基于固體發(fā)酵的青稞中多糖含量的提高方法【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種基于固體發(fā)酵方法提高青稞多糖含量方法。該工藝涉及生物工程【
技術(shù)領(lǐng)域：
】，以靈芝為發(fā)酵菌株、青稞為主要基質(zhì)，靈芝菌株通過(guò)液體發(fā)酵后進(jìn)一步在青稞基質(zhì)中固體發(fā)酵，從而使得青稞中的多糖含量增加、易于分離。青稞充分吸水后，接入10％的靈芝液體菌種，25‐30℃條件下固體發(fā)酵7‐10天；發(fā)酵后的青稞基質(zhì)粉碎后，加10倍量的水提取，提取液減壓濃縮后，加入乙醇沉淀，上清液8000轉(zhuǎn)離心分離或靜置2小時(shí)后過(guò)濾分離，殘?jiān)礊槎嗵?。采用該方法固體發(fā)酵后多糖含量比原來(lái)青稞中多糖的含量提高了2倍以上，且易于提取分離；所得多糖兼有青稞多糖和靈芝多糖的活性成分，可用于各類(lèi)食品添加劑、保健食品、藥物的開(kāi)發(fā)等領(lǐng)域?！緦?zhuān)利說(shuō)明】基于固體發(fā)酵的青稞中多糖含量的提高方法【
技術(shù)領(lǐng)域：
】[0001]本發(fā)明涉及的是一種生物工程領(lǐng)域的青稞深加工方法，具體是一種以青稞籽粒為原料利用生物轉(zhuǎn)化原理提高青稞中β-葡聚糖含量的制備方法?！?br>背景技術(shù)：
】[0002]青棵（HordeumvulgareVar.Muda)，英文名hullessbarley，是禾本科大麥屬的一種禾谷類(lèi)作物，因其內(nèi)外穎殼分離，籽粒裸露，故又稱(chēng)裸大麥、元麥、米大麥。青稞分為白青稞，黑青稞，墨綠色青稞等種類(lèi)。青藏高原是野生大麥和青稞栽培的起源地也是優(yōu)質(zhì)青稞的豐產(chǎn)地。在糧食作物中，青稞具有高蛋白質(zhì)、高纖維、高維生素、低脂肪、低糖等特點(diǎn)。據(jù)檢測(cè)青稞β-葡聚糖平均含量為6.57%，優(yōu)良品種青稞可達(dá)8.6%，僅比燕麥低0.1百分點(diǎn)，是小麥平均含量的50倍。正是由于青稞中可溶性膳食纖維含量高，特別是β-葡聚糖含量高，青稞作為營(yíng)養(yǎng)保健品的重要地位越來(lái)越受到人們的重視。（張峰，楊勇，趙國(guó)華等.青稞@-葡聚糖研究進(jìn)展.糧食與油脂，2003(12):3-5.4111]^(^，411加11^，2311〇〇1·!'，NawazH,DinA.hysicochemicalandfunctionalpropertiesofbarleyβ-glucanasaffectedbydifferentextractionprocedures.InternationalJournalofFoodScience&Technology,2009,44(1)：181-187.)[0003]β-葡聚糖是谷物胚乳和糊粉層細(xì)胞壁的一種非淀粉多糖，是一種分子量小于纖維素的復(fù)合的葡萄糖聚合糖。β-葡聚糖有兩種同分異構(gòu)體：β-D-(1-4)葡聚糖和β-D-(1-3)葡聚糖，被認(rèn)為是最具生理活性的一種多糖，主要存在于皮大麥、青稞（裸大麥）和燕麥的糊粉層和胚乳細(xì)胞壁中（MillerSSandFulcherRG.Distributionof(l-3)，（1-4)β-D-glucaninkernelsofoatsandbarleyusingmicrospectrofluorometry.CerealChemistry.1994,(71)：64-68.MusattoSI,DragoneGandRobertoIC.Brewers,spentgrain：generation,characteristicsandpotentialapplication.JournalofCerealScience.2006,43(1):1-14)。經(jīng)過(guò)生物轉(zhuǎn)化后的青棵中β-葡聚糖的含量更高，更有利提取與分離。20世紀(jì)60年代，研究逐漸發(fā)現(xiàn)β-葡聚糖具有降血脂、降膽固醇和預(yù)防心血管疾病的作用，隨后β-葡聚糖的調(diào)節(jié)血糖、提高免疫力、抗腫瘤的作用也陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)，引起了全世界的廣泛關(guān)注。愈來(lái)愈多的醫(yī)療研究已證實(shí)β-葡聚糖對(duì)腫瘤、肝炎、糖尿病等疑難病都有良好的治療效果。目前，生物醫(yī)學(xué)界普遍認(rèn)為β-葡聚糖具有清腸、調(diào)節(jié)血糖、降低膽固醇、提高免疫力等四大生理作用（BaikBK，UllrichSE.Barleyforfoodcharacteristics,improvement,andrenewedinterest.JournalofCerealScience,2008,48(2)：233-242.BrennanCS,ClearyLJ.Thepotentialuseofcereal(1-3,1-4)-β-d-glucansasfunctionalfoodingredients.JournalofCerealScience，2005,42(1):1-13)西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院在對(duì)西藏75個(gè)青稞品種研究后發(fā)現(xiàn)，西藏青稞β-葡聚糖含量在3.66%-8.62%之間，平均含量為5.25%，在谷類(lèi)作物中含量最高，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于皮大麥、小麥和燕麥，"藏青25"的青稞新品種β-葡聚糖含量高達(dá)8.62%，是目前世界上含β-葡聚糖最高的麥類(lèi)作物（江春艷，嚴(yán)冬，譚進(jìn)等.青稞的研究進(jìn)展及應(yīng)用現(xiàn)狀.西藏科技，2010,（2):14-16.洛桑旦達(dá)，強(qiáng)小林.青稞特有營(yíng)養(yǎng)成份分析與開(kāi)發(fā)利用現(xiàn)狀調(diào)查研究報(bào)告.西藏科技.2001，（8):55-64)。[0004]固態(tài)發(fā)酵是指沒(méi)有或幾乎沒(méi)有自由水存在下，在有一定濕度的固態(tài)基質(zhì)中進(jìn)行的發(fā)酵過(guò)程。其優(yōu)勢(shì)有以下幾點(diǎn)：首先，固體發(fā)酵使用的培養(yǎng)條件相對(duì)粗放，而且培養(yǎng)基只需要比較簡(jiǎn)單的前期處理；其次，工業(yè)生產(chǎn)的資金投入比較小，尤其在工業(yè)生產(chǎn)前期投入少，利于規(guī)?；a(chǎn)；另外，固體發(fā)酵的產(chǎn)品性能較好、而且工業(yè)生產(chǎn)時(shí)環(huán)境污染比較小，更有利于生物循環(huán)（Barrios-GonzcilezJ·Solid-statefermentation:Physiologyofsolidmedium,itsmolecularbasisandapplications.ProcessBiochemistry.2012,47(2):175-185)。如今，固體發(fā)酵被廣泛應(yīng)用于來(lái)生產(chǎn)許多低成本高附加值的產(chǎn)品。靈芝為擔(dān)子菌綱多孔菌科靈芝屬真菌，自古以來(lái)就是我國(guó)名貴藥用真菌。衛(wèi)生部2001年發(fā)布的"可用于保健食品的真菌菌種名單"中，有三種靈芝科真菌：赤芝（G.lucidum)、紫芝(G.sinense)和松杉靈芝（G.tsugae)。在實(shí)際被開(kāi)發(fā)利用的靈芝種類(lèi)中，有些種類(lèi)（如赤芝Ganodermalucidum等）已經(jīng)被人工栽培，作為制藥或保健食品的生產(chǎn)原料出口國(guó)外或用于國(guó)內(nèi)市場(chǎng)；有些種類(lèi)（如薄蓋靈芝Ganodermacapense)已被用于液體深層培養(yǎng)，獲得菌絲體及其代謝產(chǎn)物生產(chǎn)保健食品、藥品（ZhouXW，SuKQ，ZhangYM.AppliedmodernbiotechnologyforcultivationofGanodermaanddevelopmentoftheirproducts.ApplliedMicrobiologyandBiotechnology.2012,93:941-963)。目前以玉米、小麥、大豆等農(nóng)作物的種子為基質(zhì)，以靈芝（Ganodermalucidum)為菌株構(gòu)建生物轉(zhuǎn)化體系生產(chǎn)各類(lèi)活性物質(zhì)在國(guó)內(nèi)外已經(jīng)有不少的報(bào)道（高文庚.以玉米為基質(zhì)的靈芝固體發(fā)酵條件優(yōu)化·中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)。2007,23(7)422-422。AsgherM，SharifY，andBhattiH.EnhancedproductionofligninolyticenzymesbyGanoderma1ucidumIBL-06usinglignocellulosicagriculturalwastes.InternationalJournalofChemicalReactorEngineering.2010,8：59.MurugesanK,NamlH,KimYM,andChangYS.DecolorizationofreactivedyesbyathermostablelaccaseproducedbyGanodermaluciduminsolidstateculture.EnzymeandMicrobialTechnology.2007,40:1662-1672·)，但尚未見(jiàn)以青稞為基質(zhì)針對(duì)提高多糖含量進(jìn)行研究的相關(guān)報(bào)道。[0005]β-葡聚糖是大麥品質(zhì)的一個(gè)重要指標(biāo)，以食用為主的西藏青稞含有大量的β_葡聚糖，其具有降低膽固醇、降血脂、調(diào)節(jié)血糖的保健功能，已被越來(lái)越多的研究者和消費(fèi)者所接受和認(rèn)可。利用生物轉(zhuǎn)化原理獲得的青稞發(fā)酵基質(zhì)中的β-葡聚糖易被分離、純化，且兼具有靈芝β-葡聚糖和青稞β-葡聚糖的功效，因此可廣泛應(yīng)用于保健食品、藥品等領(lǐng)域的產(chǎn)品加工。[0006]經(jīng)過(guò)對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的檢索發(fā)現(xiàn)，中國(guó)專(zhuān)利文獻(xiàn)號(hào)CN103689550A公開(kāi)（公告）日2014.04.02,公開(kāi)了一種靈芝功能性食品及其制備方法。該工藝涉及生物工程【
技術(shù)領(lǐng)域：
】，以玉米和小麥為主要原料采用菌種液體深層培養(yǎng)和固體發(fā)酵技術(shù)制備靈芝功能性食品。玉米和小麥浸泡，使含水率達(dá)到40?80%，滅菌后接入5?30%靈芝種子液，用保鮮膜密封發(fā)酵，發(fā)酵物經(jīng)過(guò)烘干和粉碎、即為靈芝功能性食品。該制品靈芝三萜含量0.8?3.9mg/g，蛋白質(zhì)0.9?8mg/g，可溶性糖<50mg/g，多糖1?15mg/g。但該技術(shù)的缺陷和不足在于靈芝液體菌種的制作使用了多種農(nóng)副產(chǎn)品（如豆餅粉、玉米漿、麩皮等）作為培養(yǎng)基，這些用于培養(yǎng)基制作的農(nóng)副產(chǎn)品中碳源和氮源的比例（碳氮比C/N)不清楚，且由于受大豆、玉米、小麥品種的影響，以及各自加工工藝的影響，各批次材料（豆餅粉、玉米漿、麩皮）的差異難以控制，因此用于規(guī)模化固體發(fā)酵的菌種制作，會(huì)使得菌種質(zhì)量的難以控制。從而降低了后續(xù)固體發(fā)酵的可控性和發(fā)酵產(chǎn)品的質(zhì)量。此外，靈芝固體發(fā)酵中有多種代謝產(chǎn)物，針對(duì)不同代謝產(chǎn)物固體發(fā)酵的工藝是有區(qū)別的，沒(méi)有一個(gè)固定的工藝適合各種代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)，各種代謝產(chǎn)之間可能存在著此消彼長(zhǎng)的關(guān)系（ZhouXW，SuKQ，ZhangYM.AppliedmodernbiotechnologyforcultivationofGanodermaanddevelopmentoftheirproducts.ApplliedMicrobiologyandBiotechnology.2012,93:941-963)。所以該技術(shù)存在的另外一個(gè)明顯的不足在于靈芝固體發(fā)酵到底是針對(duì)哪一種目標(biāo)物而設(shè)計(jì)的和實(shí)施的并不清楚。[0007]中國(guó)專(zhuān)利文獻(xiàn)號(hào)0附036952264公開(kāi)（公告）日2014.04.02，公開(kāi)了一種靈芝果酒及其制備方法，該工藝涉及生物工程【
技術(shù)領(lǐng)域：
】，以玉米、小麥和大米為主要原料采用固體發(fā)酵技術(shù)和釀酒工藝制得靈芝酒。玉米和小麥浸泡，使含水率達(dá)到40?80%，滅菌后接入5?30%靈芝種子液，用保鮮膜密封發(fā)酵，加入30?70%靈芝發(fā)酵物重量的大米煮成的米飯，和大米重量1?5%的酒曲，2?5倍的水，經(jīng)過(guò)10?30°C，10?50天發(fā)酵，發(fā)酵液經(jīng)過(guò)過(guò)濾、勾兌獲得靈芝果酒。該酒酒精度8?30%，靈芝三萜含量50?500mg/L，蛋白質(zhì)60?500mg/L，還原糖〈2.0%，多糖100?800mg/L，色質(zhì)米黃色至褐色。但該技術(shù)的缺陷和不足在于在發(fā)酵的過(guò)程中加入大米煮成的米飯和酒曲，靈芝的固體發(fā)酵是一個(gè)好氧發(fā)酵的過(guò)程，而酒曲和米飯的發(fā)酵是一個(gè)厭氧發(fā)酵的過(guò)程，所以在靈芝固體發(fā)酵的基質(zhì)中加入米飯和酒曲進(jìn)一步發(fā)酵缺乏科學(xué)依據(jù)，存在著明顯的技術(shù)缺陷；此外，酒曲中存在著多種微生物，包括細(xì)菌和真菌（榮瑞金，李祖明，王德良，白志輝，李鴻玉，榮瑞芬，葉磊.中國(guó)酒曲微生物研究進(jìn)展.中國(guó)釀造.2009,（6):5-8)，酒曲中的這些微生物是否能夠和靈芝菌共同發(fā)酵，以及他們代謝產(chǎn)物之間的關(guān)系，目前還沒(méi)有相關(guān)的報(bào)道和確切的證據(jù)。【
發(fā)明內(nèi)容】[0008]本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的上述不足，提出一種基于固體發(fā)酵的青稞多糖含量的提高方法，既兼顧青稞功效成分的改善和保留，又能增加了靈芝β-葡聚糖的成分，明顯改善青稞中β-葡聚糖的含量和產(chǎn)品的功效。[0009]本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：本發(fā)明通過(guò)將青稞籽粒接入靈芝液體菌種并固體發(fā)酵得到青稞發(fā)酵基質(zhì)；然后將青稞發(fā)酵基質(zhì)干燥、粉碎后經(jīng)乙醇提取得到的沉淀物即為多糖。[0010]所述的青稞籽粒優(yōu)選為經(jīng)過(guò)挑選的優(yōu)質(zhì)種子，經(jīng)過(guò)清洗浸泡后滅菌處理。[0011]所述的清洗浸泡是指：浸泡溫度為30°C，固體發(fā)酵溫度為28°C，在此條件下，固體發(fā)酵的青稞籽粒菌絲體濃密，β-葡聚糖含量較高。如果要在較短段時(shí)間獲得較高的β-葡聚糖含量，可以選擇浸泡溫度為40°C，固體發(fā)酵培養(yǎng)溫度為30°C，此條件下，發(fā)酵時(shí)間可縮短，β-葡聚糖含量也會(huì)保持較高，但青稞籽粒的漲破率會(huì)增加，增加了培養(yǎng)過(guò)程中污染的概率。通過(guò)上述方法，能夠提高青稞中β-葡聚糖含量至青稞籽粒的2倍以上，取得了預(yù)料不到的效果。[0012]所述的固體發(fā)酵包括如下兩個(gè)步驟：①接種，是指在無(wú)菌條件下，將靈芝液體菌種按照5%-10%的量（ν/ν)接入已經(jīng)滅菌的青稞籽粒中；②培養(yǎng)，是指溫度為25-30°C，相對(duì)濕度為85-95%的環(huán)境下培養(yǎng)8-10d。[0013]所述的靈芝是指：我國(guó)衛(wèi)生部2001年發(fā)布的《可用于保健食品的真菌菌種名單》中的靈芝（Ganodermalucidum)〇[0014]所述的靈芝液體菌種是指：經(jīng)過(guò)復(fù)壯、液體培養(yǎng)后獲得的懸浮在培養(yǎng)液中的靈芝菌絲體和培養(yǎng)液的復(fù)合體。[0015]所述的干燥包括：①把發(fā)酵后的青稞基質(zhì)放入風(fēng)速2.5-4m/s、風(fēng)溫50?55°C的電熱鼓風(fēng)干燥裝置中干燥3-4.5小時(shí)，使物料含水量降低到15%-20%;②把經(jīng)過(guò)上述①處理的青稞基質(zhì)放入微波爐干燥和殺菌裝置中，微波干燥和殺菌裝置的干燥功率為0.2-0.3W/g，頻率為2450MHz±50MHz，鋪放厚度1.5-2.5cm，風(fēng)速40?45m/min，干燥和殺菌的時(shí)間為20?30min，使物料含水量降低到10%-12%。[0016]所述的粉碎是指：利用粉碎機(jī)械將青稞發(fā)酵基質(zhì)打碎，并過(guò)30?50目篩網(wǎng)。[0017]所述的乙醇提取包括以下步驟：[0018]①粉碎后的青稞發(fā)酵基質(zhì)用75%(v/v)乙醇，60°C水浴lh，用于去除脂、單糖、低聚糖等物質(zhì)；[0019]②去脂后的殘?jiān)?0倍量（v/v)的清水浸泡1小時(shí)后，超聲處理10_15min后于95°C水浴提取2-4h;[0020]③渣濾進(jìn)行第二次浸提；再過(guò)濾，濾渣進(jìn)行第三次浸提；合并三次浸提液。[0021]④減壓濃縮，55°C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，濾液濃度相當(dāng)于原浸提液1/3-1/5體積時(shí)，進(jìn)入乙醇沉淀環(huán)節(jié)。[0022]⑤在攪拌狀態(tài)下，以流速（每minl/10水提物的體積）加入2倍量體積的95%以上（v/v)乙醇，并置于冷凍環(huán)境下過(guò)夜；[0023]⑥采用5000-10000轉(zhuǎn)離心分離或靜置2小時(shí)后過(guò)濾分離，所得濾渣即為提取的粗多糖。[0024]步驟①中，醇提lh后的產(chǎn)物優(yōu)選經(jīng)過(guò)濾，濾渣用75%乙醇洗滌2次。[0025]步驟②中，浸泡1小時(shí)后的混合液體優(yōu)選經(jīng)超聲處理lOmin后于95°C水浴提取4h,提取液透析至不再有還原糖反應(yīng)。[0026]步驟④中，濾液濃度優(yōu)選為在55°C真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至原體積的1/3-1/5。[0027]步驟⑤中，所述的冷凍環(huán)境為4°C。[0028]步驟⑥中，離心分離的速度優(yōu)選為8000r/min，離心處理20min，所得沉淀用無(wú)水乙醇洗滌2或3次，冷凍干燥即得菌質(zhì)多糖粗品。技術(shù)效果[0029]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明采用生物轉(zhuǎn)化方法，利用靈芝菌絲分泌的相關(guān)酶轉(zhuǎn)化青稞中的纖維素、半纖維素等物質(zhì)稱(chēng)為β-葡聚糖，使得生成的發(fā)酵基質(zhì)中的β-葡聚糖含量比普通青稞提高了兩倍以上。[0030]本發(fā)明中青稞發(fā)酵之前對(duì)青稞的溫水浸泡，增加了發(fā)酵基質(zhì)中營(yíng)養(yǎng)成分(CN103461861A;曾亞文，楊濤，普曉英，等.大麥籽粒中γ氨基丁酸、總黃酮和生物堿含量在發(fā)芽過(guò)程中的變化.麥類(lèi)作物學(xué)報(bào)，2012,32(1):135-139.)，更有利于靈芝菌絲生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)需求，使得發(fā)酵時(shí)間縮短到了10天以?xún)?nèi)（相比CN201210366380.1發(fā)酵時(shí)間為5-20天）；此外，發(fā)酵后的青稞基質(zhì)糊粉層和胚乳細(xì)胞壁發(fā)生了變化，更利于多糖的提取，節(jié)省了能耗，減少了工藝時(shí)間和人力成本。[0031]本發(fā)明中對(duì)青稞發(fā)酵基質(zhì)的干燥中，采用的微波干燥與殺菌的工序，工藝簡(jiǎn)單、時(shí)間短（20-30min)，能夠有效抑制發(fā)酵結(jié)束后雜菌的進(jìn)一步滋生，確保進(jìn)一步提取多糖（或作其它用途）時(shí)原材料的質(zhì)量。【專(zhuān)利附圖】【附圖說(shuō)明】[0032]圖1為本發(fā)明流程示意圖。[0033]圖2為實(shí)施例中固體發(fā)酵完成后的谷物-靈芝菌絲體基質(zhì)示意圖；[0034]圖中：A玉米-靈芝發(fā)酵菌質(zhì)、B小麥-靈芝發(fā)酵菌質(zhì)、C青稞-靈芝發(fā)酵菌質(zhì)。[0035]圖3是發(fā)酵基質(zhì)多糖的提取工藝不意圖。[0036]圖4為實(shí)施例中葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)?！揪唧w實(shí)施方式】[0037]下面對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例作詳細(xì)說(shuō)明，本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過(guò)程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。實(shí)施例1[0038]靈芝液體菌種的制作[0039]1.培養(yǎng)基的制作：[0040]1)PDA固體培養(yǎng)基制作[0041]配制方法：去皮馬鈴薯200g用700?800mL蒸饋水煮30?40min至爛，用4層紗布過(guò)濾后溶入葡萄糖20g、KH2P045g、MgS04·THWSgJitaminBAOlg，定容至1000mL，調(diào)pH值至6·5-7·0,加入瓊脂粉16?18g，121°C、1·034X105Pa、20min高壓滅菌，冷至60°C時(shí)倒平板，4°C保存。[0042]2)靈芝預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基制作[0043]配制方法：稱(chēng)取蔗糖35g、蛋白胨（NIH0NSEIYAKU公司）5g、酵母粉（MERCK公司）25g、KH2P04·Η2018、]\%504·7Η200·SgJitaminBW.05g于燒杯中，加入800mL去離子水，充分?jǐn)嚢枞芙猓傺a(bǔ)水至l〇〇〇mL;調(diào)pH值到5.5,121°C、1.034X105Pa、20min高壓滅菌，4°C保藏。[0044]2.預(yù)培養(yǎng)：由試管斜面或培養(yǎng)皿平板固體培養(yǎng)基上的靈芝菌絲接至PDA固體培養(yǎng)基平板上，28°C恒溫培養(yǎng)7d。用接種鏟將0.9?1.lcm2的平板菌種接至裝有20?40mL液體靈芝預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基的150mL三角瓶中，并搗碎。靜置2-3d活化后，將三角瓶放入28°C恒溫振蕩器中120rpm培養(yǎng)4-6d。[0045]所述的靈芝菌絲取自市售的靈芝（Ganodermalucidum)，菌株編號(hào)GIM5.8,購(gòu)自廣東省微生物研究所微生物菌種保藏中心。[0046]2.擴(kuò)大培養(yǎng)：將150mL三角瓶中的培養(yǎng)物轉(zhuǎn)入500mL或1L三角瓶中（前者加入100mL，后者加入200mL液體靈芝預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基）放入28°C恒溫振蕩器中120rpm培養(yǎng)5-7d，備用。[0047]3.產(chǎn)物[0048]培養(yǎng)5-7d后培養(yǎng)液清涼透明、菌絲球濃密，且均勻地懸浮在培養(yǎng)液中，培養(yǎng)結(jié)束。獲得的菌絲球懸浮液可用于固體發(fā)酵的液體菌種。實(shí)施例2[0049]谷物-靈芝的固體發(fā)酵[0050]1.挑選：分別選取小麥、青稞和玉米作為固體發(fā)酵的基質(zhì)，采取目測(cè)的方法，根據(jù)顏色、體積質(zhì)量，盡量選取透亮、飽滿(mǎn)、質(zhì)量相近的谷物（小麥、青稞和玉米）種子，剔除干癟、不飽滿(mǎn)、有裙皺、殘缺、發(fā)霉或有病蟲(chóng)害的種子。[0051]2.清洗：使用清水沖洗數(shù)min。[0052]3.浸泡：將清洗過(guò)的谷物種子置于合適的培養(yǎng)器皿（如不銹鋼缸、槽等），加入熱水，種子和水的質(zhì)量體積比為1:5?1:10,在前期預(yù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上確定浸泡溫度在30°C?40°C，浸泡時(shí)間分別為24?36h不等，當(dāng)單個(gè)谷物籽粒充分吸水后（用手指能夠輕松捏開(kāi)時(shí)），浸泡結(jié)束。[0053]4.固體發(fā)酵（25°C?30°C，8?10d)[0054]4.1)固體發(fā)酵的培養(yǎng)基制作[0055]固體發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基：把浸泡后的谷物（小麥、青稞和玉米）籽粒置于普通鐵鍋中煮沸15?20min，至手指捏開(kāi)麥粒時(shí)里面沒(méi)有"白心"為度，撈出浙干，含水量掌握在55?65%，再與配料（葡萄糖2.5%，腿2?040.375%，]\%504.7!1200.25%，03〇)31%)混合拌勻、裝瓶，滅菌后即可接入液體種。[0056]每種谷物接種6瓶，瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)基的裝量至瓶肩為度。[0057]4.2)接種[0058]接種前30min打開(kāi)超凈工作臺(tái)內(nèi)紫外燈，并開(kāi)啟風(fēng)機(jī)；30min后關(guān)閉紫外燈，開(kāi)啟風(fēng)機(jī)，稍后在無(wú)菌條件下打開(kāi)瓶蓋，在滅菌后的固體發(fā)酵培養(yǎng)基中用消毒后的玻璃棒在中間打一小洞，將已經(jīng)準(zhǔn)備好的靈芝液體菌種，用移液器按照發(fā)酵基質(zhì)總量的5%和10%接入靈芝液體菌種，封蓋后送入培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。[0059]4.3)培養(yǎng)[0060]在25°C-30°C條件下培養(yǎng)，菌絲體封口后，將瓶子倒置培養(yǎng)；8-10d待菌絲長(zhǎng)滿(mǎn)瓶后結(jié)束培養(yǎng)。[0061]5、接種量和接種方法對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響：[0062]觀察表明：5%接種量和10%的接種量，菌絲生長(zhǎng)速度差異較大。前者菌絲分布不勻，菌絲細(xì)弱，吃料定植緩慢，封口時(shí)間慢，試驗(yàn)結(jié)束時(shí)仍未長(zhǎng)滿(mǎn)，內(nèi)部菌絲稀疏；后者液體菌種可以迅速分布開(kāi)來(lái)，菌絲生長(zhǎng)旺盛，內(nèi)部菌絲濃密（見(jiàn)圖2)。[0063]觀察結(jié)果顯示：用10%接種量，小麥、玉米、青稞基質(zhì)發(fā)酵封口的時(shí)間分別為：4d、4d和3d;長(zhǎng)滿(mǎn)瓶的時(shí)間分別為：9d、8d和7d。發(fā)酵完成后的靈芝-谷物發(fā)酵基質(zhì)如圖2所/_J、1〇[0064]鑒于上述實(shí)驗(yàn)，分析認(rèn)為10%接種量較為合適。雖然以小麥、玉米、青稞三種作物分別為固體發(fā)酵基質(zhì)時(shí)，固體發(fā)酵的封口時(shí)間和滿(mǎn)屏?xí)r間差異不是特別明顯，但是我們依然可以看出以青稞為發(fā)酵基質(zhì)時(shí)，封口時(shí)間和滿(mǎn)瓶時(shí)間都早于以小麥和玉米為基質(zhì)。實(shí)施例3[0065]谷物-靈芝發(fā)酵基質(zhì)中粗多糖的提取[0066]1.干燥與二次殺菌[0067]將谷物（小麥、青稞、玉米）-靈芝發(fā)酵的基質(zhì)從瓶子中掏出后，采用上海弘圓微波設(shè)備制造有限公司生產(chǎn)的箱式微波干燥殺菌機(jī)，微波干燥和殺菌裝置的干燥功率為0.2-0.3W/g，頻率為2450MHz±50MHz，鋪放厚度1.5-2.5cm，風(fēng)速40?45m/min，干燥和殺菌的時(shí)間為20?30min，使物料含水量降低到10%-12%。[0068]2.粉碎[0069]干燥后的發(fā)酵基質(zhì)采用小型食品粉碎機(jī)粉碎，過(guò)30?50目不銹鋼篩網(wǎng)。[0070]3.提取[0071]3.1)前處理：稱(chēng)取一定量的粉碎后的固體菌質(zhì)，加入適量的75%乙醇60°C水浴醇提lh去除脂、單糖、低聚糖等物質(zhì)，過(guò)濾，濾渣用75%乙醇洗滌2次后備用。[0072]3.2)提?。悍Q(chēng)取一定量的處理后的殘?jiān)?0倍蒸餾水，超聲處理lOmin后于95°C水浴提取4h，提取液透析至不再有還原糖反應(yīng)。[0073]3.3)減壓濃縮：是指透析液在55-60°C真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至原體積的1/3-1/5.[0074]3.4)乙醇沉淀：在攪拌狀態(tài)下，以流速（每minl/10水提物的體積）加入2倍量無(wú)水乙醇于濃縮后的透析液中，4°C過(guò)夜。[0075]3.5)分離：透析液分裝入8000r/min離心20min。沉淀用無(wú)水乙醇洗漆2或3次，冷凍干燥即得菌質(zhì)多糖粗品。[0076]4.結(jié)果[0077]分別獲得三種粗多糖樣品，即小麥-靈芝、青稞-靈芝和玉米靈芝的粗多糖產(chǎn)品。實(shí)施例4[0078]苯酚硫酸法測(cè)定β-葡聚糖含量[0079]采用實(shí)施例3中收集的粗多糖樣品進(jìn)行下列實(shí)驗(yàn)。[0080]1.標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制[0081]精密稱(chēng)取一定重量的樣品，于l〇5°C干燥至恒重；準(zhǔn)確稱(chēng)取已干燥恒重的葡萄糖0.5000g，加水溶解，定容至50mL，作為葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（此溶液lmL含10.Omg葡萄糖）。準(zhǔn)確吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液1.OmL，置于100mL容量瓶中，加水至刻度，混勻，作為葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)使用液（此溶液lmL含0·10mg葡萄糖）。[0082]準(zhǔn)確吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)使用液0、0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.OOmL(相當(dāng)于葡萄糖0、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10mg)分別置于25mL比色管中，準(zhǔn)確補(bǔ)充水至2.OmL，加入50mg/mL的苯酚溶液1.OmL，在旋轉(zhuǎn)混勻器上混勻，小心加入濃硫酸10.OmL,于旋轉(zhuǎn)混勻器上小心混勻，置沸水浴中煮沸2min，冷卻后用分光光度計(jì)在490nm波長(zhǎng)處以試劑空白溶液為參比，lcm比色皿測(cè)定吸光度值。以葡萄糖質(zhì)量為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。[0083]2.待測(cè)樣品溶液的制備：[0084]2.1)樣品提?。簻?zhǔn)確稱(chēng)取三種待測(cè)樣品2.0g(精準(zhǔn)至0.OOOlg)混勻，置于100mL容量瓶中，加水80mL，于沸水浴上加熱2h，冷卻至室溫后補(bǔ)水定容至100mL，混勻后過(guò)濾，棄去初濾液，收集余下濾液供沉淀多糖。[0085]2.2)沉淀粗多糖：準(zhǔn)確吸?、僦薪K濾液5.OmL以3000r/min離心5min，棄去上清液。殘?jiān)?0%(體積分?jǐn)?shù)）乙醇溶液數(shù)毫升洗滌，離心后棄上清液，反復(fù)操作3?4次。殘?jiān)盟芙獠⒍ㄈ葜?.OmL，混勻后，供沉淀葡聚糖。[0086]2.3)沉淀葡聚糖：準(zhǔn)確吸?、谥薪K溶液2mL置于20mL離心管中，加入lOOg/L氫氧化鈉溶液2.OmL、銅試劑溶液2.OmL，沸水浴中煮沸2min，冷卻，以3000r/min離心5min，棄去上清液。殘?jiān)孟礈煲簲?shù)毫升洗滌，離心后棄去上清液，反復(fù)操作3次，殘?jiān)?0%(體積分?jǐn)?shù)）硫酸溶液2.OmL溶解并轉(zhuǎn)移至100mL容量瓶中，加水稀釋至刻度定容，混勻。此溶液為樣品測(cè)定液。[0087]3.葡聚糖糖含量測(cè)定：準(zhǔn)確吸取樣品測(cè)定液2.OmL置于25mL比色管中，加入50g/L苯酚溶液1.OmL，在旋轉(zhuǎn)混勻器上混勻，小心加入濃硫酸10.OmL于旋轉(zhuǎn)混勻器上小心混勻，置沸水浴中煮沸2min，冷卻至室溫，用分光光度計(jì)在490nm波長(zhǎng)處，以試劑空白為參比，lcm比色皿測(cè)定吸光度值。依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算樣品中葡萄糖含量。同時(shí)做樣品空白實(shí)驗(yàn)。[0088]4.測(cè)定結(jié)果[0089]4.1)回歸方程：按照王亞光《保健食品功效成分檢測(cè)方法》（中國(guó)輕工業(yè)出版社，2002)報(bào)道的方法，以葡萄糖糖質(zhì)量為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，見(jiàn)圖3;葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)見(jiàn)圖4。葡萄糖含量和吸光度值經(jīng)回歸處理，回歸方程為Y=34.9768+0.04756X，R2=0.99862(η=7)。糖濃度在0?1.Omg/mL范圍內(nèi)線(xiàn)性較好。[0090]4.2)樣品中β-葡聚糖含量測(cè)定樣品中葡萄糖含量測(cè)定的結(jié)果如表1所示。進(jìn)一步對(duì)基質(zhì)發(fā)酵前后多糖含量的變化進(jìn)行方差分析，分析結(jié)果見(jiàn)表2。[0091]表1谷物發(fā)酵前后多糖含量的變化【權(quán)利要求】1.一種基于固體發(fā)酵的青稞多糖含量的提高方法，其特征在于，通過(guò)將經(jīng)過(guò)清洗浸泡后滅菌處理的青稞籽粒接入靈芝（Ganodermalucidum)液體菌種并固體發(fā)酵得到青稞發(fā)酵基質(zhì)；然后將青稞發(fā)酵基質(zhì)干燥、粉碎后經(jīng)乙醇提取得到的沉淀物即為多糖；所述的清洗浸泡是指：浸泡溫度為30°C?40°C，固體發(fā)酵溫度為28°C?30°C。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是，所述的固體發(fā)酵包括：①接種，是指在無(wú)菌條件下，將靈芝液體菌種按照5%-10%的量（v/v)接入已經(jīng)滅菌的青稞籽粒中；②培養(yǎng)，是指溫度為25-30°C，相對(duì)濕度為85-95%的環(huán)境下培養(yǎng)8?10d。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征是，所述的清洗浸泡是指：當(dāng)浸泡溫度為30°C時(shí)，固體發(fā)酵溫度為28°C;當(dāng)浸泡溫度為40°C時(shí)，固體發(fā)酵溫度為30°C。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是，所述的靈芝液體菌種是指：經(jīng)過(guò)復(fù)壯、液體培養(yǎng)后獲得的懸浮在培養(yǎng)液中的靈芝菌絲體和培養(yǎng)液的復(fù)合體。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征是，所述的復(fù)壯是指：由試管斜面或培養(yǎng)皿平板固體培養(yǎng)基上的靈芝菌絲接至PDA固體培養(yǎng)基平板上，28°C恒溫培養(yǎng)7d。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征是，所述的PDA固體培養(yǎng)基通過(guò)以下方式配制得至IJ:去皮馬鈴薯200g用700?800mL蒸餾水煮30?40min至爛，用4層紗布過(guò)濾后溶入葡萄糖20g、KH2P045g、MgS04·7H203g、VitaminBIO.Olg，定容至1000mL，調(diào)pH值至6.5-7.0，加入瓊脂粉16?18g，121°C、1.034X105Pa、20min高壓滅菌，冷至60°C時(shí)倒平板，4°C保存。7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征是，所述的液體培養(yǎng)是指：用接種鏟將平板菌種接至裝有20?40mL液體靈芝預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基的150mL三角瓶中搗碎，靜置2?3d活化后，將三角瓶放入28°C恒溫振蕩器中120rpm培養(yǎng)4?6d。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征是，所述的靈芝預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基通過(guò)以下方式配置得到：稱(chēng)取蔗糖35g、蛋白胨5g、酵母粉25g、ΚΗ2Ρ04·H201g、MgS04·7H200.5g、VitaminBA05g于燒杯中，加入800mL去離子水，充分?jǐn)嚢枞芙?，再補(bǔ)水至lOOOmL;調(diào)pH值到5.5,121°C、1.034X105Pa、20min高壓滅菌，4°C保藏。9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是，所述的干燥包括：①把發(fā)酵后的青稞基質(zhì)放入風(fēng)速2.5?4m/s、風(fēng)溫50?55°C的電熱鼓風(fēng)干燥裝置中干燥3?4.5小時(shí)；②把經(jīng)過(guò)上述①處理的青稞基質(zhì)放入微波爐干燥和殺菌裝置中，微波干燥和殺菌裝置的干燥功率為〇.2?0.3W/g，頻率為2450±50MHz，鋪放厚度1.5?2.5cm，風(fēng)速40?45m/min，干燥和殺菌的時(shí)間為20?30min。10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是，所述的乙醇提取包括以下步驟：①粉碎后的青稞發(fā)酵基質(zhì)用75%(v/v)乙醇，60°C水浴lh;②去脂后的殘?jiān)?0倍量的清水浸泡1小時(shí)后，加熱至微沸浸提，溫度90?100°C，保持60?90min;③渣濾進(jìn)行第二次浸提；再過(guò)濾，濾渣進(jìn)行第三次浸提；合并三次浸提液；④減壓濃縮，55°C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，濾液濃度相當(dāng)于原浸提液1/3?1/5體積時(shí)，進(jìn)入乙醇沉淀環(huán)節(jié)；⑤在攪拌狀態(tài)下，以流速為每minl/10水提物的體積下加入2倍量體積的95%以上(v/v)乙醇，并置于冷凍環(huán)境下過(guò)夜；⑥采用8000轉(zhuǎn)離心分離或靜置2小時(shí)后過(guò)濾分離，所得濾渣即為提取的粗多糖?！疚臋n編號(hào)】C12R1/645GK104087633SQ201410318845【公開(kāi)日】2014年10月8日申請(qǐng)日期:2014年7月4日優(yōu)先權(quán)日:2014年7月4日【發(fā)明者】汪新,周選圍申請(qǐng)人:西藏圣龍實(shí)業(yè)有限公司