鞘氨醇單胞菌的蝦青素合成酶及其編碼基因和鞘氨醇單胞菌遺傳操作的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了鞘氨醇單胞菌的蝦青素合成酶及其編碼基因和鞘氨醇單胞菌遺傳操作的方法。本發(fā)明證實鞘氨醇單胞菌可以產(chǎn)生蝦青素，含有能夠產(chǎn)生蝦青素的生物合成途徑，發(fā)現(xiàn)鞘氨醇單胞菌中通過MEP途徑和類胡蘿卜素合成途徑生成蝦青素；并進一步證明該菌株中存在與現(xiàn)有已知基因同源性較低的crtE、crtZ基因在合成蝦青素中的功能。本發(fā)明公開的鞘氨醇單胞菌的蝦青素生物合成途徑所需的酶及其編碼基因現(xiàn)有技術(shù)均未報道，為生物合成代謝改造類胡蘿卜素提供更多資源。鞘氨醇單胞菌可以以pBBR1MCS2為載體、EGFP為報告基因進行遺傳操作，為這類環(huán)境微生物的遺傳改造及降解機制的發(fā)現(xiàn)建立了基礎(chǔ)。
【專利說明】鞘氨醇單胞菌的蝦青素合成酶及其編碼基因和鞘氨醇單胞 菌遺傳操作的方法
[0001]

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002] 本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及鞘氨醇單胞菌的蝦青素生物合成酶及其編碼 基因，及在鞘氨醇單胞菌中進行遺傳操作的方法。

【背景技術(shù)】
[0003] 蝦青素（Astaxanthin，又稱變胞藻黃素或蝦紅素)，屬于酮式類胡蘿卜素，是一種 較強的天然抗氧化劑。其獨特的分子結(jié)構(gòu)不但使其具有超強的抗氧化活性，還具有抗衰老、 抗輻射、抗腫瘤及預(yù)防心腦血管疾病的作用。目前，蝦青素已在食品、飼料、保健品市場等 廣泛應(yīng)用。然而天然蝦青素的來源非常有限，目前，蝦青素大多采用傳統(tǒng)突變技術(shù)產(chǎn)生的 Pfaffia菌株和微藻生產(chǎn)，但是，Pfaffia發(fā)酵存在發(fā)酵周期長的缺點，而從藻類中獲得產(chǎn)物 的生產(chǎn)技術(shù)仍不成熟。因此，開發(fā)新的天然蝦青素資源具有重要意義。
[0004] 鞘氨醇單胞菌是革蘭氏陰性菌，1990年被鑒定，專性需氧，以單側(cè)生極性鞭毛運 動，多呈黃色。其黃色菌落多是由于產(chǎn)生類胡蘿卜素導(dǎo)致。細胞膜與一般的革蘭氏陰性菌 不同，為鞘糖脂，這也使得對其的遺傳操作還未成熟。目前，在ATCC 55669 中尚無任何基因方面的信息報道，也未有相關(guān)遺傳操作的文獻，即使是該菌株所在的屬也 鮮有報道。目前，鞘氨醇單胞菌多可降解多元化的芳環(huán)化合物，是環(huán)境微生物的研究熱點， 其遺傳操作的建立為進一步利用其降解機制建立了基礎(chǔ)。
[0005] 蝦青素生物合成途徑已被廣泛研究并取得了巨大進展，大量關(guān)鍵酶基因得到克 隆。目前已知的類胡蘿卜素均通過類異戊二烯化合物或萜類化合物途徑合成。其中，非甲 輕戊酸途徑MEP (nonmevalonate pathway)途徑廣泛存在于細菌中，它以糖酵解中間代謝 物丙酮酸和3-磷酸甘油醛為前體，在脫氧木酮糖磷酸合酶作用下生成脫氧木酮糖磷酸，然 后受脫氧木酮糖磷酸還原酶和異構(gòu)酶催化，通過還原和異構(gòu)反應(yīng)將脫氧木酮糖磷酸轉(zhuǎn)變成 2-甲基赤蘚糖醇-4-磷酸（MEP)。經(jīng)胞苷三磷酸活化，腺苷三磷酸磷酸化，從而形成甲基赤 蘚糖醇環(huán)化焦磷酸，然后轉(zhuǎn)變成IPP (異戊烯焦磷酸)，IPP異構(gòu)化形成DMAPP (二甲基丙烯 基二磷酸)。IPP和DMAPP是合成蝦青素途徑的前體物質(zhì)。兩者在IPP異構(gòu)酶作用下相互轉(zhuǎn) 換達到平衡，在crtE (櫳牛兒基櫳牛兒基焦磷酸合成酶）作用下，1個DMAPP與3個IPP分 子縮合生成GGPP (櫳牛兒基櫳牛兒基焦磷酸)。2分子GGPP在crtB (八氫番茄紅素合成酶） 作用下形成第一個無色的類胡蘿卜素--八氫番茄紅素。八氫番茄紅素經(jīng)過連續(xù)的脫氫步 驟（crtl)生成番茄紅素。番茄紅素在crtY (番茄紅素 β-環(huán)化酶)的作用下生成β-胡蘿 卜素 。β -胡蘿卜素在crtZ ( β -胡蘿卜素羥化酶)和crtW ( β -胡蘿卜素酮酶)的一系列 作用下生成蝦青素(如圖1)。
[0006] 通過豐富不同來源的蝦青素生物合成相關(guān)基因，經(jīng)重組DNA技術(shù)篩選，從而增加 蝦青素生物合成的生產(chǎn)能力，是縮短發(fā)酵周期，提高蝦青素生物合成產(chǎn)率的重要途徑，從而 為蝦青素進一步工業(yè)化生產(chǎn)打下基礎(chǔ)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于提供鞘氨醇單胞菌的蝦青素生物合成途徑所需的酶，以及這些 酶的編碼基因。此外，本發(fā)明還提供一種在鞘氨醇單胞菌中進行遺傳操作的方法。
[0008] 本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)： 本發(fā)明通過對鞘氨醇單胞菌的提取產(chǎn)物進行檢測，證實鞘氨醇單胞菌可以產(chǎn)生蝦青 素，含有能夠產(chǎn)生蝦青素的生物合成途徑。將鞘氨醇單胞菌基因組信息在NCBI Blastp中 進行比對，發(fā)現(xiàn)鞘氨醇單胞菌中存在MEP途徑，該途徑從丙酮酸經(jīng)t/xs，t/xr， /沙"合成IPP和DMAPP ; IPP和DMAPP經(jīng)類胡蘿卜素合成途徑通過cr仿，cri凡cri/， cr ? 7, cr iZ，cr i/f生成蝦青素。在鞘氨醇單胞菌合成蝦青素的這條線性通路中，所得基因除 crii?，criZ，其他基因均為唯一，并進一步證實了與現(xiàn)有已知基因同源性較低的crii?、criZ 基因具有相應(yīng)的功能。
[0009] 鞘氨醇單胞菌的蝦青素生物合成途徑所需的酶為如下一種或多種： 1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶（dxs)，為641個氨基酸組成的蛋白質(zhì)，其氨基酸序 列如SEQ ID NO. 1所示；該1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶的編碼基因為GENE0427,其 核苷酸序列如SEQ ID N0. 2所示； 1- 脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶（dxr)，為386個氨基酸組成的蛋白質(zhì)，其氨 基酸序列如SEQ ID N0. 3所示；該1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶的編碼基因為 GENE0904,其核苷酸序列如SEQ ID N0. 4所示； 4-焦磷酸胞苷酰-2-C-甲基-D-赤蘚糖醇激酶（i spE )，為277個氨基酸組成的蛋白質(zhì)， 其氨基酸序列如SEQ ID N0. 5所示；該4-焦磷酸胞苷酰-2-C-甲基-D-赤蘚糖醇激酶的編 碼基因為GENE0171，其核苷酸序列如SEQ ID N0. 6所示； 2- C-甲基-D-赤蘚糖醇-胞苷酰轉(zhuǎn)移酶和2-C-甲基-D-赤蘚糖醇2, 4-環(huán)二磷酸合 酶（ispD& ispF)(在鞘氨醇單胞菌中為一個合酶)，為345個氨基酸組成的一個蛋白質(zhì)，其 氨基酸序列如SEQ ID N0. 7所示；該合酶的編碼基因為GENE0666,其核苷酸序列如SEQ ID NO. 8所示； (E)-4-羥基-3-甲基-2- 丁烯-二磷酸合酶（ispG)，為378個氨基酸組成的蛋白質(zhì)， 其氨基酸序列如SEQ ID N0. 9所示；該（E) -4-羥基-3-甲基-2- 丁烯-二磷酸合酶的編碼 基因為GENE3357,其核苷酸序列如SEQ ID N0. 10所示； 4-羥基-3-甲基-2- 丁烯-二磷酸還原酶（ispH)，為323個氨基酸組成的蛋白質(zhì)，其 氨基酸序列如SEQ ID N0. 11所示；該4-羥基-3-甲基-2- 丁烯-二磷酸還原酶的編碼基 因為GENE1218,其核苷酸序列如SEQ ID N0. 12所示； GGPP合成酶（crtE)，為296個氨基酸組成的蛋白質(zhì)，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 13所 示；該GGPP合成酶的編碼基因為GENE3518,其核苷酸序列如SEQ ID NO. 14所示； 八氫番茄紅素合成酶（crtB)，為316個氨基酸組成的蛋白質(zhì)，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 15所示；該八氫番茄紅素合成酶的編碼基因為GENE3077,其核苷酸序列如SEQ ID Ν0· 16所示； 八氫番茄紅素脫氫酶（crtl)，為491個氨基酸組成的蛋白質(zhì)，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 17所示；該八氫番茄紅素脫氫酶的編碼基因為GENE3193,其核苷酸序列如SEQ ID NO. 18所示； 番茄紅素 β -環(huán)化酶（crtY)，為388個氨基酸組成的蛋白質(zhì)，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 19所示；該番茄紅素 β-環(huán)化酶的編碼基因為GENE3194,其核苷酸序列如SEQ ID NO. 20所示； β -胡蘿卜素羥化酶（crtZ)，為172個氨基酸組成的蛋白質(zhì)，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 21所示；該β -胡蘿卜素羥化酶的編碼基因為GENE2930,其核苷酸序列如SEQ ID NO. 22所示；或β -胡蘿卜素羥化酶（crtZ)，為155個氨基酸組成的蛋白質(zhì)，其氨基酸序列 如SEQ ID NO. 23所示；該β -胡蘿卜素羥化酶的編碼基因為GENE1181，其核苷酸序列如 SEQ ID NO. 24 所示； β-胡蘿卜素酮酶（crtW)，為238個氨基酸組成的蛋白質(zhì)，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 25所示；該β -胡蘿卜素酮酶的編碼基因為GENE1182,其核苷酸序列如SEQ ID NO. 26 所示。
[0010] 上述鞘氨醇單胞菌的蝦青素生物合成途徑所需的酶或其編碼基因在生產(chǎn)蝦青素 中的應(yīng)用。
[0011] 一種生產(chǎn)蝦青素的方法，包括如下步驟：將產(chǎn)蝦青素質(zhì)粒中的蝦青素生物合成途 徑所需的酶的基因替換為上述相應(yīng)的酶的編碼基因；再將基因替換后的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿 菌中,通過誘導(dǎo)表達生產(chǎn)蝦青素。
[0012] 優(yōu)選的，一種生產(chǎn)蝦青素的方法，包括如下步驟：將產(chǎn)蝦青素質(zhì)粒中的cr仿基因 或criZ基因替換為上述GGPP合成酶或β -胡蘿卜素羥化酶的編碼基因；再將基因替換后 的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，通過誘導(dǎo)表達生產(chǎn)蝦青素。所述的產(chǎn)蝦青素質(zhì)粒優(yōu)選為PFZ153。
[0013] 一種在鞘氨醇單胞菌中進行遺傳操作的方法，所用載體為PBBR1MCS2,報告基因為 EGFP (加強型綠色熒光蛋白）。
[0014] 本發(fā)明具有如下優(yōu)點和效果： 本發(fā)明證實鞘氨醇單胞菌可以產(chǎn)生蝦青素，含有能夠產(chǎn)生蝦青素的生物合成途徑；發(fā) 現(xiàn)鞘氨醇單胞菌中通過ΜΕΡ途徑和類胡蘿卜素合成途徑生成蝦青素。在鞘氨醇單胞菌合 成蝦青素的這條線性通路中，所得基因除其他基因均為唯一，并進一步證實 了與現(xiàn)有已知基因同源性較低（GENE3518基因與目前已知cr仿基因的同源性低于30%， GENE2930和GENE1181與目前已知criZ基因的同源性約為60%)的cr仿、criZ基因具有相 應(yīng)的功能。
[0015] 鞘氨醇單胞菌的蝦青素生物合成途徑所需的酶及其編碼基因現(xiàn)有技術(shù)均未報道， 豐富了細菌生物合成類胡蘿卜素的基因多樣性，并為生物合成代謝改造類胡蘿卜素提供更 多資源。
[0016] 本發(fā)明提出了首次在ATCC 55669進行遺傳操作的方法，為這類環(huán) 境微生物的遺傳改造及降解機制的發(fā)現(xiàn)建立了基礎(chǔ)。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0017] 圖1是蝦青素合成路線圖。
[0018] 圖2是LC-MS檢測ATCC 55669中蟲下青素結(jié)果。
[0019] 圖3是pFZ153質(zhì)粒圖譜。
[0020] 圖4是pTM3518質(zhì)粒圖譜。
[0021] 圖5是pTM2930質(zhì)粒圖譜。
[0022] 圖6是pTM1181質(zhì)粒圖譜。
[0023] 圖7是HPLC檢測轉(zhuǎn)化不同質(zhì)粒的MG1655菌株的蝦青素生成；2-5分別是轉(zhuǎn)化 pFZ153、pTM3518、pTM2930和pTM1181的菌株，1是蝦青素標(biāo)準(zhǔn)品（濃度為lppm)。
[0024] 圖8是轉(zhuǎn)化不同質(zhì)粒的MG1655菌株的蝦青素產(chǎn)量對比。
[0025] 圖9是熒光顯微鏡檢測外源EGFP蛋白在ATCC 55669中的表達，（A) 和（B)分別是轉(zhuǎn)化 pBBRlMCS2 和 pTMB2E 質(zhì)粒的 ATCC 55669。

【具體實施方式】
[0026] 以下實施例進一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限制。在不背離 本發(fā)明精神和實質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明 的范圍。
[0027] 除非有特殊說明，本發(fā)明中的寡核苷酸引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合 成；DNA序列測定由蘇州金唯智生物科技有限公司完成；除非特殊說明，本發(fā)明所用限制性 內(nèi)切酶、核酸外切酶、連接酶均購自NEB，DNA片段回收采用OMEGA DNA凝膠回收試劑盒，按 說明書方法操作；PCR純化采用Axygen試劑盒，按說明書方法操作。
[0028] 下述實施例中所用引物見下表。

【權(quán)利要求】
1. 鞘氨醇單胞菌的蝦青素生物合成途徑所需的酶，其特征在于為如下一種或多種： 氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示的1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶，氨基酸序列如 SEQ ID NO. 3所示的1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶，氨基酸序列如SEQ ID NO. 5 所示的4-焦磷酸胞苷酰-2-C-甲基-D-赤蘚糖醇激酶，氨基酸序列如SEQ ID NO. 7所示的 2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-胞苷酰轉(zhuǎn)移酶和2-C-甲基-D-赤蘚糖醇2, 4-環(huán)二磷酸合酶，氨 基酸序列如SEQ ID NO. 9所示的（E) -4-羥基-3-甲基-2- 丁烯-二磷酸合酶，氨基酸序列 如SEQ ID NO. 11所示的4-羥基-3-甲基-2- 丁烯-二磷酸還原酶，氨基酸序列如SEQ ID NO. 13所示的GGPP合成酶，氨基酸序列如SEQ ID NO. 15所示的八氫番茄紅素合成酶，氨基 酸序列如SEQ ID NO. 17所示的八氫番茄紅素脫氫酶，氨基酸序列如SEQ ID NO. 19所示的 番茄紅素 β-環(huán)化酶，氨基酸序列如SEQ ID NO. 21或23所示的β -胡蘿卜素羥化酶，氨 基酸序列如SEQ ID NO. 25所示的β -胡蘿卜素酮酶。
2. 權(quán)利要求1所述的鞘氨醇單胞菌的蝦青素生物合成途徑所需的酶的編碼基因，其特 征在于：所述的1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶編碼基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2 所示；所述的1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶編碼基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所示；所述的4-焦磷酸胞苷酰-2-C-甲基-D-赤蘚糖醇激酶編碼基因的核苷酸序列 如SEQ ID NO. 6所示；所述的2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-胞苷酰轉(zhuǎn)移酶和2-C-甲基-D-赤 蘚糖醇2, 4-環(huán)二磷酸合酶編碼基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 8所示；所述的（E)-4-羥 基-3-甲基-2- 丁烯-二磷酸合酶編碼基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 10所示；所述的 4-羥基-3-甲基-2-丁烯-二磷酸還原酶編碼基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 12所示；所 述的GGPP合成酶編碼基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 14所示；所述的八氫番茄紅素合成 酶編碼基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 16所示；所述的八氫番茄紅素脫氫酶編碼基因的 核苷酸序列如SEQ ID NO. 18所示；所述的番茄紅素 β-環(huán)化酶編碼基因的核苷酸序列如 SEQ ID NO. 20所示；所述的β -胡蘿卜素羥化酶編碼基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 22 或24所示；所述的β -胡蘿卜素酮酶編碼基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 26所示。
3. 權(quán)利要求1所述的酶或權(quán)利要求2所述的編碼基因在生產(chǎn)蝦青素中的應(yīng)用。
4. 一種生產(chǎn)蝦青素的方法，其特征在于包括如下步驟：將產(chǎn)蝦青素質(zhì)粒中的蝦青素生 物合成途徑所需的酶的基因替換為權(quán)利要求2所述的編碼基因；再將基因替換后的質(zhì)粒轉(zhuǎn) 化到大腸桿菌中，通過誘導(dǎo)表達生產(chǎn)蝦青素。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的生產(chǎn)蝦青素的方法，其特征在于包括如下步驟：將產(chǎn)蝦青素 質(zhì)粒中的cr仿基因或criZ基因替換為上述GGPP合成酶或β -胡蘿卜素羥化酶的編碼基 因；再將基因替換后的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，通過誘導(dǎo)表達生產(chǎn)蝦青素。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的生產(chǎn)蝦青素的方法，其特征在于：所述的產(chǎn)蝦青素質(zhì)粒為 PFZ153。
7. -種在鞘氨醇單胞菌中進行遺傳操作的方法，其特征在于：所用載體為PBBR1MCS2， 報告基因為EGFP。
【文檔編號】C12N9/10GK104232595SQ201410447259
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2014年9月3日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月3日
【發(fā)明者】劉天罡, 馬田, 周袁杰, 朱發(fā)銀 申請人:武漢生物技術(shù)研究院, 武漢大學(xué)