]【具體實(shí)施方式】二:本實(shí)施方式高油脂含量的四尾柵藻按以下步驟構(gòu)建:
[0019]一、用質(zhì)粒pMD19-T載體和人工DGATl基因構(gòu)建質(zhì)粒pMD-DGATl ；
[0020]二、提取質(zhì)粒pMD-DGATl和質(zhì)粒pBI121分別用Xba I和BamH I進(jìn)行雙酶切，回收目的基因人工DGATl基因和載體pBI 121，然后連接人工DGATl基因和載體pBI121，獲得重組質(zhì)粒 pBI 121-DGATI ；
[0021]三、取培養(yǎng)至對(duì)數(shù)中期的四尾柵藻藻液放入離心管中8000r/min離心5min收集藻體細(xì)胞并用預(yù)冷的滲透液洗滌藻體，然后加入滲透液冰上放置lh，再8000r/min離心5min，重懸直至四尾柵藻細(xì)胞密度達(dá)到IO8ceIlsAiL ;然后將四尾柵藻懸液放入水浴鍋中42°C熱激lOmin、冰浴5min并沿管壁加入重組質(zhì)粒pBI121_DGATl與鮭精DNA，之后吹打混勻置于冰上lOmin，再用脈沖電壓為1500v、脈沖持續(xù)時(shí)間為2ms的脈沖電擊；
[0022]四、將步驟三電擊轉(zhuǎn)化的四尾柵藻細(xì)胞用微藻培養(yǎng)液清洗兩次，再置于微藻培養(yǎng)液中于22~25°C黑暗環(huán)境中培養(yǎng)24h，即獲得高油脂含量的四尾柵藻；
[0023]其中，步驟一中人工DGATl基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0024]利用天然紫蘇的DGATl基因(紫蘇DGATl基因的cDNA序列如SEQ ID N0:2所示)介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的四尾柵藻發(fā)生基因沉默，并沒(méi)有獲得油脂含量提高的四尾柵藻。當(dāng)然轉(zhuǎn)基因微藻中的外源基因沉默是常見(jiàn)問(wèn)題，也是主要難題，其原因可能是外源基因在受體細(xì)胞中出現(xiàn)轉(zhuǎn)錄、翻譯及修飾等多方面的問(wèn)題，任何一步中出現(xiàn)差錯(cuò)均可能導(dǎo)致外源基因沉默。而且即使是成功的將與微藻油脂合成主要限速酶轉(zhuǎn)化到微藻中也未必可以提高微藻的油脂含量，如Dunahay等人成功地將編碼乙酰CoA羧化酶(ACCase)基因轉(zhuǎn)化到硅藻中，使得硅藻中ACCase的活性提高到對(duì)照組的2~3倍，然而微藻的油脂含量并沒(méi)有顯著增加。
[0025]本實(shí)施方式對(duì)天然紫蘇的DGATl基因進(jìn)行了人為的改造，與天然紫蘇DGATl基因的同源性為97%。采用本實(shí)施方式構(gòu)建的高油脂含量的四尾柵藻，可以明顯提高四尾柵藻的油脂含量，為工業(yè)化四尾柵藻生產(chǎn)生物柴油的實(shí)現(xiàn)奠定了基礎(chǔ)。
[0026]本實(shí)施方式中利用載體pBI 121構(gòu)建的重組質(zhì)粒PBI121-DGAT1中包含CaMV35S啟動(dòng)子。
[0027]【具體實(shí)施方式】三:本實(shí)施方式與【具體實(shí)施方式】二的不同點(diǎn)是:步驟二用獲得的重組質(zhì)粒PBI121-DGAT1轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞大腸桿菌DH5 α，然后進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，挑選白色菌落進(jìn)行PCR驗(yàn)證和酶切驗(yàn)證。其它步驟及參數(shù)與實(shí)施方式二相同。
[0028]【具體實(shí)施方式】四:本實(shí)施方式與【具體實(shí)施方式】二或三的不同點(diǎn)是:步驟三中滲透液中甘油的體積濃度為10%、甘露醇的濃度為0.2mol/L、山梨醇的濃度為0.2mol/L。其它步驟及參數(shù)與實(shí)施方式二或三相同。
[0029]【具體實(shí)施方式】五:本實(shí)施方式與【具體實(shí)施方式】二、三或四的不同點(diǎn)是:步驟三中鮭精DNA的終濃度為25 μ g/mL。其它步驟及參數(shù)與實(shí)施方式二、三或四相同。
[0030]【具體實(shí)施方式】六:本實(shí)施方式與【具體實(shí)施方式】二至五之一的不同點(diǎn)是:步驟四中微藻培養(yǎng)液為BGll液體培養(yǎng)基。其它步驟及參數(shù)與實(shí)施方式二至五之一相同。
[0031]【具體實(shí)施方式】七:本實(shí)施方式與【具體實(shí)施方式】二至六之一的不同點(diǎn)是:步驟四中將獲得的高油脂含量的四尾柵藻涂布于含有0.3mg/ml卡那霉素的BGll固體培養(yǎng)基平板上，未加重組質(zhì)粒的四尾柵藻同樣處理作為對(duì)照；15天后挑取在卡那霉素固體培養(yǎng)基平板上長(zhǎng)出的轉(zhuǎn)化子四尾 柵藻群落轉(zhuǎn)接于含有0.3mg/ml卡那霉素的液體培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)15天后轉(zhuǎn)接到?jīng)]有抗生素的固體培養(yǎng)基上，隔代在抗生素與無(wú)抗生素的培養(yǎng)基中進(jìn)行交替培養(yǎng)，獲得性狀穩(wěn)定的高油脂含量的四尾柵藻。其它步驟及參數(shù)與實(shí)施方式二至六之一相同。
[0032]實(shí)施例1
[0033]高油脂含量的四尾柵藻按以下步驟構(gòu)建:
[0034]一、用質(zhì)粒pMD19-T載體和人工DGATl基因構(gòu)建質(zhì)粒pMD-DGATl ；
[0035]二、提取質(zhì)粒pMD-DGATl和質(zhì)粒pBI121分別用Xba I和BamH I進(jìn)行雙酶切，回收目的基因人工DGATl基因和載體pBI 121，然后連接人工DGATl基因和載體pBI121，獲得重組質(zhì)粒 pBI 121-DGATI ；
[0036]三、取培養(yǎng)至對(duì)數(shù)中期的四尾柵藻藻液放入離心管中8000r/min離心5min收集藻體細(xì)胞并用預(yù)冷的滲透液洗滌藻體，然后加入滲透液冰上放置lh，再8000r/min離心5min，重懸直至四尾柵藻細(xì)胞密度達(dá)到IO8ceIlsAiL ;然后將四尾柵藻懸液放入水浴鍋中42°C熱激lOmin、冰浴5min并沿管壁加入重組質(zhì)粒pBI121_DGATl與鮭精DNA，之后吹打混勻置于冰上lOmin，再用脈沖電壓為1500v、脈沖持續(xù)時(shí)間為2ms的脈沖電擊；
[0037]四、將步驟三電擊轉(zhuǎn)化的四尾柵藻細(xì)胞用微藻培養(yǎng)液清洗兩次，再置于微藻培養(yǎng)液中于22~25°C黑暗環(huán)境中培養(yǎng)24h，即獲得高油脂含量的四尾柵藻；
[0038]其中，步驟一中人工DGATl基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；
[0039]步驟三中滲透液中甘油的體積濃度為10%、甘露醇的濃度為0.2mol/L、山梨醇的濃度為0.2mol/L ；
[0040]步驟三中鮭精DNA的終濃度為25 μ g/mL ；
[0041 ] 步驟四中微藻培養(yǎng)液為BGlI液體培養(yǎng)基；
[0042]步驟四中將獲得的高油脂含量的四尾柵藻涂布于含有0.3mg/ml卡那霉素的BGll固體培養(yǎng)基平板上，未加重組質(zhì)粒的四尾柵藻同樣處理作為對(duì)照；15天后挑取在卡那霉素固體培養(yǎng)基平板上長(zhǎng)出的轉(zhuǎn)化子四尾柵藻群落轉(zhuǎn)接于含有0.3mg/ml卡那霉素的液體培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)15天后轉(zhuǎn)接到?jīng)]有抗生素的固體培養(yǎng)基上，隔代在抗生素與無(wú)抗生素的培養(yǎng)基中進(jìn)行交替培養(yǎng)，獲得性狀穩(wěn)定的高油脂含量的四尾柵藻。
[0043]取本實(shí)施例獲得的高油脂含量的四尾柵藻、未基因重組的四尾柵藻和電擊轉(zhuǎn)化天然紫蘇DGATl基因的四尾柵藻進(jìn)行試驗(yàn)。
[0044]按1.0g/L的量分別接入高油脂含量的四尾柵藻、未基因重組的四尾柵藻和電擊轉(zhuǎn)化天然紫蘇DGATl基因(cDNA序列如SEQ ID N0:2所示)的四尾柵藻于錐形瓶中對(duì)地?zé)釓U水進(jìn)行處理，以藻體干重為檢驗(yàn)指標(biāo)，對(duì)藻體生長(zhǎng)、水體除污和生物柴油產(chǎn)量進(jìn)行試驗(yàn)。試驗(yàn)在溫度為25°C、光照強(qiáng)度為55001x、通氣量為220L/h的條件下對(duì)地?zé)釓U水處理11天。
[0045]本實(shí)施例中地?zé)釓U水取自大慶市林甸縣四季青鎮(zhèn)溫室大棚保溫管道內(nèi)排出的地?zé)釓U水，PH值為7~9。本實(shí)施例中選用同一種四尾柵藻，購(gòu)自于中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)淡水藻種庫(kù)(FACHB)，藻種編號(hào)為FACHB-1476。
[0046]將處理11天之后的高油脂含量的四尾柵藻藻液在4000r/min條件下離心獲得藻泥并置于80°C烘箱中干燥兩小時(shí)，待重組四尾柵藻烘干后收集藻粉。取藻粉用研缽粉碎取粉碎后樣品5g將其用干凈濾紙包好并稱重，然后放入脂肪測(cè)定儀之中，用石油醚萃取抽提脂肪(分成多組取平均值)，每抽提6小時(shí)取出稱重，待差值穩(wěn)定后即為微藻中油脂的粗重，并計(jì)算微藻的產(chǎn)油率。
[0047]高油脂含量的四尾柵藻的油脂含量達(dá)細(xì)胞干重的11.8% ;未基因重組的四尾柵藻的油脂含量達(dá)細(xì)胞干重的6.3% ;電擊轉(zhuǎn)化天然紫蘇DGATl基因的四尾柵藻的油脂含量達(dá)細(xì)胞干重的2.1%。
[0048]實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明本發(fā)明構(gòu)建的高油脂含量的四尾柵藻具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，可明顯提高生物柴油的產(chǎn)量。
[0049]地?zé)釓U水中C0D、總氮、總磷及氟含量的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)如表1所示。
[0050]表1
[0051]
【權(quán)利要求】
1.一種高油脂含量的四尾柵藻，其特征在于高油脂含量的四尾柵藻中含有人工DGATl基因，人工DGATl基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.權(quán)利要求1所述高油脂含量的四尾柵藻的構(gòu)建方法，其特征在于高油脂含量的四尾柵藻按以下步驟構(gòu)建: 一、用質(zhì)粒PMD19-T載體和人工DGATl基因構(gòu)建質(zhì)粒pMD-DGATl； 二、提取質(zhì)粒pMD-DGATl和質(zhì)粒pBI121分別用XbaI和BamH I進(jìn)行雙酶切，回收目的基因人工DGATl基因和載體pBI 121，然后連接人工DGATl基因和載體pBI 121，獲得重組質(zhì)粒 pBI121-DGATl ； 三、取培養(yǎng)至對(duì)數(shù)中期的四尾柵藻藻液放入離心管中8000r/min離心5min收集藻體細(xì)胞并用預(yù)冷的滲透液洗滌藻體，然后加入滲透液冰上放置lh，再8000r/min離心5min，重懸直至四尾柵藻細(xì)胞密度達(dá)到IO8ceIlsAiL ;然后將四尾柵藻懸液放入水浴鍋中42°C熱激lOmin、冰浴5min并沿管壁加入重組質(zhì)粒pBI121-DGATl與鮭精DNA，之后吹打混勻置于冰上lOmin，再用脈沖電壓為1500v、脈沖持續(xù)時(shí)間為2ms的脈沖電擊； 四、將步驟三電 擊轉(zhuǎn)化的四尾柵藻細(xì)胞用微藻培養(yǎng)液清洗兩次，再置于微藻培養(yǎng)液中于22~25°C黑暗環(huán)境中培養(yǎng)24h，即獲得高油脂含量的四尾柵藻； 其中，步驟一中人工DGATl基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的高油脂含量的四尾柵藻的構(gòu)建方法，其特征在于步驟二用獲得的重組質(zhì)粒PBI121-DGAT1轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞大腸桿菌DH5 α，然后進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，挑選白色菌落進(jìn)行PCR驗(yàn)證和酶切驗(yàn)證。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的高油脂含量的四尾柵藻的構(gòu)建方法，其特征在于步驟三中滲透液中甘油的體積濃度為10%、甘露醇的濃度為0.2mol/L、山梨醇的濃度為0.2mol/L。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的高油脂含量的四尾柵藻的構(gòu)建方法，其特征在于步驟三中鮭精DNA的終濃度為25 μ g/mL。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的高油脂含量的四尾柵藻的構(gòu)建方法，其特征在于步驟四中微藻培養(yǎng)液為BGll液體培養(yǎng)基。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的高油脂含量的四尾柵藻的構(gòu)建方法，其特征在于步驟四中將獲得的高油脂含量的四尾柵藻涂布于含有0.3mg/ml卡那霉素的BGll固體培養(yǎng)基平板上，未加重組質(zhì)粒的四尾柵藻同樣處理作為對(duì)照；15天后挑取在卡那霉素固體培養(yǎng)基平板上長(zhǎng)出的轉(zhuǎn)化子四尾柵藻群落轉(zhuǎn)接于含有0.3mg/ml卡那霉素的液體培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)15天后轉(zhuǎn)接到?jīng)]有抗生素的固體培養(yǎng)基上，隔代在抗生素與無(wú)抗生素的培養(yǎng)基中進(jìn)行交替培養(yǎng)，獲得性狀穩(wěn)定的高油脂含量的四尾柵藻。
【文檔編號(hào)】C12R1/89GK103923838SQ201410180811
【公開(kāi)日】2014年7月16日 申請(qǐng)日期:2014年4月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月28日
【發(fā)明者】劉玉, 劉宇峰, 姬妍茹, 楊慶麗, 董艷, 石杰 申請(qǐng)人:黑龍江省科學(xué)院大慶分院