一種抑制奶牛EEF1D基因表達(dá)的siRNA及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種抑制奶牛EEF1D基因表達(dá)的siRNA及其應(yīng)用,該siRNA能有效降低奶牛EEF1D基因的表達(dá)量。本發(fā)明公開一種siRNA分子，由SEQ ID No.7所示的正義鏈和SEQ ID No.8所示的反義鏈退火而成。利用本發(fā)明公開的siRNA構(gòu)建的shRNA慢病毒表達(dá)載體，可進(jìn)一步獲得高滴度的慢病毒顆粒，可用于EEF1D基因?qū)Ξa(chǎn)奶性狀和其他基因的影響的研究。
【專利說(shuō)明】-種抑制奶牛EEF1D基因表達(dá)的s i RNA及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種抑制奶牛EEFlD基因表達(dá)的siRNA及其應(yīng)用，屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002] EEFlD基因編碼翻譯延伸因子1復(fù)合物的eEFIB δ亞基，參與調(diào)控真核生物的 翻譯延伸，位于奶牛的ΒΤΑ14上，落在一個(gè)已知與乳脂量（EBV)相關(guān)的QTL(Id:10455 ; Chrl4:0-7219780)區(qū)間內(nèi)。哺乳動(dòng)物的翻譯延伸因子1復(fù)合物由（Sourd等，2006) eEFlA(對(duì)應(yīng)細(xì)菌中的EF-Tu)和eEFlB(對(duì)應(yīng)細(xì)菌中的EF-Ts)兩部分組成，eEFIB在復(fù) 合物發(fā)揮鳥噪呤核苷酸轉(zhuǎn)換因子（guanine nucleotide exchange factor，GEF)的作用 (Janssen 等，1988 ;Pittman 等，2006), eEFIB 包括一個(gè)結(jié)構(gòu)亞基（eEFIB γ )和 2 個(gè)催化亞 基（eEFIB a，eEFIB δ )。eEFIB δ，起源于eEFIB α的重復(fù)并具有一個(gè)獨(dú)特的亮氨酸拉鏈結(jié) 構(gòu)（Amons等，1994 ;Minella等，1996 ;Guerrucci等，1999)，提示其可能與其他蛋白存在相 互作用。研究證明，eEFIB δ可以被絲氨酸/蘇氨酸激酶磷酸化，例如蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)，多能 S6 激酶（multipotential S6kinase，S6K)，細(xì)胞周期依賴性激酶 l(cyclin_dependent kinase 1，CDKl)和酪氨酸激酶 2 (casein kinase II，CK2)，從而影 響其 GEF 活性和翻譯延伸率（Venema 等，1991 ;Mulner_Lorillon 等，1994 ;Chang 等，1998 ; Sivan 等，2011)。另外，eEFIB δ 能抑制 E3activity of SIAH-I 的 E3 活性，從而抑制 SIAH-I 和其底物的降解（Wu等，2011)，進(jìn)而影響SIAH-I的生物功能，包括：細(xì)胞周期調(diào)控，腫瘤和 神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生（Roperch等，1999)。在一些人和小鼠癌化和腫瘤細(xì)胞及病灶中， 可發(fā)現(xiàn)該基因的高表達(dá)特征，說(shuō)明其與細(xì)胞癌化存在聯(lián)系。綜上可見，eEFIBS除了具有 基本的翻譯因子的功能外，還與其它基因和生理現(xiàn)象有聯(lián)系。陸黎敏研究發(fā)現(xiàn)人為改變體 外培養(yǎng)的牛乳腺上皮細(xì)胞中eEFIB的表達(dá)量后β -酪蛋白量改變，并應(yīng)用細(xì)胞免疫沉淀和 GST-pull down技術(shù)并聯(lián)合質(zhì)譜鑒定與eEFIB相互作用的蛋白有14_3_3theta、Heat shock protein、 eEFlAl、 Small nuclear ribonucleoprotein polypeptide A 和 40S ribosomal protein S4(陸黎敏，2013)。
[0003] RNAi (RNA interference)技術(shù)即基于機(jī)體對(duì)外源雙鏈RNA具有抵抗機(jī)制的 原理，通過人工向細(xì)胞或機(jī)體內(nèi)導(dǎo)入短的雙鏈RNA (siRNA)，可以使其靶基因在轉(zhuǎn)錄后 被降解，從而在轉(zhuǎn)錄后降低或完全沉默目的基因的表達(dá)，現(xiàn)已成為基因功能研究中最重 要的工具（Bosher等，2000 ;Meins等，2000)。RNA干涉的作用機(jī)理如下：Dicer酶可在 Argonaute蛋白的存在下特異性識(shí)別dsRNA，將長(zhǎng)的dsRNA切割成21-23nt的dsRNA分 子：microRNAs(miRNA)或 small interfering RNAs (siRNA) ;siRNA 進(jìn)入機(jī)體后，被 Dicer 轉(zhuǎn)運(yùn)到 RISC(RNA_induced silence complex), RISC 激活；其保留 siRNA 的反義鏈，識(shí)別 互補(bǔ)mRNA并結(jié)合，隨后，RISC上的Dicer將mRNA降解，沉默基因的表達(dá)。siRNA是誘發(fā) RNAi的基本單位，RNAi可采用化學(xué)方法合成siRNA用于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的研究，并可在siRNA末 端加上保護(hù)或者熒光基團(tuán)，用于提高siRNA穩(wěn)定作用時(shí)間和追蹤目的基因表達(dá)位置。隨 后，出現(xiàn)了 siRNA的表達(dá)載體，在載體上構(gòu)建了 pol III啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄終止序列，中間插入 shRNA(small hairpin RNA)的DNA序列,轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在細(xì)胞內(nèi)被剪切成siRNA分子。相對(duì)于 導(dǎo)入siRNA片段，siRNA表達(dá)載體可以在導(dǎo)入細(xì)胞中發(fā)揮長(zhǎng)期的沉默作用。RNAi技術(shù)具有 操作簡(jiǎn)單、成本低、周期短、效率高的特點(diǎn)，應(yīng)用前景廣闊，適用于基因沉默后的功能分析。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種抑制奶牛EEFlD基因表達(dá)的SiRNA及其應(yīng)用，該SiRNA 能有效降低奶牛EEFlD基因的表達(dá)量。
[0005] 本發(fā)明提供一種siRNA分子，由SEQ ID No. 7所示的正義鏈和SEQ ID No. 8所示 的反義鏈退火而成；
[0006] 或，由SEQ ID No. 7所示的DNA分子中自5'末端起第1-19位核苷酸所示的序列 與SEQ ID No. 8所示的DNA分子中自5'末端起第1-19位核苷酸所示的序列退火而成。
[0007] 含有所述DNA分子的重組慢病毒表達(dá)載體也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0008] 上述重組慢病毒表達(dá)載體中，所述重組慢病毒表達(dá)載體是將上述DNA分子插入穿 梭質(zhì)粒的BamHI和EcoR I位點(diǎn)間得到。
[0009] 上述任一所述的重組慢病毒表達(dá)載體中，所述穿梭質(zhì)粒為L(zhǎng)V3質(zhì)粒。
[0010] 一種慢病毒也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍，是將上述任一所述的重組慢病毒表達(dá)載體 和病毒包裝系統(tǒng)共轉(zhuǎn)染病毒包裝細(xì)胞得到。
[0011] 上述慢病毒中，所述病毒包裝系統(tǒng)含有pGag/Pol，PRev和PVSV-G ;
[0012] 所述病毒包裝細(xì)胞為293T細(xì)胞。
[0013] 一種抑制牛EEFlD基因表達(dá)的方法也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍，是將上述siRNA分 子轉(zhuǎn)染表達(dá)牛EEFlD基因的細(xì)胞；
[0014] 所述細(xì)胞具體為牛成纖維細(xì)胞；
[0015] 或，
[0016] 用上述慢病毒轉(zhuǎn)染表達(dá)牛EEFlD基因的細(xì)胞；
[0017] 所述表達(dá)牛EEFlD基因的細(xì)胞具體為表達(dá)外源牛EEFlD基因的細(xì)胞或內(nèi)源表達(dá)牛 EEFlD基因的細(xì)胞；
[0018] 所述表達(dá)外源牛EEFlD基因的細(xì)胞具體是將pEGFP-Cl-EEFID質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293FT細(xì) 胞得到；
[0019] 所述內(nèi)源表達(dá)牛EEFlD基因的細(xì)胞具體為牛乳腺上皮細(xì)胞；
[0020] 所述牛具體為奶牛。
[0021] 上述siRNA分子、上述DNA分子、上述任一所述的重組慢病毒表達(dá)載體、上述慢病 毒在制備抑制牛EEFlD基因表達(dá)的產(chǎn)品中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0022] 上述siRNA分子、上述DNA分子、上述任一所述的重組慢病毒表達(dá)載體、上述慢病 毒在制備檢測(cè)牛EEFlD基因?qū)ε．a(chǎn)奶性狀的影響的產(chǎn)品中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范 圍。
[0023] 上述任一所述的應(yīng)用中，所述牛為奶牛。
[0024] 利用本發(fā)明構(gòu)建的ShRNA慢病毒表達(dá)載體，在特定包裝質(zhì)粒和條件下，可獲得高 滴度轉(zhuǎn)染顆粒，用于EEFlD基因?qū)Ξa(chǎn)奶性狀和其他基因的影響的研究。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0025] 圖1為siRNA在牛成纖維細(xì)胞中的干擾效果。
[0026] 圖2為shRNA慢病毒顆粒轉(zhuǎn)染表達(dá)牛EEFlD基因的293FT細(xì)胞后EEFlD mRNA表 達(dá)量。
[0027] 圖3為慢病毒顆粒轉(zhuǎn)染乳腺上皮細(xì)胞后120h的轉(zhuǎn)染效率。
[0028] 圖4為shRNA慢病毒顆粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染BMEC后EEFlD mRNA表達(dá)量。

【具體實(shí)施方式】
[0029] 下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。
[0030] 下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0031] 牛成纖維細(xì)胞在文獻(xiàn)"謝巖.奶牛產(chǎn)奶性狀候選基因 EEFlD和TOE9A功用驗(yàn)證 [D].北京，中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)，2013"中公開過，公眾可從中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得。
[0032] LV3質(zhì)粒購(gòu)自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為C06003。
[0033] pGag/Pol，pRev，pVSV-G均購(gòu)自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司。
[0034] pEGFP-Cl-EEFID質(zhì)粒在文獻(xiàn)"謝巖.奶牛產(chǎn)奶性狀候選基因 EEFlD和TOE9A功用 驗(yàn)證[D].北京，中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)，2013"中公開過，公眾可從中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得。
[0035] 293T細(xì)胞購(gòu)自行知生物科技有限公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為AA-CELL-122。
[0036] 293FT細(xì)胞購(gòu)自北京康碧泉生物科技有限公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為KX0000005。
[0037] DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco,產(chǎn)品目錄號(hào)為C11995500BT。
[0038] DMEM/DF12培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco,產(chǎn)品目錄號(hào)為C11330500BT。
[0039] 胎牛血清（FBS)購(gòu)自Gibco,產(chǎn)品目錄號(hào)為10099-141。
[0040] 100X青鏈霉素（雙抗）購(gòu)自Gibco,產(chǎn)品目錄號(hào)為15140-122。
[0041] Opti-MEM I Reduced serum medium 購(gòu)自 Gibco,產(chǎn)品目錄號(hào)為 31985-070。
[0042] Lipofectamine ? 2000 購(gòu)自 Invitrogen，產(chǎn)品目錄號(hào)為 11668-019。
[0043] Polybrene 購(gòu)自 Sigma，產(chǎn)品目錄號(hào)為 H9268-1G。
[0044] 牛乳腺上皮細(xì)胞（BMEC)在文獻(xiàn)"謝巖.奶牛產(chǎn)奶性狀候選基因 EEFlD和TOE9A功 用驗(yàn)證[D].北京，中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)，2013"中公開過，公眾可從中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得。
[0045] 實(shí)施例1、有效沉默牛EEFlD基因的siRNA設(shè)計(jì)及篩選
[0046] 一、siRNA序列的設(shè)計(jì)與合成
[0047] 針對(duì)牛的EEFlD基因 mRNA序列確定4個(gè)siRNA靶位點(diǎn)，由此確定相應(yīng)的siRNA序 列（如表1所示），每條序列包含正義鏈和與之互補(bǔ)的反義鏈，長(zhǎng)度均為21nt。
[0048] 表 IEEFlD 的 siRNA 序列
[0049]

【權(quán)利要求】
1. 一種siRNA分子，由SEQ ID No. 7所示的正義鏈和SEQ ID No. 8所示的反義鏈退火 而成。
2. -種DNA分子，由SEQ ID No. 13和SEQ ID No. 14所示的DNA分子退火而成。
3. 含有權(quán)利要求2所述DNA分子的重組慢病毒表達(dá)載體。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組慢病毒表達(dá)載體，其特征在于：所述重組慢病毒表達(dá)載 體是將權(quán)利要求2所述的DNA分子插入穿梭質(zhì)粒的BamHI和EcoR I位點(diǎn)間得到。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的重組慢病毒表達(dá)載體，其特征在于：所述穿梭質(zhì)粒為L(zhǎng)V3 質(zhì)粒。
6. -種慢病毒，是將權(quán)利要求3-5任一所述的重組慢病毒表達(dá)載體和病毒包裝系統(tǒng)共 轉(zhuǎn)染病毒包裝細(xì)胞得到。
7. -種抑制牛EEF1D基因表達(dá)的方法，是將權(quán)利要求1所述的siRNA分子轉(zhuǎn)染表達(dá)牛 EEF1D基因的細(xì)胞； 或， 用權(quán)利要求6所述的慢病毒轉(zhuǎn)染表達(dá)牛EEF1D基因的細(xì)胞。
8. 權(quán)利要求1所述的siRNA分子、權(quán)利要求2所述的DNA分子、權(quán)利要求3-5任一所述 的重組慢病毒表達(dá)載體、權(quán)利要求6所述的慢病毒在制備抑制牛EEF1D基因表達(dá)的產(chǎn)品中 的應(yīng)用。
9. 權(quán)利要求1所述的siRNA分子、權(quán)利要求2所述的DNA分子、權(quán)利要求3-5任一所述 的重組慢病毒表達(dá)載體、權(quán)利要求6所述的慢病毒在制備檢測(cè)牛EEF1D基因?qū)ε．a(chǎn)奶性狀 的影響的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
10. 根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的應(yīng)用，其特征在于：所述牛為奶牛。
【文檔編號(hào)】C12N7/01GK104293787SQ201410474752
【公開日】2015年1月21日 申請(qǐng)日期:2014年9月17日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月17日
【發(fā)明者】孫東曉, 謝巖 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)