臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)為神經(jīng)細(xì)胞的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種將臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)為神經(jīng)細(xì)胞的方法，采用預(yù)誘導(dǎo)和誘導(dǎo)二步結(jié)合法，并配制了優(yōu)化的預(yù)誘導(dǎo)培養(yǎng)液和誘導(dǎo)培養(yǎng)液，通過該誘導(dǎo)方式，誘導(dǎo)周期短、細(xì)胞分化均一度高，而且電生理檢測(cè)發(fā)現(xiàn)該神經(jīng)細(xì)胞具有誘導(dǎo)放電功能，成功得到誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞。
【專利說明】臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)為神經(jīng)細(xì)胞的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及神經(jīng)生物學(xué)領(lǐng)域，特別涉及一種將臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)為神經(jīng)細(xì)胞的方法，本發(fā)明還涉及培養(yǎng)得到的神經(jīng)細(xì)胞。
【背景技術(shù)】
[0002]臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)是中胚層起源的，能夠進(jìn)行自我更新，并具備向成骨、軟骨和脂肪三種中胚層系細(xì)胞分化潛能的一種成體干細(xì)胞。近年來研究發(fā)現(xiàn)MSC在中胚層之外，還可以跨胚層進(jìn)行轉(zhuǎn)分化，如分化成外胚層系的神經(jīng)細(xì)胞和上皮細(xì)胞以及內(nèi)胚層系的肝細(xì)胞和胰腺細(xì)胞。因?yàn)镸SC來源廣泛，易于分離培養(yǎng)，免疫原性較低，且不存在胚胎干細(xì)胞所面臨的倫理學(xué)問題，這使其在再生醫(yī)學(xué)方面的應(yīng)用具備了其他干細(xì)胞所沒有的優(yōu)勢(shì)。中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)退行性疾病如帕金森氏綜合征以及外部創(chuàng)傷造成的神經(jīng)損傷等長期困擾人類的問題也因此將有更為現(xiàn)實(shí)可行的解決之道。
[0003]過去幾年來，國內(nèi)外許多研究小組報(bào)道了體外將MSC定向誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞的方法。
[0004]MSC定向誘導(dǎo)分化為神經(jīng)細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究有少數(shù)國外研究機(jī)構(gòu)正在進(jìn)行，而國內(nèi)研究很少，而且現(xiàn)有報(bào)道的誘導(dǎo)分化方法誘導(dǎo)周期長，得到的神經(jīng)細(xì)胞分化效率低、細(xì)胞分化均一度低。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明目的是提供一種在體外將人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)分化成神經(jīng)細(xì)胞的新方法，同時(shí)制備得到分化的神經(jīng)細(xì)胞。
[0006]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:一種臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)為神經(jīng)細(xì)胞的方法，其特征在于包括以下步驟:
[0007](I)、臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)和擴(kuò)增:獲得臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞單體，將臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞單體按1-5X 105/ml接種于臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)液中，每3-8天換液傳代一次，得到培養(yǎng)的細(xì)胞；
[0008]所述臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)液含DMEM/F12，2% B27，2-4mM L-谷氨酰胺，ImM硫代甘油(MTG)，I % 非必需氨基酸，EGF20-40ng/ml, bFGF20_30ng/ml，80_90U/ml 青霉素，60-70 μ g/ml 鏈霉素；
[0009](2)、預(yù)誘導(dǎo)分化:將步驟⑴得到的細(xì)胞按I~5X 104/ml的細(xì)胞密度接種進(jìn)行貼壁誘導(dǎo)培養(yǎng)，貼壁培養(yǎng)3天后更換預(yù)誘導(dǎo)培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，3天后半量換液，第3-4天時(shí)終止誘導(dǎo)；
[0010]所述預(yù)誘導(dǎo)培養(yǎng)液為DMEM作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，在此基礎(chǔ)上還含有20nmol~50nmol的維生素C，10-20U/ml人白細(xì)胞抑制因子，l-8mML-谷氨酰胺，2_5mM硫代甘油(MTG)，80-100U/ml 青霉素，80-100 μ g/ml 鏈霉素；
[0011]步驟(3)誘導(dǎo)分化:將步驟(2)得到的細(xì)胞按I~5 X 104/ml的細(xì)胞密度接種進(jìn)行貼壁誘導(dǎo)培養(yǎng)，貼壁培養(yǎng)2天后更換誘導(dǎo)培養(yǎng)液進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，3天后半量換液，第3-6天時(shí)終止誘導(dǎo)，得到神經(jīng)細(xì)胞；
[0012]所述誘導(dǎo)培養(yǎng)液為DMEM作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，在此基礎(chǔ)上還含有20nmol~50nmol的維生素 C，30nmol ~40nmol 的維生素 BI，0.01-0.02%的01^0，0.1πιΜ2-β-巰基乙醇，10-20U/ml人白細(xì)胞抑制因子，10-30U/ml堿性成纖維細(xì)胞生長因子，l_8mML-谷氨酰胺，2-5mM 硫代甘油(MTG)，80-100U/ml 青霉素，80-100 μ g/ml 鏈霉素。
[0013]本發(fā)明所用培養(yǎng)液可在常用的細(xì)胞基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上補(bǔ)充一種或多種成分而得到?？捎糜诒景l(fā)明的細(xì)胞基本培養(yǎng)基可以包括但不僅限于:DMEM，DMEM/F12，2% B27。這些培養(yǎng)基的配方是本領(lǐng)域所公知的，不僅在普通教科書和實(shí)驗(yàn)手冊(cè)中有詳細(xì)描述，而且還可以直接以成品的形式從公司購買獲得。
[0014]作為補(bǔ)充物的成分可以是任何維持或促進(jìn)細(xì)胞生長的成分。他們可以包括但不限于:氨基酸、維生素、蛋白、激素、金屬離子、微量元素、脂肪酸、糖等等。
[0015]本發(fā)明所用的所有試劑均可通過商業(yè)途徑購買得到。
[0016]本發(fā)明所述方法獲得的神經(jīng)細(xì)胞至少具有如下特征之一:
[0017](a)具有典型的細(xì)胞體、軸突和樹突等細(xì)胞結(jié)構(gòu)；
[0018](b)至少表達(dá)蛋白:β -tublin III ；
[0019](c)神經(jīng)細(xì)胞占誘導(dǎo)細(xì)胞群體86-91%左右； [0020](d)對(duì)外界刺激具有放電功能。
[0021]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在:相比現(xiàn)有技術(shù)中一步誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞的方法，本發(fā)明采用預(yù)誘導(dǎo)和誘導(dǎo)二步結(jié)合法，并配制了優(yōu)化的預(yù)誘導(dǎo)培養(yǎng)液和誘導(dǎo)培養(yǎng)液，采用該誘導(dǎo)方式，誘導(dǎo)周期短6~10天、細(xì)胞分化均一度高(比例高達(dá)90%以上)，明顯高于目前現(xiàn)有技術(shù)中神經(jīng)細(xì)胞的誘導(dǎo)效率，而且電生理檢測(cè)發(fā)現(xiàn)該神經(jīng)細(xì)胞具有誘導(dǎo)放電功能。
[0022]本發(fā)明的二步誘導(dǎo)法和使用的優(yōu)化培養(yǎng)液的組合未公開發(fā)表，本領(lǐng)域的技術(shù)人員如不花費(fèi)創(chuàng)造性勞動(dòng)根本不能根據(jù)現(xiàn)有的技術(shù)推斷得到本發(fā)明的方法。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0023]圖1為本發(fā)明神經(jīng)細(xì)胞的免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果，A為本發(fā)明神經(jīng)細(xì)胞β -tublin III免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果，B為相差圖；
[0024]圖2為實(shí)施例2誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞的流式細(xì)胞分析，B為本發(fā)明神經(jīng)細(xì)胞，A為同型對(duì)照；
[0025]圖3為實(shí)施例3誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞的流式細(xì)胞分析，B為本發(fā)明神經(jīng)細(xì)胞，A為同型對(duì)照；
[0026]圖4為實(shí)施例2誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞的電生理檢測(cè)；
[0027]圖5為實(shí)施例3誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞的電生理檢測(cè)。
【具體實(shí)施方式】
[0028]實(shí)施例1、臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞獲取和培養(yǎng)
[0029]使用經(jīng)產(chǎn)婦同意授權(quán)的新生兒臍帶作為間充質(zhì)干細(xì)胞的來源。[0030]將新生兒臍帶在含I %雙抗的生理鹽水中洗滌三次，去除表面的血污，然后剪成約I厘米長的小段。用眼科剪將臍帶沿血管平行方向縱向剖開，將2根臍動(dòng)脈和I根臍靜脈血管從臍帶中剝離干凈。剝掉表面羊膜，華通膠部分用含I %雙抗的生理鹽水充分洗滌3次，剪碎至約Imm3大小。將剪碎的組織塊均勻的平鋪在75cm2培養(yǎng)瓶內(nèi)，室溫放置5_10min，使組織塊貼緊。加入5ml培養(yǎng)基，培養(yǎng)基含DMEM/F12，2% B27,4mM L-谷氨酰胺，ImM硫代甘油(MTG)，I %非必需氨基酸，EGF20ng/ml, bFGF20ng/ml, 90U/ml 青霉素，70 μ g/ml 鏈霉素，37°C 5% CO2孵箱培養(yǎng)。每隔三天更換一次培養(yǎng)基，細(xì)胞生長至鋪滿培養(yǎng)皿后傳代培養(yǎng)。
[0031]也可以使用市售或商售的合法來源的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞通過實(shí)施例1的方法直接進(jìn)行培養(yǎng)。
[0032]實(shí)施例2、臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞體外定向誘導(dǎo)分化I
[0033]新鮮傳代的P3-6代臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞以5X 104/ml接種于放置有包被多聚賴氨酸蓋玻片的24孔板內(nèi)，Iml/孔，貼壁培養(yǎng)3天后更換預(yù)誘導(dǎo)培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，3天后半量換液，第3天時(shí)終止誘導(dǎo)。
[0034]預(yù)誘導(dǎo)培養(yǎng)液為DMEM作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，此基礎(chǔ)上還含有50nmol的維生素C，20U/ml人白細(xì)胞抑制因子，8mM L-谷氨酰胺，5mM硫代甘油(MTG)，80U/ml青霉素，80 μ g/ml鏈霉素。
[0035]將預(yù)誘導(dǎo)培養(yǎng)得到的細(xì)胞按5X 104/ml的細(xì)胞密度接種進(jìn)行單層貼壁誘導(dǎo)培養(yǎng)，貼壁培養(yǎng)2天后更換誘導(dǎo)培養(yǎng)液進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，3天后半量換液，第3天時(shí)終止誘導(dǎo)，得到神經(jīng)細(xì)胞；
[0036]誘導(dǎo)培養(yǎng)液為DMEM作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，在此基礎(chǔ)上還含有50nmol的維生素C，30nmol的維生素B1，0.01 %的DMS0，0.lmM2_β -巰基乙醇，10U/ml人白細(xì)胞抑制因子，30U/ml堿性成纖維細(xì)胞生長因子，8mM L-谷氨酰胺，5mM硫代甘油(MTG)，100U/ml青霉素，80 μ g/ml鏈霉素。
[0037]對(duì)實(shí)施例2中誘導(dǎo)得到的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果、流式細(xì)胞分析結(jié)果和電生理檢測(cè)結(jié)果，結(jié)果表明誘導(dǎo)培養(yǎng)即誘導(dǎo)產(chǎn)生了神經(jīng)細(xì)胞，而且細(xì)胞分化比例達(dá)到91.43%，而且得到的神經(jīng)細(xì)胞對(duì)外界刺激具有放電功能。
[0038]實(shí)施例3、臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞體外定向誘導(dǎo)分化2
[0039]新鮮傳代的P3-6代臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞以5X 104/ml接種于放置有包被多聚賴氨酸蓋玻片的24孔板內(nèi)，Iml/孔，貼壁培養(yǎng)3天后更換預(yù)誘導(dǎo)培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，3天后半量換液，第4天時(shí)終止誘導(dǎo)。
[0040]預(yù)誘導(dǎo)培養(yǎng)液為DMEM作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，此基礎(chǔ)上還含有20nmol的維生素C，IOU/ml人白細(xì)胞抑制因子，ImM L-谷氨酰胺，2mM硫代甘油(MTG)，100U/ml青霉素，100 μ g/ml鏈
霉素O
[0041]將預(yù)誘導(dǎo)培養(yǎng)得到的細(xì)胞按5X 104/ml的細(xì)胞密度接種進(jìn)行單層貼壁誘導(dǎo)培養(yǎng)，貼壁培養(yǎng)2天后更換誘導(dǎo)培養(yǎng)液進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，3天后半量換液，第6天時(shí)終止誘導(dǎo)，得到神經(jīng)細(xì)胞；
[0042] 誘導(dǎo)培養(yǎng)液為DMEM作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，此基礎(chǔ)上還含有20nmol的維生素C，40nmol的維生素BI，0.02%的DMS0，0.lmM2- β -巰基乙醇，20U/ml人白細(xì)胞抑制因子，10U/ml堿性成纖維細(xì)胞生長因子，ImM L-谷氨酰胺，2mM硫代甘油(MTG)，80U/ml青霉素，80 μ g/ml鏈霉素。
[0043]對(duì)實(shí)施例3中誘導(dǎo)得到的神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)、流式細(xì)胞分析和電生理檢測(cè)，結(jié)果表明誘導(dǎo)產(chǎn)生了神經(jīng)細(xì)胞，而且細(xì)胞分化比例達(dá)到86.64%，而且得到的神經(jīng)細(xì)胞對(duì)外界刺激具有放電功能。
[0044]實(shí)施例4對(duì)比實(shí)施例
[0045]新鮮傳代的P3-5代臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞以5X 104/ml接種于放置有包被多聚賴氨酸蓋玻片的24孔板內(nèi)，Iml/孔，貼壁培養(yǎng)3天后更換培養(yǎng)液為DMEM/F12，2% B27此基礎(chǔ)上還含有8mM L-谷氨酰胺，80U/ml青霉素，80 μ g/ml鏈霉素。3天后半量換液，第6天時(shí)終止誘導(dǎo)。
[0046]實(shí)施例5神經(jīng)細(xì)胞的檢測(cè)
[0047](I)免疫組化鑒定
[0048]步驟:(I)將實(shí)施例2方法獲得的神經(jīng)細(xì)胞加入4ml預(yù)熱至30°C，用杜氏磷酸緩沖液(DPBS)漂洗細(xì)胞兩次，每次4min ;(2)加入2mi3%多聚甲醛固定液，室溫固定20min ; (3)DPBS漂洗4次，每次2min。用含1% Triton X-100的DPBS在35°C溫育20分鐘。(4)加入2ml含6%山羊血清的DPBS，室溫下作用20min。(5)用槍頭吸棄封閉液后，加入I: 500稀釋的鼠抗人β-tublin III單抗，4°C過夜。(6)用槍頭吸棄一抗反應(yīng)液，用DPBS漂洗4次，每次3min。(7)加入1: 200稀釋的羊抗鼠熒光二抗，37°C避光溫育lh。(8)用槍頭吸棄第二抗體反應(yīng)液后，用DPBS漂洗兩次，每次4min。(9)雙蒸水漂洗3次，熒光顯微鏡(Nikon)下觀察并拍照記錄，如圖1顯示，A實(shí)施例2誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞β -tublin III免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果，B為相差圖。結(jié)果表 明成功誘導(dǎo)產(chǎn)生了神經(jīng)細(xì)胞。
[0049]將實(shí)施例3方法獲得的神經(jīng)細(xì)胞重復(fù)該方法，結(jié)果同樣表明成功誘導(dǎo)產(chǎn)生了神經(jīng)細(xì)胞。
[0050](2)流式細(xì)胞分析
[0051]步驟:(1)將實(shí)施例2-4方法誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞，分別以300Xg離心4min后用4°C DPBS漂洗兩次。(2)重懸于0.5ml的4°C的4%多聚甲醛中，18°C溫育10分鐘。間歇地渦旋管子以維持單細(xì)胞懸液。(3) DPBS漂洗2次，每次2min。300 Xg離心4min。(4)用含1% Triton X-100的DPBS在37°C溫育20分鐘。(5) 300X g離心4min，棄上清后加入2ml含5%山羊血清的DPBS(封閉液)，室溫下作用20min。(6)300Xg離心5min，棄上清后加入I: 50稀釋的FITC標(biāo)記過的β-tublin III單抗；加抗體稀釋液作為同型對(duì)照。室溫孵育2小時(shí)。(7) 300 Xg離心5min，棄上清，用DPBS漂洗3次，每次3min。(8) 300 Xg離心5min,棄上清后每管用200ul的DPBS重懸細(xì)胞，上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)分析。圖2中B顯示實(shí)施例2誘導(dǎo)細(xì)胞中神經(jīng)細(xì)胞比例約占91.43%,A圖為實(shí)施例4對(duì)照。圖3中B顯示實(shí)施例3誘導(dǎo)細(xì)胞中神經(jīng)細(xì)胞比例約占86.64%, A圖為實(shí)施例4對(duì)照。
[0052](3)電生理檢測(cè)
[0053]培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)測(cè)試腔內(nèi)加入150 μ I的10 μ g/ml多聚賴氨酸表面處理液，37°C培養(yǎng)箱中放置20小時(shí)，然后用滅菌雙蒸水將培養(yǎng)皿漂洗4次，鋪入實(shí)施例2獲得的神經(jīng)細(xì)胞，37°C、5%°C O2培養(yǎng)2天，再對(duì)神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)行無鎂細(xì)胞外液37°C處理4h。采用LAPS芯片系統(tǒng)檢測(cè)誘導(dǎo)出的神經(jīng)細(xì)胞電位，結(jié)果如圖4-5所示。圖4中顯示實(shí)施例2得到的神經(jīng)細(xì)胞經(jīng)無鎂誘導(dǎo)電位信號(hào)(上)及自發(fā)電位信號(hào)(下)，圖5中顯示實(shí)施例3得到的神經(jīng)細(xì)胞經(jīng)無鎂誘導(dǎo)電位信號(hào)(上)及自發(fā)電位信號(hào)(下)，結(jié)果表明本發(fā)明培養(yǎng)得到的神經(jīng)細(xì)胞對(duì)外界刺激具有放電功能。
[0054]最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的具體實(shí)施例子。顯然，本發(fā)明不限于以上實(shí)施例子， 還可以有許多變形。
【權(quán)利要求】
1.一種臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)為神經(jīng)細(xì)胞的方法，其特征在于包括以下步驟: (1)、臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)和擴(kuò)增:獲得臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞單體，將臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞單體按1-5 X 105/ml接種于臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)液中，每3-8天換液傳代一次，得到培養(yǎng)的細(xì)胞； 所述臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)液含DMEM/F12，2% B27，2-4mM L-谷氨酰胺，ImM硫代甘油，I %非必需氨基酸，EGF20-40ng/ml, bFGF20-30ng/ml, 80-90U/ml 青霉素，60-70 μ g/ml 鏈霉素； (2)、預(yù)誘導(dǎo)分化:將步驟(1)得到的培養(yǎng)細(xì)胞按I~5X104/ml的細(xì)胞密度接種進(jìn)行貼壁誘導(dǎo)培養(yǎng)，貼壁培養(yǎng)3天后更換預(yù)誘導(dǎo)培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，3天后半量換液，第3-4天時(shí)終止誘導(dǎo)； 所述預(yù)誘導(dǎo)培養(yǎng)液為DMEM作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，在此基礎(chǔ)上還含有20nmol~50nmol的維生素C，10-20U/ml人白細(xì)胞抑制因子，l_8mM L-谷氨酰胺，2_5mM硫代甘油，80_100U/ml青霉素，80-100 μ g/ml鏈霉素。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)為神經(jīng)細(xì)胞的方法，其特征在于:還包括步驟(3)誘導(dǎo)分化:將步驟(2)得到的細(xì)胞按I~5X104/ml的細(xì)胞密度接種進(jìn)行貼壁誘導(dǎo)培養(yǎng)，貼壁培養(yǎng)2天后更換誘導(dǎo)培養(yǎng)液進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，3天后半量換液，第3-6天時(shí)終止誘導(dǎo)，得到神經(jīng)細(xì)胞；所述誘導(dǎo)培養(yǎng)液為DMEM作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，在此基礎(chǔ)上還含有20nmol~50nmol的維生素C, 30nmol~40nmol的維生素BI, 0.01-0.02 %的二甲基亞砜，0.1πιΜ2-β-巰基乙醇，10-20U/ml人白細(xì)胞抑制因子，10_30U/ml堿性成纖維細(xì)胞生長因子，l-8mM L-谷氨酰胺 ，2-5mM硫代甘油，80-100U/ml青霉素，80-100 μ g/ml鏈霉素。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)為神經(jīng)細(xì)胞的方法，其特征在于:所述臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)液含DMEM/F12，2% B27,4mM L-谷氨酰胺，ImM硫代甘油，1%非必需氨基酸，EGF20ng/ml, bFGF20ng/ml90U/ml青霉素,70 μ g/ml鏈霉素；所述預(yù)誘導(dǎo)培養(yǎng)液為DMEM作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，在此基礎(chǔ)上還含有50nmol的維生素C，20U/ml人白細(xì)胞抑制因子，8mM L-谷氨酰胺，5mM硫代甘油，80U/ml青霉素，80 μ g/ml鏈霉素；所述誘導(dǎo)培養(yǎng)液為DMEM作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，在此基礎(chǔ)上還含有50nmol的維生素C，30nmol的維生素BI，0.01%的二甲基亞砜，0.1πιΜ2-β-巰基乙醇，10U/ml人白細(xì)胞抑制因子，30U/ml堿性成纖維細(xì)胞生長因子，8mM L-谷氨酰胺，5mM硫代甘油，100U/ml青霉素，100 μ g/ml鏈霉素。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3之一的方法培養(yǎng)得到的神經(jīng)細(xì)胞。
【文檔編號(hào)】C12N5/079GK104004713SQ201410201461
【公開日】2014年8月27日 申請(qǐng)日期:2014年5月14日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月14日
【發(fā)明者】安沂華, 董健伸 申請(qǐng)人:安沂華