根癌農(nóng)桿菌中銻氧化酶基因sboA的功能鑒定的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于細(xì)菌基因工程領(lǐng)域，涉及一種根癌農(nóng)桿菌中銻氧化酶基因的功能鑒定。通過基因敲除、銻生長氧化實驗以及異源表達(dá)等方法，分離、克隆了一種來源于根癌農(nóng)桿菌GW4中的銻氧化酶基因sboA。該基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，其編碼的蛋白質(zhì)序列如SEQ ID NO：2所示。該基因編碼的酶能催化毒性強的三價銻[Sb(III)]氧化至毒性弱的五價銻[Sb(V)]，具有應(yīng)用于環(huán)境銻污染凈化的潛能。該基因包含在原核表達(dá)載體中，含有該質(zhì)粒的大腸桿菌BL21/pET28a-sboA，保藏在CCTCC，保藏號為CCTCC NO：2014437。CCTCC NO：M20144372014.09.22
【專利說明】根癌農(nóng)桿菌中銻氧化酶基因sboA的功能鑒定

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于細(xì)菌基因工程領(lǐng)域，涉及一種根癌農(nóng)桿菌GW4中銻氧化酶基因的功 能鑒定。通過基因敲除、銻生長氧化實驗以及異源表達(dá)等方法，分離、克隆了一個來源于 根癌農(nóng)桿菌GW4中的新型銻氧化酶基因sboA。該基因編碼的酶催化毒性較強的三價銻 [Sb(III)]氧化至毒性較弱的五價銻[Sb(V)],具有應(yīng)用于環(huán)境銻污染凈化的潛能。

【背景技術(shù)】
[0002] 銻（Antimony，Sb)是一種劇毒的重金屬元素，位于元素周期表中第5周期VA 族，廣泛分布于巖石、大氣、土壤沉積物及水體中。其無機形態(tài)主要以單質(zhì)銻[Sb(0)]、 三價銻[Sb(III)]和五價銻[Sb(V)]的形態(tài)存在，有機形態(tài)主要為三甲基銻化合物（何 孟常等，2004)。銻的毒理性質(zhì)與砷相似但毒性遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于砷，且無機銻的毒性強于有機 鋪，Sb(III)的毒性強于 Sb(V) (Smichowski P. Antimony in the environment as a global pollutant:Areview on analytical methodologies for its determination in atmosphericaerosols. Talanta，2008, 75:2)。人類長期接觸鍵可造成皮膚、上呼吸道、心、 肝、肺等組織明顯損害，最終導(dǎo)致機體的癌變（Shotyk W，Krachler A. Contamination of bottled waters with antimony leaching from polyethylene terephthalate(PET) increases upon storage. Environ Sci Technol，2007, 41:1560-1563)。鍵的用途廣泛， 包括生產(chǎn)陶瓷、玻璃、合金、電池、油漆、煙火材料及阻燃劑等，還可用來治療各種寄生蟲病。 但隨著我國經(jīng)濟的迅猛發(fā)展，人民生活水平提高的同時，也對環(huán)境造成了極大的污染。工 業(yè)"三廢"、機動車尾氣的排放、污水灌溉和農(nóng)藥、除草劑、化肥等的使用以及礦業(yè)的發(fā)展， 使大量的銻及其化合物進入到大氣、水和土壤，并最終進入動植物及人體中。據(jù)國際癌癥 研究署（IARC)報道，充分的證據(jù)表明Sb(III)對環(huán)境中的動物有致癌作用（IARC. Some organic solvents,resin monomers and related compounds, pigments and occupational exposures in paint manufacture and painting. Lyon: IARC，1989. 291-305) 〇 由于鍵的 毒性和生物有效性，銻及其化合物被美國環(huán)保局及歐盟列為優(yōu)先污染物，日本環(huán)境廳也將 其列為密切關(guān)注的污染物。在巴塞爾公約中關(guān)于危險廢物的越境迀移限定中將銻列為危 險廢物之列（Filella M，Belzile N，Chen Y W. Antimony in the environment:A review focused on natural waters I. Occurrence. EarthSci Rev，2002,57:125-176) 〇
[0003] 雖然銻污染嚴(yán)重威脅人類生命健康，但一些微生物卻對環(huán)境中高濃度銻表現(xiàn)出極 強的適應(yīng)性并在銻的環(huán)境地球循環(huán)中扮演著重要的角色。因此了解微生物的重金屬抗性機 制，研究銻抗性相關(guān)的功能基因有助于我們從基因的水平上了解微生物對重金屬的解毒機 制，并發(fā)現(xiàn)新的重金屬污染修復(fù)方法。為環(huán)境中銻污染的修復(fù)提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)支持，并 更好的認(rèn)識銻元素的環(huán)境地球循環(huán)。
[0004]目前，對細(xì)菌中銻抗性分子機制的研究較少，特別是與銻氧化相關(guān)的分子機制研 究相當(dāng)匱乏。細(xì)菌銻氧化可以將環(huán)境中的Sb(III)轉(zhuǎn)化為毒性較低的Sb(V)，降低環(huán)境毒 性，對環(huán)境銻污染修復(fù)具有重要意義。迄今為止，科研工作者相繼從多個種屬中分離出50 多株鋪氧化菌（Shi Z, Cao Z, Qin D et al. Correlation models between environmental factors and bacterial resistance to antimony and copper.PLoS One, 2013,8:e78533 ； Li J, Wang Q, Zhang S Z, Qin D, Wang G J. Phylogenetic and genome analyses of antimony-oxidizing bacteria isolated from antimony mined soil. Interna Biodeter &Biodegra，2013, 76:76-80)。但目前發(fā)現(xiàn)的銻氧化菌中，存在兩種類型：第一類銻氧化菌既 可以氧化Sb (III)又可以氧化As (III)。2007年Lehr等人發(fā)現(xiàn)根癌農(nóng)桿菌5A為這一類銻 氧化菌的代表。該菌在缺失了砷氧化酶大亞基基因aioA后，Sb (III)氧化僅受到十分微弱 的影響（Lehr CR, Kashyap DR, McDermott TR. New Insights into Microbial Oxidation of Antimony and Arsenic. Appl Environ Microbiol, 2007, 73:2386-2389)。第二類鋪氧 化細(xì)菌中不含砷氧化酶，但也可以氧化Sb(III)。雖然砷和銻位于同一主族，但以上結(jié)果說 明細(xì)菌砷氧化和銻氧化是兩個相對獨立的過程，細(xì)菌內(nèi)應(yīng)該存在與砷氧化酶基因完全不同 的銻氧化酶基因。但目前，還沒有研究發(fā)現(xiàn)特異性的銻氧化酶以及調(diào)控銻氧化過程的功能 基因。
[0005] 因此， 申請人:通過比較蛋白質(zhì)組學(xué)等方法分析找出根癌農(nóng)桿菌GW4(Wang Q, Qin D, Zhang S, et al. Fate of arsenate following arsenite oxidation in Agrobacterium tumefaciens GW4. Environ Microbiol, 2014, doi:10. 1111/1462-2920. 12465)中的鋪氧化 酶基因sboA，并采用基因敲除、生長氧化實驗以及異源表達(dá)等方法鑒定該酶銻氧化的功能。 sboA基因的發(fā)現(xiàn)有利于我們研究銻氧化及抗性的分子機制，填補目前國內(nèi)外對于銻氧化酶 基因研究領(lǐng)域的空白。其異源表達(dá)可以為構(gòu)建基因工程菌修復(fù)環(huán)境中的銻污染提供理論依 據(jù)和技術(shù)支持。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于分離和克隆根癌農(nóng)桿菌GW4中一個編碼Sb(III)氧化酶的基 因sboA，并對其進行功能驗證及應(yīng)用。該基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID. NO: 1中第 1-855位喊基所不的序列；該基因編碼的蛋白質(zhì)序列如SEQ ID N0:2所不。
[0007] 本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實施：
[0008] 申請人:前期工作是以分離自山西省山陰市地下水沉積物中的根癌農(nóng)桿菌 (Agrobacterium tumefaciens) GW4 (參見：Wang Q, Qin D, Zhang S, et al. . Environ M icrobiol, 2014, doi : 10. 1111/1462-2920. 12465)為研究對象，在加 50 μ M Sb (III)和 不加Sb(III)條件下進行比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究。經(jīng)質(zhì)譜測序后發(fā)現(xiàn)，由sboA編碼的 氧化還原酶表達(dá)量上調(diào)。通過比對發(fā)現(xiàn)該基因編碼的蛋白屬于SDR家族，能夠在類 固醇、輔酶因子、碳水化合物、脂類、多元醇、芳香族化合物和氨基酸等的代謝過程中 表現(xiàn)氧化還原表型（Odermatt A and Nashev LG. The glucocorticoid-activating enzyme IIbeta-433hydroxysteroid dehydrogenase type Ihas broad substrate specificity!physiological and toxicological considerations. J. Steroid Biochem. Mol. Biol, 2010, 119:1-13)。而鋪（酒石酸鋪鉀）在水溶液中的水解形式類似于多元醇，因 此推測SboA可能為根癌農(nóng)桿菌GW4中的銻氧化酶，并通過基因敲除、銻生長氧化實驗以及 異源表達(dá)等方法鑒定其銻氧化的功能。
[0009] 本發(fā)明采用敲除載體PJQ200SK(其構(gòu)建見圖1，美國蒙大拿州立大學(xué)，蒂莫 西?麥克德莫特（Timothy R. McDermott)教授惠贈）對sboA基因進行無痕敲除（Link AJ,Phillips D, Church GE Methods for generating precise deletions and insertions in the genome of wild-type Escherichia coli:application to open reading frame characterization. J Bacteriol, 1997, 179:6228-6237)。敲除載體 pJQ-sboA 構(gòu)建過程 如下：根據(jù)菌株GW4中sboA基因序列及其上下游序列，分別設(shè)計上下游同源片段引物 PsboA-lF，如下所示：（5 ' AAATCTAGAGCGGAACATCGGGAATACG3 '）/PsboA-IR (5 ' CATTATC TTCCTTGAATGCGGGGTGGATGGTCGTCATAGGTT3，）和 PsboA-2F (5，CCGCATTCAAGGAAGATAATGC CTATGACATCGTCCAGAACC3，）/PsboA-2R(5，AAAGGATCCTGAATAGCGAGCCAGACCA3，）。通過 cross-over PCR將sboA基因的上下游同源片段連接到一起，再將其與pJQ200SK敲除載體 同時利用BamHI和XbaI進行雙酶切，并連接轉(zhuǎn)化至大腸桿菌（Escherichia coli) S17-1中， 最終成功獲得敲除載體E. coli S17-l/pJQ-sboA。將構(gòu)建好的載體利用雙親本雜交方法轉(zhuǎn) 入野生型根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens)GW4中，通過同源重組使載體單交換插 入到GW4基因組中，最后通過蔗糖致死得到突變株GW4-Λ sboA。通過引物PMsboA-IF ^ A ACAACAGCAGGCGGAGAC3' )/PMsboA-IR(5，CGATGGCGGCAACAAT3')和引物 PMsboA-2F(5， CGCTTTCCGCCTTCTTT3 '）/PMsboA-2R (5 ' CGTACATCGCCGACAAGG3 '）同時擴增 sboA 上下游 同源片段以及基因內(nèi)部片段來驗證敲除成功（見圖3)。
[0010] 敲除成功后，構(gòu)建互補載體pCPP30-sb〇A并驗證互補株表型能否回復(fù)。利用引物C sboA-F (Si AAACTGCAGCGAAACGACGCGAAGGAGAA3; )/CsboA-R(Si AMGGATCCCTGGAGGTTGCCG TGCTTAA3')擴增完整的sboA基因片段，與互補載體pCPP30(見圖2)同時進行PstI-BamHI 雙酶切，再通過T 4連接酶連接后轉(zhuǎn)化至E. coli S17-1中最終獲得互補載體。將互補載體 通過雙親本雜交轉(zhuǎn)化至突變株GW4-Λ sboA中得到互補株GW4-Λ sboA-C，同時將互補載體 通過雙親本雜交轉(zhuǎn)化至野生型GW4中的到超表達(dá)株GW4: : sboA (見圖3)。
[0011]分別將菌株 GW4、GW4- Λ sboA、GW4- Λ SboA-C 和 GW4: : SboA 接種至含有 10 μ M 和 50yMSb(III)的CDM(配方見附錄）培養(yǎng)基中，每隔8h取樣，檢測其生長及氧化情況。利用 紫外分光光度計測定〇D_ (Beckman，DU800)，利用高效液相色譜-氫化物發(fā)生-原子熒光光 譜儀（HPLC-HG-AFS, Beijing Titan Instruments Co. ,Ltd.)測定培養(yǎng)基中的鋪含量。結(jié) 果顯示敲除sboA基因的突變株氧化速率降低了 27%，互補株的表型回復(fù)到野生型水平，而 超標(biāo)達(dá)菌株的氧化速率提高了 34%，說明sboA基因確實影響了菌株的Sb(III)氧化表型 (見圖4)。
[0012] 為了進一步研究sboA的Sb(III)氧化功能，我們通過將互補載體pCPP30_sboA 轉(zhuǎn)入不含該基因的E. coli S17-1中進行異源表達(dá)并檢測其Sb(III)氧化表型。以野生 型E. coli S17-1和轉(zhuǎn)入pCPP30空載體的E. coli S17-l(pCPP30)作為對照。結(jié)果顯示， 雖然E. coli S17-1和轉(zhuǎn)入空載的E. coli S17-l(pCPP30)可以氧化少量Sb(III)，但轉(zhuǎn)入 pCPP30-sboA載體的E.coliS17-l(pCPP30-sboA)的Sb(III)氧化表型明顯加快，說明SboA 確實加快了E.COliS17-l(pCPP30-SbOA)中的銻氧化反應(yīng)，具有催化細(xì)菌Sb(III)氧化的 能力（見圖5)。
[0013] 為深入證實SboA的銻氧化能力，我們通過原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)并純化SboA蛋白， 并在體外檢測其對Sb(III)的氧化能力。利用帶有EcoRI和HindIII酶切位點的引物Es boA-F (5，AAAGAATTCATGACGACCATCCACCCC3，）/EsboA-R(5，AAAAAGCTTCGGCACCCGTAAAAT CTG3)擴增完整的sboA基因片段，并將其與pET-28a(+)表達(dá)載體連接構(gòu)建成重組載體后 (見圖6)，轉(zhuǎn)入表達(dá)菌株即大腸桿菌BL21中。 申請人:將構(gòu)建好的重組的大腸桿菌BL21/ pET28a-sboA，Escherichia coli BL21/pET28a-sboA，于 2014 年 9 月 22 日送至中國.武 漢.武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心（英文簡稱CCTCC)保藏，其保藏號為CCTCC NO: M2014437。
[0014] 大腸桿菌pET28a_sboA的菌學(xué)特征
[0015] 本發(fā)明構(gòu)建的重組大腸桿菌（或稱之為表達(dá)菌株）E.coli BL21/pET28a-sb〇A最 適生長溫度37°C ;為革蘭氏陰性桿菌，周身鞭毛，能運動，無芽孢；具有卡那霉素（Kan)抗 性。
[0016]將重組的表達(dá)菌株 E. coli BL21 (pET28a-sboA)在 37°C培養(yǎng)至 OD6tltl 約為 0· 3-0. 4 時加入0. 2mM IPTG，28°C誘導(dǎo)2h后收集菌體壓力破碎，利用鎳柱結(jié)合帶有His標(biāo)簽的目的 蛋白，再通過不同濃度的咪唑?qū)⒛康牡鞍紫疵撓聛恚罱K成功獲得SboA蛋白。由于SboA在 體外氧化Sb(III)需要一個電子受體，而目前的研究還并未發(fā)現(xiàn)Sb(III)氧化的電子受體， 因此我們將缺失了 sboA基因的突變菌株GW4-AsboA在加IOyM Sb(III)的條件下培養(yǎng) 24h后取細(xì)胞破碎的上清液作為電子受體，加入1 μ M Sb (III)，200 μ M輔酶NADP+和不同 濃度純化后的SboA蛋白，以50mM Tris-HCUpH = 8. 0)作為緩沖體系，28°C孵育0. 5h后通 過高效液相色譜-氫化物發(fā)生-原子熒光光譜儀檢測SboA體外氧化Sb (III)的能力。結(jié) 果表明相比于不加SboA蛋白，加入不同濃度SboA蛋白后Sb(III)氧化能力逐漸增強,證明 SboA在體外具有氧化Sb (III)的能力（見圖7)。
[0017] 本發(fā)明的優(yōu)點如下：
[0018]1.自然界中很多細(xì)菌可以氧化Sb(III)，但迄今為止還未有研究發(fā)現(xiàn)細(xì)菌中的銻 氧化酶基因，本發(fā)明創(chuàng)新點在于首次揭示細(xì)菌中銻氧化酶基因，填補國內(nèi)外關(guān)于細(xì)菌銻氧 化酶研究領(lǐng)域的空白。
[0019] 2.目前我國重金屬污染嚴(yán)重，研究細(xì)菌銻抗性相關(guān)的功能基因有助于我們從基因 的水平上了解微生物對銻的解毒機制，也能使我們更好的認(rèn)識地球上銻元素的物質(zhì)循環(huán)。
[0020] 3.異源表達(dá)SboA可以使E. coli S17-1的Sb(III)氧化速率加快，有利于我們開 發(fā)新的重金屬污染修復(fù)方法，為環(huán)境中銻污染的原位微生物修復(fù)以及基因工程菌的構(gòu)建提 供理論基礎(chǔ)和技術(shù)支持。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0021] 序列表SEQ ID NO :1是本發(fā)明銻氧化酶基因Sb0A的核苷酸序列，序列長度為 855bp (該基因編碼區(qū)為l-855bp，顯示對應(yīng)的氨基酸序列）。
[0022] 序列表SEQ ID NO :2是本發(fā)明銻氧化酶基因sboA編碼的蛋白質(zhì)序列，編碼284個 氨基酸。
[0023] 圖1 :本發(fā)明所使用的敲除載體pJQ200SK-sb〇A示意圖。
[0024] 圖2 :本發(fā)明所使用的互補載體pCPP30_sboA示意圖。
[0025] 圖3 :sboA基因及其周圍基因的不意圖及檢驗PCR結(jié)果。
[0026] 其中：圖3中的A為鋪氧化酶基因sboA及其周圍基因的不意圖。在圖3中的A : B'為sboA基因及其上下游同源片段，C'為sboA基因內(nèi)部片段。圖3中的B為利用引物 PMsboA-lF/PMsboA-lR 擴增的 B' 段長度，圖 3 中的 C 為利用引物 PMsboA-2F/PMsboA-2R 擴增的C'片段長度。泳道說明：1-為野生型GW4,2-為突變株GW4-Asb〇A，3-為互補株 GW4-AsboA_C，M為DL2000plus Marker。由圖3可知，突變株及互補株構(gòu)建成功。
[0027] 圖4 :是野生型菌株GW4,突變株GW4- Λ sboA，互補株GW4- Λ sboA-C和超表達(dá)菌株 GW4: : sboA在加不同濃度Sb(III)條件下的生長及氧化曲線。
[0028] 其中：圖4中的A和C為大腸桿菌（E. coli)S17-l菌株在加ΙΟμΜ Sb(III)條件 下的生長氧化曲線，圖4中的B和D為大腸桿菌（E. coli) S17-1菌株在加50 μ M Sb (III) 條件下的生長氧化曲線。
[0029]圖 5 :大腸桿菌（E. coli)S17-l 中 Sb(III)的氧化。
[0030] 其中：圖5中的A為0· 5h，lh，I. 5h和2h分別取樣檢測轉(zhuǎn)入質(zhì)粒（即互補載體） pCPP30-sboA 的 E. coli S17-1 (pCPP30-sboA)和對照菌株 E. coli S17-1 (pCPP30)，E. coli S17-1的生長曲線。圖5中的B為各菌株的Sb(III)氧化曲線。
[0031] 圖6 :本發(fā)明所使用的重組表達(dá)載體pET-28a_sboA示意圖。
[0032] 圖7 :SboA對Sb (III)的體外氧化實驗。

【具體實施方式】
[0033] 實施例I :sboA基因敲除，互補及超標(biāo)達(dá)實驗
[0034] 1、敲除載體構(gòu)建
[0035] 本實施例采用PJQ200SK(見圖1，美國蒙大拿州立大學(xué)，蒂莫西?麥克德莫特 (Timothy R. McDermott)教授惠贈））敲除載體對sboA基因進行無痕敲除。敲除載體構(gòu)建 過程如下：根據(jù)菌株GW4中sboA基因序列，設(shè)計帶有BamHI和XbaI酶切位點上游同源片 段的引物PsboA-IF和PsboA-IR以及下游同源片段的引物PsboA-2F和PsboA-2R。然后配 置 PCR 體系：5yL10XPCR buffer，lyL dNTPs，左右引物各 lyL，2yL DNA 模板，0.5yL Taq DNA聚合酶，最后補水至50yL。PCR程序：95°C預(yù)變性5min，95°C變性45sec，5(TC退 火45sec，72°C延伸30sec，最后72°C延伸lOmin，循環(huán)次數(shù)設(shè)為30次。
[0036] PCR結(jié)束后，分別取5 μ L點樣，使用Trans2K plus Marker (北京全式金公司）。1% 瓊脂糖凝膠中電泳（120V，30min)后，在EB(Ethidiumbromide，溴化乙錠）中染色10min，之 后置于UVP凝膠成像系統(tǒng)（Alpha Innotech公司）下觀察。如果擴增成功則采用PCR產(chǎn)物 純化試劑盒（上海賽百盛公司）純化。純化步驟為：吸取0. 4mL純化樹脂（使用前充分混 勻）裝入離心純化柱中，然后分別加入100 μ L PCR反應(yīng)液，顛倒混勻并靜置5min，12000r/ min離心30s，倒掉收集管中的廢液。再加入500 μ L 80%乙醇懸浮，12000r/min離心30s， 倒掉收集管中的廢液。再重復(fù)上步操作一次，12000r/min離心2min，此時務(wù)必要除盡乙醇。 之后將離心純化柱套入到一個干凈的I. 5mL離心管中，加入預(yù)熱的20 μ L TE緩沖液到純化 樹脂上（注意務(wù)必要加在管中心，不能粘在管壁上）。放置2min，12000r/min離心30s。離 心管中的液體即是純化好的DNA片段sboA-F和sboA-R。最后，通過cross-over PCR的方 法將sboA-F 和 sboA-R 連接在一起。配置 PCR 體系：5yL IOXPCR buffer，lyL dNTPs，正 向引物和反向引物各luL，2yL DNA模板，0. 5yL Taq DNA聚合酶，最后補雙蒸水至50yL。 PCR程序：95°C預(yù)變性 5min，95°C變性 45sec，50°C退火 45sec，72°C延伸 60sec，最后 72°C延 伸lOmin，循環(huán)次數(shù)設(shè)為30次。PCR完成后，經(jīng)I %瓊脂糖凝膠電泳檢測后，純化PCR產(chǎn)物。 然后配置連接體系：加入7 μ L純化好的DNA片段，1 μ L pGEM-Τ載體（購自美國Promega公 司）連接，IuL IOXDNA ligase Buffer 和 IyL DNA ligase，在室溫下孵育 5h。
[0037] 待反應(yīng)結(jié)束后，將10 μ L連接產(chǎn)物與E. coli DH5 α感受態(tài)細(xì)胞混合均勻，冰上放 置30min，42°C水浴熱激45s后，立即冰上放置5min，再加入500mL預(yù)冷的LB培養(yǎng)基（配方 見附錄）在37°C搖床中復(fù)蘇培養(yǎng)lh，之后取100 μ L涂在添加有氨芐青霉素（Amp)、異丙基 硫代半乳糖苷（IPTG)和5-溴_4_氯_3_ Π引哚-β -D-半乳糖苷（X-gal)的LB固體平板上， 37°C培養(yǎng)過夜。待長出菌落后，用牙簽挑取白色菌落，放入加有50 μ LCldH2O的1.5mL離心 管中，洗脫并打散菌體，l〇〇°C熱激5min后立即冰上放置5min，重復(fù)上述步驟，最后12000r/ min離心5min后取上清作為DNA模板進行PCR(體系及程序同上）。PCR完成后，將陽性克 隆送上海生工生物技術(shù)公司測序。將測序結(jié)果與銻氧化酶基因SboA進行比對。如果正確， 分別抽提包含目的片段的pGEM-Τ載體和敲除質(zhì)粒的PJQ200SK載體。然后配置50 μ L酶切 體系：36yL DNA，10yL10XTango Buffer，2yL BamHI 和 2yL XbaI，37°C酶切過夜。
[0038] 利用純化回收試劑盒純化回收酶切產(chǎn)物。經(jīng)I %瓊脂糖凝膠電泳檢測含量。然后 配置連接體系：加入5 μ L純化好的DNA片段，3 μ L質(zhì)粒pJQ200SK (美國蒙大拿州立大學(xué)蒂 莫西?麥克德莫特教授（Timothy R. McDermott)惠贈），1μ L IOXDNA ligase Buffer 和 IyL DNA ligase。隨后，在室溫下反應(yīng)5h。將連接好的產(chǎn)物與E. coli DH5a感受態(tài)細(xì)胞 混合均勻，冰上放置30min，42°C水浴熱激45s后，立即冰上放置5min，再加入500mL預(yù)冷的 LB培養(yǎng)基在37°C搖床中復(fù)蘇培養(yǎng)lh，之后取100 μ L涂在添加有慶大霉素（Gm)的LB固體 平板上，在37°C培養(yǎng)過夜。之后進行PCR檢測（方法同上），將陽性克隆進行劃線保藏。
[0039] 2、雙親本雜交
[0040] 挑取受體菌株根癌農(nóng)桿菌GW4 (Amplr,氨芐青霉素）和含供體質(zhì)粒pJQ200SK (Gnf， 慶大霉素）的供體菌株E. coli S17-1單克隆進行活化。當(dāng)菌液0D_值達(dá)到0.5-0. 6時， 于6000rpm離心5min收集I. 5-3mL菌體。收集得到的菌體利用ImLCldH2O或者生理鹽水 重懸,在6000rpm離心5min再次收集菌體，重復(fù)洗滌2次。在最后一次洗滌過程中，將供體 菌E. coli S17-1與受體菌根癌農(nóng)桿菌GW4合為一管，利用IOOyLCldH2O或者生理鹽水重 懸后，滴加在鋪于LB平板的濾紙片上，吹干后28°C倒置培養(yǎng)3-5d。
[0041] 當(dāng)濾紙片上有明顯可見的菌膜后，用5mLCldH2O或者生理鹽水將菌洗下制成菌懸 液，再進行梯度稀釋。各取100 μ L稀釋度為10'KT5和KT6的菌懸液，均勻涂布于含有 100 μ g/mL Amp和50 μ g/mL Gm的固體CDM培養(yǎng)基上。分別涂布適當(dāng)濃度的供體菌（同上） 和受體菌（同上）懸液作陰性對照，于28°C倒置培養(yǎng)48h。當(dāng)抗性平板上長出克隆后，挑取 克隆，進行抗性和PCR驗證（按常規(guī)方法），確定插入的準(zhǔn)確性。
[0042] 3、蔗糖篩選實驗
[0043] 將雙親本實驗中獲得的突變子在加入Gm抗性的LB培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)。當(dāng)OD 6c?達(dá) 到0. 5-0. 6時，將100 μ L菌液涂布在含有20-25 %蔗糖的CDM平板上28°C倒置培養(yǎng)3-5d 后，挑取克隆進行抗性驗證。選取在Amp抗性平板上可以生長但在Gm抗性平板上不能生長 的克隆利用引物PMsboA-lF/PMsboA-1R和PMsboA-2F/PMsboA-2R分別擴增，以野生型GW4 的DNA作為對照；如果用外部引物擴增片段與野生型片段大小剛好相差SboA基因的長度且 用內(nèi)部基因無法擴增出sboA基因片段，則得到的菌株即判定為突變株GW4-AsboA。圖3的 結(jié)果顯示GW4中sboA基因敲除成功。
[0044] 4、互補實驗及超表達(dá)實驗
[0045] 使用帶有PstI和BamHI酶切位點的引物CsboA-F和CsboA-F-R進行PCR擴增得 到sboA基因的完整序列，然后用限制性內(nèi)切酶PstI和BamHI對純化后的擴增產(chǎn)物和載體 pCPP30(美國蒙大拿州立大學(xué)蒂莫西?麥克德莫特教授（Timothy R. McDermott)惠贈）進 行雙酶切。將酶切產(chǎn)物進行純化，并配置10 μ L的連接體系。在室溫下連接5h，然后通過熱 激法將構(gòu)建好的互補載體pCPP30-sb〇A轉(zhuǎn)化到E. coli S17-1感受態(tài)細(xì)胞中。通過雙親本 雜交將載體pCPP30-sboA轉(zhuǎn)化到GW4- Λ sboA中，再利用Tc和Amp抗生素以及PCR進行篩 選，獲得互補株GW4-AsboA-C，圖3PCR結(jié)果顯示互補株構(gòu)建成功。將構(gòu)建好的互補載體 轉(zhuǎn)入野生型GW4中得到超標(biāo)達(dá)株GW4: : sboA，抽提質(zhì)粒，利用PstI和BamHI雙酶切驗證GM 中是否含有該質(zhì)粒。
[0046]實施例 2:野生菌株 GW4, sboA 突變株（GW4- Λ sboA)，sboA 互補株（GW4- Λ sboA-C) 和sboA超表達(dá)株（GW4: : sboA)的生長及鋪氧化實驗
[0047] 挑取野生型GW4, sboA突變株GW4- Λ sboA，sboA互補株GW4- Λ sboA-C和超表達(dá)株 GW4: : sboA的單克隆，分別接種于5mL CDM培養(yǎng)基中，28°C搖床振蕩培養(yǎng)24h。取其新鮮菌 液各 100 μ L 分別接種到含有 10 μ mol/L Sb (III)和 50 μ mol/L Sb(III)的 IOOmL CDM 培 養(yǎng)基中。28°C搖床振蕩培養(yǎng)，以不加Sb(III)的條件作為對照。
[0048] 根據(jù)菌株生長狀況，每隔8h取一次樣，用于測定OD6tltl(600nm波長處的吸光值， DU800型分光光度計）和培養(yǎng)基中不同形態(tài)銻的含量。采用高效液相色譜-氫化物發(fā)生-原 子熒光光譜儀（HPLC-HG-AFS)測定培養(yǎng)基中銻含量。直到菌體達(dá)到穩(wěn)定期后停止取樣。將 各個階段取樣所得的〇D_和培養(yǎng)基中不同價態(tài)銻含量數(shù)據(jù)繪制成曲線圖（見圖4)，進行對 比觀察分析。
[0049] 圖4結(jié)果顯示：敲除sboA基因的sboA突變株GW4-Λ sboA，銻氧化速率降低了 27 %，而sboA互補株GW4- Λ sboA-C的銻氧化表型得到回復(fù)，而超表達(dá)菌株GW4: : sboA的銻 氧化速率提高了 34%，說明sboA基因確實影響了菌株的Sb(III)氧化表型。
[0050] 實施例3 :SboA在大腸桿菌Ε. coli S17-1中超表達(dá)和銻氧化鑒定
[0051] 將實施例1中的互補載體pCPP30_sboA轉(zhuǎn)入不含sboA基因的E. coli S17-1 中，使其在E. coli中異源表達(dá)。以野生型E. coli S17-1和轉(zhuǎn)入pCPP30空載的E. coli S17-l(pCPP30)作為對照，檢測其Sb(m)氧化表型。
[0052]將活化好的菌株 S17-1 (pCPP30-sboA)，S17-1 (pCPP30)和 S17-1 接種于 LB 培養(yǎng) 基中進行擴大培養(yǎng)，再低速離心（5000rpm)收集菌體并用50mM Tris-HCKpH = 8. 0)洗滌 2遍。然后接種于含0.02%酵母粉和10 μ MSb (III)的CDM培養(yǎng)基中并調(diào)整菌體量使初始 OD6tltl達(dá)到0. 5左右。置于37°C搖床進行培養(yǎng)。分別于0. 5h、lh、l. 5h和2h取樣測定OD6tltl 及不同形態(tài)銻含量。
[0053] 實施例4:SboA對Sb (III)的體外氧化實驗
[0054]使用高保真酶Fast Pfu DNA Polymerase (Transgen) PCR擴增 sboA 的基因全長，所 用引物為EsboA-F/EsboA-R。純化回收PCR產(chǎn)物，與抽提的pET28a(+)載體（德國Novagen 公司贈送）同時使用E C〇RI-HindIII37°C雙酶切過夜，然后將酶切產(chǎn)物純化，連接后將表達(dá) 載體轉(zhuǎn)入E. Co I i高效表達(dá)菌株BL21 StarTM (DE3) pLy sS感受態(tài)中，挑選陽性克隆，最終得到 SboA的表達(dá)菌株E. coli BL21 (pET28a-sboA)。將該表達(dá)菌株接種至5mL含有100 μ g/mL Kan的LB培養(yǎng)基中，37°C過夜培養(yǎng)。將ImL過夜培養(yǎng)的菌液接種到IOOmL含有100 μ g/mL Kan的LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)2-3h至OD6tltl達(dá)到0. 3-0. 4時，加入終濃度0. 2mM的IPTG，28°C誘 導(dǎo)2h。
[0055] 將培養(yǎng)好的菌體使用8000r/min，4°C離心全部收集，用含有300 μ M NaCl的50mM Tris-HCl (pH = 8. 0)洗滌3次后，最終用IOmL含有上述緩沖液重懸，并充分打散。細(xì)胞 在冰上經(jīng)過30%超聲波破碎至澄清后，120001'/1^11，41：離心101^11。取上清加入終濃度 為20mM的咪唑，與ImL預(yù)處理過的ProfinityTM IMAC Resins(Bio-RAD)混勻，4°C的垂直 搖床上結(jié)合2h，使得含有組氨酸標(biāo)簽的可溶目的蛋白與樹脂充分結(jié)合。然后將樹脂與蛋 白混合物轉(zhuǎn)移到IOmL的蛋白純化管中，先用含有20mM的咪唑50mM Tris-HCl (pH8. 0)緩 洗脫雜蛋白數(shù)次。再依次用40、60、100、200、300、400、500mM的咪唑洗脫蛋白。最終純化 出來的蛋白使用 10% 的 SDS-PAGE 檢測（Liu GH，Liu MY，Kim EH et al.A periplasmic arsenite-binding protein involved in regulating arsenite oxidation. Environ Microbiol, 2012, 14 (7) : 1624-1634)，用常用的考馬斯亮藍(lán)R250染色，并觀察結(jié)果。純化出 來的蛋白加入10%的甘油保存于_80°C冰箱中。
[0056] 將菌株GW4-AsboA接種于含10μΜ Sb(III)的50mL CDM培養(yǎng)基中，28°C培養(yǎng)24h 后收集全部菌體。用50mM Tris-HCl (pH = 8. 0)洗滌3次并重懸后，至于冰上超聲破碎細(xì) 胞，12000r/min離心，取上清液作為含有Sb (III)氧化過程中所需電子受體的緩沖體系。再 向該體系中加入ΙμΜ Sb(III)，200yM輔酶NADP+，和不同濃度的SboA蛋白，最終用50mM Tris-HCl (pH = 8. 0)將體系補齊至5mL，并在28°C孵育0. 5h。以不加輔酶的體系作為對照， 通過高效液相色譜-氫化物發(fā)生-原子熒光光譜儀（HPLC-HG-AFS)分別檢測不同濃度梯度 的SboA氧化Sb (III)的含量。
[0057] 附錄
[0058] (I)LB培養(yǎng)基配方（IL)
[0059] 胰蛋白胨IOg
[0060] 酵母提取物5g
[0061] NaCl IOg
[0062] 溶解后用10M NaOH調(diào)節(jié)pH至7. 0,補加CldH2O定容至1L，高溫滅菌。
[0063] (2) CDM培養(yǎng)基配方
[0064]溶液 A(IL):
[0065] MgSO4* 7112O 20 g NlliCIIOy Na^SO+ IOg
[0066] K2HPO4-SH2O 0.13 g CaCl3-II2O 0.67 g CiiI5NaO3 50g
[0067] ddH20定容至1L，高溫滅菌。
[0068] 溶液 B (IL):
[0069] FeSO4 · 7H20 I. 33g
[0070] ddH20定容至1L，過濾除菌。
[0071] 溶液 C(IL):
[0072] NaHCO3 79. 8g
[0073] ddH20定容至1L，過濾除菌。
[0074] 配制IL CDM培養(yǎng)基：在887. 5mL無菌水中加入IOOmL溶液A，2. 5mL溶液B，IOmL 溶液C，調(diào)節(jié)pH至7.0。
【權(quán)利要求】
1. 一種分離自根癌農(nóng)桿菌的銻氧化酶基因 sboA，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO :1 中第1-855位堿基所示的序列。
2. -種分離自根癌農(nóng)桿菌的銻氧化酶基因 sboA，其特征在于該基因編碼的蛋白質(zhì)序 列如序列表SEQ ID N0:2所示。
3. 包含SEQ ID NO :1中第1-855位堿基所示的序列的銻氧化酶基因 sboA的大腸桿 菌（Escherichia coli)BL21/pET28a-sboA，保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，其保藏號為 CCTCC NO :M2014437。
4. 如序列表SEQ ID NO :1中第1-855位堿基所示的序列的銻氧化酶基因 sboA在氧化 環(huán)境銻污染中的應(yīng)用。
5. 如權(quán)利要求4所述的銻氧化酶基因 sboA在氧化環(huán)境銻污染中的應(yīng)用，其特征在于， 所述的銻是三價銻或五價銻。
【文檔編號】C12N1/21GK104357463SQ201410538034
【公開日】2015年2月18日 申請日期:2014年10月13日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月13日
【發(fā)明者】王革嬌, 李璟欣, 王倩, 楊碧榮, 李明順, 史曼曼, 郭瑋 申請人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)