一種e2f3基因沉默對(duì)前列腺癌動(dòng)物模型中全血e2f3影響的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種E2F3基因沉默對(duì)前列腺癌動(dòng)物模型中全血E2F3影響的方法，通過免疫組化研究不同前列腺癌組織中E2F3的表達(dá)情況，明確E2F3與前列腺癌分級(jí)、分期及預(yù)后的關(guān)系；通過構(gòu)建針對(duì)E2F3的AAV病毒載體，沉默E2F3基因并進(jìn)行相關(guān)的外功能實(shí)驗(yàn)；通過建立裸鼠前列腺癌模型，成功應(yīng)用AAV病毒載體進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)并明確E2F3基因沉默前后裸鼠全血中E2F3mRNA表達(dá)情況。本發(fā)明的E2F3基因作為前列腺癌基因治療的高效靶點(diǎn)，為后續(xù)的以E2F3為靶點(diǎn)的前列腺癌基因治療體內(nèi)實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)；針對(duì)E2F3的重組RNA干擾AAV病毒能夠抑制腫瘤細(xì)胞的增殖并能夠促進(jìn)細(xì)胞的凋亡，并有效抑制動(dòng)物模型腫瘤的生長并降低了外周血標(biāo)本內(nèi)E2F3的表達(dá)，為以E2F3為靶點(diǎn)的腫瘤基因沉默療法提供了可靠的理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
【專利說明】—種E2F3基因沉默對(duì)前列腺癌動(dòng)物模型中全血E2F3影響的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于E2F3基因【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種E2F3基因沉默對(duì)前列腺癌動(dòng)物模型中全血E2F3影響的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]前列腺癌是歐美最常見的男性惡性腫瘤之一，目前在美國前列腺癌的發(fā)病率已經(jīng)超過肺癌，成為第一位危害男性健康的腫瘤，在我國，隨著生活方式的改變、人口的老齡化及診斷技術(shù)的提高，前列腺癌的發(fā)病率也呈持續(xù)增長趨勢(shì)，在北京及上海等現(xiàn)代化程度較高的城市，前列腺癌已經(jīng)超過膀胱癌，成為最為常見的泌尿系統(tǒng)腫瘤。
[0003]腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與細(xì)胞周期調(diào)節(jié)失控密切相關(guān)，細(xì)胞周期調(diào)控發(fā)生異常，使受損害的DNA得不到及時(shí)修復(fù)，細(xì)胞繼續(xù)分裂，因遺傳不穩(wěn)定，可轉(zhuǎn)變?yōu)榘┘?xì)胞，E2F3是E2F轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一，也是細(xì)胞周期調(diào)控過程中起重要作用的調(diào)控蛋白之一，其是細(xì)胞由Gl期進(jìn)入S期最重要的細(xì)胞因子，調(diào)控著細(xì)胞增殖，E2F3聯(lián)系著Cyclins、⑶Ks、Rb及細(xì)胞增殖等相關(guān)基因，這些基因在細(xì)胞周期不同階段起作用，并且隨著細(xì)胞的轉(zhuǎn)變而發(fā)生變化，Maddiso等的研究表明，Rb的失活引起E2F表達(dá)增多，可引起早期前列腺癌，促進(jìn)前列腺癌的發(fā)展進(jìn)程和轉(zhuǎn)移，F(xiàn)oste等應(yīng)用免疫組化的方法研究發(fā)現(xiàn)前列腺癌組織中E2F3的表達(dá)率達(dá)到67%，而在良性前列腺組織中僅有2.3%細(xì)胞核表達(dá)E2F3，在正常人前列腺標(biāo)本中無E2F3的表達(dá)，上述的研究結(jié)果表明，E2F3在前列腺癌的發(fā)病機(jī)制中處于非常重要的地位，而有效的沉默E2F3基因的表達(dá)為系統(tǒng)的研究E2F3與前列腺癌的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。
[0004]隨著RNAi技術(shù)的出現(xiàn)，基因沉默技術(shù)在保持高效的基礎(chǔ)上更為特異的沉默靶mRNA，從而使相應(yīng)蛋白表達(dá)下降，因?yàn)镽NAi技術(shù)通過抑制宿主細(xì)胞mRNA轉(zhuǎn)錄后的基因表達(dá)而發(fā)揮作用，利用RNAi技術(shù)進(jìn)行抗腫瘤基因治療有望成為癌癥治療的新的突破口，當(dāng)前RNAi技術(shù)在疾病診治中應(yīng)用的困難主要集中在兩方面，即靶目標(biāo)的有效性以及siRNAs或shRNAs靶點(diǎn)轉(zhuǎn)運(yùn)的高效性，其一，靶目標(biāo)的有效性是進(jìn)行RNAi應(yīng)用研究的重要前提，在設(shè)計(jì)siRNAs或shRNAs時(shí)，必須高度重視其靶向有效性的基礎(chǔ)研究；尤其是當(dāng)進(jìn)入臨床試驗(yàn)時(shí)，更應(yīng)當(dāng)注意其設(shè)計(jì)的有效性，以避免產(chǎn)生體內(nèi)的非特異性反應(yīng)或者更為嚴(yán)重的目前還尚未明了的潛在不良反應(yīng)，其二，siRNAs或shRNAs靶點(diǎn)轉(zhuǎn)運(yùn)的高效性包括分子體內(nèi)穩(wěn)定性和穿透細(xì)胞膜所涉及到的轉(zhuǎn)運(yùn)問題，早期的RNAi多應(yīng)用脂質(zhì)體進(jìn)行質(zhì)粒載體或siRNA直接向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染，這種情況常常因?yàn)檗D(zhuǎn)染效率的低下而導(dǎo)致基因沉默效果不佳，AAV干擾載體的出現(xiàn)為更加高效的進(jìn)行基因沉默奠定了基礎(chǔ)。
[0005]AAV載體具有逆轉(zhuǎn)錄病毒和腺病毒的許多優(yōu)點(diǎn)，并且與其它幾種病毒相比，腺相關(guān)病毒載體具有安全性好、無致病性、免疫原性低、物理性質(zhì)穩(wěn)定、感染細(xì)胞譜廣，可介導(dǎo)外源基因長期穩(wěn)定表達(dá)等優(yōu)點(diǎn)，被視為最有如途的基因治療載體之一，成為目如基因治療載體研究的熱點(diǎn)，由于AAV載體的容量較大,在表達(dá)干擾序列的同時(shí)，還能夠同時(shí)表達(dá)眾多的蛋白，這為多靶點(diǎn)進(jìn)行前列腺癌基因治療提供便利，由于AAV病毒在人體具有良好的組織相容性，其已成為腫瘤基因治療的高效載體而受到重視，既往的研究表明AAV載體能夠高效的轉(zhuǎn)染前列腺癌細(xì)胞系，但其在體內(nèi)試驗(yàn)中AAV病毒載體是否能夠有效的進(jìn)行RNAi干擾序列的表達(dá)，是否能夠有效的降低靶mRNA的表達(dá)，這就需要建立前列腺癌動(dòng)物模型而得到驗(yàn)證。
[0006]動(dòng)物實(shí)驗(yàn)是細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和臨床實(shí)驗(yàn)之間的重要過渡環(huán)節(jié)，簡(jiǎn)便而實(shí)用的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ驮谀[瘤的研究中具有十分重要的作用，由于具有種植方便、成瘤快、腫瘤生長一致性好、便于觀察等特點(diǎn)，裸鼠皮下注射前列腺癌細(xì)胞制備移植瘤已經(jīng)成為探索前列腺的發(fā)生、發(fā)展與轉(zhuǎn)歸機(jī)理的重要評(píng)價(jià)方法，但是由于前列腺癌細(xì)胞對(duì)于前列腺內(nèi)的微環(huán)境及前列腺內(nèi)的激素水平的影響非常敏感，這使得前列腺癌原位模型能夠更為真是的反映實(shí)驗(yàn)效果，從而越來越多的實(shí)驗(yàn)研究采取前列腺癌原位模型進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究，但前列腺癌原位模型在構(gòu)建時(shí)非常復(fù)雜，常需要對(duì)裸鼠進(jìn)行外科操作，這不僅降低了裸鼠的生存率，增加了各種術(shù)后并發(fā)癥的危險(xiǎn)，還一定程度上降低了成瘤的一致性，我研究所前列腺癌研究室已經(jīng)掌握了 LNCaP細(xì)胞裸鼠前列腺前葉腫瘤原位模型構(gòu)建技術(shù)，并且專人負(fù)責(zé)操作，盡量的降低了成瘤大小不一致及腹腔種植等的發(fā)生率，動(dòng)物模型與細(xì)胞水平實(shí)驗(yàn)相比較，還具有一個(gè)顯著的優(yōu)勢(shì):實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的血液標(biāo)本能夠用來進(jìn)行相關(guān)基因及蛋白的檢測(cè)，這也便于一些腫瘤標(biāo)記物更為便捷的應(yīng)用于臨床，血清PSA(前列腺特異抗原)檢測(cè)的發(fā)展及其在臨床中的廣泛應(yīng)用，明顯的提高了前列腺癌的早期診斷率并提高了前列腺癌患者的5年生存率，但PSA存在一定的局限性，PSA在4-10ng/dl時(shí)，有近80 %的患者為前列腺良性疾??；而？3八小于4ng/dl時(shí)，有15%的患者卻仍被檢查前列腺癌，這就有可能導(dǎo)致一部分患者經(jīng)受不必要的前列腺穿刺活檢，而另外一部分患者病情延誤，盡管對(duì)PSA界值、PSMA、PSA密度、PSA速率等的研究在一定程度上能夠提高前列腺癌的診斷準(zhǔn)確性，但臨床急需更為準(zhǔn)確的診斷指標(biāo)，這對(duì)于前列腺癌的早期的診斷和預(yù)防、病程監(jiān)測(cè)、探索對(duì)前列腺癌的治療方法以及評(píng)估預(yù)后有著重要的意義。
[0007]Jean等的研究發(fā)現(xiàn)，前列腺癌患者的全血標(biāo)本中，E2F3mRNA表達(dá)顯著高于前列腺增生患者及正常人群，而通過我們的前期研究也發(fā)現(xiàn)E2F3蛋白的表達(dá)與前列腺癌的分期及分級(jí)密切相關(guān)，那么E2F3是否可以與PSA聯(lián)合應(yīng)用，成為診斷前列腺癌的新的分子標(biāo)記物，彌補(bǔ)PSA的不足？上述的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)可以使我們?cè)谶M(jìn)行E2F3基因沉默前后測(cè)定動(dòng)物全血中的E2F3基因mRNA的表達(dá)，從而進(jìn)一步明確E2F3基因mRNA的表達(dá)在臨床應(yīng)用的潛力及價(jià)值。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0008]本發(fā)明實(shí)施例的目的在于提供一種E2F3基因沉默對(duì)前列腺癌動(dòng)物模型中全血E2F3影響的方法，旨在為前列腺癌基因治療的一個(gè)有效的祀點(diǎn)，為前列腺癌的診斷與治療提供理論基礎(chǔ)。
[0009]本發(fā)明實(shí)施例是這樣實(shí)現(xiàn)的，一種E2F3基因沉默對(duì)前列腺癌動(dòng)物模型中全血E2F3影響的方法，該E2F3基因沉默對(duì)前列腺癌動(dòng)物模型中全血E2F3影響的方法包括:
[0010]步驟一，通過收集不同前列腺癌石蠟標(biāo)本，采用real-timePCR、WESTERN、免疫組化，分析E2F3及其所調(diào)基因在前列腺癌中的表達(dá)情況；
[0011]步驟二，建立以AVV為載體的RNAi平臺(tái)，并分析干擾序列對(duì)前列腺癌LNCaP細(xì)胞中E2F3基因沉默的影響；
[0012]步驟三，并經(jīng)體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)E2F3基因沉默對(duì)LNCaP細(xì)胞中E2F3及相關(guān)調(diào)控基因的影響及對(duì)細(xì)胞增殖及凋亡的影響；應(yīng)用裸鼠進(jìn)行原位前列腺癌動(dòng)物模型的構(gòu)建；
[0013]步驟四，應(yīng)用AAV干擾載體進(jìn)行腫瘤的局部注射后明確腫瘤組織中E2F3在mRNA及蛋白質(zhì)水平的表達(dá)情況及對(duì)腫瘤生長抑制情況，最后應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR進(jìn)行全血E2F3mRNA的檢測(cè)，明確作為前列腺癌腫瘤標(biāo)記物的可能性。
[0014]進(jìn)一步，該E2F3基因沉默對(duì)前列腺癌動(dòng)物模型中全血E2F3影響的方法具體包括以下步驟:
[0015]第一步，取不同臨床分期、病理分級(jí)的前列腺癌石蠟切片組織進(jìn)行免疫組化染色，在蛋白質(zhì)水平研究E2F3及AR的表達(dá)情況及二者的表達(dá)與前列腺癌臨床特點(diǎn)及預(yù)后之間的關(guān)系，根據(jù)Gleason分級(jí)和評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行病理分級(jí)并根據(jù)Whitmore-Jewett系統(tǒng)進(jìn)行臨床分期；
[0016]第二步，合成三對(duì)針對(duì)于E2F3基因的SiRNA對(duì)應(yīng)模版DNA序列，通過RT-PCR方法篩選出最為有效的干擾片段；根據(jù)篩選結(jié)果，將相應(yīng)shRNA表達(dá)框克隆到腺相關(guān)病毒載體中，包裝純化病毒后，轉(zhuǎn)染膀胱移行細(xì)胞癌腫瘤細(xì)胞株，檢測(cè)病毒載體的長效基因沉默的效果，以及細(xì)胞增殖凋亡相關(guān)指標(biāo)；
[0017]第三步，采用LNCaP細(xì)胞在裸鼠前列腺前頁進(jìn)行接種，建立原位前列腺癌動(dòng)物模型。
[0018]進(jìn)一步，取不同臨床分期、病理分級(jí)的前列腺癌石蠟切片組織進(jìn)行免疫組化染色，在蛋白質(zhì)水平研究E2F3及AR的表達(dá)情況及二者的表達(dá)與前列腺癌臨床特點(diǎn)及預(yù)后之間的關(guān)系；根據(jù)Gleason分級(jí)和評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行病理分級(jí)并根據(jù)Whitmore-Jewett系統(tǒng)進(jìn)行臨床分期。
[0019]進(jìn)一步，針對(duì)E2F3的AAV干擾穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建及病毒的包裝、濃縮與純化包括以下步驟:
[0020]步驟一，對(duì)已制備的E2F3RNAi質(zhì)粒載體進(jìn)行雙酶切，插入干擾片斷后，將U6-RiE2F3序列PCR后克隆進(jìn)T載體，然后亞克隆至pAAV-MCS ;酶切、PCR、測(cè)序驗(yàn)證載體構(gòu)建成功并證明ITR的存在；
[0021]步驟二，待AAV-293細(xì)胞達(dá)到70% _80 %融合后，分別將干擾穿梭質(zhì)粒與pRC、pHelper按照1:1:1濃度與細(xì)胞電轉(zhuǎn)，24小時(shí)后收集細(xì)胞；
[0022]步驟三，采用氯仿處理-PEG/NaCl沉淀-氯仿抽提三個(gè)步驟分離、濃縮、純化病毒；
[0023]步驟四，應(yīng)用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)病毒純度；將純化的病毒經(jīng)鎢酸鹽染色后，置于150目的鎳網(wǎng)上，掃描電鏡觀察。
[0024]進(jìn)一步，含有干擾序列的rAAV對(duì)E2F3及相關(guān)調(diào)控基因表達(dá)影響的方法包括:
[0025]步驟一，對(duì)LNCaP細(xì)胞進(jìn)行病毒轉(zhuǎn)染，通過綠色熒光的觀察、重組病毒載體與質(zhì)粒載體在轉(zhuǎn)化效率、沉默效率、細(xì)胞毒性；
[0026]步驟二，rAAV干擾載體對(duì)LNCaP細(xì)胞中E2F3及ARmRNA及蛋白質(zhì)表達(dá)水平的影響；
[0027]步驟三，接種LNCaP細(xì)胞于24孔板中，待細(xì)胞80_90%融合，棄培養(yǎng)液，并向每孔中分別加入不同濃度的rAAV-U6-RiE2F3-GFP，分別提取總RNA和總蛋白，觀察干擾效果，不同濃度及不同作用時(shí)間的rAAV-RiE2F3干擾載體對(duì)LNCaP細(xì)胞中E2F3沉默的影響及細(xì)胞殺傷作用；
[0028]步驟四，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)研究rAAV-U6-RiE2F3-GFP轉(zhuǎn)染前后LNCaP細(xì)胞細(xì)胞周期及凋亡的變化情況。
[0029]進(jìn)一步，裸鼠原位前列腺癌模型的建立包括以下步驟:
[0030]步驟一，將LNCaP細(xì)胞進(jìn)行消化后濃度調(diào)整至I X 107個(gè)/ml，置于無菌Eppendorf管內(nèi)，冰塊上送到動(dòng)物房中；
[0031]步驟二，裸鼠前列腺位置的確定:取仰臥位，75%酒精棉球消毒小鼠腹部及腹部以下皮膚，下腹正中切口，從兩側(cè)分離到精囊及輸精管，沿著輸精管向下游離至膀胱頸，暴露前列腺；選擇該葉作為LNCaP細(xì)胞的種植位置；
[0032]步驟三，應(yīng)用細(xì)胞懸液種植腫瘤細(xì)胞后定期觀察裸鼠體重變化，并且進(jìn)行成瘤情況的判定，應(yīng)用免疫組化的方法驗(yàn)證前列腺癌動(dòng)物模型的成功建立。
[0033]進(jìn)一步，含有干擾序列的rAAV對(duì)E2F3及相關(guān)調(diào)控基因表達(dá)影響的方法包括:
[0034]步驟一，應(yīng)用rAAV干擾載體進(jìn)行腫瘤局部注射并于治療后4周處死裸鼠，觀察腫瘤大小及重量的變化；觀察病毒作用后對(duì)裸鼠各個(gè)臟器組織學(xué)影響；
[0035]步驟二，rAAV干擾載體對(duì)原位前列腺癌中E2F3mRNA及蛋白質(zhì)表達(dá)水平的影響；檢測(cè)E2F3基因沉默后其下游調(diào)控基因的表達(dá)情況；
[0036]步驟三，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)研究rAAV-U6-RiE2F3_GFP注射前后腫瘤細(xì)胞細(xì)胞周期及凋亡的變化情況；應(yīng)用電鏡技術(shù)了解AAV干擾病毒對(duì)腫瘤細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響；
[0037]步驟四，用摘眼球放血方法收集裸鼠血液標(biāo)本，應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR比較不同組間全血E2F3基因mRNA表達(dá)情況。
[0038]進(jìn)一步，E2F3在前列腺癌組織中的表達(dá)與AR的異常表達(dá)具有相關(guān)性；構(gòu)建前列腺原位癌模型并通過腹腔注射干擾病毒的方法，抽取種植成功小鼠靜脈血檢測(cè)mRNA表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)治療組外周血標(biāo)本中E2F3mRNA表達(dá)明顯下降；治療組中前列腺腫瘤提及明顯縮小。
[0039]本發(fā)明提供的E2F3基因沉默對(duì)前列腺癌動(dòng)物模型中全血E2F3影響的方法，通過免疫組化研究不同前列腺癌組織中E2F3的表達(dá)情況，明確E2F3與前列腺癌分級(jí)、分期及預(yù)后的關(guān)系；通過構(gòu)建針對(duì)E2F3的AAV病毒載體，沉默E2F3基因并進(jìn)行相關(guān)的外功能實(shí)驗(yàn)；通過建立裸鼠前列腺癌模型，成功應(yīng)用AAV病毒載體進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)并明確E2F3基因沉默前后裸鼠全血中E2F3mRNA表達(dá)情況。本發(fā)明的E2F3基因可以作為前列腺癌基因治療的高效靶點(diǎn)，為后續(xù)的以E2F3為靶點(diǎn)的前列腺癌基因治療體內(nèi)實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)；針對(duì)E2F3的重組RNA干擾AAV病毒能夠抑制腫瘤細(xì)胞的增殖并能夠促進(jìn)細(xì)胞的凋亡，并通過上述機(jī)制能有效抑制動(dòng)物模型腫瘤的生長并降低了外周血標(biāo)本內(nèi)E2F3的表達(dá)，為以E2F3為靶點(diǎn)的腫瘤基因沉默療法提供了可靠的理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0040]圖1是本發(fā)明實(shí)施例提供的E2F3基因沉默對(duì)前列腺癌動(dòng)物模型中全血E2F3影響的方法的流程圖；
[0041]圖2是本發(fā)明實(shí)施例提供的pAAV-MCS及pRNAT_U6.l_siE2F3/Neo質(zhì)粒及Mlu單酶切電泳結(jié)果示意圖；
[0042]圖中:M:DL1, 5000Marker ;1，2:pRNAT_U6.l_siE2F3/Neo 質(zhì)粒；3:Mlu 單酶切PRNAT-U6.l-siE2F3/Neo 質(zhì)粒(約 6400bp) ;4:pAAV_MCS 質(zhì)粒；5:Mlu 單酶切 pAAV-MCS 質(zhì)粒(4600bp)；
[0043]圖3是本發(fā)明實(shí)施例提供的以PRNAT-U6.l-siE2F3/Neo質(zhì)粒為模板的干擾序列PCR結(jié)果不意圖；
[0044]圖中:M:DL2000Marker ;1，2，3:Mlu-U6-MCS-CMV-GFP_Mlu 片段(約 1700bp)；
[0045]圖4是本發(fā)明實(shí)施例提供的pAAV_siE2F3環(huán)狀質(zhì)粒示意圖；
[0046]圖中:M:DL1,5000Marker ；1, 2:已插入目的片段的 pAAV-MCS ；
[0047]圖5是本發(fā)明實(shí)施例提供的pAAV_siE2F3質(zhì)粒BglII單酶切示意圖；
[0048]圖中:Ml: DLl, 5000Marker ；M2: DL2000Marker ; 1，2，3:線性 pAAV_siE2F3 質(zhì)粒片段(約 6300bp)；
[0049]圖6是本發(fā)明實(shí)施例提供的pAAV_siE2F3質(zhì)粒Mlu、BamHl、HandIII酶切效果示意圖；
[0050]圖中:M1:DL1,5000Marker ；M2:DL2000Marker ；l:Mlu 單酶切后出現(xiàn)兩條片段(約1650bp 及 4200bp) ;2:BamHl 單酶切后出現(xiàn)兩條片段(約 2750bp 及 3550bp) ;3:HandIII 單酶切后出現(xiàn)兩條片段(約2750bp及3550bp) ；4:BamHl和HandIII單酶切后出現(xiàn)兩條片段(約 2750bp 及 3550bp)；
[0051]圖7是本發(fā)明實(shí)施例提供的pAAV_siE2F3質(zhì)粒PCR鑒定結(jié)果示意圖；
[0052] 圖中:Ml:DLl，5000Marker ;1，4:應(yīng)用Mlu為兩邊酶切位點(diǎn)設(shè)計(jì)的引物擴(kuò)增片段(約1700bp) ；2,3:應(yīng)用ITR引物擴(kuò)增片段(約3500bp)；
[0053]圖8是本發(fā)明實(shí)施例提供的轉(zhuǎn)染病毒后LNCaP細(xì)胞RNA提取后進(jìn)行電泳示意圖；
[0054]圖9是本發(fā)明實(shí)施例提供的RT-PCR證實(shí)LNCaP細(xì)胞轉(zhuǎn)染重組干擾AAV病毒后E2F3mRNA表達(dá)降低示意圖；
[0055]圖10是本發(fā)明實(shí)施例提供的RT-PCR證實(shí)LNCaP細(xì)胞轉(zhuǎn)染重組干擾AAV病毒后E2F3mRNA表達(dá)下降降低情況示意圖；
[0056]圖11是本發(fā)明實(shí)施例提供的RT-PCR證實(shí)LNCaP細(xì)胞轉(zhuǎn)染重組干擾AAV病毒后ARmRNA表達(dá)降低情況示意圖；
[0057]圖12是本發(fā)明實(shí)施例提供的E2F3在不同組織中的表達(dá)情況示意圖；
[0058]圖中:1:DL2000marker ;2_5:1 X PBS 對(duì)照組；6_7:重組干擾病毒組；
[0059]圖13是本發(fā)明實(shí)施例提供的E2F3蛋白表達(dá)在不同前列腺組織中的表達(dá)情況示意圖；
[0060]圖中:1:1 XPBS對(duì)照組；2:空質(zhì)粒對(duì)照組；3:重組干擾病毒組。
【具體實(shí)施方式】
[0061]為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0062]下面結(jié)合附圖及具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的應(yīng)用原理作進(jìn)一步描述。
[0063]如圖1所示，本發(fā)明實(shí)施例的E2F3基因沉默對(duì)前列腺癌動(dòng)物模型中全血E2F3影響的方法包括以下步驟:
[0064]SlOl:通過收集不同前列腺癌石蠟標(biāo)本，采用real-timePCR、WESTERN、免疫組化等技術(shù)手段，分析E2F3及其所調(diào)基因在前列腺癌中的表達(dá)情況；
[0065]S102:建立以AVV為載體的RNAi平臺(tái)，并分析干擾序列對(duì)前列腺癌LNCaP細(xì)胞中E2F3基因沉默的影響；
[0066]S103:并經(jīng)體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)E2F3基因沉默對(duì)LNCaP細(xì)胞中E2F3及相關(guān)調(diào)控基因的影響及對(duì)細(xì)胞增殖及凋亡的影響；應(yīng)用裸鼠進(jìn)行原位前列腺癌動(dòng)物模型的構(gòu)建；
[0067]S104:應(yīng)用AAV干擾載體進(jìn)行腫瘤的局部注射后明確腫瘤組織中E2F3在mRNA及蛋白質(zhì)水平的表達(dá)情況及其對(duì)腫瘤生長抑制情況，最后應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR對(duì)不同實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行全血E2F3mRNA的檢測(cè)，明確其作為前列腺癌腫瘤標(biāo)記物的可能性。
[0068]在步驟S104中，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:E2F3與前列腺癌的惡性程度密切相關(guān)，其不僅是前列腺癌的診斷與預(yù)后指標(biāo)，而且為前列腺癌的基因靶向治療提供理論依據(jù)。本發(fā)明明確E2F3及AR在不同病理分級(jí)、臨床分期的前列腺癌組織中的表達(dá)情況；明確E2F3及AR表達(dá)之間的相關(guān)性及其與前列腺癌預(yù)后的關(guān)系；構(gòu)建以U6為啟動(dòng)子的AAV干擾穿梭質(zhì)粒，并包裝出高純度rAAV-RiE2F3腺相關(guān)病毒生物制劑；通過前列腺癌細(xì)胞系進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)，明確E2F3基因沉默后AR及相關(guān)基因的表達(dá)情況及細(xì)胞的生長情況。上述實(shí)驗(yàn)表明E2F3基因可以作為前列腺癌基因治療的高效祀點(diǎn)，這也為后續(xù)的以E2F3為祀點(diǎn)的前列腺癌基因治療體內(nèi)實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。通過采用LNCaP細(xì)胞在裸鼠前列腺前頁進(jìn)行接種，建立原位前列腺癌動(dòng)物模型。并進(jìn)行針對(duì)E2F3干擾病毒的腹腔注射體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究。針對(duì)E2F3的重組RNA干擾AAV病毒能夠抑制腫瘤細(xì)胞的增殖并能夠促進(jìn)細(xì)胞的凋亡，并通過上述機(jī)制能有效抑制動(dòng)物模型腫瘤的生長并降低了外周血標(biāo)本內(nèi)E2F3的表達(dá)。本發(fā)明為以E2F3為靶點(diǎn)的腫瘤基因沉默療法提供了可靠的理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
[0069]本發(fā)明的工作原理:
[0070]本發(fā)明通過免疫組化研究不同前列腺癌組織中E2F3的表達(dá)情況，明確E2F3與前列腺癌分級(jí)、分期及預(yù)后的關(guān)系；通過構(gòu)建針對(duì)E2F3的AAV病毒載體，沉默E2F3基因并進(jìn)行相關(guān)的外功能實(shí)驗(yàn)；通過建立裸鼠前列腺癌模型，成功應(yīng)用AAV病毒載體進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)并明確E2F3基因沉默前后裸鼠全血中E2F3mRNA表達(dá)情況。
[0071]本發(fā)明的具體包括以下四個(gè)方面:
[0072]1、取不同臨床分期、病理分級(jí)的前列腺癌石蠟切片組織進(jìn)行免疫組化染色，在蛋白質(zhì)水平研究E2F3及AR的表達(dá)情況及二者的表達(dá)與前列腺癌臨床特點(diǎn)及預(yù)后之間的關(guān)系，根據(jù)Gleason分級(jí)和評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行病理分級(jí)并根據(jù)Whitmore-Jewett系統(tǒng)進(jìn)行臨床分期。
[0073]2、設(shè)計(jì)合成三對(duì)針對(duì)于E2F3基因的siRNA對(duì)應(yīng)模版DNA序列，通過RT-PCR方法篩選出最為有效的干擾片段。根據(jù)上述篩選結(jié)果，將相應(yīng)shRNA表達(dá)框克隆到腺相關(guān)病毒載體中(AAVHelper-FreeSystem, Strategene),包裝純化病毒后,轉(zhuǎn)染膀胱移行細(xì)胞癌腫瘤細(xì)胞株，檢測(cè)病毒載體的長效基因沉默的效果，以及細(xì)胞增殖凋亡相關(guān)指標(biāo)。
[0074]3、采用LNCaP細(xì)胞在裸鼠前列腺前頁進(jìn)行接種，建立原位前列腺癌動(dòng)物模型。并進(jìn)行針對(duì)E2F3干擾病毒的腹腔注射體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究。
[0075]結(jié)合以下的實(shí)驗(yàn)對(duì)本發(fā)明的原理做進(jìn)一步的說明:
[0076]1.不同前列腺癌組織中E2F3的表達(dá)情況:
[0077]取不同臨床分期、病理分級(jí)的前列腺癌石蠟切片組織進(jìn)行免疫組化染色，在蛋白質(zhì)水平研究E2F3及AR的表達(dá)情況及二者的表達(dá)與前列腺癌臨床特點(diǎn)及預(yù)后之間的關(guān)系；根據(jù)Gleason分級(jí)和評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行病理分級(jí)并根據(jù)Whitmore-Jewett系統(tǒng)進(jìn)行臨床分期。
[0078]2.針對(duì)E2F3的AAV干擾穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建及病毒的包裝、濃縮與純化:
[0079]①對(duì)已制備的E2F3RNAi質(zhì)粒載體進(jìn)行雙酶切，插入干擾片斷后，將U6_RiE2F3序列PCR后克隆進(jìn)T載體，然后亞克隆至pAAV-MCS。酶切、PCR、測(cè)序驗(yàn)證載體構(gòu)建成功并證明ITR的存在；
[0080]②待AAV-293細(xì)胞達(dá)到70% -80%融合后，分別將干擾穿梭質(zhì)粒與pRC、pHelper按照1:1:1濃度與細(xì)胞電轉(zhuǎn)，24小時(shí)后收集細(xì)胞；
[0081]③采用“氯仿處理-PEG/NaCl沉淀-氯仿抽提”三個(gè)步驟分離、濃縮、純化病毒；
[0082]④應(yīng)用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)檢測(cè)病毒純度；將純化的病毒經(jīng)鎢酸鹽染色后，置于150目的鎳網(wǎng)上，掃描電鏡觀察。
[0083]3.含有干擾序列的rAAV對(duì)E2F3及相關(guān)調(diào)控基因表達(dá)影響的體外功能實(shí)驗(yàn):
[0084]①對(duì)LNCaP細(xì)胞進(jìn)行病毒轉(zhuǎn)染，通過綠色熒光的觀察、MTT實(shí)驗(yàn)等研究重組病毒載體與質(zhì)粒載體在轉(zhuǎn)化效率、沉默效率、細(xì)胞毒性等；
[0085]②研究rAAV干擾載體對(duì)LNCaP細(xì)胞中E2F3及ARmRNA及蛋白質(zhì)表達(dá)水平的影響；
[0086] 接種LNCaP細(xì)胞于24孔板中，待細(xì)胞80_90%融合，棄培養(yǎng)液，并向每孔中分別加入不同濃度的rAAV-U6-RiE2F3-GFP，分別提取總RNA和總蛋白，觀察干擾效果，研究不同濃度及不同作用時(shí)間的rAAV-RiE2F3干擾載體對(duì)LNCaP細(xì)胞中E2F3沉默的影響及細(xì)胞殺傷作用。
[0087]③應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)研究rAAV-U6-RiE2F3-GFP轉(zhuǎn)染前后LNCaP細(xì)胞細(xì)胞周期及凋亡的變化情況。
[0088]4.裸鼠原位前列腺癌模型的建立:
[0089]①將LNCaP細(xì)胞進(jìn)行消化后濃度調(diào)整至IX 107個(gè)/ml，置于無菌Eppendorf管內(nèi)，冰塊上送到動(dòng)物房中；
[0090]②裸鼠前列腺位置的確定:取仰臥位，75%酒精棉球消毒小鼠腹部及腹部以下皮膚。下腹正中切口，從兩側(cè)分離到精囊及輸精管，沿著輸精管向下游離至膀胱頸，暴露前列腺。因裸鼠前列腺前葉位置好，體積較大，所以選擇該葉作為LNCaP細(xì)胞的種植位置。
[0091]③應(yīng)用細(xì)胞懸液種植腫瘤細(xì)胞后定期觀察裸鼠體重變化，并且進(jìn)行成瘤情況的判定，應(yīng)用免疫組化的方法驗(yàn)證前列腺癌動(dòng)物模型的成功建立。
[0092]5.含有干擾序列的rAAV對(duì)E2F3及相關(guān)調(diào)控基因表達(dá)影響的體內(nèi)功能實(shí)驗(yàn):
[0093]①應(yīng)用rAAV干擾載體進(jìn)行腫瘤局部注射并于治療后4周處死裸鼠，觀察腫瘤大小及重量的變化；觀察病毒作用后對(duì)裸鼠各個(gè)臟器組織學(xué)影響；
[0094]②研究rAAV干擾載體對(duì)原位前列腺癌中E2F3mRNA及蛋白質(zhì)表達(dá)水平的影響；檢測(cè)E2F3基因沉默后其下游調(diào)控基因的表達(dá)情況；
[0095]③應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)研究rAAV-U6-RiE2F3-GFP注射前后腫瘤細(xì)胞細(xì)胞周期及凋亡的變化情況。應(yīng)用電鏡技術(shù)了解AAV干擾病毒對(duì)腫瘤細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響；
[0096]④用摘眼球放血方法收集裸鼠血液標(biāo)本，應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR比較不同組間全血E2F3基因mRNA表達(dá)情況。
[0097]本發(fā)明應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)不同病理分期及組織分級(jí)的前列腺癌標(biāo)本和前列腺增生組織中E2F3、AR蛋白的表達(dá)情況；通過構(gòu)建重組病毒干擾質(zhì)粒pAAV-siE2F3并包裝重組干擾病毒后進(jìn)行相關(guān)體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)，以明確E2F3在前列腺癌發(fā)生機(jī)發(fā)展機(jī)制中的作用。
[0098]本發(fā)明結(jié)果顯示:E2F3在前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用。E2F3的高表達(dá)提示預(yù)后不良；AR在前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展中及進(jìn)展成激素非依賴型起著重要作用；E2F3在前列腺癌組織中的表達(dá)與AR的異常表達(dá)具有相關(guān)性；E2F3、AR可望成為診斷前列腺癌和評(píng)估預(yù)后的指標(biāo)。在前期進(jìn)行質(zhì)粒干擾載體構(gòu)建的基礎(chǔ)上，構(gòu)建了針對(duì)E2F3基因的AAV干擾載體穿梭質(zhì)粒，經(jīng)過多種限制性內(nèi)切酶酶切檢測(cè)、目的基因PCR檢測(cè)及測(cè)序證實(shí)pAAV-siE2F3重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。同時(shí)，本發(fā)明通過PCR證實(shí)pAAV_siE2F3重組質(zhì)粒存在ITR，并在此基礎(chǔ)上成功進(jìn)行了病毒的包裝與純化。本發(fā)明介紹的改造AAVHelper-Free系統(tǒng)進(jìn)行RNAi的方法操作簡(jiǎn)便、價(jià)格低廉并且不影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)。在進(jìn)一步的體外細(xì)胞功能試驗(yàn)中，證實(shí)重組干擾病毒質(zhì)粒能夠有效的降低前列腺癌細(xì)胞系LNCaP細(xì)胞中E2F3基因mRNA表達(dá)，并發(fā)現(xiàn)E2F3基因表達(dá)明顯降低后LNCaP細(xì)胞系中ARmRNA的表達(dá)明顯降低。成功周建了前列腺原位癌模型并通過腹腔注射干擾病毒的方法進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，抽取種植成功小鼠靜脈血檢測(cè)mRNA表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)治療組外周血標(biāo)本中E2F3mRNA表達(dá)明顯下降。治療組中前列腺腫瘤提及明顯縮小。
[0099]實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)及結(jié)果:
[0100]第一部分:前列腺癌組織中E2F3、AR的表達(dá)及其與前列腺癌的關(guān)系:
[0101]一、E2F3在前列腺良性增生組織和癌組織中的表達(dá):
[0102]1.E2F3在前列腺良性增生組織和癌組織中的表達(dá)(表1):
[0103]E2F3蛋白主要定位在細(xì)胞核，偶見于細(xì)胞漿，免疫組化產(chǎn)物陽性呈黃或黃棕色顆粒，為灶性或彌漫狀分布。PCa中的E2F3表達(dá)顯著高于BPH ;且在PCa中的表達(dá)多著色較深，而在BPH為弱陽性或陽性。經(jīng)兩兩組間比較表明:E2F3在二者中的表達(dá)不同，在BPH與PCa中的表達(dá)差異有顯著性(X 2 = 26.67，P = 0.000)，即PCa中E2F3表達(dá)水平明顯高于 BPH。
[0104]表1 E2F3在良性前列腺增生和前列腺癌組織中的表達(dá)E2F3
[0105]
【權(quán)利要求】
1.一種E2F3基因沉默對(duì)前列腺癌動(dòng)物模型中全血E2F3影響的方法，其特征在于，該E2F3基因沉默對(duì)前列腺癌動(dòng)物模型中全血E2F3影響的方法包括: 步驟一，通過收集不同前列腺癌石蠟標(biāo)本，采用real-timePCR、WESTERN、免疫組化，分析E2F3及其所調(diào)基因在前列腺癌中的表達(dá)情況； 步驟二，建立以AVV為載體的RNAi平臺(tái)，并分析干擾序列對(duì)前列腺癌LNCaP細(xì)胞中E2F3基因沉默的影響； 步驟三，并經(jīng)體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)E2F3基因沉默對(duì)LNCaP細(xì)胞中E2F3及相關(guān)調(diào)控基因的影響及對(duì)細(xì)胞增殖及凋亡的影響；應(yīng)用裸鼠進(jìn)行原位前列腺癌動(dòng)物模型的構(gòu)建； 步驟四，應(yīng)用AAV干擾載體進(jìn)行腫瘤的局部注射后明確腫瘤組織中E2F3在mRNA及蛋白質(zhì)水平的表達(dá)情況及對(duì)腫瘤生長抑制情況，最后應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR進(jìn)行全血E2F3mRNA的檢測(cè)，明確作為前列腺癌腫瘤標(biāo)記物的可能性。
2.如權(quán)利要求1所述的E2F3基因沉默對(duì)前列腺癌動(dòng)物模型中全血E2F3影響的方法，其特征在于，該E2F3基因沉默對(duì)前列腺癌動(dòng)物模型中全血E2F3影響的方法具體包括以下步驟: 第一步，取不同臨床分期、病理分級(jí)的前列腺癌石蠟切片組織進(jìn)行免疫組化染色，在蛋白質(zhì)水平研究E2F3及AR的表達(dá)情況及二者的表達(dá)與前列腺癌臨床特點(diǎn)及預(yù)后之間的關(guān)系，根據(jù)Gleason分級(jí)和評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行病理分級(jí)并根據(jù)Whitmore-Jewett系統(tǒng)進(jìn)行臨床分期； 第二步，合成三對(duì)針對(duì)于E2F3基因的siRNA對(duì)應(yīng)模版DNA序列，通過RT-PCR方法篩選出最為有效的干擾片段；根據(jù)篩選結(jié)果，將相應(yīng)shRNA表達(dá)框克隆到腺相關(guān)病毒載體中，包裝純化病毒后，轉(zhuǎn)染膀胱移行細(xì)胞癌腫瘤細(xì)胞株，檢測(cè)病毒載體的長效基因沉默的效果，以及細(xì)胞增殖凋亡相關(guān)指標(biāo)； 第三步，采用LNCaP細(xì)胞在裸鼠前列腺前頁進(jìn)行接種，建立原位前列腺癌動(dòng)物模型。
3.如權(quán)利要求2所述的E2F3基因沉默對(duì)前列腺癌動(dòng)物模型中全血E2F3影響的方法，其特征在于，取不同臨床分期、病理分級(jí)的前列腺癌石蠟切片組織進(jìn)行免疫組化染色，在蛋白質(zhì)水平研究E2F3及AR的表達(dá)情況及二者的表達(dá)與前列腺癌臨床特點(diǎn)及預(yù)后之間的關(guān)系；根據(jù)Gleason分級(jí)和評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行病理分級(jí)并根據(jù)Whitmore-Jewett系統(tǒng)進(jìn)行臨床分期。
4.如權(quán)利要求2所述的E2F3基因沉默對(duì)前列腺癌動(dòng)物模型中全血E2F3影響的方法，其特征在于，針對(duì)E2F3的AAV干擾穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建及病毒的包裝、濃縮與純化包括以下步驟: 步驟一，對(duì)已制備的E2F3RNAi質(zhì)粒載體進(jìn)行雙酶切，插入干擾片斷后，將U6_RiE2F3序列PCR后克隆進(jìn)T載體，然后亞克隆至pAAV-MCS ;酶切、PCR、測(cè)序驗(yàn)證載體構(gòu)建成功并證明ITR的存在； 步驟二，待AAV-293細(xì)胞達(dá)到70% -80%融合后，分別將干擾穿梭質(zhì)粒與pRC、pHelper按照1:1:1濃度與細(xì)胞電轉(zhuǎn)，24小時(shí)后收集細(xì)胞； 步驟三，采用氯仿處理-PEG/NaCl沉淀-氯仿抽提三個(gè)步驟分離、濃縮、純化病毒； 步驟四，應(yīng)用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)病毒純度；將純化的病毒經(jīng)鎢酸鹽染色后，置于150目的鎳網(wǎng)上,掃描電鏡觀察。
5.如權(quán)利要求2所述的E2F3基因沉默對(duì)前列腺癌動(dòng)物模型中全血E2F3影響的方法，其特征在于，含有干擾序列的rAAV對(duì)E2F3及相關(guān)調(diào)控基因表達(dá)影響的方法包括: 步驟一，對(duì)LNCaP細(xì)胞進(jìn)行病毒轉(zhuǎn)染，通過綠色熒光的觀察、重組病毒載體與質(zhì)粒載體在轉(zhuǎn)化效率、沉默效率、細(xì)胞毒性； 步驟二，rAAV干擾載體對(duì)LNCaP細(xì)胞中E2F3及ARmRNA及蛋白質(zhì)表達(dá)水平的影響； 步驟三，接種LNCaP細(xì)胞于24孔板中，待細(xì)胞80-90 %融合，棄培養(yǎng)液，并向每孔中分別加入不同濃度的rAAV-U6-RiE2F3-GFP，分別提取總RNA和總蛋白，觀察干擾效果，不同濃度及不同作用時(shí)間的rAAV-RiE2F3干擾載體對(duì)LNCaP細(xì)胞中E2F3沉默的影響及細(xì)胞殺傷作用； 步驟四，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)研究rAAV-U6-RiE2F3-GFP轉(zhuǎn)染前后LNCaP細(xì)胞細(xì)胞周期及凋亡的變化情況。
6.如權(quán)利要求2所述的E2F3基因沉默對(duì)前列腺癌動(dòng)物模型中全血E2F3影響的方法，其特征在于，裸鼠原位前列腺癌模型的建立包括以下步驟: 步驟一，將LNCaP細(xì)胞進(jìn)行消化后濃度調(diào)整至I X 107個(gè)/ml，置于無菌Eppendorf管內(nèi)，冰塊上送到動(dòng)物房中； 步驟二，裸鼠前列腺位置的確定:取仰臥位，75%酒精棉球消毒小鼠腹部及腹部以下皮膚，下腹正中切口，從兩側(cè)分離到精囊及輸精管，沿著輸精管向下游離至膀胱頸，暴露前列腺；選擇該葉作為LNCaP細(xì)胞的種植位置； 步驟三，應(yīng)用細(xì)胞懸液種植腫瘤細(xì)胞后定期觀察裸鼠體重變化，并且進(jìn)行成瘤情況的判定，應(yīng)用免疫組化的方法驗(yàn)證前列腺癌動(dòng)物模型的成功建立。
7.如權(quán)利要求2所述的E2F3基因沉默對(duì)前列腺癌動(dòng)物模型中全血E2F3影響的方法，其特征在于，含有干擾序列的rAAV對(duì)E2F3及相關(guān)調(diào)控基因表達(dá)影響的方法包括: 步驟一，應(yīng)用rAAV干擾載體進(jìn)行腫瘤局部注射并于治療后4周處死裸鼠，觀察腫瘤大小及重量的變化；觀察病毒作用后對(duì)裸鼠各個(gè)臟器組織學(xué)影響； 步驟二，rAAV干擾載體對(duì)原位前列腺癌中E2F3mRNA及蛋白質(zhì)表達(dá)水平的影響；檢測(cè)E2F3基因沉默后其下游調(diào)控基因的表達(dá)情況； 步驟三，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)研究rAAV-U6-RiE2F3-GFP注射前后腫瘤細(xì)胞細(xì)胞周期及凋亡的變化情況；應(yīng)用電鏡技術(shù)了解AAV干擾病毒對(duì)腫瘤細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響； 步驟四，用摘眼球放血方法收集裸鼠血液標(biāo)本，應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR比較不同組間全血E2F3基因mRNA表達(dá)情況。
8.如權(quán)利要求2所述的E2F3基因沉默對(duì)前列腺癌動(dòng)物模型中全血E2F3影響的方法，其特征在于，E2F3在前列腺癌組織中的表達(dá)與AR的異常表達(dá)具有相關(guān)性；構(gòu)建前列腺原位癌模型并通過腹腔注射干擾病毒的方法，抽取種植成功小鼠靜脈血檢測(cè)mRNA表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)治療組外周血標(biāo)本中E2F3mRNA表達(dá)明顯下降；治療組中前列腺腫瘤提及明顯縮小。
【文檔編號(hào)】C12N15/864GK104131088SQ201410334972
【公開日】2014年11月5日 申請(qǐng)日期:2014年7月14日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月14日
【發(fā)明者】胡海龍, 孫巖, 陳濤, 謝林國 申請(qǐng)人:天津市泌尿外科研究所