檢測cx3cr1基因v249i突變位點的方法和引物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了檢測CX3CR1基因V249I位點突變的方法和引物，包括擴增CX3CR1基因V249I突變位點片段的正、反向引物和正向測序引物。將PCR擴增和Sanger測序相結合，可快速檢測糖尿病以及糖代謝異常引起的心腦血管病患者體內(nèi)CX3CR1基因V249I位點的突變情況。
【專利說明】檢測CX3CR1基因 V249I突變位點的方法和引物

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬生命科學和生物【技術領域】，特別涉及檢測CX3CR1基因V249I突變位點的 方法和引物。

【背景技術】
[0002] 近年來，隨著生活方式的逐漸改變，糖尿病發(fā)病率正在逐年增高，成為腦血管 病的常見危險因素之一。臨床資料研究表明，與非糖尿病患者相比，糖尿病性腦梗死患 者的病殘率、復發(fā)率、死亡率較高，并且病情恢復較慢。糖耐量減低（impaired glucose tolerance, IGT)和空腹血糖調(diào)節(jié)減低（impaired fasting plasma glucose, IFG)，兩者是 正常葡萄糖穩(wěn)態(tài)和糖尿病高血糖之間的中間代謝狀態(tài)，且均為2型糖尿病高風險的預示因 素。有研究顯示IGT患者中已有腦血管意外的風險，在IGT階段各種復雜的關系已經(jīng)充分暴 露，糖代謝發(fā)生異常，胰島素抵抗，高胰島素血癥，內(nèi)皮細胞功能紊亂，氧化應激，血脂異常， 血壓升高等交織在一起，從而出現(xiàn)靶器官的損害。因此腦梗死患者的糖代謝異常是預測其 預后的重要因素。
[0003] Fractalkine(FKN)是炎癥內(nèi)皮細胞釋放的一種趨化因子，與受體CX3CR1結合以 后可以增強自然殺傷細胞（NK細胞）的殺傷力，從而損傷血管內(nèi)皮細胞，促進動脈粥樣硬化 (atherosclerosis, AS)的形成。因此，觀察高血糖尤其是糖調(diào)節(jié)異常階段與急性腦梗死患 者FKN表達相關性的研究，對急性腦梗死合并糖耐量異?；颊叩姆乐喂ぷ鲗兄匾呐R 床意義。國外已有文獻報道空腹血糖（FPG)和糖負荷后2h血糖（2hPG)是動脈粥樣硬化 (atherosclerosisAS)的獨立危險因素。另外有研究表明，頸動脈粥樣硬化是導致腦梗死 的重要原因之一。隨著對動脈粥樣硬化性疾病其相關發(fā)病機制的不斷深入研究，近年來發(fā) 現(xiàn)一種由炎癥內(nèi)皮細胞釋放的新趨化因子Fractalkine (FKN)，與表達在淋巴細胞、單核細 胞、自然殺傷細胞（NK細胞）上的CX3CR1受體結合以后，可以增強NK細胞的殺傷力，損傷 血管內(nèi)皮細胞，從而促進動脈粥樣硬化性疾病的形成和發(fā)展。趨化因子家族是一系列分子 量約為8-12KD，結構相似并具有趨化功能，能夠控制細胞定向遷移的細胞因子。趨化因子肽 鏈N端的半胱氨酸殘基是高度保守的，根據(jù)其相對位置和數(shù)量的差異，可以將趨化因子分 為四個亞族。Fractalkine (FKN)是目前發(fā)現(xiàn)的唯一的CX3C類趨化因子。FKN基因定位于 人類第16號染色體中的ql3片段。不同于與其他趨化因子的是，F(xiàn)KN有兩種存在形式，即 膜結合型FKN和可溶型FKN，其中膜結合型FKN是黏附分子，可溶型FKN是化學誘導物。成 熟的膜結合型可分為三段：胞外段，其CX3C趨化因子結構域位于頭部氨基端，含有氨基酸 殘基76個，下面連接一段粘蛋白樣的莖狀結構，共有氨基酸殘基241個，其中含有豐富的蘇 氨酸（Thr)、脯氨酸（Pro)、絲氨酸（Ser)及谷氨酸（Gly);跨膜段，共含有疏氨基酸殘基18 個；胞內(nèi)段，有氨基酸殘基37個。膜結合型FKN位于其近膜側的第314-317位氨基酸殘基， 即Thr-Arg-Arg-Gln，是一雙堿基的水解位點，可以由蛋白酶水解，則膜結合型FKN轉(zhuǎn)變成 可溶型FKN?？扇苄秃湍そY合型FKN之間的平衡是金屬蛋白酶依賴性蛋白酶通過調(diào)節(jié)實現(xiàn) 的。FKN在人體內(nèi)分布廣泛。研究表明，在非造血組織、神經(jīng)細胞及血管內(nèi)皮細胞表面，均發(fā) 現(xiàn)有FKN表達。另外，F(xiàn)oussat等也發(fā)現(xiàn)在上皮細胞FKN表達較高。大多數(shù)FKN在活化的 內(nèi)皮細胞表面表達，既具有黏附功能又具有趨化作用，并且參與了白細胞向炎癥組織游走 的過程。FKN通過其黏蛋白樣莖狀結構，可以迅速結合位于細胞表面的高親和受體CX3CR1， 從而發(fā)揮生物學作用，并且不需要黏附分子參與該過程。另外有實驗發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)KN還可以增加 炎性因子滲出，從而促進炎癥級聯(lián)反應的發(fā)生。
[0004] CX3CR1是FKN因子的專一受體，屬于G-蛋白偶聯(lián)受體。CX3CR1基因定位于人類 3號染色體中的短臂二區(qū)一帶，一簇CC趨化因子受體基因與CX3CR1受體相鄰。CX3CR1受 體是由355個氨基酸殘基組成的單鏈受體，共含有7個疏水性穿膜區(qū)段，并對百日咳毒素敏 感。CX3CR1受體的第249和280位氨基酸殘基具有多態(tài)性，考慮與形成動脈粥樣硬化的過 程有關。CX3CR1受體結構可分為三部分，分別是：胞外區(qū)（即趨化因子結構區(qū)），跨膜區(qū)（即 疏水性氨基酸富含區(qū)）和胞內(nèi)區(qū)（即信號轉(zhuǎn)導區(qū)）。CX3CR1受體的N端位于細胞外，含有 N-糖基化位點結構，CX3CR1受體的C端位于細胞內(nèi)，其磷酸化位點有蛋白激酶作用。在胞 外區(qū)，3個環(huán)狀結構和1個N端共同組成FKN的配體，可以結合FKN因子；在胞內(nèi)區(qū)，3個環(huán) 狀結構和1個C端結合起來，用于傳導FKN因子的功能信號。實驗表明，與CX3CR1相關的 鈣離子流活化和細胞游走現(xiàn)象可被百日咳毒素所抑制，證明CX3CR1與G蛋白家族的Gi亞 家族相偶聯(lián)。當CX3CR1受體和FKN因子結合以后，可以通過與G-蛋白耦聯(lián)，使細胞內(nèi)信號 轉(zhuǎn)導機制啟動，進一步促使腫瘤壞死因子-a (tumor necrosis factor-a，TNF-α )和核因 子-κ Β (nuclear factor- κ Β, NF- κ Β)表達水平升高，隨之產(chǎn)生生物學效應。
[0005] 動物實驗結果顯示，單核細胞將CX3CR1敲除后，F(xiàn)KN因子與該細胞的結合力和趨 化活性均降低。與僅敲除apoE的小鼠相比，敲除CX3CR1和apoE的小鼠，在動脈壁上的巨 噬細胞浸潤發(fā)現(xiàn)有明顯降低。因此可以證明，在富含巨噬細胞的動脈粥樣硬化病變過程中， FKN因子起著直接和主要的作用。另外有研究表明，以FKN濃度依賴的方式，氧化型亞油酸 和氧化型低密度脂蛋白可以誘導冠狀動脈血管平滑肌細胞和單核細胞異常黏附，從而在動 脈粥樣硬化性疾病的進展中發(fā)揮作用。有研究表明，動脈粥樣硬化性疾病進展過程的不同 階段，損傷的巨噬細胞源性泡沫細胞、內(nèi)皮細胞和其他細胞，以及動脈粥樣硬化形成的斑塊 中，過度表達FKN及其受體CX3CR1。其表達水平與病情的嚴重程度呈正相關，并且FKN可 以通過誘導單個核細胞使NF- κ B和TNF- α的表達水平增高，從而促進動脈粥樣硬化的形 成和進展。FKN因子及其受體CX3CR1對動脈粥樣硬化的影響及其機制：膜結合型FKN因子 刺激自然殺傷細胞，或FKN表達細胞與自然殺傷細胞共培養(yǎng)可誘導干擾素γ (IFN-γ)表 達。而且FKN能與新分離的自然殺傷細胞結合，以劑量依賴的方式增強其殺傷力，從而導 致內(nèi)皮細胞出現(xiàn)損傷。另外由于淋巴細胞、單核細胞及血管平滑肌細胞等表達FKN的受體 CX3CR1，因此FKN因子可以介導這些細胞向已經(jīng)損傷的血管內(nèi)皮細胞趨化并黏附，并且還 能夠跨越血管壁，遷移向血管外的特定部位。因此，F(xiàn)KN被認為是動脈粥樣硬化形成的危險 因素之一。研究證明，CX3CR1受體的基因多態(tài)性與動脈粥樣硬化性心腦血管疾病相關。另 夕卜，在動脈粥樣硬化性斑塊內(nèi)也發(fā)現(xiàn)FKN因子的高水平表達。
[0006] 目前針對CX3CR1基因突變位點的檢測普遍采用的是聚合酶鏈式反應-限制性片 段長度多態(tài)性（PCR-RFLP)法，用PCR擴增目的DNA，擴增產(chǎn)物再用特異性內(nèi)切酶消化切割成 不同大小片段，直接在凝膠電泳上分辨。不同等位基因的限制性酶切位點分布不同，產(chǎn)生不 同長度的DNA片段條帶。該方法簡便，結果容易判定，但是也同時存在諸多弊端，①靶片段 的擴增產(chǎn)物要純，如有非特異產(chǎn)物（特別是大片段可能含有酶識別序列）將競爭酶活性，使 樣品消化不完全或及出現(xiàn)酶消化雜帶；②酶消化過程要充分（即底物與酶的比例要合適， 消化時間要保證），避免假陰性結果；③酶切陽性結果可以確定所檢測具體序列，陰性結果 僅可說明非酶識別序列，但不能準確判定具體序列。④酶識別序列如有甲基化之核苷酸將 不被切割。而本發(fā)明采用測序的方法，可以有效地克服RFLP方法各種缺陷，從而快速，準 確，高通量地檢測樣本。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于提供檢測CX3CR1基因V249I突變位點的引物，其特征在于，包 括：擴增CX3CR1基因V249I突變位點的正、反向引物；其堿基序列為 ：
[0008] V249I-F ：GAGTTATTGCTACTTCAGAA
[0009] V249I-R ：GTAAAGGTATCTTCTGAACT
[0010] 進一步地，所述引物還包括正向測序引物，其堿基序列為
[0011] V249I-S-F :GAGTTATTGCTACTTCAGAA。
[0012] 進一步地，所述正、反向引物的使用濃度比為：V249I-F:V249I-R = 1:1。
[0013] 進一步地，所述正向測序引物的使用濃度為：3. 2uM
[0014] 進一步地，所述正、反向擴增引物的擴增反應條件為：第一階段，95 °C預變性 lOmin ;第二階段，變性溫度94°C 30sec，退火溫度64°C 90sec，延伸溫度72°C 30sec，循環(huán)35 次；第三階段，72°C lOmin ;第四階段，擴增反應結束，擴增產(chǎn)物在4°C下保存。
[0015] 本發(fā)明的目的還在于提供一種檢測CX3CR1基因V249I突變位點的方法，其包括如 下步驟：
[0016] (1)提取樣本 DNA;
[0017] (2)利用一對擴增引物V249I-F和V249I-R對（1)中的DNA進行擴增，獲得擴增產(chǎn) 物；
[0018] (3)利用正向測序引物V249I-S-F對⑵中的擴增產(chǎn)物進行測序，獲得所述擴增產(chǎn) 物的基因序列；
[0019] (4)將⑶中的基因序列與CX3CR1基因野生型參考序列CX3CRl-ref進行比較，確 定突變位點是否存在，其特征在于，
[0020] V249I-F ：GAGTTATTGCTACTTCAGAA
[0021] V249I-R ：GTAAAGGTATCTTCTGAACT
[0022] V249I-S-F :GAGTTATTGCTACTTCAGAA。
[0023] 進一步地，步驟（2)的擴增反應條件為：第一階段，95°C預變性lOmin ;第二階段， 變性溫度94°C 30sec，退火溫度64°C 90sec，延伸溫度72°C 30sec，循環(huán)35次；第三階段， 72°C lOmin ;第四階段，擴增反應結束，擴增產(chǎn)物在4°C下保存。
[0024] 本發(fā)明的目的還在于提供一種檢測CX3CR1基因V249I突變位點的試劑盒，其特 征在于,所述試劑盒包括樣本DNA抽提試劑；無水乙醇；檢測體系PCR反應液、測序體系反 應液、陽性對照品、陰性對照品和空白對照品，其中檢測體系PCR反應液包括一對擴增產(chǎn)物 V249I-F和V249I-R，測序體系反應液包括正向測序引物V249I-S-F，其特征在于：
[0025] V249I-F ：GAGTTATTGCTACTTCAGAA
[0026] V249I-R ：GTAAAGGTATCTTCTGAACT
[0027] V249I-S-F :GAGTTATTGCTACTTCAGAA。
[0028] 進一步地，所述試劑盒還包括CX3CR1基因野生型參考序列CX3CRl-ref。
[0029] 進一步地，所述測序純化液還包括由堿性磷酸酶和核酸外切酶I組成的測序純化 液。
[0030] 本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明設計了擴增CX3CR1基因V249I突變位點的正，反向 引物，構建了穩(wěn)定的PCR擴增體系，對V249I突變位點的片段進行擴增，包含待檢測的所有 突變位點，同時在擴增時，富集正向引物與模板正確配對的特異性擴增產(chǎn)物，提高擴增特異 性。此外，通過調(diào)整正向擴增引物的濃度、退火溫度等反應條件，可使擴增效率達到最佳，并 采用Sanger測序法，對PCR擴增產(chǎn)物進行測序反應擴增、純化后變性、直接測序檢測CX3CR1 基因V249I突變位點的多態(tài)性情況，具有靈敏度高、操作簡單和成本低等優(yōu)點。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0031] 圖1 :樣本1的檢測結果圖。
[0032] 圖2 :樣本2的檢測結果圖。
[0033] 圖3 :樣本3的檢測結果圖。
[0034] 圖4 :樣本4的檢測結果圖。
[0035] 圖5 :樣本5的檢測結果圖。
[0036] 圖6 :樣本6的檢測結果圖。
[0037] 圖7為正常PCR-RFLP檢測的膠圖：Ac 11酶切，如果是純合突變（ATT)，則只有 295bp條帶；如果是雜合突變（GTT/ATT)，則有295bp，191bp，104bp三條帶；如果是野生型 (GTT)，則有 104bp，191bp 兩條帶。
[0038] 圖8為異常的PCR-RFLP檢測圖：野生型兩條帶沒有問題，而雜合型只有兩條帶，所 以不能準確判定結果。

【具體實施方式】
[0039] 下面結合具體實施例和附圖，進一步闡述本發(fā)明。應當注意的是，實施例中未說明 的常規(guī)條件和方法，通常按照所屬領域?qū)嶒炄藛T常規(guī)采用方法：譬如，奧斯柏和金斯頓主編 的《精編分子生物學實驗指南》第四版，或者按照制造廠商所建議的步驟和條件。
[0040] 實施例1
[0041] 檢測CX3CR1基因V249I突變位點的引物，包括：擴增CX3CR1基因V249I突變位點 的正向引物；其喊基序列為：
[0042] V249I-F ：GAGTTATTGCTACTTCAGAA
[0043] V249I-R :GTAAAGGTATCTTCTGAACT。
[0044] 優(yōu)選地，所述引物還包括正向測序引物，其堿基序列為
[0045] V249I-S-F :GAGTTATTGCTACTTCAGAA。
[0046] 在檢測中，先利用上述正、反向引物對CX3CR1基因V249I突變位點進行擴增，獲得 擴增產(chǎn)物，然后利用上述正向測序引物對擴增產(chǎn)物進行測序，獲得擴增產(chǎn)物的基因序列。
[0047] 檢測CX3CR1基因V249I突變位點的試劑盒，包括：樣本DNA抽提試劑（例如使用 天根生物的試劑盒來抽提樣本DNA);無水乙醇；檢測體系PCR反應液、測序體系反應液、陽 性對照品、陰性對照品和空白對照品，其中
[0048] 檢測體系 PCR 反應液包括：2XPCR Buffer ;2mM dNTPs ;K0D FX DNA Polymerase(lU/y 1);擴增 CX3CR1 基因 V249I 突變位點的正、反向引物 V249I-F(10ym)、 V249I-R(10ym)。
[0049] 測序體系反應液包括：測序純化液、EDTA (125mmol)、無水乙醇、75 %乙醇、 HIDI (高度去離子甲酰胺）、測序引物：V249I-S-F (3. 2 μ m),以及Bigdye Terminator V3. 1 (購買自美國Applied Biosystems公司），其中測序純化液包括奸堿性磷酸酶 (SAP) 0· 6U 和核酸外切酶 I (ΕΧ0ΝΙ) 1. 2U。
[0050] 檢測體系PCR反應液試劑配制如下：
[0051]

【權利要求】
1. 檢測CX3CR1基因V249I突變位點的引物，其特征在于，包括：擴增CX3CR1基因V249I 突變位點的正、反向引物；其堿基序列為： V249I-F ：GAGTTATTGCTACTTCAGAA V249I-R :GTAAAGGTATCTTCTGAACT。
2. 如權利要求1所述的引物，其特征在于，所述引物還包括正向測序引物，其堿基序列 為： V249I-S-F :GAGTTATTGCTACTTCAGAA。
3. 如權利要求1至2之一所述的引物，其特征在于，所述正、反向引物的使用濃度比為： V249I-F : V249I-R=l:l〇
4. 如權利要求1至2之一所述的引物，其特征在于，所述正向測序引物V249I-S-F的使 用濃度3. 2uM。
5. 如權利要求1所述的引物，其特征在于，所述正、反向擴增引物的擴增反應條件為： 第一階段，95 °C預變性lOmin;第二階段，變性溫度94 °C 30sec，退火溫度58 °C 90sec， 延伸溫度72 °C 3〇sec，循環(huán)35次，第三階段，72 °C lOmin;第四階段，擴增反應結束，擴增 產(chǎn)物在4 °C下保存。
6. -種檢測CX3CR1基因V249I突變位點的方法，其包括如下步驟： (1)提取樣本DNA ; ⑵利用一對擴增引物V249I-F和V249I-R對（1)中的DNA進行擴增，獲得擴增產(chǎn)物； (3) 利用正向測序引物V249I-S-F對（2)中的擴增產(chǎn)物進行測序，獲得所述擴增產(chǎn)物的 基因序列； (4) 將（3)中的基因序列與CX3CR1基因野生型參考序列CX3CRl-ref進行比較，確定突 變位點是否存在，其特征在于， V249I-F ：GAGTTATTGCTACTTCAGAA V249I-R ：GTAAAGGTATCTTCTGAACT V249I-S-F :GAGTTATTGCTACTTCAGAA。
7. 如權利要求6所述的方法，其特征在于，步驟（2)的擴增反應條件為：第一階段，95 °C預變性lOmin;第二階段，變性溫度94 °C 30sec，退火溫度64 °C 90sec，延伸溫度72 °C 3〇sec，循環(huán)35次；第三階段，72 °C lOmin;第四階段，擴增反應結束，擴增產(chǎn)物在4 °C 下保存。
【文檔編號】C12N15/11GK104195234SQ201410366629
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2014年7月29日 優(yōu)先權日:2014年7月29日
【發(fā)明者】王淑一, 陳奕磊, 林筱劍 申請人:杭州艾迪康醫(yī)學檢驗中心有限公司