一株提高對乙醇耐受性的釀酒酵母基因工程菌株及其構(gòu)建方法
【專利摘要】一株提高對乙醇耐受性的釀酒酵母基因工程菌株及其構(gòu)建方法，菌株分類命名為Saccharomyces?cerevisiae?YM-27，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC?M2014206。本發(fā)明還提供了該菌株的構(gòu)建方法以及濃醪發(fā)酵淀粉生產(chǎn)乙醇的方法。該菌株的構(gòu)建方法是：將釀酒酵母轉(zhuǎn)錄激活因子Msn4基因置于組成型強啟動子PGK下，構(gòu)建重組整合表達質(zhì)粒YPKR-Msn4，rDNA介導(dǎo)整合到受體菌酵母工業(yè)菌株Y49的染色體中，篩選得到釀酒酵母菌YM-27。本發(fā)明構(gòu)建的釀酒酵母工程菌運用在木薯乙醇工業(yè)生產(chǎn)中，可克服濃醪發(fā)酵中后期酵母菌受高濃度乙醇抑制而發(fā)酵活力不足的問題，可應(yīng)用于乙醇濃醪發(fā)酵，為木薯乙醇發(fā)酵工業(yè)帶來明顯的經(jīng)濟效益。
【專利說明】一株提高對乙醇耐受性的釀酒酵母基因工程菌株及其構(gòu)建方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體是一株提高對乙醇耐受性的釀酒酵母基因工程菌株的構(gòu)建方法及其應(yīng)用。以及該工程菌株在以木薯為原料濃醪發(fā)酵生產(chǎn)燃料乙醇中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]燃料乙醇目前被認為是最有可能大規(guī)模替代石油的液體燃料，市場潛力十分巨大，非糧乙醇的規(guī)?；虡I(yè)開發(fā)將成為我國最有前途的新興能源產(chǎn)業(yè)之一。目前我國生產(chǎn)乙醇的主要原料是以玉米等糧食作物為主，但是我國人口眾多，存在“與民爭糧”的問題。在纖維素轉(zhuǎn)化為乙醇的技術(shù)成熟之前，未來燃料乙醇發(fā)展更多的應(yīng)是依靠非糧原料。木薯具有產(chǎn)量高、耐貧瘠、耐干旱、耐酸性、抗逆性強等特性，其塊根淀粉含量可達70%以上，有“淀粉之王”的美稱，是生產(chǎn)燃料乙醇的首選低成本原料。廣西的木薯種植面積和產(chǎn)量居全國首位，廣西利用高產(chǎn)木薯作為原料生產(chǎn)燃料乙醇是世界首創(chuàng)。我國《可再生能源發(fā)展“十二五”規(guī)劃》在政策上明確支持建設(shè)具備條件的木薯乙醇等非糧項目，因此木薯燃料乙醇具有長期的可行性。
[0003]濃醪發(fā)酵是燃料乙醇發(fā)酵工業(yè)發(fā)展的有效途徑之一，其有以下優(yōu)點:(I)提高單位體積和時間內(nèi)發(fā)酵濃度，增加了發(fā)酵強度，提高乙醇產(chǎn)量和設(shè)備利用率。(2)醪液酒度的提高，能有效降低乙醇蒸餾蒸氣的用量，從而降低了煤電的消耗。如將乙醇發(fā)酵的濃度由12% (v/v)提高至16% (v/v),可節(jié)省蒸懼能耗25%左右。(3)節(jié)約工藝用水,并可減少乙醇蒸餾損失。(4)實現(xiàn) 濃醪發(fā)酵可以減少企業(yè)污水處理負擔(dān)。然而，與傳統(tǒng)發(fā)酵相比，釀酒酵母在濃醪發(fā)酵過程中，面臨著嚴峻的環(huán)境脅迫，在濃醪發(fā)酵過程中，酵母菌隨著發(fā)酵液乙醇、乙醛等毒性物質(zhì)濃度的升高，發(fā)酵速率逐漸下降，導(dǎo)致發(fā)酵周期延長，并使發(fā)酵終點乙醇濃度降低，殘?zhí)巧?，可見發(fā)酵終點的乙醇濃度與酵母菌本身的耐乙醇性能有關(guān)。
[0004]近年來，國內(nèi)已開始采用耐乙醇酵母進行工業(yè)化濃醪發(fā)酵生產(chǎn)乙醇，玉米原料乙醇發(fā)酵濃度可達13% (v/v)，木薯原料乙醇發(fā)酵濃度低于玉米且發(fā)酵效率不高。在高濃度乙醇發(fā)酵技術(shù)研究上，國內(nèi)有關(guān)的科研機構(gòu)已開展了相應(yīng)的工作，其發(fā)酵菌株乙醇發(fā)酵濃度最高可達15% -16% (v/v)，但其發(fā)酵時間較長，發(fā)酵效率低于92%，同時其發(fā)酵底物大多為玉米和精制淀粉。乙醇濃醪發(fā)酵會引起糖濃度和乙醇濃度升高，導(dǎo)致酵母菌的生長受到抑制和乙醇發(fā)酵不徹底的現(xiàn)象，是制約木薯原料濃醪發(fā)酵的主要的關(guān)鍵因素之一。因此，提高工業(yè)乙醇酵母的逆境耐受性，是選育發(fā)酵生產(chǎn)燃料乙醇菌種的重要指標。利用代謝工程構(gòu)建選育具有高抗逆性的工業(yè)釀酒酵母菌株是突破濃醪發(fā)酵瓶頸的關(guān)鍵所在，對于燃料乙醇的發(fā)酵生產(chǎn)，尤其是高濃度乙醇發(fā)酵具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]針對現(xiàn)有技術(shù)不足，提供一株提高對乙醇耐受性的釀酒酵母基因工程菌株的構(gòu)建方法及其應(yīng)用。能很好地在木薯濃醪乙醇發(fā)酵生產(chǎn)中應(yīng)用。
[0006]本發(fā)明的技術(shù)方案是:提供的一株提高對乙醇耐受性的釀酒酵母基因工程菌株，該菌株為YM-27,分類學(xué)名為釀酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae),于2014年5月15日保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC M2014206，保藏地址為武漢市武昌珞珈山武漢大學(xué)。
[0007]所述的提高對乙醇耐受性的釀酒酵母基因工程菌株的構(gòu)建方法，包括如下步驟:PCR克隆釀酒酵母轉(zhuǎn)錄激活因子Msn4基因，連接入rDNA介導(dǎo)的多拷貝整合表達載體YPKR，構(gòu)建rDNA介導(dǎo)、PGK酵母強啟動子的高拷貝整合表達質(zhì)粒YPKR_Msn4，線性化酶切重組表達質(zhì)粒，將其轉(zhuǎn)化導(dǎo)入到受體酵母菌株Y49的染色體中，獲得工程菌株YM-27。
[0008]所述的提高對乙醇耐受性的釀酒酵母基因工程菌株在木薯乙醇濃醪發(fā)酵生產(chǎn)中的應(yīng)用。
[0009]本發(fā)明所述的整合型表達質(zhì)粒YPKR，是以釀酒酵母整合載體?ρ5為骨架，在其中引入特定的rDNA片段及G418抗性基因，同時引入釀酒酵母PGK強啟動子，構(gòu)建rDNA介導(dǎo)的多拷貝整合表達載體，以適用對釀酒酵母工業(yè)菌株的分子生物學(xué)操作，提高外源基因的穩(wěn)定性和表達量。
[0010]本發(fā)明所述的受體酵母菌株Y49,由自行篩選的釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae) Y09tj (中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心、保藏編號CGMCCN0.3476)誘變篩選獲得。
[0011]本發(fā)明所述的提高對乙醇耐受性的釀酒酵母基因工程菌株在木薯乙醇濃醪發(fā)酵生產(chǎn)中的應(yīng)用，包括以 下步驟:35g木薯粉，淀粉的終濃度為20~40% (W/W)，加水70mL攪拌，加入0.25% (W/W)的尿素,加入耐高溫α -淀粉酶,使用量為向每克淀粉質(zhì)原料中加入
0.15KNU的耐高溫α -淀粉酶，在震蕩水浴鍋85°C液化30min，降溫至32°C后，按0.10~
0.14億個細胞/mL發(fā)酵液接種釀酒酵母發(fā)酵，同時加入糖化酶,使用量為向每克原料中加入0.14AGU的糖化酶，初始pH值調(diào)整為4.5，發(fā)酵溫度為30~37°C，轉(zhuǎn)速為90rpm，發(fā)酵時間為40~48h。
[0012]本發(fā)明的突出優(yōu)點在于:所獲得的釀酒酵母工程菌(Saccharomyces cerevisiae)YM-27與受體酵母菌株Y49相比，具有較好的乙醇耐受性，在12 %的乙醇脅迫下，最大0D_生長值是受體酵母菌的1.97倍，在35%木薯淀粉乙醇發(fā)酵中，48h乙醇濃度達15.17% (V/V)，比一般工業(yè)酵母菌發(fā)酵周期短，酒度高，適合木薯濃醪乙醇發(fā)酵，提高了原料的利用率，降低了乙醇生產(chǎn)成本，能夠為乙醇發(fā)酵工業(yè)帶來顯著的經(jīng)濟利益。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0013]圖1為Msn4基因PCR擴增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳。
[0014]圖2為轉(zhuǎn)化子的G418抗性表型。A，YPD平板；B，600ug/mLG418YPD平板；1，2，3釀酒酵母轉(zhuǎn)化子；4，受體酵母。
[0015]圖3為重組酵母工程菌株YM-27和受體酵母菌株Y49在12%乙醇脅迫下，在三角瓶培養(yǎng)不同時間測定的0D_值。
【具體實施方式】[0016]下列實施例中的方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。
[0017]實施例1
[0018]釀酒酵母整合表達載體的構(gòu)建
[0019]構(gòu)建質(zhì)粒YP，以釀酒酵母整合載體YIp5為骨架，克隆酵母穿梭質(zhì)粒ΡΜΑ91的PGK基因，連接于Yip5的Hind III位點。
[0020]構(gòu)建質(zhì)粒YPK，以質(zhì)粒pFA6akanMX4為模板，PCR擴增G418抗性基因KanMX，弓丨物均引入 SalI 酶切位點，Kan-F (5，-ATTA GTCGACTCTGTTTAGCTTGCCTC-3’)，Kan-R(5，-ACGCGTCGACTATCATCGATGAATTCGA-3’)，連接于質(zhì)粒 YP。
[0021]構(gòu)建質(zhì)粒YPKR，以釀酒酵母總DNA為模板，PCR擴增rDNA基因，引物分別引入XmalII 和 BspMII 酶切位點，rDNA_F(5’ -ATCACGGCCGAACGAACGAGACCTTAACCT-3’)，rDNA_R(5’ -GCTGTCCGGAGGAACCTCTAATCATTGGCT-3’)，連接于經(jīng) XmalII 和 BspMII 酶切雙酶切的質(zhì)粒YPK,得到釀酒酵母表達載體YPKR。酶切和連接反應(yīng)參照Takara公司提供的酶的使用說明書，所述的質(zhì)粒Πρ5, pMA91, pFA6akanMX4通過惠贈獲得。
[0022]實施例 2
[0023]高耐受性重組釀酒 酵母工程菌株的獲得
[0024]1、關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄激活因子Msn4基因的獲得
[0025]根據(jù)已報道的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子Msn4的基因序列，設(shè)計上下游引物，添加Bgl II酶切位點序列AGATCT，進行Msn4基因的PCR擴增。引物序列為:
[0026]上游引物Pl:5，-GCGCAGATCTATGCTAGTCTTCGGACCTAATAGT-3，
[0027]下游引物P2:5’ -TTGCAGATCTTTAAAAATCACCGTGCTTTTTGT-3’
[0028]以酵母總DNA為模板，以P1、P2為引物進行PCR擴增。擴增體系:2XMix12.5 μ LlOXPolymerase Buffer5 μ L，引物 Ρ1、Ρ2 各 20pmol,模板DNA0.3 μ g, Taq 酶
5.0U，H2O補足至50 μ L。擴增條件:首次循環(huán)在95°C下預(yù)變性2min，如下反應(yīng)30個循環(huán)包括94°C變性30s，55°C退火30s，72°C延伸2min ;最后72°C延伸lOmin，。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，觀察到一條約1.9kb的特異性條帶，大小與預(yù)期一致，如圖1所示。
[0029]2、重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建
[0030]將PCR產(chǎn)物Msn4基因片段純化后用Bgl II進行單酶切，與經(jīng)同樣酶切的質(zhì)粒YPKR連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞DH5a，挑取轉(zhuǎn)化子進行菌體1%瓊脂糖凝膠電泳，以空質(zhì)粒為對照，選出滯后的轉(zhuǎn)化子提質(zhì)粒，質(zhì)粒經(jīng)PCR、酶切、測序鑒定，產(chǎn)物純化、酶切、轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒抽提等步驟均按常規(guī)方法進行，測序由上海生工完成，經(jīng)測序正確的質(zhì)粒命名為YPKR-Msn4。
[0031 ] 3、釀酒酵母轉(zhuǎn)化子的篩選
[0032]在釀酒酵母進行電轉(zhuǎn)化之前，對釀酒酵母受體菌進行了抗性篩選標記G418的敏感性測定，在G418濃度為275ug/mL的YPD平板上酵母已經(jīng)被抑制而不能生長，因而在篩選轉(zhuǎn)化子的時候可以用超過275ug/mL的G418濃度來篩選。
[0033]將構(gòu)建好的重組表達質(zhì)粒YPKR_Msn4進行限制性內(nèi)切酶HpaI線性化后，用酚/氯仿抽提、乙醇沉淀。同時，制備酵母Y49感受態(tài)，取80 μ L感受態(tài)，加入1yL酶切產(chǎn)物，輕輕混勻后吸入電擊杯冰浴1min后，1500V電擊轉(zhuǎn)化(同時轉(zhuǎn)化空質(zhì)粒YPKR作為陰性對照)。隨即加入ImLlM山梨醇，30°C放置2h后，4500rpm，4°C，離心5min收集菌體，用YPD重懸菌體，于30°C預(yù)培養(yǎng)2h，快速離心收集菌體，用IM山梨醇適當(dāng)稀釋，均勻涂布在G418濃度為300 μ g/mL的YPD平板上，30 V培養(yǎng)2_3d，直至明顯長出菌落。挑取轉(zhuǎn)化子和受體酵母菌Y49轉(zhuǎn)接至含600 μ g/mL G418的高抗性平板上，在30°C培養(yǎng)數(shù)天，所有被測轉(zhuǎn)化子均表現(xiàn)出良好的G418抗性表型(如圖2)，但受體酵母菌表現(xiàn)不能生長的狀態(tài)。
[0034]分別挑取高抗性平板上的陽性單菌落接種至裝液量20mL，含12%乙醇的YPD液體培養(yǎng)基的50mL的三角瓶中，30°C搖床培養(yǎng)12h以上，不同時間測量其OD6tltl值，進行轉(zhuǎn)化子篩選。
[0035]4、菌株耐性試驗
[0036]挑取耐性較高的轉(zhuǎn)化子YM-27以及受體酵母菌單菌落，接種至5mLYPD液體培養(yǎng)基中，30°C培養(yǎng)過夜，以8%的接種量分別接種至12%乙醇的YPD液體培養(yǎng)基中，300C，220rpm培養(yǎng)，每隔12h取樣測量其0D_值(如圖3)。
[0037]實施例3
[0038]重組菌株木薯濃醪乙醇發(fā)酵試驗。
[0039]種子培養(yǎng)基YPD:葡萄糖20g，蛋白胨20g，酵母粉10g，蒸餾水定容至1000mL。
[0040]所用酶類:耐高溫淀粉酶:Liquozyme Supra,購自諾維信公司，標準酶活力為90KNU/g。糖化酶:Dextrozyme DX,購自諾維信公司，標準酶活500AGU/mL。
[0041]種子液準備:將重組菌株接種于YH)液體培養(yǎng)基中，30°C，220rpm/min培養(yǎng)12h~14h，使種子液的酵母菌細 胞達到每毫升1.5億以上，用于接種發(fā)酵。
[0042]發(fā)酵過程:取木薯粉35g，放入250mL三角瓶中，加自來水70mL，尿素添加量為
0.25% (W/W)，加入0.15KNU/g木薯粉的耐高溫α -淀粉酶，在85°C水浴震蕩液化30min，降溫至32°C，按8%的接種量接種發(fā)酵，同時加入0.14AGU/g木薯粉的糖化酶，用鹽酸調(diào)pH值為4.5，在32°C，90rpm/min發(fā)酵48h后，氣相測量乙醇濃度可達至Ij 15.17% (V/V)。
【權(quán)利要求】
1.一株提高對乙醇耐受性的釀酒酵母基因工程菌株，其特征在于，該菌株為YM-27，分類學(xué)名為釀酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae),于2014年5月15日保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC M2014206。
2.如權(quán)利要求1所述的提高對乙醇耐受性的釀酒酵母基因工程菌株的構(gòu)建方法，其特征在于，包括如下步驟:PCR克隆釀酒酵母轉(zhuǎn)錄激活因子Msn4基因，連接入rDNA介導(dǎo)的多拷貝整合表達載體YPKR，構(gòu)建rDNA介導(dǎo)、PGK酵母強啟動子的高拷貝整合表達質(zhì)粒YPKR-Msn4,線性化酶切重組表達質(zhì)粒，將其轉(zhuǎn)化導(dǎo)入到受體酵母菌株Y49的染色體中，獲得工程菌株YM-27。
3.如權(quán)利要求2所述的提高對乙醇耐受性的釀酒酵母基因工程菌株的構(gòu)建方法，其特征在于，所述的整合表達載體YPKR，是以釀酒酵母整合載體?ρ5為骨架，在其中引入特定的rDNA片段及G418抗性基因，同時引入釀酒酵母PGK強啟動子，構(gòu)建rDNA介導(dǎo)的多拷貝整合表達載體，以適用對釀酒酵母工業(yè)菌株的分子生物學(xué)操作，提高外源基因的穩(wěn)定性和表達量。
4.如權(quán)利要求2所述的提高對乙醇耐受性的釀酒酵母基因工程菌株的構(gòu)建方法，其特征在于，所述的受體酵母菌株Y49，由保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心、保藏編號為CGMCC N0.3476自行篩選的釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)Y09tj,誘變篩選獲得。
5.如權(quán)利要求1或2所述的提高對乙醇耐受性的釀酒酵母基因工程菌株在木薯乙醇濃醪發(fā)酵生產(chǎn)中的應(yīng)用。
6.如權(quán)利要求5所述的提高對乙醇耐受性的釀酒酵母基因工程菌株在木薯乙醇濃醪發(fā)酵生產(chǎn)中的應(yīng)用，其特征在于，包括以下步驟:取35g木薯粉，淀粉的終濃度為20~40%(W/W)，加水70mL攪拌，加入0.25% (W/W)的尿素，加入耐高溫α-淀粉酶，使用量為向每克淀粉質(zhì)原料中加入0.15KNU的耐高溫α -淀粉酶，在震蕩水浴鍋85°C液化30min，降溫至32°C后，按0.10~0.14億個細胞/mL發(fā)酵液接種釀酒酵母發(fā)酵，同時加入糖化酶，使用量為向每克原料中加入0.14AGU的糖化酶，初始pH值調(diào)整為4.5，發(fā)酵溫度為30~37°C，轉(zhuǎn)速為90rpm,發(fā)酵時間為40~48h。
【文檔編號】C12P7/06GK104031854SQ201410279326
【公開日】2014年9月10日 申請日期:2014年6月20日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月20日
【發(fā)明者】秦艷, 王青艷, 謝能中, 申乃坤, 米慧芝, 朱綺霞, 朱婧, 廖思明, 黃日波, 陳東 申請人:廣西科學(xué)院