專利名稱：：植物中可遺傳的雄性不育性和無融合生殖的無性誘導(dǎo)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及植物中可遺傳的雄性不育性的無性誘導(dǎo)。誘導(dǎo)和遺傳的這種現(xiàn)象在下文中被稱之“無性的雄性不育性“或者“AMS”。本發(fā)明還涉及在植物中誘導(dǎo)一種類無融合生殖現(xiàn)象的方法，此種現(xiàn)象可能與雄性不育性有關(guān)，但與其有區(qū)別。更具體地說，本發(fā)明涉及一些來自某些植物的因子，當(dāng)將這些因子施用于某些受體植物時(shí)在該受體中誘導(dǎo)可遺傳的雄性不育性和(或)無融合生殖。這些因子在下文中被稱之“AMS/載體”。本發(fā)明還涉及這種AMS/載體在產(chǎn)生遺傳上各異的雄性不育性植物的快速、無性方法中的應(yīng)用。這種植物可以用于生產(chǎn)在農(nóng)物、園藝、果樹學(xué)及林業(yè)中重要的新的雜交品種。雌雄同株植物是一類在同一株植物上分別長有雄性器官(雄蕊)和雌性器官(雌蕊)的植物。雌雄器官可以處于不同的花中，如玉米作物，或者它們可以處于自然緊密并列，如大豆植物。雌雄同株植物在自然界中廣泛地存在，在栽培種中是很典型的，它包括重要的農(nóng)作物、園藝品種以及制材料、果樹和結(jié)堅(jiān)果樹。因?yàn)榇菩弁曛参锛染哂行坌孕云鞴儆志哂写菩孕云鞴伲识鼈兡軌蜃灾陚鞣?，即雄性器官中的花粉可以傳粉給雌性器官，結(jié)出種子。甚至在那些通常是通過異花受精而繁殖的雌雄同株植物，例如玉米作物，在一株植物上雌雄器官相互分開，自株傳粉也是可能的。雖然在自然界雌雄同株可能是有利的，但它在栽培種植方面有問題。事實(shí)上，常常要求栽培的雌雄同株植物是雄性不育的，使其不能夠自株傳粉。雄性不育性有利的情況包括生成單性果;不結(jié)籽的觀賞植物，使花保持長久，以及生成雄性不育性引起花藥轉(zhuǎn)化成花瓣的重瓣花。然而，至今有效地把雄性不育性用作繁殖手段的最重要的實(shí)例是生成雜種，特別是F1(第一雜交后代)雜種。雜交是一種遺傳上獨(dú)特的植物與另一種進(jìn)行異花受精。其主要的優(yōu)點(diǎn)在于增加植物及其后代的遺傳變異，保持群體穩(wěn)定以及提高植物活力。由雜交而導(dǎo)致的植物活力的提高在現(xiàn)有技術(shù)中被稱之雜種優(yōu)勢。一般來說，當(dāng)相關(guān)程度最小的基因型一起雜交時(shí)，可看到最大雜種優(yōu)勢。例如不相關(guān)的栽培品系之間的雜交可以產(chǎn)生比相關(guān)栽培品系之間的雜交更好的雜種，因?yàn)槠浠蛐偷牟町愝^大。從技術(shù)上來說，F(xiàn)1雜種是任何兩種遺傳學(xué)上不同的親本植物雜交的結(jié)果，而不管它們的純合性狀態(tài)如何。然而，在現(xiàn)有技術(shù)一般接受的含義中，F(xiàn)1雜種是兩種純合(但基因上不同)的親本或者系之間的雜交產(chǎn)物，所有F1植物相互間極其相似。F1雜種的被認(rèn)為有以下優(yōu)點(diǎn)a)具有較大的活力，其特別表示在高的產(chǎn)量、花或種子的生成、較早的發(fā)芽、疫病的抗力、害蟲的抗力以及雜種優(yōu)勢的其他表現(xiàn)形式表示;b)具有較強(qiáng)的對環(huán)境狀態(tài)變化的適應(yīng)性，因?yàn)榇蠖鄶?shù)基因處于雜合狀態(tài);c)當(dāng)它們受顯性等位基因控制時(shí)，表達(dá)有利的性狀;以及d)可由培育對所得雜種產(chǎn)物進(jìn)行控制。因?yàn)榕嘤呦霃闹械玫诫s種的許多植物是雌雄同株的，即能夠自株傳粉以及異花受精，所要求的雜交是難以達(dá)到可靠的基準(zhǔn)，特別是商品化的水平。故而，涉及雌雄同株植物的任何雜交程序中的目的在于通過使自株傳粉減至最小甚至消除，來控制或者促進(jìn)異花受精。達(dá)到這個(gè)目的的一種方法是把一個(gè)雄性不育植物用作培育方案中的一種親本。過去，業(yè)已用不同方法來達(dá)到親本系的雄性不育性，但這些方法均有各種各樣的缺點(diǎn)。例如，雌雄同株植物可以通過人為方式(手工或者機(jī)械方式)把雄花、雄性器官或者產(chǎn)花粉的花藥從植物中去除而造成雄性不育。這種方法是很費(fèi)力的，并且有人為和機(jī)器的錯(cuò)誤，并不特別保險(xiǎn)。在田間的人為去雄與天氣有關(guān)且可導(dǎo)致失去組織和產(chǎn)量損失。另外，雌雄同株植物也可以用化學(xué)藥品，例如殺配子劑處理，它會(huì)破壞植物產(chǎn)生能生存的花粉的能力，或者例如化學(xué)雜交劑，它不影響花粉的生存力，但是阻止花粉的自株傳粉。然而，這種方法的費(fèi)用大和(或)導(dǎo)致對環(huán)境有害。在雌雄同株植物達(dá)到雄性不育性的最常用的方法是生物學(xué)的方法，這種方法會(huì)導(dǎo)致植物失去產(chǎn)生能生存的花粉的能力。在現(xiàn)有技術(shù)中(Allard，PrinciplesofPlantBreeding，JohnWiley&Sons，NewYork，1960，P.245;Watts，F(xiàn)lower&VegetablePlantBreeding，GrowerBooks，London，1980，P.42)，一類生物學(xué)雄性不育性被稱之遺傳性雄性不育性。簡言之，在某些植物中，雄性不育或雄性能育狀態(tài)取決于單個(gè)基因。隱性等位基因純合的植物是雄性不育的，可以用作生成雜種的親本系。純合的雄性不育系可通過與一個(gè)已知的雜合體(不育性/能育性等位基因)雜交來保存，這一雜交產(chǎn)生50%純合雄性不育后代和50%雜合雄性能育后代。必須注意只有純合雄性不育后代才能作為以后雜交的母本。還必須注意不能有雜合體間的相互雜交，因?yàn)檫@將導(dǎo)致純合雄性能育而擾亂該系統(tǒng)?？偟膩碚f，這一方法是不可靠的。在現(xiàn)有技術(shù)中，參見上述的Allard，第245-246頁，已知的另一類生物學(xué)雄性不育性被稱為胞質(zhì)雄性不育性或者CMS，它取決于胞質(zhì)因子。帶有特殊類型胞質(zhì)的植物是雄性不育的，可用作產(chǎn)生F1雜種的親本系。這些F1雜種均是雄性不育的，因?yàn)樗鼈兊陌|(zhì)完全來自雌性配子(來自雄性不育的親本)。換言之，CMS性狀是母系遺傳的。可以提供雄性不育性性狀的許多玉米胞質(zhì)屬于S組，業(yè)已表明，它的線粒體中含三種質(zhì)粒狀DNAs(Sisco，P.H.，etal.，1984，PlantScienceLetters34∶127-134;Pring，D.R.，etal.，1977，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.74∶2904;Kemble，R.J.，etal.，1980，Genetics95∶451;Koncz，C.，etal.，1981，Mol.GenGenet.183∶449)。S胞質(zhì)并不顯示穩(wěn)定的雄性不育性(Laughnan，J.R.andGabay-Laughnan，1983，Ann，Rev.Genet.17∶27-48)，在某些遺傳背景中，具有高的回復(fù)到雄性能育的比率。另一類生物學(xué)雄性不育有時(shí)被稱為胞質(zhì)遺傳雄性不育性(參見上述的Allard，第246-247頁)。與胞質(zhì)雄性不育性的區(qū)別僅在于雄性不育(母本的)植物的后代不一定是雄性不育的，如果把某一種遺傳構(gòu)成的植物用作父本則可以產(chǎn)生雄性能育的。這些產(chǎn)生雄性能育F后代的父本帶有能使具有雄性不育胞質(zhì)的植物恢復(fù)產(chǎn)生花粉能力的基因。這些基因被稱之恢復(fù)基因而帶有這些基因的植物稱之恢復(fù)株。這種胞質(zhì)遺傳雄性不育性業(yè)已投入諸如洋蔥培育中應(yīng)用(參見JonesandDavis，1944，U.S.D.A.TechnicalBulletin874∶1-28)。用胞質(zhì)雄性不育性或者胞質(zhì)遺傳雄性不育性方法形成一種新的雄性不育性親本以產(chǎn)生雜種需要通過回交進(jìn)行費(fèi)力費(fèi)時(shí)的性轉(zhuǎn)移。上述的Allard第246-247頁中敘述了胞質(zhì)雄性不育性的性轉(zhuǎn)移的程序，更精確地說，把基因型或者核組分轉(zhuǎn)移到產(chǎn)生雄性不育性的胞質(zhì)中。長久以來，種子工業(yè)一直應(yīng)用性轉(zhuǎn)移胞質(zhì)雄性不育性來對生成雜交種子產(chǎn)物進(jìn)行傳粉控制。然而，任何一種植物中僅極少品種帶有性轉(zhuǎn)移的胞質(zhì)雄性不育性，如上所述，轉(zhuǎn)移是一個(gè)費(fèi)時(shí)且費(fèi)用大的過程，它需要培育許多代才能得到一種新的雄性不育的親本系。除了多代培育的時(shí)間、精力和費(fèi)用之外，應(yīng)用性轉(zhuǎn)移的胞質(zhì)雄性不育性會(huì)導(dǎo)致很狹的胞質(zhì)，因?yàn)閭鹘y(tǒng)的傳粉不會(huì)使胞質(zhì)發(fā)生遺傳性改變。這一結(jié)果是有害的。例如，1970年，由于在雜交玉米的生產(chǎn)中應(yīng)用CMS系獲得成功，美國85%以上的玉米攜帶了CMS胞質(zhì)的T株。然而，同年，南方玉米葉枯萎的植物流行病破壞了大量玉米作物;這種病由Helminthosporiummaydis的T族引起的，后者是一種對帶有CMS-T胞質(zhì)的植物具有特別強(qiáng)致病性的子囊菌。因?yàn)槿Q于胞質(zhì)雄性不育性性轉(zhuǎn)移的培育程序的固有缺陷，該
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員研究了轉(zhuǎn)移決定雄性不育性的胞質(zhì)因子的無性方法，一種無性方法是嫁接。業(yè)已表明，雄性不育性在諸如矮牽牛(Frankel，1956，Science124∶684-685;EdwardsonandCorbett，1967，Proc.Natl.Acacl.Sci.U.S.A.47∶390-396;Frankel，1962，Genetics47∶641-646)和苜蓿(ThompsonandAxtell，1978，J.Hered.69∶159-164)等植物中可被嫁接轉(zhuǎn)移(雖然直到F1代才被表達(dá))。這種方法的問題是轉(zhuǎn)移雄性不育性的頻率較低。還可通過體細(xì)胞融合的方法來無性轉(zhuǎn)移胞質(zhì)雄性不育性因子。在培養(yǎng)中融合不同植物的原生質(zhì)體，以形成雜種，有時(shí)稱之“胞質(zhì)雜種”。這種技術(shù)業(yè)已由BelliardandPelletier用于煙草植物中(1980，Eur.J.CellBiol.22(1)∶605)。體細(xì)胞融合作為胞質(zhì)雄性不育性轉(zhuǎn)移的無性手段，其主要缺點(diǎn)是再生頻率很低以及需要適當(dāng)?shù)暮Y選或標(biāo)記來體外選擇融合的雜種。另一種業(yè)已用于轉(zhuǎn)移胞質(zhì)雄性不育性的無性技術(shù)是通過諸如菟絲子(Cuscutasp.)的中間宿主來轉(zhuǎn)移。這種中間宿主在本領(lǐng)域中稱之菟絲子橋。這種方法的缺點(diǎn)在于菟絲子本身被認(rèn)為是一種毒性寄生植物，既是一種草又是一種病害，故而不可能是大規(guī)模田間應(yīng)用的選擇物。GrillandGarger(1981，Proc.Natl.Aead.Sci.U.S.A.78(11)∶7043-7046)用了Viciafaba(蠶豆植物)及菟絲子橋。他們鑒定并定性了一種與Viciafaba中胞質(zhì)雄性不育性有關(guān)的高分子量雙鏈RNA(dsRNA)。顯然，dsRNA位于一個(gè)直徑為70毫微米的球形體中，它位于植物的胞質(zhì)中，極象一種病毒。先在CMSV.faba上生長菟絲子，然后使這種菟絲子與雄性能育植物接觸，從而把dsRNA轉(zhuǎn)移到V.faba的一株能育系上。從受體中去除菟絲子之后，可觀察到其開花。60%經(jīng)上述處理的雄性能育植物變成雄性不育的且含有原有雄性不育植物的dsRNA特性。雖然已獲成功，但是嫁接、原生質(zhì)體融合以及應(yīng)用菟絲子橋作為胞質(zhì)雄性不育性的無性轉(zhuǎn)移方法是繁復(fù)的，不能很好地適用于大規(guī)模的作業(yè)。胞質(zhì)不育性還可通過誘變、把珍珠粟暴露在溴乙錠中(Burton，G.W.andHanna，W.W.，1976，CropScience16∶731-732)以及用EMS處理稻谷(Mallick，E.H.，1980，Genet.Agr.34∶207-213)來誘導(dǎo)。業(yè)已表明，含有分子量為1.9×106和0.5×106的雙鏈RNAs的母本轉(zhuǎn)移核酸種類與玉米的雄性不育胞質(zhì)中的線粒體有關(guān)，后者被稱為LBN胞質(zhì)(Sisco，P.H.，etal.，1984，PlantScienceLetters34∶127-134;U.S.PatentNo.4，569，152byGracenetal.，filedApril26，1984)。在來源于IS1112C雄性不育蜀黍的胞質(zhì)線粒體中也業(yè)已檢測到質(zhì)粒狀DNAs(Pring，D.R.，etal.，1982，Mol.Gen.Genet.186∶180-184)。本發(fā)明的目的在于提供一種在植物中誘導(dǎo)可遺傳的雄性不育性的方法。此方法克服了現(xiàn)有技術(shù)中諸方法的缺陷，以達(dá)到雄性不育性。這樣，本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供一種誘導(dǎo)雄性不育性的快速無性方法，本方法避免了人為去雄、化學(xué)處理、性轉(zhuǎn)移回交、嫁接、原生質(zhì)體融合以及中間宿主橋接中繁復(fù)、費(fèi)用大以及費(fèi)時(shí)的不利方面。本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種在植物中誘導(dǎo)可遺傳的雄性不育性的無性方法，本方法可適用于大規(guī)模生產(chǎn)對其本身有用的新系以及用于商品化生產(chǎn)新而實(shí)用的呈雜種優(yōu)勢的雜種的新的親本系。關(guān)于后面這點(diǎn)，本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供一種誘導(dǎo)雄性不育性的無性方法，接著可遺傳到被誘導(dǎo)的雄性不育系的后代中，從而增加用于商品化規(guī)模的生產(chǎn)雜種的雄性不育親本的數(shù)目。本發(fā)明還有一個(gè)目的在于通過誘導(dǎo)以前僅可用作雄性能育親本系植物的雄性不育性，來增加雜交中所用的雄性不育親本系的基因多樣性。本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供具有高產(chǎn)、抗病害，抗蟲害和(或)抗不利環(huán)境條件的對農(nóng)物、園藝、林業(yè)以及果樹方面重要的雜種。本發(fā)明的另外的一個(gè)目的在于提供一種不僅在不同的種而且在不同的屬的植物之間，以及雙子葉和單子葉植物之間轉(zhuǎn)移遺傳性雄性不育性的通用的無性方法。本發(fā)明的再一個(gè)目的在于提供一種在植物中誘導(dǎo)無融合生殖的方法，本方法以比以前可能要用大量植物種的方法更方便、更有效的方式來維持農(nóng)作物所要求的雜種系。無融合生殖的建立能使的基因組成中與母本一致的種子發(fā)育，而不需配子融合。關(guān)于這點(diǎn)，本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供一種誘導(dǎo)無融合生殖的方法，并將此特性遺傳給后代，從而避免為了不斷地產(chǎn)生雜交種子而需要經(jīng)選擇的親本系多次重復(fù)雜交。這些以及其他的目的均可由本文所提供的材料和方法達(dá)到。本發(fā)明涉及存在于某些雄性不育的苜蓿植物的提取物中的可無性轉(zhuǎn)移雄性不育性以及無融合生殖的因子，AMS/載體。與這種提取物有關(guān)，且被用于處理過不育植物，其特點(diǎn)是(1)分子量大約為1×106道爾頓的單一可分離的核酸;以及(2)直徑大約為40-110毫微米的顆粒，如在顯微鏡下觀察，它由被兩層膜包圍的致密核心組成。本發(fā)明還涉及這種提取物及其在受體植物中無性誘導(dǎo)雄性不育性和(或)無融合生殖中的應(yīng)用。更具體地說，苜蓿植物的提取物具有AMS性狀當(dāng)例如通過噴霧施用于敏感的受體植物時(shí)，可誘導(dǎo)或給予雄性不育性。還業(yè)已表明，這些提取物可誘導(dǎo)或給予經(jīng)過這樣處理的植物以無融合形式生殖。很明顯，AMS/載體提取物在種和屬以及在雙子葉植物和單子葉植物之間誘導(dǎo)雄性不育性或者無融合生殖均是有效的。本發(fā)明還提一些產(chǎn)生F1雜種植物的改進(jìn)方法，其中改進(jìn)部分包括用經(jīng)AMS/載體無性誘導(dǎo)的雄性不育植物作為F1雜交中的母本。本發(fā)明還提供一種產(chǎn)生雜種種子的方法，其中改進(jìn)部分包括使兩親本系雜交，其中之一已用AMS/載體處理過，雜交生成F1雜種后代，用F1后代再生成F2后代，鑒定這些表型上與F1相同且結(jié)種子的F2植物，繁殖這種植物以及收集由此而得的雜種種子。本發(fā)明還提供能夠產(chǎn)生無融合生殖植物的雜種種子以及由此而得的無融合生殖植物。本發(fā)明還試圖用僅僅與含有AMS/載體的提取物有關(guān)的分子量大約為1×106道爾頓的核酸和(或)40-100毫微米顆粒作為一個(gè)可轉(zhuǎn)移的植物傳遞或者表達(dá)的載體系統(tǒng)。本文中所用的縮略語及其意思如下所示AMS＝asexualmalesterility＝無性雄性不育性CMS＝cytoplasmicmalesterility＝胞質(zhì)雄性不育性DNase＝deoxyribonuclease＝脫氧核糖核酸酶Kb＝kilobasepair＝千堿基對OBS＝observation;anexperimentaltreatmentgroup＝觀察;一個(gè)實(shí)驗(yàn)處理組REP＝replication一復(fù)制TRT＝treatment＝處理圖1A所示為經(jīng)溴乙錠染色的瓊脂糖凝膠的照片，其中核酸來自苜蓿AMS/載體源1.29(U.S.D.A.PINo.223386)(道1)，未經(jīng)處理的能育苜蓿保持株(Arc品種)(道3)以及來自未經(jīng)處理的能育苜蓿非保持株(道4)。道1中可見與AMS/載體源有關(guān)的大約為3.5kb的單一條帶，但在道3或4中未見。圖1A中的道2是經(jīng)HindⅢ消化的噬菌體入DNA，分子量(從上到下)為23.6kb、9.6kb、6.6kb、4.3kb、2.2kb以及1.9kb。圖1B所示為經(jīng)溴乙錠染色的瓊脂糖凝膠的照片，其中核酸來自能育苜蓿(Arc品種)(道1)和用AMS/載體源1.29(U.S.D.A.PINo.223386)(道3)處理后轉(zhuǎn)化成雄性不育性的苜蓿(Arc品種)。圖1B的道3中可見與AMS性狀有關(guān)的大約3.5kb的單一條帶，但在道1中未見。如對圖1A所述，圖1B的道2是經(jīng)HindⅢ消化的噬菌體入DNA。圖1C所示為經(jīng)溴乙錠染色的瓊脂糖凝膠的照片，其中核酸來自經(jīng)AMS/載體源1.26(U.S.D.A.PINo.221469)(道1)處理后轉(zhuǎn)化成雄性不育性的玉米(B73品種)和能育玉米(B73品種)(道2)。圖1C的道1中可見與AMS性狀有關(guān)的大約3.5kb的單一條帶，但道2中未見。如對圖1A所述，道3是經(jīng)Hind消化的噬菌體入DNA。圖1D所示為經(jīng)溴乙錠染色的瓊脂糖凝膠的照片，其中核酸來自經(jīng)AMS/載體源1.36(U.S.D.A.PINo.243223)(道1)處理后轉(zhuǎn)化成雄性不育性的大豆(Williams82品種)和能育大豆(Williams82品種)(道2)。圖10的道1中可見與AMS性狀有關(guān)的大約3.5kb的單一條帶，但道2中未見。如對圖1A所述，道3是HindⅢ消化的噬菌體入DNA。圖1E所示為以下6.2節(jié)中所述的試驗(yàn)結(jié)果，它說明與含有AMS/載體的提取物有關(guān)的大約3.5kb核酸的DNA性質(zhì)。從苜蓿提取的核酸在瓊脂糖凝膠電泳和溴乙錠染色之前用DNase(道1-7)或者RNase(道8-14)處理。圖1E是溴乙錠染色圖形的照片。道1為HindⅢ消化的噬菌體入DNA(如對圖1A所述);道2為恢復(fù)苜蓿系印第安納綜合(c);道3為AMS/載體源1.26(U.S.D.A.PINo.221469);道4為AMS/載體源1.36(U.S.D.A.PINo.243223);道5為苜蓿保持株(Arc品種);道6為AMS/載體源1.29(U.S.D.A.PINo.223386);道7為AMS/載體源1.7(U.S.D.A.PINo.173733);道8為經(jīng)HindⅢ消化的噬菌體入DNA(如對圖1A所述);道9為恢復(fù)苜蓿系印第安納綜合(c);道10為AMS/載體源1.26(U.S.D.A.PINo.221469);道11為AMS/載體源1.36(U.S.D.A.PINo.243223);道12為苜蓿保持株(Arc品種);道13為AMS/載體源1.29(U.S.D.A.PINo.223386);道14為AMS/載體源1.7(U.S.D.A.PINo.173733)。在AMS/載體源中存在的大約3.5kb的帶(箭頭所指)在RNase處理之后仍保留，但在DNase處理之后就不存在。圖2A為在雄性不育苜蓿植物U.S.D.A.PINo.223386的粗提取物中存在的40-110毫微米顆粒的電子顯微鏡照片。放大倍數(shù)20，000X。圖2B為在雄性不育苜蓿植物U.S.D.A.PINo.221469的胚珠中觀察到的40-110毫微米顆粒的電子顯微鏡照片，放大倍數(shù)10，000X。圖2C為由一種苜蓿保持株植物和一種原先能育，后用苜蓿AMS/載體源U.S.D.A.PINo.223386的提取物處理而轉(zhuǎn)化成雄性不育性的苜蓿植物之間雜交，得到的種子的薄切片的電子顯微鏡照片。呈現(xiàn)黑點(diǎn)的白色內(nèi)含體可能含有與AMS/載體的提取物有關(guān)的大約3.5kb的核酸。放大倍數(shù)20，000X。圖3(3A、3B、3C、3D)為有代表性的顯微鏡視場的照片，它們描繪了存在于以下6.9節(jié)中所述的田間試驗(yàn)中的品種1-4的ZeamaysL.玉米植物的含有開裂花粉的穗狀雄花的花藥中的花粉。圖4為有代表性的顯微鏡視場的照片，它描繪了未開裂花粉的穗狀雄花中的花藥，此存在于以下6.9節(jié)中所述的田間試驗(yàn)中品種2的ZeamaysL.玉米植物中。圖5A為有代表性的顯微鏡視場的照片，它描繪了在施加壓力之后從如圖4所示的品種1的花藥中釋放花粉。圖5B為有代表性的顯微鏡視場的照片，它描繪了在施加壓力之后從如圖4所示的品種2的花藥中釋放花粉。圖6為有代表性的顯微鏡視場的照片，它描繪了以下6.9節(jié)中所述的田間試驗(yàn)中品種4的ZeamaysL.玉米植物，在施加壓力之后，在具有未開裂花粉的花藥中沒有可見的造孢組織。圖7為有代表性的顯微鏡視場的照片，它描繪了以下6.10節(jié)中所述的生長室試驗(yàn)中的經(jīng)處理的大豆植物(GlycinemaxVar.Williams82)中具有一相同大小和形狀的多度花粉粒的花藥。圖8為有代表性的顯微鏡視場的照片，它描繪了如圖7所示的花藥用醋酸洋紅染紅。圖9為有代表性的顯微鏡視場的照片，它描繪了與柱頭相連的如圖7所示的花藥中的花粉粒的特征部分。圖10為有代表性的顯微鏡視場的照片，它描繪了含有以下6.10節(jié)中所述的生長室試驗(yàn)中的經(jīng)處理的大豆植物(Glycinemaxvar.Williams82)的不可染色的、異常形狀的花粉粒和正?；ǚ鄣幕旌象w的花藥。圖11為有代表性的顯微鏡視場的照片，它描繪了如圖10所示的形狀的不規(guī)則、無醋酸洋紅染色以及高度液泡化的花藥。圖12為有代表性的顯微鏡視場的照片，它描繪了以下6.10節(jié)中所述的生長室試驗(yàn)中的經(jīng)處理的大豆植物(Glycinemaxvar.Willaiams82)的沒有任何花粉粒的花藥。圖13為有代表性的顯微鏡視場的照片，它描繪了在施加壓力之后，如圖12所示的花藥中沒有任何可見的花粉粒。圖14為以下6.11節(jié)中所述的試驗(yàn)中的“近親交配1”ZeamaysL.玉米植物的有代表性的不育性穗狀雄花的照片。照片上未見花藥開裂。這種穗狀雄花并不脫落花粉，被認(rèn)為是不育性的。圖15為以下6.11節(jié)中所述的試驗(yàn)中的“近親交配2”ZeamaysL.玉米植物的有代表性的不育性穗狀雄花的照片。照片上未見花藥開裂。這種穗狀雄花并不脫落花粉，被認(rèn)為是不育性的。圖16為以下6.11節(jié)中所述的試驗(yàn)中的近親交配的ZeamaysL.玉米植物的一些有代表性的穗狀雄花照片。圖16A所示為近親交配1的能育穗狀雄花，呈開裂的花藥。(藍(lán)色紙上花粉部分是明顯的。)圖16B所示為近親交配1、被認(rèn)為是不育性的穗狀雄花。圖16C所示為近親交配2且被認(rèn)為是能育的穗狀雄花。圖16D所示為近親交配2、被認(rèn)為是不育性的穗狀雄花。圖17為以下6.11節(jié)中所述的試驗(yàn)中的近親交配的ZeamaysL.玉米植物的有代表性的穗狀雄花。圖17A所示為近親交配被認(rèn)為能育的穗狀雄花。圖17B所示為近親交配4被認(rèn)為是不育性的穗狀雄花。圖17C所示為近親交配2、被認(rèn)為是能育的穗狀雄花，但僅有一個(gè)開裂的花藥。圖17D所示為近親交配4、被認(rèn)為是能育的穗狀雄花，有多達(dá)10個(gè)開裂的花藥。圖18為一些有代表性的顯微鏡視場的照片，它們描繪了以下6.11節(jié)中所述的試驗(yàn)中的近親交配的ZeamaysL.玉米植物的穗狀雄花中醋酸洋紅染色花藥的結(jié)果。圖18A所示為被認(rèn)為是能育的穗狀雄花的近親交配1的正常、球形的且可染色的花粉。圖18B所示為近親交配3、被認(rèn)為是能育的穗狀雄花中的花粉。圖18C所示為近親交配3、被認(rèn)為是能育的穗狀雄花中的花粉。圖18D所示為近親交配4、被認(rèn)為是能育的穗狀雄花中的花粉。圖19為一些有代表性的顯微鏡視場的照片，它們描繪了交配ZeamaysL.玉米植物的穗狀雄花中醋酸洋紅染色花藥的結(jié)果。圖19A所示為近親交配1、被認(rèn)為是能育的穗狀雄花中的完全開裂的花藥?；ㄋ幈诤鸵粋€(gè)單個(gè)花粉粒是明顯的。圖19B所示為近親交配2、被認(rèn)為是能育的穗狀雄花中的完全開裂的花藥。圖19C所示為近親交配3、被認(rèn)為是能育的穗狀雄花中的完全開裂的花藥。圖19D所示為近親繁殖4且被認(rèn)為是能育的穗狀雄花中的完全開裂的花藥。圖20為一些有代表性的顯微鏡視場的照片，它們描繪了以下6.11節(jié)中所述的試驗(yàn)中的近親繁殖ZeamaysL.玉米植物的穗狀雄花中的醋酸洋紅染色花藥的結(jié)果。圖20A所示為近親交配1、被認(rèn)為不育性的穗狀雄花中的花藥中的異?；ǚ邸D20B所示為近親交配2、被認(rèn)為是不育性的穗狀雄花中的花藥中的異?；ǚ?。圖20C所示為近親交配3、被認(rèn)為是不育性的穗狀雄花中的花藥中的異?；ǚ?。圖20D所示為近親交配4、被認(rèn)為是不育性的穗狀雄花中的花粉中的不可發(fā)現(xiàn)的花粉。圖21為一些有代表性的顯微鏡視場的照片，它們描繪了以下6.11節(jié)中所述的試驗(yàn)中的近親交配的ZeamaysL.玉米植物的穗狀雄花中的醋酸洋紅染色花藥的結(jié)果。圖21A所示為近親交配1、被認(rèn)為是不育性的穗狀雄花中的花藥，被壓擠后出現(xiàn)異常的、形狀不規(guī)則的、不可染色的花粉。圖21B所示為近親交配2、被認(rèn)為是不育性的穗狀雄花中的花藥，被壓擠后出現(xiàn)異常的、形狀不規(guī)則的、不可染色的花粉。圖21C所示為近親交配3、被認(rèn)為是不育性的穗狀雄花中的花藥，被壓擠后出現(xiàn)異常的花粉。圖21D所示為近親交配4、被認(rèn)為是不育性的雄穗中的花藥，在擠壓后未露出花粉。圖22為一些有代表性的顯微鏡視場的照片，它描繪了以下6.11節(jié)中所述的試驗(yàn)中的近親交配ZeamaysL.玉米植物的穗狀雄花中的醋酸洋紅染色花藥的結(jié)果。圖22A所示為近親交配1、被認(rèn)為是不育性的穗狀雄花中的花藥，呈現(xiàn)少許可染色的、外表正常的花粉、這是罕見的。圖22B所示為近親交配2、被認(rèn)為是能育的穗狀雄花中的未開裂花藥中的顯著異常及稍有正常外表的花粉。圖22C和D所示為如圖22B中所述的花藥，顯示含有外表明顯正常的花粉的膨脹部分。5.1.AMS/載體源起源于中東的非本地的苜蓿植物(Medicago屬)可以用作AMS/載體源(供體)。由TheSeedIncreaseCollection，U.S.D.A.，Reno，Nevada(1979-1984)獲得的植物進(jìn)行抗蟲篩選和退化籽苗(reducedseedset)。從大約一萬七千株植物中，選五株具有AMS/載體性狀的植物，即所有的均含有一種可提取的因子，當(dāng)施用于易感受體時(shí)，可給予雄性不育性。所有含AMS/載體的植物均被稱為雄性不育的、四倍體的、開紫花多年生植物。這些植物的提取物的特點(diǎn)是含有直徑大約為40-110毫微米的顆粒和一種分子量大約為1.1×106道爾頓的可分離的核酸(參見6.2節(jié))?？梢栽诒疚乃龅木唧w實(shí)例中用作AMS/載體源的特定植物當(dāng)由TheSeedIncreaseCollection獲得時(shí)具有以下的植物序號(hào)(PINos.)∶PINo.172429，PINo.173733，PINo.221469，PINo.223386和PINo.243223。由五種來源中的每一種和Arc衍生的保持株植物(在U.S.D.A.Labs，Beltsville，MD生長的MedicagoSativavar.Arc)雜交后獲得的植物的種子可以用于生成植物，后者也可以用作AMS/載體源?？捎衅渌囊恍〢MS/載體源。它們可以通過以下5.2節(jié)和5.3節(jié)中的方法根據(jù)經(jīng)驗(yàn)確定。5.2.AMS/載體提取物的制備和應(yīng)用含有AMS/載體的制劑可以通過一個(gè)簡單的提取過程來制備。當(dāng)苜蓿植物供體完全長出冠狀部后進(jìn)行收獲，通常在十分之一花期或者一星期之前進(jìn)行收割。采用新鮮的葉和莖或者把它們冷藏后備用。將植物材料懸浮于任何適合的非致死緩沖液中，例如磷酸鉀緩沖液(如0.067MKH2PO4，pH6.9)。通常，每5至7毫升緩沖液中懸浮大約1克植物組織。其他的組分可以加到提取物中，例如磨料(如硅藻土諸如Celite)或者吸附增強(qiáng)劑(如二甲亞砜或稱DMSO)。植物物質(zhì)用任何適合的方法浸析，例如用高速攪拌器攪拌形成勻漿。殘留植物碎片通過過濾、傾析或者其他適合的方法去除。提取過程不需在無菌條件下完成，所得濾液或者提取物不需貯存在無菌容器中。提取物可以在使用前冷藏大約3小時(shí)?；蛘撸梢岳鋬霰４?，例如在使用前用液氮保存。由此制備的AMS/載體提取物用標(biāo)準(zhǔn)的田間設(shè)備噴霧到受體植物上。一般來說，只需施用一種提取物。在一個(gè)具體實(shí)例中，每株植物大約需用5到25毫升。提取物被噴霧到受體的葉子上。最好含有磨料(例如Celite)。當(dāng)受體植物長出葉子時(shí)進(jìn)行噴霧，但要在開花和結(jié)籽之前。例如，大豆植物可以至少在發(fā)芽之后大約二星期噴霧;較早噴霧在誘導(dǎo)雄性不育中不會(huì)有結(jié)果或結(jié)果差。玉米植物受體可以在露出第五片葉子，在大生長期的初始，在發(fā)芽之后大約三星期進(jìn)行噴霧。對苜蓿來說，受體在冠狀部上被截短大約二厘米;在二個(gè)星期內(nèi)，可以把提取物應(yīng)用于苜蓿受體上。其他的施用方法可能包括組織培養(yǎng)(植物組織懸浮在含有AMS/載體的介質(zhì)中、AMS/載體進(jìn)入原生質(zhì)體的電刺激(例如，對蔬菜作物)以及注射(例如樹)，但不限于這些。5.3.通過AMS/載體可誘導(dǎo)雄性不育性的植物如果遺傳上易接受誘導(dǎo)性，則所有的植物都有可能由AMS/載體誘導(dǎo)雄性不育性。這包括單子葉植物和甚至雙子葉植物(即其中雄、雌器官在不同的個(gè)體上的植物)，在這些植物中，通過誘導(dǎo)雄性不育性，雄性植物被轉(zhuǎn)化成雌性植物。在不希望受以下提出的理論約束的情況下，假設(shè)在可誘導(dǎo)的受體中，所有的染色體均帶有由AMS/載體介導(dǎo)的雄性不育性的誘導(dǎo)性的隱性等位基因。假如，如果以“r”表示雄性不育性的誘導(dǎo)性的隱性等位基因，則對于一種可誘導(dǎo)的受體，在該植物的細(xì)胞核中，四倍體的(如苜蓿)必須呈“rrrr”狀，而二倍體的(如大豆或者玉米)必須呈“rr”狀。最使人感興趣的植物是那些農(nóng)業(yè)和園藝上重要的植物，它們包括但不限于玉米作物、飼料作物、種子繁殖果實(shí)植物、種子繁殖觀賞植物以及經(jīng)濟(jì)種。表1所列為可以作為AMS/載體的受體并形成新的雄性不育的植物的具有代表性的雌雄同株植物。該表用說明的方式表示，但還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不止?？捎葾MS/載體誘導(dǎo)雄性不育的受體植物如5.2節(jié)所述采用鑒定提取物以及直觀地評定受體植物的花粉形成的結(jié)籽來鑒定。未生成花粉和(或)種子的植物是可誘導(dǎo)的受體。本發(fā)明試圖應(yīng)用DNA探針鑒定可誘導(dǎo)的受體。已知的可誘導(dǎo)和不可誘導(dǎo)的受體的DNA可以經(jīng)核酸限制性內(nèi)切酶消化。對可誘導(dǎo)的植物，可鑒定其獨(dú)特的片段，并用作制備DNA探針的模板。然后，通過雜交分類法，可以用這些探針篩選其他受體(參見Maniatis，T.，etal.，1982，MoleaularCloning，ALaboratoryManual，ColdSpingHarborLaboratory，ColdSprineHarbor，NewYork)。另外，可用探針鑒定經(jīng)誘導(dǎo)的植物，因獨(dú)特的核酸與顯示AMS性狀的植物有關(guān)。表1可由AMS/載體誘導(dǎo)雄性不育性的雌雄同株植物谷類作物果實(shí)作物禾谷類番茄玉米胡椒小麥西瓜大麥蘋果高粱桔子黑麥葡萄油燕麥檸檬稻谷萊姆酸橙豆類植物飼料作物蠶豆苜蓿豌豆洋蔥花生胡椒小扁豆甜菜蘿卜種子繁殖觀賞植物花椰菜矮牽牛包心菜金盞花馬鈴薯含油種子作物經(jīng)濟(jì)種大豆白楊樹向日葵楓樹亞麻棉花芥菜煙草紅花纖維亞麻油菜海藻5.4.應(yīng)用AMS/載體誘導(dǎo)的雄性不育植物生成雜種AMS/載體誘導(dǎo)的雄性不育植物可以用作本
技術(shù)領(lǐng)域：
中已知的雜交系統(tǒng)中的母本系。這種雄性不育的母本系通過使其與“保持株”，即遺傳上相同的未經(jīng)AMS/載體處理的植物雜交，以在數(shù)量上保持或擴(kuò)大。與AMS/載體誘導(dǎo)的雄性不育母本系雜交的父本系的選擇，隨F后代的預(yù)期應(yīng)用不同而變化。如果要求F1后代植物中和其本身作為諸如飼料作物或者觀賞植物，則要求F1雜種為雄性能育且今后能結(jié)籽是不必要的。故而，不必選擇將會(huì)產(chǎn)生雄性能育F1雜種的雄性親本系。然而，如果要求F1后代植物是結(jié)籽的植物，則一種恢復(fù)株可用作雄性親本系?；謴?fù)株通過進(jìn)行雜交和觀察F1后代的能育性百分率來鑒定。在與雄性不育的雌性親本植物雜交時(shí)獲得能育F1后代的雄性親本植物被認(rèn)為是恢復(fù)株。以近交的玉米系來說明，B73是一種已知的AMS/載體誘導(dǎo)的不育性Mo17的恢復(fù)株;Mo17是一種已知的AMS/載體誘導(dǎo)的不育性B73的恢復(fù)株;H95是一種已知的AMS/載體誘導(dǎo)的不育性A632的恢復(fù)株。通常，兩種近交系越是無關(guān)，則一種作為另一種的恢復(fù)株就越適當(dāng)，反之亦然。作為恢復(fù)株的一種替換物是雄性能育植物，在與雄性不育的母本植物雜交時(shí)獲得通過種子無性繁殖的F1后代之一雄性能育植物可以作用產(chǎn)生能結(jié)籽的F1雜種的親本植物。除了其他方法之外，F(xiàn)1后代和含有AMS/載體的雄性不育的植物均可無性繁殖。植物的莖可以在基部剪去，放在生根培養(yǎng)劑中以便在移植到土壤之前生根。正在設(shè)想應(yīng)用于繁殖的組織培養(yǎng)法(作為述評，參見Vasil，I.，etal.，1979，inAdvancesinGenetics，Vol.20，Caspari，E.W.，ed.，AcademicPress，NewYork，pp.127-216。)。5.5.無融合生殖的誘導(dǎo)5.5.1較高等的植物中無性繁殖雖然，一般高等的植物通常均經(jīng)有性繁殖，即通過配子融合，但在某些種類的植物中有一些不同類型的無性繁殖的情形。某些品種可以通過人工無性繁殖獨(dú)特地進(jìn)行無性繁殖。對于結(jié)籽差的植物，植物培養(yǎng)者往往采用該技術(shù);還可以用以消除可以由種子繁殖所引起的不希望有的基因變異性。根、塊莖、生殖根、根莖、莖或葉插條或者組織培養(yǎng)物均可進(jìn)行無性繁殖;以這種方式得到的植物是無突變的，在基因型上和表型上與親本植物相同。許多眾所周知的經(jīng)濟(jì)作物通常用這種方式生產(chǎn)。例如，經(jīng)常把切莖用于甘蔗的繁殖，后者在非熱帶地區(qū)極少開花。根和塊莖同樣用于種植根用作物，例如木薯、白薯、馬鈴薯和薯蕷屬植物。包括結(jié)籽在內(nèi)的一種完全不同類型的無性繁殖被稱為無融合生殖。以這種繁殖形式，在幾百種植物中可自發(fā)地發(fā)生，即沒有人為的介入。性器官及有關(guān)的組織均參與繁殖，但是所形成的種子在沒有配子結(jié)合的情況下產(chǎn)生。對于某些植物種來說，在融合生殖是唯一的繁殖形式，這些植物稱之絕對無融合生殖。然而，無融合生殖植物往往會(huì)呈現(xiàn)既有配子生殖又有無融合生殖的繁殖，這些植物稱之兼性無融合生殖。對后者來說，有性和無性過程均可同時(shí)在一株植物中完成。在絕對和兼性的無融合生殖中，可能有幾種無性過程中涉及的機(jī)理或者綜合機(jī)理。無融合生殖有四種基本類型。在無配子生殖中，胚由兩種單倍體核而不是由卵發(fā)育而來;這往往是胚囊的兩個(gè)細(xì)胞、或者助細(xì)胞或者反足細(xì)胞融合的結(jié)果。在無孢形成中，胚囊直接由體細(xì)胞發(fā)育而來，沒有減少和形成孢子;胚由雙倍體卵發(fā)育而來，沒有受精作用。在二倍性孢子形成中，胚由大孢子母細(xì)胞發(fā)育而來，沒有減少。最后，在單性生殖中，胚直接由一個(gè)未受精的卵發(fā)育而來，可能是也不可能不是單倍體，取決于形成卵的過程中成熟分裂的整齊性。為了便于目前的討論，無融合生殖術(shù)語一般用于任何或者全部這些現(xiàn)象，或者任何產(chǎn)生相同最終結(jié)果的變異。一般認(rèn)為，無融合生殖在遺傳學(xué)上受到控制(Taliaferro，C.M.，SouthernPastureForageCoop.Impr.Conf.Rep.26∶41-43，1969)并且已經(jīng)設(shè)想它可由單個(gè)基因控制(Harlanetal.，Bot.Gaz.125∶41-46，1964)。5.5.2.無融合生殖在繁殖中的應(yīng)用在無融合生殖首次發(fā)現(xiàn)時(shí)，被認(rèn)為是對植物繁殖的一種不可逾越的障阻。絕對無融合生殖之間的雜交除了極少的情況下實(shí)際上是不可能的。對于大多數(shù)種類的無融合生殖，胚具有與母體植物相同的基因結(jié)構(gòu)并且是一種真克隆，故而，為了培育新品種或者新雜種，把變異引入到無融合生殖系中的可能性似乎受到嚴(yán)格的限制。實(shí)際上，早期研究人員通常把無融合生殖當(dāng)作進(jìn)化的“死胡同”(Darlington，TheEvolutionofGeneticSystems，p.149UniversityPress，Cambridge，1939)因?yàn)樯城须x的潛力之故。然而，近年來，植物培育者業(yè)已明白這種現(xiàn)象在繁殖中可能具有有價(jià)值的應(yīng)用。如果無融合生殖完全被控制，則可提供一種手段，從而使生產(chǎn)者有一種可利用的系統(tǒng)，該系統(tǒng)通過營養(yǎng)器官提供繁殖的一致性和可靠性，不過需要在種子繁殖的適當(dāng)時(shí)候。此外，培育者發(fā)現(xiàn)有利的是能用不同的成對親本試驗(yàn)，分離優(yōu)良雜種組合，同時(shí)通過獲得真正的育種F1來“固定”雜種優(yōu)勢。這種技術(shù)證明對一些作物是特別有用的，這些作物由于授粉不足結(jié)籽少而影響獲得大量的雜種種子。這些重要的作物包括例如小麥、大豆和棉花。5.5.3.無融合生殖的AMS/載體誘導(dǎo)除了可觀察到的對通過植物處理后獲得雄性不育性的影響之外，還意外地發(fā)現(xiàn)，AMS/載體具有誘導(dǎo)被處理植物無融合生殖的能力。在研究經(jīng)AMS/載體處理的植物，其雄性不育性的遺傳型式的過程中，對其他表型特征的遺傳的某些初步觀察表明，一些經(jīng)處理的植物并未呈現(xiàn)一種正常雜種生產(chǎn)所用的型式，后者來自親本的有性繁殖。例如，兩種表型上各異的大豆親本系進(jìn)行雜交，其中一種親本已用AMS/載體處理，表明為雄性不育的。人們不認(rèn)為大豆是天然的無融合生殖植物。經(jīng)選擇的作為母本的雄性不育性植物開出白花并形成緣胚軸;用作父本的雄性能育的植物開出紫花并形成紫胚軸。它們中的每一種均受單基因控制。正如所預(yù)期的，由這種雜交所生成的F1均呈現(xiàn)紫花，紫胚軸表型;在這些植物中大多數(shù)為雄性不育的，其中少數(shù)結(jié)籽。然后，使F1自交產(chǎn)生F2代。如果出現(xiàn)正常的有性繁殖和遺傳的型式，則可預(yù)計(jì)所得的F2代應(yīng)當(dāng)出現(xiàn)花和胚軸的顏色分離。然而，令人驚奇的是花和胚軸的顏色實(shí)際并未分離，再有，許多F2的植物是結(jié)籽的雄性不育的植物。這種方式不僅與正常有性繁殖中所預(yù)期的相反，而且與以無融合生殖植物種子形成為特征的型式一致，即(1)在F1雜種雜交的后代中沒有所預(yù)期的分離;(2)出現(xiàn)仍結(jié)籽的雄性不育性的后代。所觀察到的這種型式在以后的F3和F4代中得以重復(fù)，雖然在F5代中觀察到了某些蛻變。盡管如此，顯然無融合生殖或者類無配生殖現(xiàn)象是可通過AMS/載體施用于敏感性植物誘導(dǎo)的。在先前用小麥和玉米所作的試驗(yàn)中也已觀察到相似的型式。誘導(dǎo)無融合生殖的植物的處理可以用與誘導(dǎo)雄性不育性相同方法來實(shí)現(xiàn)。常用的施用方法是在開花前噴灑植物，但要在該植物足以生長到長出葉子時(shí)噴灑。另外，可以設(shè)計(jì)在開花后不多短時(shí)間噴灑，力求直接影響生長的種子。確定對所給的一種植物的最佳施用方式的操作要求在有經(jīng)驗(yàn)的植物培育者的技藝中是需要的。施用AMS/載體之后，種植由雜交產(chǎn)生的種子并生長到成熟，這一組構(gòu)成了F1雜種代。所有的F1成員在表型上應(yīng)當(dāng)是相同的。通常，其中有許多處理后引起的雄性不育性植物。F1植物能自交，收集和種植種子，并且觀察所得F2代的表型。如果沒有出現(xiàn)無融合生殖誘導(dǎo)，則由于成熟分裂過程中性狀的分離，F(xiàn)2植物將顯示3∶1的性狀比，以及表明親本特征的各種混合。然而，如果出現(xiàn)無融合生殖，所得的F2在表型上將都與F1代相同。此外，有許多雄性不育性的植物，其中多數(shù)將會(huì)結(jié)籽。這種兩種特性的存在表明出現(xiàn)了無融合生殖以及表明生成的種子與原雜種雜交生成的種子是相同的。AMS/載體還可用作植物載體系統(tǒng)。與含有AMS/載體的提取物有關(guān)的40-110nm(大約)顆粒作為胞內(nèi)植物輸送系統(tǒng)具有潛在的實(shí)用性，例如，為輸送生物活性分子如養(yǎng)分、農(nóng)藥等等。與含有AMS/載體或者衍生物、突變體或其片段的提取物有關(guān)的1×106(大約)道爾頓核酸作為可轉(zhuǎn)移的表達(dá)載體也具有潛在的價(jià)值。當(dāng)包括異種基因順序時(shí)，核酸可以用作為表達(dá)異種基因順序的載體。這種核酸可和或不和40-110nm顆粒一起應(yīng)用。6.實(shí)例6.1篩選AMS/載體供體通過嫁接試驗(yàn)，篩選含AMS/載體的不育性苜蓿系(獲自SeedIncreaseCollection，U.S.D.A.，Reno，Nevada)。首先用目測法及乙酰卡紅染色花粉鑒別17種不育苜蓿系，隨后用以后被證明為保持株的苜蓿植物進(jìn)行雜交而證明其不育性。用不同的保持株作為接穗(嫁接的上部)，分別對十五個(gè)不育系進(jìn)行嫁接。將255個(gè)嫁接體置于一個(gè)濕盒內(nèi)，使之開花并自交(間隔進(jìn)行)，收獲種子。在嫁接的子代中未發(fā)現(xiàn)有不育性。下一代的植物發(fā)芽，并在開花期對其是否存在不育性進(jìn)行分級(jí)。按下述方式將花間隔地分成1、3、5、及7級(jí)1＝無花藥，無開裂的花粉3＝有花藥，無開裂的花粉5＝有花藥，有開裂的花粉7＝有花粉，有豐富的開裂花粉存在即，1或3級(jí)表示該植物是不育的;5或7級(jí)表示該植物為能育的。為了確認(rèn)植物的不育性，嘗試讓不育性植物進(jìn)行自交。為了防止與近親繁殖產(chǎn)生的抑制相混淆，也讓這些不育植物與一個(gè)不同的保持株植物進(jìn)行雜交。這些不育植物還與恢復(fù)系印第安納綜合(C)進(jìn)行雜交。作為AMS/載體的供體植物，必須達(dá)到兩個(gè)要求(ⅰ)當(dāng)與一個(gè)不相關(guān)的保持株植物雜交后其不育性可得到保持;及(ⅱ)與恢復(fù)系雜交后可產(chǎn)生能育性子代。對十七個(gè)不育系進(jìn)行篩選后，有五系被確認(rèn)為可作為AMS/載體的供體。這五個(gè)被確認(rèn)的AMS/載體源再次被應(yīng)用于嫁接實(shí)驗(yàn)中。將一種一年生的閉花受精(即在開花前進(jìn)行自株傳粉)的植物Medicagoscutellata，它與大豆極為類似，分別嫁接到作為接穗的5個(gè)AMS/載體系上。嫁接物未改變其嫁接子代的能育性，后者均為能育的;然而，在再下一代中，約有10%的植物雄性不育。6.2對與AMS/載體供體相關(guān)的核酸的定性如6.1.章節(jié)中所述的，有AMS/載體而被篩選出的苜蓿植物，具有一個(gè)獨(dú)特的核酸。當(dāng)這些植物的提取物被用于接受體(保持株)，便可從接受體(正無性誘導(dǎo)雄性不育)中提取出同樣的核酸。該核酸不能從未處理過的同源保持株中提取出。該核酸分子量約為1.1×106道爾頓(大約為3.3至3.5千堿基對)，并被假定為DNA。通過以下的從整個(gè)植物中提取DNA及RNA的過程，從第6.1.章節(jié)中所述的苜蓿植物的胚珠的葉、莖及/或初生胼胝體組織中分離出獨(dú)特的核酸。同樣的過程也用于經(jīng)AMS/載體提取物處理而誘導(dǎo)出的雄性不育的苜蓿、大豆及玉米植物，而且獨(dú)特的核酸也從這些植物中分離出來。在盛有5克植物組織的50毫升離心管中，加入10毫升1×STE抽提緩沖液、0.1M氯化鈉(NaCl)、0.05MTris、0.001M乙二胺三氯乙酸(EDTA)(pH7.0，含1%巰基乙醇)。在4℃下，將組織在Tekmar攪拌器中磨碎1分鐘。隨后加入10毫升含1%巰基乙醇的沸騰的1×STE抽提緩沖液，之后將該管移至55℃的水浴中，手工攪拌至溫度達(dá)到50℃為止。此時(shí)，加入等體積的(20毫升)氯仿∶異戊醇(24∶1)混和液，并將管子用貝克曼(Beckman)J21C型轉(zhuǎn)頭在10℃用Sorvall離心機(jī)13，000rpm離心10分鐘。將獲得的液相移到一個(gè)新的試管內(nèi)，先后加入相當(dāng)于液相體積的十分之一的10%十六烷基三甲基溴銨(CTAB)溶液及20毫升氯仿∶異戊醇(24∶1)混合液。隨后，13，000rpm下再離心10分鐘。離心后，將獲得的液相移入另一個(gè)試管，加入等體積的STE緩沖液。將試管于室溫(約25℃)下放置30分鐘，然后用貝克曼J21C型轉(zhuǎn)頭在4，000rpm離心5分鐘。去除上清液部分，并在氮流下使余下的沉淀物干燥。該沉淀物可保存于-20℃待用。接著，該沉淀物被重新懸浮于5毫升由50mMTris(pH8.0)、5mMEDTA、50mMNaCl及濃度為每毫升200微克(以下為“ug/ml”)的溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓組成的溶液中。加入4.4克氯化銫。將得到的混和液用貝克曼J21C型轉(zhuǎn)頭在28，000rpm離心10分鐘，保留澄清的上清部分。將3毫升的上清液移至另外的離心管，用CsCl將折光率調(diào)節(jié)成1.390后用SW50.1轉(zhuǎn)頭進(jìn)行貝克曼超離心。試管中加2.5毫升礦物油，每管加至6.1克以平衡各離心管。在SW50.1型轉(zhuǎn)頭中于23℃以33，000rpm離心60小時(shí)以達(dá)到平衡。從中取出DNA組份。通過用等體積的以20×SSC、0.15MNaCl、0.015M檸檬酸鈉(pH6.8)平衡的異丙醇萃取三次除去溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓。用10mMTris(pH7.6)及1mMEDTA以0.3醋酸鈉調(diào)節(jié)的溶液二倍稀釋DNA組分。用兩份體積的乙醇使DNA沉淀。沉淀物冷凍保存于-20℃下待用。將上述經(jīng)60小時(shí)離心后產(chǎn)生的RNA沉淀重新懸浮于0.5毫升10mMTris(pH7.6)，及1mMEDTA緩沖液形成的溶液用經(jīng)20×SSC平衡的等體積的異丙醇萃取二次去除溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓。用10mMTris(pH7.6)、1mMEDTA并用0.3M醋酸鈉調(diào)節(jié)而形成的溶液將RNA稀釋二倍。加入兩份體積的乙醇，將混和液在-20℃下冷凍保存待用。DNA及RNA樣品復(fù)蘇后用貝克曼J21C型轉(zhuǎn)頭在4℃以10，000rpm將含RNA的試管離心10分鐘。傾去上清液。在氮?dú)饬飨聦埩粲谠嚬艿腞NA沉淀干燥。將每份RNA沉淀物重懸于250微升(此后為“ul”)的由0.089MTris、0.089M硼酸、2.5mMEDTA、pH8.3及數(shù)滴0.1M乙酸鈉形成的Tris硼酸緩沖液，然后加入一份體積的乙醇。將這些混和液于-20℃下冷凍保存待用。將復(fù)蘇的DNA樣本放在45ul的離心管中，加入5ul10mMTris，pH7.6，1mMEDTA緩沖液，混和后直至沉淀溶解，加入10ul乙醇和數(shù)滴0.1M的醋酸鈉，未見CsCl沉淀。-20℃冷凍保存DNA溶液待用。將RNA樣品再次復(fù)蘇并用desk-topEppendorf離心機(jī)離心3分鐘。傾棄上清液，在氮?dú)饬飨率乖嚬苤械某恋砦锔稍?。將沉淀物重懸于?ulTris硼酸緩沖液及20ul甘油/染料(溴酚藍(lán))形成的混合液。將樣品充分混和后貯存于-20℃?zhèn)溆?。將DNA樣品再次復(fù)蘇。用貝克曼J21C型轉(zhuǎn)頭以10，000rpm在4℃下離心10分鐘，并將獲得的上清液傾棄。在氮?dú)饬飨赂稍锍恋砦?，并重新懸浮?毫升已加入0.3M乙酸鈉的10mMTris(pH7.6)、1mMEDTA緩沖液形成的混合液中。然后加入10ml乙醇。使DNA在-70℃下沉淀1小時(shí)。將這些DNA樣品再次復(fù)蘇，并用貝克曼J21C型轉(zhuǎn)頭在4℃下10，000rpm離心10分鐘。傾棄上清液，并使殘留的沉淀物在氮?dú)饬飨赂稍铩⑦@些沉淀物重新懸浮于500ulTris硼酸緩沖液，并將這些混和液轉(zhuǎn)移至1.5ul小試管中。每個(gè)試管中加入數(shù)滴0.3M乙酸鈉及1ml乙醇。將樣品于-20℃冷凍過夜。再次地將這些DNA樣品復(fù)蘇并用desk-topEppendorf離心機(jī)離心3分鐘。傾棄上清液，沉淀氮?dú)饬飨逻M(jìn)行干燥。將沉淀物重新懸浮于80ulTris硼酸緩沖液中。加入20ul甘油/染料混和液并充分混和。將如此制備的DNA及RNA樣品透析過夜，并于1%瓊脂糖、1×Tris-硼酸-EDTA(TBE)凝膠上走電泳。在走電泳之前收集DNA及RNA。經(jīng)溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓染色后，有攜帶AMS/載體特性的植物其條帶大約為3.5kb。上述實(shí)驗(yàn)的凝膠的照片如圖1A、1B、1C及1D所示。圖1A表明3.5kb條帶存在于苜蓿AMS/載體源1.29(U.S.D.APINo.223386)而在能育的未經(jīng)處理的苜蓿保持株(Arc品種)中沒有這一條帶，也不存于能育的未經(jīng)處理的非保持株(Arc品種)中。圖1B表明3.5kb條帶存在于通過AMS/載體源1.29(U.S.D.APINo.223386)處理而變?yōu)樾坌圆挥能俎?Arc品種)中。圖1C表明3.5kb條帶存在于經(jīng)AMS/載體源1.26(U.S.D.APINo.221469)處理而變?yōu)樾坌圆挥挠衩?B73品種)中。圖1D表明3.5kb條帶存在于經(jīng)AMS/載體源1.36(U.S.D.APINO.243223)處理而變?yōu)樾坌圆挥拇蠖?Williams82品種)中。與含有AMS/載體的提取物有關(guān)的大約為3.5kb的核酸看來含有DNA(圖1E)。這一點(diǎn)可以通過用脫氧核糖核酸酶(DNase，BoehringerMannheim，3，000U/mg)或核糖核酸酶(RNase，BoehringerMannheim，3，000U/mg)消化上述制備的來源于苜蓿的核酸樣品來顯示。將20ulDNase或RNase(10U/ul溶于50mMNaCl，50%甘油)加入60ul的核酸樣品中，并將該混合物置于37℃15分鐘。在樣品進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳之前加入15ul0.4MEDTA中止反應(yīng)。圖1E顯示了經(jīng)溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓染色后的條帶。與AMS/載體提取物有關(guān)的大約為3.5kb的條帶在RNase處理樣品中可見，但不存在于DNaes處理的樣品中。這就表明3.5kb核酸含有DNA，根據(jù)在于其對DNase的消化敏感。6.3AMS/載體顆粒的電子顯微鏡觀察為了獲得描述與AMS/載體1.29(PINo.223386)有關(guān)的40-110nm顆粒的電子顯微照片，進(jìn)行了以下的過程。所有步驟均于4℃或在冰上進(jìn)行。緩沖液Ⅰ的組成為50mMTris-HCl(pH7.5)、0.4M蔗糖、10mMKCl、5mMMgCl2、10%(v/v)甘油及10mM2-巰基乙醇。緩沖液Ⅱ的組成為50mM磷酸鈉緩沖液(pH7.0)。將植物組織的樣品放入六份體積(v/s)的緩沖液Ⅰ中，用Virtis均化機(jī)進(jìn)行勻漿化，先進(jìn)行30秒慢速勻漿化，后進(jìn)行30秒快速勻漿化。用4層米拉布(Miracloth)過濾勻漿，并于2，000g離心5分鐘。上清液在20，000g離心20分鐘。將獲得的上清液在兩個(gè)離心管180，000g離心60分鐘。在進(jìn)一步的純化過程中，將小的暗綠的沉淀物重新懸浮于1.5ml緩沖液Ⅱ中，并在12-42%(w/w)的蔗糖梯度的緩沖液Ⅱ中進(jìn)行分層。將梯度組成物用SW41型旋轉(zhuǎn)機(jī)于35，000rpm4℃離心75分鐘。在該梯度組成物中沒有可見的條帶。從這些管子的頂部取出大約0.5ml的組份，將這些組份稀釋至0.8ml測定OD254值。從吸收峰的前邊緣的峰肩區(qū)域(大約為試管頂部起三分之一的距離)開始收集并貯存于4℃過夜。樣品在緩沖液Ⅱ中透析以除去蔗糖，然后用SW50.1型轉(zhuǎn)頭40，000rpm離心75分鐘。為了去除負(fù)染色，將小體積的白色沉淀物懸浮于大約0.2ml的緩沖液Ⅱ中。將5微升懸浮液置于聚醋酸甲基乙烯脂包被的柵格上，放置大約2分鐘。洗去過量的液體，并將柵格(有樣品的面向下)漂在一滴2%乙酸雙氧鈾上2分鐘。洗去過量液體。用掃描電鏡檢查該樣品。發(fā)現(xiàn)有一些泡狀顆粒，有一些具有致密的核，但沒有明顯的結(jié)構(gòu)。有些AMS/載體源雄性不育系的顯微照片似乎顯示了40-110nm的顆粒。圖2A顯示了存在于雄性不育苜蓿植物AMS1.29(PINo.223386)的粗提取物(如上所述而制得)中的40-110nm顆粒。圖2B顯示在雄性不育苜蓿植物AMS1.26(PINo.221469)的胚珠中存在的40-110nm顆粒。圖2C顯示了苜蓿保持株植物與經(jīng)AMS/載體源1.29處理而由能育性苜蓿植物轉(zhuǎn)化為雄性不育株之間的雜交體種子的薄切片。在顯暗色點(diǎn)的白色內(nèi)含物可能含有與AMS/載體提取物有關(guān)的大約為3.5kb的核酸。6.4苜蓿植物中雄性不育性的誘導(dǎo)，這里所述的試驗(yàn)證明通過AMS/載體的介導(dǎo)，可以苜蓿中無性誘導(dǎo)雄性不育。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)是一種完整的區(qū)組設(shè)計(jì)，即為一個(gè)裂區(qū)，以處理為主區(qū)，以品種為裂。共有4次重復(fù)，每一重復(fù)中有16個(gè)處理區(qū)，每個(gè)區(qū)中有8行8個(gè)基因型(品種)隨機(jī)分布于其中的1行。表ⅠA、ⅠB中列出了所試驗(yàn)的16個(gè)處理和8個(gè)基因型。表ⅠA苜蓿的實(shí)驗(yàn)性處理編號(hào)處理T1注射，源1.7AMS/載體T2注射，源1.4AMS/載體T3注射，1.26AMS/載體T4注射，源1.36AMS/載體T5注射，源1.29AMS/載體T6注射，印第安納綜合(C)(苜?；謴?fù)株)T7注射，分離自苜蓿Arc品種的保持株T8注射，僅為緩沖劑(KH2PO4，pH6.9)T9硅藻土應(yīng)用，源1.7AMS/載體T10硅藻土應(yīng)用，源1.4AMS/載體T11硅藻土應(yīng)用，源1.26AMS/載體T12硅藻土應(yīng)用，源1.36AMS/載體T13硅藻土應(yīng)用，源1.29AMS/載體T14硅藻土應(yīng)用，印第安納綜合(C)(苜蓿恢復(fù)株)T15硅藻土應(yīng)用，分離自苜蓿Arc品種的保持株T16硅藻土應(yīng)用，僅為緩沖劑(KH2PO4，pH6.9)表ⅠB苜?；蛐吞?hào)碼基因型說明1源1.26，AMS/載體2源1.36，AMS/載體3源1.29，AMS/載體4能育保持株5能育保持株6能育保持株7能育保持株8印第安納綜合(C)，恢復(fù)株每種AMS/載體源的U.S.D.A植物序號(hào)(PI)編號(hào)例于表ⅠC。表ⅠC苜蓿AMS/載體源的U.S.D.A.植物序號(hào)AMS/載體源編號(hào)植物序號(hào)1.41724291.71737331.262214691.362432231.29223386處理包括注射可溶性提取物，及硅藻土(硅藻土Ⅲ級(jí)，西格瑪化學(xué)藥品，Cat.No.D5384)應(yīng)用。注射時(shí)采用28號(hào)針。將針頭穿刺入植物莖，待有一滴滲出液自莖的另一側(cè)滲出時(shí)，抽回針頭。每顆植物大約對其五個(gè)莖干進(jìn)行注射。將所有未經(jīng)注射的莖干修剪掉。硅藻土應(yīng)用基本上按下述于6.9.1.6.3章節(jié)中描述的方式進(jìn)行。對每種基因型在處理的三星期對其不育性進(jìn)行分級(jí)。將花散置于emory布上，并按下法記分1＝無花藥;無花粉3＝有花藥;無花粉5＝有花藥;有少量的花粉7＝有花藥;有豐富的花粉對于1或3級(jí)認(rèn)為是不育;5或7級(jí)被認(rèn)為是能育。用乙?？t染色來論證目測分級(jí)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果揭示，處理T1到T5及T9至T13(均為AMS/載體源)改變能育性基因型4至7(保持株)從7級(jí)下降至3級(jí)，即將可育的保持株改變?yōu)椴挥隣顟B(tài)。方差分析表明，處理的效果是相當(dāng)顯著的(P＝0.01)，在保持株經(jīng)處理的子代中，能育性已受到影響且與AMS/載體源(基因型1-3)無明顯的區(qū)別。正如預(yù)期的那樣，基因型8(恢復(fù)株)經(jīng)所有的處理仍保持能育性，而基因型1-3(AMS/載體源)經(jīng)所有的處理仍保持不育性。在重復(fù)數(shù)據(jù)中，無顯著變化。6.5在大豆中誘導(dǎo)雄性不育性在此描述的實(shí)驗(yàn)證明了通過AMS/載體介導(dǎo)，可在大豆中無性誘導(dǎo)雄性不育。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)是一種完整的區(qū)塊設(shè)計(jì)，即如上面6.4節(jié)所述，為一個(gè)裂區(qū)。處理T1至T5及T9至T13已在6.4章節(jié)作了敘述。處理T6及T14分別為用被處理的特殊基因型的提取物進(jìn)行的注射及硅藻土應(yīng)用。處理T7及T15為未經(jīng)處理的植物。處理T8及T16分別為僅用緩沖劑(KH2PO4，pH6.9)進(jìn)行的注射及硅藻土應(yīng)用。注射是在每個(gè)植物的結(jié)節(jié)處及葉柄內(nèi)(莖與葉之間的莖干組織)上進(jìn)行。經(jīng)處理的8種基因型列于表ⅠD。表ⅠD大豆基因型基因型號(hào)碼品種名稱1威廉斯82Williams822威爾斯ⅡWellsⅡ3康吐雷Century4霍比特Hobbit5庫帕蘭特Cumberland6麥克考爾McCall7采夫Traff8麥博帕拉斯多MaplePresto可育性按上述的第6.4章節(jié)中所述分級(jí)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，用所有的AMS/載體源(T1至T5;T9至T13)進(jìn)行處理，影響基因型1、2及3的能育性，在Williams82中觀察到20%不育性，在WellsⅡ及Century中都為17-30%的不育性。方差分析表明，該處理具顯著的效果(P為0.01)。重復(fù)數(shù)據(jù)中的變化均不明顯?；蛐?-8的能育性方面不變化。未觀察到在注射或硅藻土應(yīng)用兩種處理中有什么不同。6.6在大豆中誘導(dǎo)雄性不育性的附加數(shù)據(jù)將雄性大豆(紫花;WellsⅡ)的種子及雌性大豆(白花;Williams82)的種子進(jìn)行播種。27天及35天之后，對總共為186顆雌性及24顆雌性植物大約于三節(jié)間期，以來源于苜蓿AMS1.4或AMS1.36系的AMS/載體提取物噴灑。噴灑應(yīng)用時(shí)采用浸入KH2PO4，(pH6.9)的硅藻土(見下面的6.10.1.6.3章節(jié))。最后一次噴灑之后的9-10天及19天后，以花朵中取出的花藥中是否存在花粉為準(zhǔn)來對開花的大豆植物的能育性進(jìn)行分級(jí)。每顆植物至少取三朵花進(jìn)行分級(jí)。在所有情況下，被測試的花或者產(chǎn)生大量的花粉(能育)，或者根本不產(chǎn)生任何花粉(不育)。該種有或無的測試情況與苜蓿系的不同，后者的不育性植物有一個(gè)表型范圍(例如，無花粉、花粉數(shù)量減少、夭折的花粉或花粉未從花藥釋出)。誘導(dǎo)大豆的不育性的結(jié)果列于表ⅠE。表ⅠE在大豆中用AMS/載體誘導(dǎo)不育性經(jīng)處理的大豆中觀察到的不育性百分率大豆受體AMS/載體源AMS1.36AMS/載體源AMS1.4白色雌性19/49(39%)35/126(25%)紫色雄性2/10(20%)6/14(43%)示于表ⅠE中的結(jié)果表明，兩種AMS/載體源提取物均有誘導(dǎo)雄性不育的作用，開紫色花的大豆系對于AMS1.4提取物有更強(qiáng)的應(yīng)答，而開白色花的大豆系則對于AMS1.36提取物具有更強(qiáng)的應(yīng)答?？偣矠?75棵分級(jí)的植物中有50棵雌性(開白色花)植物為不育的，而總共為24棵分級(jí)的植物中有8種雄性植物(開紫色花)為不育性的。因而，199棵中有58棵即29%的植物被誘導(dǎo)不育性。6.7在玉米中誘導(dǎo)雄性不育在此敘述的該實(shí)驗(yàn)證明了在玉米中進(jìn)行的雄性不育無性誘導(dǎo)過程。該實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)及處理1-5及9-13如以上的6.4節(jié)所述。處理6及14分別為用經(jīng)處理的獨(dú)特基因型的提取物進(jìn)行注射及硅藻土應(yīng)用。處理7和15為未經(jīng)處理的植物。處理8及16分別為僅用緩沖液進(jìn)行的注射及硅藻土應(yīng)用。硅藻土應(yīng)用是按下面6.9.1.6.3節(jié)敘述的方式進(jìn)行的。注射是用28號(hào)針插入植物髓質(zhì)。用于實(shí)驗(yàn)性處理的基因型列于表ⅠF。表ⅠF玉米基因型基因型編號(hào)基因型名稱1B73＊2A632＊3Mo17＊4Mo17(IndianaCropImprovementAssociation)5B73(IndianaCropImprovementAssociation)6VA26＊7H84＊8H95＊＊獲自PurdueAgricultrueExperimentStation.可育性按以下方式分級(jí)1＝有異常花藥;無花粉3＝有正?；ㄋ?無花粉;不能被乙?？t染色5＝有正?；ㄋ?有可染色的花粉7＝有正?；ㄋ?有豐富的花粉該結(jié)果顯示用AMS/載體源進(jìn)行的所有處理均可使基因型1至7的能育性發(fā)育改變。對于基因型1-7不育性轉(zhuǎn)變范圍為15-26%，處理效果高度顯著(P＜0.01)。對基因型8進(jìn)行處理未發(fā)現(xiàn)有效果。在重復(fù)數(shù)據(jù)中變化均不明顯。6.8在其他植物中誘導(dǎo)雄性不育性用觀察測試法對在高粱、向日葵、珍珠粟及西紅柿中AMS/載體介導(dǎo)的雄性不育的誘導(dǎo)進(jìn)行了研究。用AMS/載體源進(jìn)行的處理，似乎使高粱、向日葵及粟的種子減少，而西紅柿則果實(shí)減少。6.9在大豆中誘導(dǎo)無融合生殖采用一個(gè)經(jīng)AMS/載體處理過的、雄性不育的開白花的“Williams82”大豆系作為母本，并將能產(chǎn)生正?；ǚ鄣哪苡拈_紫花“Wells-Ⅱ”作為父本，進(jìn)行雜交。產(chǎn)生的F1子代，與預(yù)期的相同，全部開紫花及紫色的胚軸植物。使F1子代自交產(chǎn)生F2子代植物，并轉(zhuǎn)而以此作為直至F5子代的遺傳研究基礎(chǔ)。檢查植物花及胚軸顏色、花藥及花粉特性(雄性不育性)及結(jié)莢情況。6.9.1.胚軸及花的顏色具有紫色胚軸的植物開紫色花，具有綠色胚軸的植物開白色花。在所有的4個(gè)子代(F2-F5)中紫色的胚軸及紫色的花具有優(yōu)勢。38棵F2中有37棵(97.4%)，39棵中F3有38棵(95%)，32棵F5中有22棵(68.8%)具有紫色的胚軸及紫色的花。在F2、F3、F4及F5子代中顯綠胚軸及白花的百分率分別為2.6%、2.5%、5%及31.2%。6.9.2.雄性不育性的特性對每棵F2-F5子代植物，測定兩朵花。用乙?？t對花藥、花粉及柱頭進(jìn)行染色并用顯微鏡進(jìn)行觀察。觀察到兩種類型的花。其中的一種，其花藥、花粉及柱頭的特征非常符合文獻(xiàn)中描述的能育大豆花(Albertsen及Palmer，Am.J.Bot.66∶253-265，1979)?；ㄋ幍拈_裂是完全的，柱頭被花藥所包圍，花藥中的開裂花粉都附于柱頭的表面。偶爾可以看到柱頭表面有花粉管?；ǚ鄣拇笮〖靶螤疃家恢拢灰阴？t染成深紅色?；ɑ蜷_該類花的植物被認(rèn)為可產(chǎn)生正常的花粉。除個(gè)別例外的部分開裂外，在另一類花中，花藥不開裂?；ǚ垲w粒保留在花藥內(nèi)，只有當(dāng)花藥被打碎時(shí)才可能釋出?；ǚ垲w粒的大小及形狀不一，且顯出形態(tài)異常。明顯可見可染色的與不可染色的兩種花粉混和。不可染色的花粉的大小及形狀不一，高度液泡化，并且不具有明確的花粉壁?？扇旧幕ǚ弁庑纬是蛐?，且大得異常(與正常的開裂花粉顆粒相比)。在大量的制備物中，發(fā)現(xiàn)花粉壁的發(fā)育不規(guī)則且不完全。偶爾可見細(xì)胞質(zhì)滲出這些花粉顆粒之外。屬于F5子代的兩株中未發(fā)現(xiàn)花藥中有花粉顆粒存在。柱頭表面上看不到花粉顆粒。這些花或開這類花的植物為雄性不育。很典型，每株植物的兩朵花都無一例外地屬于這兩種類型中的一種。在以下的說明中植物被稱為“含正?；ǚ邸保蚍Q為“雄性不育”。在所有四個(gè)子代中，可觀察到兩種類型中的每一種的花粉、花藥及柱頭的外貌特征都具有顯著的一致性。6.9.3.在F2-F5子代中發(fā)生雄性不育的頻率在每代子代中的絕大多數(shù)植物產(chǎn)生“不育花粉”并稱為“雄性不育”。在F238株中有29株(76.3%)，F(xiàn)339株中有29株(74.4%)以及F440株中的31株(77.5%)及F532株中有18株(56.2%)為“雄性不育”的。以這些數(shù)據(jù)為證據(jù)，F(xiàn)2、F3及F4子代中的雄性不育性要高于F5子代。這些結(jié)果列于表ⅠG。6.9.4.結(jié)英情況在所有的四個(gè)子代中，列為“含正?；ǚ邸钡闹仓甓夹纬僧a(chǎn)生大量種子的莢。該種類的莢，大多數(shù)為一莢三籽，較少出現(xiàn)每莢一籽或二籽。許多列為“雄性不育”的植物也形成含種子的英。F229株中有10株(34%)，F(xiàn)329株中有18株(62%)，F(xiàn)431株中有18株(58%)而F518株中有9株(50%)具有生產(chǎn)種子的英。該種類中的大多數(shù)植物中每英有三個(gè)籽。在某些植物中每莢有一或兩籽的情形也是常見的。其余的“雄性不育”植物中產(chǎn)生大量的花，但沒有莢。在F2、F3、F4及F5子代中，無莢的“雄性不育”植物的百分?jǐn)?shù)分別為14、3、3及6。6.9.5種子的存活力從四個(gè)子代中每一代的成熟莢中收集種子樣本，并使之在潮濕的濾紙上發(fā)芽?？偟陌l(fā)芽率為99%以上。F2-F4子代中的“雄性不育”植物及F2-F5子代中的含正常花粉植物所產(chǎn)生的種子都有極好的存活性。當(dāng)發(fā)芽試驗(yàn)進(jìn)行時(shí)F5雄性不育植物的種子未成熟。表ⅠG屬于F2、F3、F4及F5子代的植物的胚軸顏色、花色及雄性不育性數(shù)據(jù)的概要F2F3F4F5分級(jí)的植物數(shù)38394032()/()具有紫色胚軸及花朵的植物37383822(97.4%)*(97.4%)*(95%)(68.8%)11210具有綠色胚軸及白色花朵的植物(2.6%)(2.6%)(5%)(31.2%)()/()顯現(xiàn)正?；ǚ鄣闹参?10914(23.7%)(25.6)(22.5%)(43.8%)顯現(xiàn)不育花粉的植物29293118(“雄性不育”)(76.3%)(74.4%)(77.5%)(56.2%)＊圓括號(hào)中的為總植物數(shù)中的百分?jǐn)?shù)。表ⅠH在F2-F5子代植物中花的分級(jí)與結(jié)莢情況之間的關(guān)系+子代F2F3F4F5()/()分級(jí)的植物數(shù)38394032()/()具有正?；ǚ鄣闹参?10914有含籽英的植物9(100％)*10(100％)9(100％)14(100％)()/()具有不育花粉的植物29293118有含籽英的植物10(34％)**18(62％)18(58％)9(50％)無英的植物4(14％)**1(3％)1(3％)1(6％)()/()對產(chǎn)生正?；ǚ酆筒挥ǚ壑械拿恳环N的分級(jí)植物，用百分?jǐn)?shù)表示的花的分級(jí)及結(jié)莢情況之間的關(guān)系，示于圓括號(hào)中，分別列于表中的橫欄。＊產(chǎn)正?；ǚ鄣姆旨?jí)植物的百分?jǐn)?shù)。＊＊產(chǎn)不育花粉的分級(jí)植物的百分?jǐn)?shù)。6.9.6.結(jié)果及討論上述的結(jié)果與雜交種子無融合生殖的型式一致，在F2及其后的雜交子代中已顯現(xiàn)不分離，并且在雄性不育植物中結(jié)籽。該型式在好幾代中保持。盡管不希望受縛于任何理論，不過也許已被觀察到的無融合生殖的失敗反映出一個(gè)的兼性的無融合生殖類型的原始誘導(dǎo)，這種情況通常在自然中出現(xiàn)于某些類型的無融合性植物中。然而任何向正常繁殖的回復(fù)均可通過再次把AMS/載體應(yīng)用于原先的雜合體來糾正。6.10.AMS/載體處理玉米的田間試驗(yàn)在此描述的例子顯示了在田間條件下玉米中AMS/載體介導(dǎo)的雄性不育的誘導(dǎo)。涉及AMS/載體不育性源的四種處理及四種對照處理在田間條件下應(yīng)用于玉米，以評價(jià)AMS/載體(從苜蓿中提取出)對玉米的雄性不育的誘導(dǎo)作用。在此項(xiàng)研究中采用了四個(gè)玉米品種(近親交配)，以測定品種-AMS/載體的相互作用。觀察是否存在花粉。對于花粉的染色性、植株的高度、穗高度及75%到達(dá)長須的時(shí)間等也進(jìn)行了測定，以便確定是否有其他的處理效果，諸如刺激植物生長作用等。處理間差異的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，通過方差分析及Duncan′s多重范圍試驗(yàn)來評定。對于花粉不育性變量(無或有花粉)有很強(qiáng)的處理效果。方差分析表明，在對這一特征而言，具有顯著的處理差異，P＜0.0001。方差分析也顯示一個(gè)很強(qiáng)的品種效應(yīng)。比較三個(gè)玉米品種(在下的表Ⅱ中的1、2及4號(hào)品種)之間處理均值，有充分的證據(jù)(P小于0.0001)表明通過在實(shí)驗(yàn)中采用的處理誘導(dǎo)了玉米的不育性。沒有具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的證據(jù)表明對于品種3具有處理作用。Duncan′s多重范圍試驗(yàn)揭示采用玉米提取物(無AMS/載體)、僅用緩沖劑、苜蓿提取物(無AMS/載體)及未經(jīng)處理的植物的處理的均值顯著不同于那些源1、2、3及4AMS/載體處理的均值。對于1號(hào)品種，源4AMS/載體處理的均值與其余的不同，而對于4號(hào)品種，源2AMS/載體處理的均值與其余不同。對植物高度方差分析表明，處理的顯著差異(P＜0.0106)，和四種玉米品種之間的差異。Duncan′s多重范圍試驗(yàn)表明在任兩種品種之間進(jìn)行植物高度的比較，都具有顯著差異，P小于0.05。對于穗高度結(jié)果的方差分析未揭示在這一特征中有任何處理差異。然而，Duncan′s多重范圍試驗(yàn)則揭示了玉米各品種間的穗長顯著地不同。對任何玉米品種75%到達(dá)長須的時(shí)間，沒有處理效果。然而，無論是方差分析或是Duncan′s多重范圍試驗(yàn)都揭示在這四種玉米品種之間，在這一特征有顯著的差異。用源1、2、3及4AMS/載體進(jìn)行的處理在玉米1、2及4號(hào)品種中顯示花粉不育性。分別是用玉米提取物(無AMS/載體)、單獨(dú)的緩沖液、苜蓿提取物(無AMS/載體)進(jìn)行處理或在未經(jīng)處理的任何玉米品種中均未發(fā)現(xiàn)有花粉不育性存在。3號(hào)品種在任何處理下都無花粉不育性在能育性植物中成群地顯示出不育性的植物，表明在不育性的表達(dá)方面存在位置效應(yīng)。從無開裂花粉(花粉不育性)的每顆植物上取下一朵花進(jìn)行的顯微測定表明，1、2號(hào)品種在其不開裂的花藥中具有不可染色的、異常的不規(guī)則花粉。4號(hào)品種不產(chǎn)生任何花粉、花藥也不開裂。從所有3號(hào)品種植物及1、2及4號(hào)品種的能育植物中取出的花粉，為正常、球形、可染色的、典型的未受處理的玉米植物花粉。6.10.1材料及方法6.10.1.1.玉米種子源選擇四種玉米品種(如表Ⅱ所描述)用于此項(xiàng)研究。這些品種得自O(shè)hioFundationSeedCompany(Croton，Ohio)。田間操作人員取來這四個(gè)品種，并記錄其特征。將這些品種編號(hào)并使觀察小組了解。品種編號(hào)列于表Ⅱ。表Ⅱ玉米計(jì)劃品種編號(hào)玉米種子來源品種A632Ht，Lot950，F(xiàn)級(jí)1B73Ht，Lot4551ST，2Grade23-21FH95Ht，Lot150，MF級(jí)3M017Ht，Lot055，MF級(jí)4在播種之前將種子儲(chǔ)存于38°F的冷庫中。6.10.1.2該實(shí)驗(yàn)在俄亥俄州的西杰佛遜的田間進(jìn)行。對這塊田(150英尺×120英尺)進(jìn)行耕犁、用盤耙耕作和旋轉(zhuǎn)碎土。用施肥機(jī)施以組成為P2O5(28磅)、K2O(39磅)、及尿素(140磅)分別作為磷、鉀及氮源的基肥。在出苗四周后，另在行間用手施以140磅尿素。用Lasso(Monsanto，St.Louis)萌發(fā)前除莠劑控制雜草生長。當(dāng)肥料及除莠劑施完之后，再次在4英寸的深度進(jìn)行旋轉(zhuǎn)碎土。在實(shí)驗(yàn)田的兩側(cè)進(jìn)行生態(tài)學(xué)的實(shí)驗(yàn)，另兩側(cè)為租給農(nóng)夫的田地，那些田在實(shí)驗(yàn)階段種著燕麥。6.10.1.3實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)采用的設(shè)計(jì)方案為一個(gè)裂區(qū)以處理為主區(qū)而品種為裂。實(shí)驗(yàn)重復(fù)四次，每個(gè)重復(fù)樣品中有8個(gè)處理區(qū)，在每個(gè)區(qū)中有4行，4個(gè)品種隨機(jī)分布在其中的一行，每個(gè)品種種在20英尺長的一行，行內(nèi)間隔6英寸，行間間隔6英尺。所有的區(qū)都用6英尺寬的小徑分隔開。處理及品種的隨機(jī)性概括于表Ⅲ。表Ⅲ玉米處理及品種的隨機(jī)化T7T6T3T8T4T5T2T1R142311243123442134132132431422341T8T4T7T2T1T6T5T3R214324213124321433214431242132413T2T6T1T5T3T8T4T7R313423412413214234132213424313412T5T2T8T1T3T4T7T6R443211243431241233124124323413241在每次重復(fù)中用的八次處理(T1至T8)列于表Ⅳ。表Ⅳ玉米計(jì)劃處理編號(hào)處理編號(hào)1編號(hào)2(田間編號(hào))玉米提取物(無AMS/載體)T1B2源2，AMS/載體(U.S.D.A.T2B6PINo.172429)源1，AMS/載體(U.S.D.A.T3B1PINo.221469)苜蓿提取物(無AMS/載體)T4B8未處理T5B7源3，AMS/載體(U.S.D.A.T6B4PINo.223386)源4，AMS/載體(U.S.D.A.T7B5PINo.243223)僅為緩沖劑T8B36.10.1.4玉米的種植用手種入四種玉米品種。每個(gè)品種種成20英尺的行，每顆之間的間距為6英寸(即每行中種40株)。品種的種植是按照隨機(jī)性圖進(jìn)行的(表Ⅳ)。6.10.1.5處理及對照材料的收集及轉(zhuǎn)運(yùn)將從田界收割的新鮮苜蓿材料浸入液氮中，于前一天晚上將液氮冷凍的材料運(yùn)至田間。苜蓿材料被用作八個(gè)處理中五個(gè)的基礎(chǔ)，其中之一為無AMS/載體的對照，另四個(gè)含有AMS/載體。AMS/載體源是自四種稱為PINo.221469、172429、223386及243223的苜蓿系發(fā)育而來的四個(gè)不同的雄性不育基因型。苜蓿對照提取物(無AMS/載體)為同源的非不育系的保持株。用封閉的塑料包盛放冷凍的苜蓿材料預(yù)先編號(hào)為T1、T2、T3、T4及T5(見上表Ⅳ)。在別處將對照及AMS/載體處理材料及塑料包上相應(yīng)的編號(hào)記錄下來。因而進(jìn)行田間試驗(yàn)的人是不知道這些處理的編號(hào)的。6.10.1.6AMS/載體處理及對照處理的制備及應(yīng)用6.10.1.6.1.處理材料及其來源將取來后冷凍貯存的苜蓿材料用于制備四種含AMS/載體的提取物及一個(gè)作為對照的不含AMS/載體的苜蓿提取物。從四種玉米品種中取得的材料用于制備一個(gè)玉米提取物對照。這些品種為未處理的植物，在實(shí)驗(yàn)的全過程中植于同地塊地中，在八行中，每一品種占兩行，都為90英尺長。用從這些品種中收集的新鮮植物組織用來制備玉米提取物對照處理。另外兩個(gè)對照處理，其中之一僅為緩沖劑(0.067MKH2PO4，pH6.9)，另一個(gè)既不用緩沖劑又不應(yīng)用植物提取物(見上表Ⅳ)。6.10.1.6.2提取過程在提取植物材料之前三天配制磷酸緩沖液(KH2PO4、0.067M、pH6.9)并貯存于11℃。在提取過程中操作者戴著可隨意使用的外科手術(shù)用手套。當(dāng)每個(gè)處理材料的提取過程完成后，將手套處理掉。在每次處理中都使用一副新的手套。用盛著干冰的冰盒將冷凍的苜蓿植物材料轉(zhuǎn)運(yùn)至西吉佛遜現(xiàn)場實(shí)驗(yàn)室。在提取開始之前將該冰盒放置于38°F的冷庫。對于每個(gè)處理提取物，共使用310克植物材料及2200ml緩沖液。因?yàn)橹挥幸恢浑x心機(jī)，每次處理的提取是分兩批進(jìn)行的，每次使用155克植物材料及1100毫升緩沖液。將植物材料于Waring重型攪拌器中浸漬于緩沖液中達(dá)2-3分鐘。用四層滅菌的干酪包布對組織勻漿進(jìn)行過濾，去除植物碎片。用250ml滅菌離心瓶收集濾液，用GSA離心機(jī)于11℃下以2，000rpm離心五分鐘。將上清液倒入滅菌燒瓶，標(biāo)記后放入38°F的冷庫中預(yù)備噴灑使用。用相似方法從四種玉米品種的新鮮葉子材料中進(jìn)行提取。將上述方法得到的上清液作為噴灑玉米作物的處理材。6.10.1.6.3提取物的施用進(jìn)行田間試驗(yàn)的人不了解各種處理的特性，并由他們來對處理區(qū)進(jìn)行編號(hào)(見上表Ⅳ)。因而，該研究是在“雙育”的情況下進(jìn)行的。把硅藻土(Ⅲ級(jí)、sigma化學(xué)藥品Cat.No.D5384)用作磨料。一個(gè)一加侖裝的花園槽車噴壺中盛有的1000mlKH2PO4緩沖液(0.067M，pH6.9，11℃)，加入100克硅藻土。劇然地震蕩硅藻土-緩沖液混合物，以保證形成一個(gè)均勻的分散系，用于噴灑的硅藻土均勻分散于緩沖液。種下后四周，即第五片葉子空全展開時(shí)對玉米作物進(jìn)行噴灑。用一加侖的噴壺將硅藻土對所有植物的輪(玉米植物的頂部)周圍進(jìn)行噴灑。六種植物提取物及僅為緩沖液的對照都用一加侖噴壺對植物輪周圍進(jìn)行噴灑。處理T5植物既不用緩沖液也用植物提取物處理。6.10.1.7.數(shù)據(jù)的收集數(shù)據(jù)收集包括五個(gè)參數(shù)花粉是否存在、花粉可染色性、植物高度(英寸)、75%達(dá)到長須期的時(shí)間(天數(shù))及穗高度(英寸)。對植物高度、75%達(dá)到長須期的時(shí)間及穗長等參數(shù)的觀察，可以確定是否存在其他的處理應(yīng)用效果，諸如植物生長刺激作用。對每一處理區(qū)中的每一行，計(jì)算植物高度、75%達(dá)到長須期的天數(shù)及穗長的平均數(shù)。用照片來描過花粉類別的典型外觀。對是否存在花粉的數(shù)據(jù)的收集是當(dāng)花藥剛開始在穗狀雄花上顯現(xiàn)時(shí)進(jìn)行的。將8-1/2英寸×11英寸的黑紙置于穗狀雄花之下。當(dāng)花粉脫落時(shí)(7∶30AM-11∶30AM)，搖動(dòng)該植物兩次。根據(jù)花粉的分級(jí)用染色的麻線將標(biāo)牌系上植物。如下1＝無開裂花粉＝橙色標(biāo)牌2＝有開裂花粉＝黃色標(biāo)牌對每種品種、每一次處理的每一個(gè)，都用兩種類型的結(jié)果來對花粉的可染色性進(jìn)行分級(jí)。對每種品種處理都對一朵可育性花進(jìn)行染色。對從田間收集的含無開裂花粉的穗狀雄花的一部分用乙?？t進(jìn)行染色并觀察外觀是否正常?；ǚ廴旧沁@樣進(jìn)行的將花藥放到一塊玻璃載片上，滴上一滴乙酰卡紅，并用蓋片蓋住雄蕊。可以立即觀察到花粉的可染色性。同時(shí)還對典型的正常及異?；ǚ圻M(jìn)行顯微攝影。6.10.1.8數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析用下述的試驗(yàn)對四個(gè)從屬變量分別進(jìn)行分析。這四個(gè)變量為花粉量、穗高度、植物高度及75%到達(dá)長須期的天數(shù)，花粉的染色性變量未進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，因?yàn)樵诿恳环N類型中只有一朵花被染色，這兩種類型稱為有開裂花粉的花或無開裂花粉的花。針對花粉可染色性將數(shù)據(jù)及趨向列成表格。對裂區(qū)設(shè)計(jì)的數(shù)據(jù)進(jìn)行了分析，此分析是用統(tǒng)計(jì)學(xué)分析系統(tǒng)(SAS)給予適當(dāng)?shù)恼`差項(xiàng)，方差分析(F項(xiàng))被用于對八種處理中具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異進(jìn)行測試。方差分析用于確定觀察到的(經(jīng)處理)，與預(yù)計(jì)的隨機(jī)值(未經(jīng)處理)之間是否存在顯著的差異。要從這些差異中得出結(jié)論，必須進(jìn)行重復(fù)以使我們能夠計(jì)算實(shí)驗(yàn)的誤差，并且必須隨機(jī)化以保證實(shí)驗(yàn)誤差在有效程度內(nèi)通過四次重復(fù)這兩項(xiàng)要求均可滿足。對植物的各種處理是隨機(jī)化的，而且各種處理的每次重復(fù)也是隨機(jī)化的。有意義的概率小于或等于p＝0.01被認(rèn)為是說明處理有效的強(qiáng)有力依據(jù)。有Duncan′s新多重范圍試驗(yàn)來計(jì)算平均分離。Duncan氏多重范圍試驗(yàn)本身并不能從無效的假設(shè)中確定是否存在“有意義的差異”，然而允許我們把各種處理拆成幾個(gè)組，而這些組相互之間是明顯不同的。例如，假設(shè)當(dāng)P小于0.05時(shí)，處理T1、T2、T3及T4都是有意義的。Duncan′s試驗(yàn)可使我們確定它們是否均等地不同(一個(gè)級(jí)別)或是不均等地不同的，例如T1及T2在A級(jí)中，及T3和T4在B級(jí)中。處理均值用臨界范圍值進(jìn)行比較。6.10.2結(jié)果與討論本研究采用的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)稱為裂區(qū)設(shè)計(jì)。該裂區(qū)設(shè)計(jì)通過將處理區(qū)組放在一起而減少誤差。每一次處理時(shí)的植物及每次重復(fù)中的各種處理都是隨機(jī)化的。(完全隨機(jī)化的設(shè)計(jì)并不將各處理分隔成區(qū)組。在我們的裂區(qū)設(shè)計(jì)中，選出八個(gè)“完整(whole)”區(qū)，以使之在空間呈直線連續(xù)。八個(gè)處理中的一個(gè)(其中某些是對照)被隨機(jī)地指定為那些完整區(qū)單元。隨后，每個(gè)完整區(qū)單元再分成“裂開”成裂區(qū)。每個(gè)個(gè)裂區(qū)單元隨機(jī)地指定玉米的四種品種中的一種種植于裂區(qū)中。測定如下五個(gè)處理后的應(yīng)答不育植物的數(shù)目、能育植物的數(shù)目、植物高度、穗高度及長須天數(shù)。另一個(gè)可變應(yīng)答可以通過將不育植物數(shù)除不育及可育植物總數(shù)來獲得。這一可變應(yīng)答即為不育的百分比例。因?yàn)橐园俜謹(jǐn)?shù)表達(dá)的數(shù)據(jù)并不符合在經(jīng)相似處理的植物中具有恒定的反應(yīng)變化這么一個(gè)假設(shè)，因而采用了一個(gè)更為適合統(tǒng)計(jì)學(xué)分析的方差穩(wěn)定變換。如果在本實(shí)驗(yàn)中，P代表不育百分?jǐn)?shù)，那么所謂的適當(dāng)?shù)淖儞Q則如下所示Z＝Sin-1(P-1/2)(1)其中Z代表用于分析的新的可變應(yīng)答。把每個(gè)處理及品種的組合，其不育百分?jǐn)?shù)、植物高度、穗高度及達(dá)到長須的天數(shù)的均數(shù)以及各品種分別地列于下面的表Ⅴ、ⅩⅤ、Ⅸ、ⅩⅩⅢ。每一個(gè)均數(shù)為四次重復(fù)的平均數(shù)。不育百分?jǐn)?shù)及達(dá)到長須的天數(shù)的均數(shù)為真正的“回復(fù)變換”的均數(shù)，即兩個(gè)變量都經(jīng)過變換，(例如1)，變換值的平均值經(jīng)計(jì)算后，再將這些均值經(jīng)過“回復(fù)變換”，又回到原先的形式。6.10.2.1.1對花粉分級(jí)的分析(表Ⅴ至ⅩⅣ)雄性不育性僅在1、2及4號(hào)品種中，在使用處理B1(源1AMS/載體)、B4(源3AMS/載體)、B5(源4AMS/載體)及B6(源2AMS/載體)的植物中觀察到。3號(hào)品種中未發(fā)現(xiàn)有雄性不育性(表Ⅴ)。對玉米作物雄性不育的百分率的結(jié)果的方差分析表明，處理效果是強(qiáng)的(P小于0.0001)。也就是說，在每個(gè)處理小組中變成不育的玉米的百分率對所有處理小組來說相同這一點(diǎn)是很極不可能的，即少于萬分之一(表Ⅵ)。對方差分析的結(jié)果同樣也顯示了品種效應(yīng)是很強(qiáng)的(P＜0.0001)。然而，任何兩種處理均值的差異在不同的玉米品種中是不同的。后面一種效應(yīng)被認(rèn)為是一種干擾影響，表明對處理均值進(jìn)行的比較應(yīng)該在同一個(gè)品種中進(jìn)行。對于1、2及4號(hào)品種，有足夠的依據(jù)(P＜0.0001)表明在實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行的處理在玉米作物中引起了不育性。然而，對3號(hào)品種，則缺乏足夠的表明處理效果的統(tǒng)計(jì)學(xué)證據(jù)(見表Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ及Ⅹ)。表Ⅺ、Ⅻ、ⅩⅢ及ⅩⅣ包含了對1、2、3及4號(hào)玉米品種，比較每一對不育處理均值的“Duncan′s多重范圍試驗(yàn)結(jié)果。又一次發(fā)現(xiàn)，屬于同一個(gè)組中個(gè)體的處理均值與其他組無顯著不同，也就是說，在以類似的方式處理的每個(gè)玉米作物組內(nèi)，成為不育的作物的百分率，在各個(gè)組之間沒有不同。因而，用源1、2、3及4AMS/載體的各個(gè)處理均值(分別為B1、B6、B4及B5)顯著不同于那些，對1、2、4號(hào)品種進(jìn)行的用玉米提取物(無AMS/載體)、單一的緩沖液、苜蓿提取物(無AMS/載體)及未處理植物(分別為B2、B3、B8及B7)的處理均值。在3號(hào)品種中未發(fā)現(xiàn)有雄性不育產(chǎn)生。6.10.2.1.2.植物高度的分析(表ⅩⅤ至ⅩⅤⅢ)對于植物高度進(jìn)行方差分析表明在各種處理中存在相當(dāng)顯著差異(P＜0.0106)。這意味著所有的不育處理(包括對照)對于植物高度均不產(chǎn)生影響的兒率大約為百分之一或千分之十一。換言之，也就是說有充足的證據(jù)表明不育性處理對于植物高度產(chǎn)生了影響(見表ⅩⅤ、ⅩⅥ)。為了確定哪些處理相互之間有顯著性差異，而采用了稱為Duncan′s多重范圍試驗(yàn)的多重比較方法。這種統(tǒng)計(jì)分析使我們能夠?qū)颠M(jìn)行比較而不增加錯(cuò)誤判斷那些比較有顯著性差異而事實(shí)不然的概率。如表ⅩⅦ表明，在特定的組中的所有均值相互之間均無顯著性差異，而判斷不同組的任意兩個(gè)均值顯著差異而產(chǎn)生差錯(cuò)的可能僅僅為二十分之一。因而，僅用緩沖液、源3及4AMS/載體及苜蓿提取物(無AMS/載體)(分別為B3、B4、B5及B8)的處理均值顯著地不同于那些采用源1及2AMS/載體、玉米提取物(無AMS/載體)及未處理植物的處理均值(分別為B1、B6、B2及B7)?？偟姆讲罘治鲆啾砻髟谟衩鬃魑锏母鱾€(gè)品種之間存在著顯著性差異(P＜0.0001)(見上表ⅩⅥ)。把植物高度應(yīng)答判斷為在每個(gè)玉米品種中均不相同，此判斷錯(cuò)誤的機(jī)率比百分之零點(diǎn)零一即萬分之一小得多。另外，對于每個(gè)玉米品種來說，各種處理之間的差異是一樣。表ⅩⅧ包括對玉米各品種的均值(即各種處理的均值)進(jìn)行的Duncan′s多重范圍試驗(yàn)的結(jié)果。表ⅩⅧ植物高度變量的Duncan′s多重范圍試驗(yàn)α＝.05DF＝72MSE＝8.52984均值編號(hào)234臨界范圍1.456871.531921.58091DUNCAN均值＊均值N品種A70.041324B70.609322C66.463321D55.322323＊具有相同字母的均值無顯著性差異表ⅩⅧ，如所有的表明Duncan′s多重范圍試驗(yàn)結(jié)果下續(xù)的表一樣，可以按以上的對表ⅩⅦ進(jìn)行的解釋去理解。表ⅩⅧ表明在任兩個(gè)品種之間進(jìn)行的植物高度的比較都是顯著地不同(P＜0.05)。判斷某品種的平均植物高度與任何另一種有顯著不同，這一判斷產(chǎn)生錯(cuò)誤的機(jī)率少于或者等于百分之五，即二十分之一。6.10.2.1.3.穗高度的分析(表ⅩⅨ至ⅩⅩⅡ)對于穗高度的方差分析結(jié)果表明在各種不育處理均值之間設(shè)有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性差異。在實(shí)驗(yàn)中所用的八種處理的任何一種似乎對穗高度都不產(chǎn)生影響(表ⅪⅩ，ⅩⅩ)。即使缺乏很強(qiáng)的處理效果，Duncan′s多重范圍試驗(yàn)也可用于揭示各種處理均值的差異的模式及相對大小。表ⅩⅪ提供了各種處理的Duncan′s多重范圍試驗(yàn)結(jié)果。穗高度似乎隨玉米作物的品種不同而變化。方差分析結(jié)果表明錯(cuò)誤判斷穗高度在各個(gè)玉米作物品種有明顯變化的機(jī)率少于百分之零點(diǎn)零一即少于萬分之一。表ⅩⅩⅡ包括玉米作物品種均值的Duncan′s多重范圍試驗(yàn)結(jié)果。表ⅩⅩⅡ變量的Duncan′s多重范圍試驗(yàn)穗高度品種均值α＝.05DF＝72MSE＝5.79405均值編號(hào)234臨界范圍1.200721.262581.30295DUNCAN分組＊均值N品種A30.7875322B29.1094324C26.6531321D20.2406323＊具有相同字母的均值無顯著性差異表ⅩⅩⅡ表明每種玉米品種與其他的任三種品種有顯著差異(P＜0.05)。這一判斷發(fā)生錯(cuò)誤的機(jī)率少于或等于百分之五，即二十分之一。6.10.2.1.4到達(dá)長須期的天數(shù)的分析(表ⅩⅩⅢ至表ⅩⅩⅥ)方差分析結(jié)果表明，無一種處理對到達(dá)長須期的天數(shù)有甚影響，但有品種效應(yīng)，但不同的玉米植物品種到達(dá)長須期的天數(shù)有顯著的差異(P小于0.0001)，參見ⅩⅩⅢ和ⅩⅩⅣ)。Duncan′s多重范圍試驗(yàn)表明，處理均值之間無顯著差異(表ⅩⅩⅤ)。表ⅩⅩⅥ包括Duncan′s多重范圍試驗(yàn)的結(jié)果，比較了玉米植物品種到達(dá)長須期天數(shù)的變量平均值。這兩種品種所有可能進(jìn)行比較的都有顯著的差異(P＜0.05)。這一陳述出差錯(cuò)的概率小于等于5%或1/20。表ⅩⅩⅥ到達(dá)長須期天數(shù)之變量的Duncan多重范圍試驗(yàn)α＝0.5DF＝72MSE＝0.0703125均值數(shù)目234臨界范圍0.1322710.1390860.143534Duncan分組＊均值NVARA80.00000323B75.00000322C73.00000324D70.09375321＊具有相同字母的均值系無顯著差異6.10.2.1.5處理差異的統(tǒng)計(jì)顯著性概述方差分析表明，在P小于0.0001時(shí)，花粉不育性有顯著的差異。用源1，2，3和4AMS/載體(分別為B1，B6，B4和B5)處理顯示出雄性不育性，而用玉米提取物(無AMS/載體)、緩沖液、苜蓿提取物(無AMS/載體)處理和未處理的植物(分別為B2，B3，B8和B7)則不產(chǎn)生此種現(xiàn)象。強(qiáng)烈的品種效應(yīng)也是顯而易見的。在1，2和4號(hào)品種中，有力的證據(jù)(P＜0.0001)表明，玉米植物的不育性受到所用處理方法的影響。而對于3號(hào)品種處理未發(fā)現(xiàn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的影響。由于方差分析表明了強(qiáng)列的品種效應(yīng)，因而對顯示出不育性的三種品種(即1，2和4)的處理平均值進(jìn)行了比較。Duncan′s多重范圍試驗(yàn)進(jìn)一步揭示，對于全部品種來說，用玉米提取物(無AMS/載體)、緩沖液、苜蓿提取物(無AMS/載體)的處理和未處理的植物(分別為B2，B3，B8和B7)與用源1，2，3和4AMS/載體(分別為B1，B6，B4和B5)的處理有顯著的區(qū)別。在1號(hào)品種中，用源4AMS/載體(B5)的處理均值不同于其余的處理均值，而在品種4中，用源2AMS/載體(B6)的處理均值不同于其余的處理均值。方差數(shù)據(jù)的分析和Duncan′s多重范圍試驗(yàn)均表明，就“植物高度”的特征而言，處理之間的差異是明顯的。采用Duncan′s多重范圍試驗(yàn)也揭示了不同品種之間植物高度特征的顯著差異(P＜0.05)。穗高度并未受到8種處理方法中任一種的影響，但似乎隨著玉米植物的品種不同而有明顯的變化。所有四種品種的穗高度的平均值之間有顯著的差異。不同的處理對到達(dá)長須期的天數(shù)”這一變量無顯著的差異。方差分析(P＜0.0001)和Duncan′s多重范圍試驗(yàn)均揭示了顯著的品種差異。6.10.2.2不育特性的描述用源1，2，3和4AMS/載體(分別為B1，B6，B4和B5)的處理表明，在所有的重復(fù)試驗(yàn)中植物均未產(chǎn)生任何開裂花粉。在未出現(xiàn)開裂花粉的穗狀雄花中，花藥被穎苞所覆蓋。若將顯露花粉的穗狀雄花放在黑紙上抖動(dòng)，則花藥會(huì)從穎苞中露出而易被看到。未顯露出開裂花粉的植物常見的是集結(jié)成狀，在所有處理中所觀察到的位置效應(yīng)顯示了這一特征，并包括四個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)。對處理和重復(fù)試驗(yàn)中所有4種品種中具有開裂花粉的穗狀雄花的花藥進(jìn)行了顯微鏡檢查。在所有的4種品種中，這類穗狀雄花的花粉特征是球形和均勻的，具有致密的細(xì)胞質(zhì)，并可用醋酸洋紅染色(圖3)。然而，在品種1和2中未顯露出開裂花粉的穗狀雄花的花藥未出現(xiàn)開裂，在顯微鏡下通過花藥的壁可清楚地見到大量異常的，不規(guī)則形狀，且看上去空心的花粉(圖4)。僅在通過按壓蓋玻片，在花藥上施加相當(dāng)?shù)膲毫?，才能使花粉從這些花藥中釋放出來(圖5A，5B)。在4號(hào)品種中，除了少數(shù)穗狀雄花中的花外，未出現(xiàn)開裂花粉的穗狀雄花中的藥中花藥不形成花粉粒(表ⅩⅩⅦ)。即使將花藥壓碎后，也未顯現(xiàn)出造孢組織(圖6)。6.11對大豆植物的AMS/載體處理的生長室試驗(yàn)本文所描述的實(shí)施例系驗(yàn)證在大豆中由AMS/載體作為媒介而引起的雄性不的誘發(fā)。在大豆出苗后，(開花前)四周，對其進(jìn)行四次包括AMS/載體的處理和四次對照處理，以檢驗(yàn)AMS/載體是否誘發(fā)大豆的雄性不育。對花藥和花粉進(jìn)行顯微檢查，以評估AMS/載體處理的效果。在完成花粉檢查后，確定每一植物的植物高度、花節(jié)數(shù)和結(jié)莢數(shù)，以表明是否存在處理過程的其他影響，如植物生長刺激作用。處理效果的統(tǒng)計(jì)顯著性系由方差分析和Duncan′s多重范圍試驗(yàn)確定。在用源1，2，3和4AMS/載體的處理中觀察到雄性不育植物。而用大豆提取物(無AMS/載體)處理，在41株被檢查的植物中產(chǎn)生一株雄性不育的植物。僅用緩沖液，或用苜蓿提取物(無AMS/載體)處理，或者不進(jìn)行處理，則并無雄性不育植物產(chǎn)生。對于花粉不育性采用1-7的顯微等級(jí)，對所有的處理和重復(fù)試驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。方差分析表明，有關(guān)花粉不育性顯微等級(jí)方面，處理差異十分明顯(P＜0.0001)。Duncan′s多重范圍試驗(yàn)揭示了用源1，2，3和4AMS/載體處理的均值明顯地不同于僅用緩沖液，或用苜蓿提取物(無AMS/載體)處理，或者不進(jìn)行處理的均值。方差分析在植物高度、每株植物的花節(jié)數(shù)和結(jié)莢數(shù)方面并未顯示出任何處理差異。當(dāng)采用Duncan′s多重范圍試驗(yàn)時(shí)，在植物高度變量方面，用源1AMS/載體和用苜蓿(無AMS/載體)處理的均值明顯地不同于用源2AMS/載體處理或不作處理的均值，而在每株植物的結(jié)莢數(shù)方面，則用源3AMS/載體處理的均值不同于用苜蓿(無AMS/載體)處理的均值。Duncan′s多重范圍試驗(yàn)并未揭示在每株植物花節(jié)數(shù)方面的任何處理差異。在對花作顯微檢查時(shí)發(fā)現(xiàn)了三種不同的型式一種花具有看上去正常的花藥，以及大量的具有正常形狀和大小，并可用醋酸洋紅染色的花粉;第二種花的花藥看上去是正常的，但其內(nèi)的花粉是異常和正?；ǚ鄣幕旌衔?而第三種花在表面上看上去是正常的花藥中并無花粉粒。6.11.1物料和方法6.11.1.1大豆種子來源用于此處所述實(shí)驗(yàn)中的大豆種子是Williams-82品種。這些種子是在前一天晚上運(yùn)到田間試驗(yàn)區(qū)的。種子被貯存在38°F的冷庫中，直至播種。用種子包裝物封裝的種子共收到8批，稱為T1-T8。6.11.1.2試驗(yàn)物料的收集和裝運(yùn)將來自田間的新鮮苜蓿材料浸入液氮中。然后將液氮冷凍的材料置于干冰中于前一天晚上運(yùn)到田間試驗(yàn)區(qū)。其中4種材料(來自四種雄性不育的苜蓿系，PINos，221469，172429，223386和243223)含有AMS/載體，而一種是苜蓿對照物(同源的非不育系)。這種材料系裝在密封塑料袋中抵達(dá)，預(yù)先編碼為T1，T2，T3，T4和T5。記錄處理和對照用材料的來源，以及它們相應(yīng)的T號(hào)碼。從事田間試驗(yàn)的人員僅僅知道“T”名稱，而不了解每種情況的處理本質(zhì)。因此，從事田間試驗(yàn)的人員對處理材料并不清楚。6.11.1.3植物生長的生長系統(tǒng)和條件一種無菌的植物生長裝置被用于大豆的生長。將含有下列大量和微量養(yǎng)分的養(yǎng)分溶液供給植物，即1.08克CaHPO4、0.2克K2HPO4、0.2克MgSO4、0.2克NaCl、0.16克FeCl3和1000毫升水。加入下列微量元素Bo-0.05%;Mn-0.05%;Zn-0.005%;Mo-0.005%;和Cu-0.002%。這種養(yǎng)分溶液使用時(shí)的濃度為上述的1/10，并補(bǔ)充以KNO3(0.05%)作為氮源。該實(shí)驗(yàn)的受控環(huán)境生長室被確定為14小時(shí)白天/10小時(shí)夜間的循環(huán)，溫度恒定在25℃，植物天棚(canopy)內(nèi)的光照強(qiáng)度為340umolm-2s-1。6.11.1.4播種和發(fā)芽將每包種子(T1-T8)完全卸入滅菌罐中，而表面即刻用50毫升的95%乙醇漂洗，使之滅菌，然后用酸化氯化汞溶液(0.2%HgCl2和0.5%濃HCl的水溶液)處理1.5分鐘。傾去氯化汞溶液后，用無菌蒸餾水將種子漂洗10次。漂洗完畢后，使種子在無菌蒸餾水中浸1小時(shí)，然后進(jìn)行播種。每一盆中播種3粒種子，在土壤中的深度為1.5-2厘米。播種后在土壤表面覆蓋1英寸厚度的無菌水族池的砂礫(aguariumgravel)，以防止細(xì)菌和真菌污染。整個(gè)裝置被包上牛皮紙，以避免土壤和根部受到光的照射。對盆進(jìn)行標(biāo)記(T1-T8)，并將其轉(zhuǎn)入生長室中。將8批種子的每一批播種在總共24只盆中。播種后6天記錄到發(fā)芽數(shù)據(jù)。每一批種子所記下的發(fā)芽百分?jǐn)?shù)如下T1-44;T2-42;T3-35;T4-54;T5-47;T6-39;T7-33;T8-32。發(fā)芽率低于常規(guī)的數(shù)值(常規(guī)的發(fā)芽率大于90%)，因此盆中所有幼苗均保持不動(dòng)，不進(jìn)行間苗。采用與上述相同的方法，將另一些Williams-82載培品種的種子(購自DewineSeedCompany，YellowSprings，Ohio)滅菌后播種到幼苗數(shù)小于3的盆中。播種種子至每盆的幼苗數(shù)至少達(dá)到3個(gè)。標(biāo)記出原先幾批種子的相應(yīng)幼苗，以使它們與補(bǔ)充的Williams-82種子組相區(qū)別。當(dāng)每盆中的幼苗數(shù)超過3個(gè)時(shí)，則僅對補(bǔ)充的Williams-82組的種子進(jìn)行間苗。然后，在第二組盆中播種取自標(biāo)有T1-T8袋(每只袋裝有20粒種子)內(nèi)的這八批大豆種子。先將這些種子放置在38°F的冷庫中，直至播種為止。在80只盆的每一只盆內(nèi)均播有2粒種子，因此每袋種子可供10只盆。除了第二次播種時(shí)不進(jìn)行表面滅菌處理外，植物生長系統(tǒng)和播種方法均與第一次播種時(shí)類同。第二次播種時(shí)種子不進(jìn)行表面滅菌處理的原因在于種皮因運(yùn)輸過程中的損傷而產(chǎn)生細(xì)的裂紋，而滅菌過程將通過這些細(xì)裂紋而滲透到種子中，由此降低成活力和發(fā)芽數(shù)。在第二次播種中種子的發(fā)芽百分率為T1-80;T2-100;T3-70;T4-80;T5-60;T6-100;T7-90;T8-65。第二次播種的發(fā)芽后，棄去第一次種植中無一原先種子發(fā)芽的盆。所棄去的盆的數(shù)目如下T1-0;T2-6;T3-7;T4-1;T5-2;T6-4;T7-5;T8-3。6.11.1.5實(shí)驗(yàn)方案和處理實(shí)驗(yàn)方案是裂區(qū)，把重復(fù)試驗(yàn)作為整個(gè)區(qū)，處理作為裂。裂區(qū)方案把處理區(qū)組集中在一起，有助于減少誤差。但是在每次處理中仍然存在植物的隨機(jī)化，并在每一重復(fù)試驗(yàn)中存在著處理的隨機(jī)化(一個(gè)完全隨機(jī)化的設(shè)計(jì)不會(huì)將處理分解成區(qū)組)。8次處理重復(fù)了6次。這8次處理(示于表ⅩⅩⅤⅢ)包括4種含有來自不同苜蓿基因型源的AMS/載體的材料各種對照物。表ⅩⅩⅤⅢ大豆的設(shè)計(jì)處理和編碼處理編碼1編碼2田間編碼源1AMS/載體B6T1(U.S.D.A.PINo.221469)未處理的B5T2大豆提取物，無AMS/載體B7T3AMS/載體源2，AMS/載體B8T4(U.S.D.A.PINo.172429)源3，AMS/載體B2T5(U.S.D.A.PINo.223386)苜蓿提取物，無B3T6AMS/載體僅用緩沖液，無植物B1T7提取物源4，AMS/載體B4T8(U.S.D.A.PINo.2432236.11.1.6AMS/載體處理和對照處理的準(zhǔn)備和應(yīng)用6.11.1.6.1處理及其來源收到的冷凍貯藏的苜蓿材料是用于4次AMS/載體處理和苜蓿提取對象的原料。大豆提取物的原料是在生長在田間的Williams品種。其他兩次對照處理涉及僅用緩沖液(0.067MKH2PO4，pH6.9)，或者所用的材料(“未處理的”)超出所有處理共用的硅藻土(Celite)使用的范圍。6.11.1.6.2提取過程在植物材料提取前三天配制磷酸鹽緩沖液(KH2PO4，0.67M，pH6.9)并將其貯存在11℃。甩的的提取步驟均在戴有可隨意使用的外科手術(shù)用手套的條件下進(jìn)行的。每一次處理均需使用一副新手套，以避免交叉污染。從冷藏箱中取出冷凍的苜蓿植物材料，稱重。每一次提取，均將160克材料在Waring重型攪拌器中的100毫升KH2PO4緩沖液(0.067M，pH6.9，11℃)內(nèi)浸漬2-3分鐘。然后將此勻漿用4層無菌粗砂布(Cheesechoth)過濾，以除去植物碎片。濾液被收集在無菌的250毫升離心瓶中，并用GSA轉(zhuǎn)頭在Sorvall冷凍離心機(jī)中，以2000轉(zhuǎn)/分(rpm)的轉(zhuǎn)速離心分離5分鐘。然后將上清液傾入無菌燒瓶中，標(biāo)記后貯存在38°F的溫度下，直至用于噴霧。所產(chǎn)生的上清液組成了用于噴霧大豆植物的提取物。按同樣的方式從生長在田間的大豆植物制備大豆提取物。6.11.1.6.3提取物的施用用硅藻土(三級(jí)，SigmaChemicalsCat.No.D5384)作為磨料，將100克硅藻土加到一個(gè)1加侖裝的花園槽車噴霧器內(nèi)的1000毫升KH2PO4緩沖液(0.067M，pH6.9，11℃)中。將此硅藻土-緩沖液混合物劇烈地震蕩，確保硅藻土均勻地分散在緩沖液中，以供噴霧。在出現(xiàn)第5個(gè)節(jié)間，但花原基還不能為肉眼所見的階段，對大豆植物進(jìn)行噴霧。所有植物第一次均用硅藻土-緩沖液混合物噴霧。然后將植物移出生長室，同時(shí)用一種處理劑(提取物)噴霧。涉及植物提取物和僅是緩沖液的對照物的6種處理劑用煙霧噴霧裝置(SigmaChemicalsCat.No.S4885)和煙霧推進(jìn)注入裝置(aerosolpropellantrefillSigmaChemicalsCat.No.A4532)進(jìn)行噴霧。對每株大豆植物從第一個(gè)結(jié)節(jié)起噴霧，直到達(dá)到苗端為止。在施用過程中對大豆值物進(jìn)行旋動(dòng)，每株植物約被施用25毫升植物提取物(或僅是緩沖液)。一種對照處理(無緩沖液，無提取物)的植物僅施用硅藻土。在噴霧時(shí)，現(xiàn)場人員無一注意到盆的“T”數(shù)目，以及它們相應(yīng)的處理編碼?，F(xiàn)場人員后用任意給定的名稱B1-B8對T1-T8的盆重新標(biāo)記?，F(xiàn)場人員保留了使“B”數(shù)與“T”數(shù)相關(guān)的編碼(參見表ⅩⅩⅤⅢ)。從此刻起，研究便成為“雙盲”試驗(yàn)，在不透露由另一批人所掌握的編碼情況下，無人知曉每一處理的本質(zhì)。在盆用現(xiàn)場編碼標(biāo)記后，將它們移入生長室中，并隨意地放置在四個(gè)區(qū)組(重復(fù))中。第二次播種其他種子的提取物制備及對大豆的噴霧均按第一次播種的相同方式進(jìn)行。采用對第一次播種所確定的相同的編榪，用相應(yīng)的現(xiàn)場號(hào)碼(B1-B8)對盆進(jìn)行編碼。然后將這些盆布置在生長室中，視作重復(fù)實(shí)驗(yàn)5和6，在每一重復(fù)實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行8次處理。用園林樁(gardenstakes)將所有植物均系在樁上，以使它們保持直立。6.11.1.7收集資料資料的收集包括4種參數(shù)花粉可染色性，達(dá)120天的植物高度(英寸)，每株植物的花結(jié)數(shù)和結(jié)莢數(shù)。對每株植物在全部處理中的這些參數(shù)進(jìn)行評價(jià)。說明花粉評價(jià)的有代表性的顯微鏡視野拍攝成照片。當(dāng)?shù)诙€(gè)結(jié)節(jié)上出現(xiàn)花時(shí)，則開始收集花粉可染色性的資料。從每株植物任選三朵花，以評定花粉可染色性的等級(jí)。用攝子將花的雄蕊移到一個(gè)載玻片上。將一滴醋酸洋紅滴于雄蕊上，并用蓋玻片覆蓋。輕輕地敲打蓋玻片，在顯微鏡下對雄蕊進(jìn)行觀察，并對所證實(shí)的可染色性分成下列等級(jí)1等＝不存在花粉;3等＝所存在的花粉中小于5%被染上顏色;5等＝所存在花粉中5-95%被染上顏色;7等＝所存在的花粉中96-100%被染上顏色。在進(jìn)行分級(jí)的過程中，拍攝符合這些等級(jí)的有代表性的花藥和花粉的照片。在播種后120天完成花粉可染色性的顯微分極然后測定植物高度、花結(jié)數(shù)和結(jié)莢數(shù)。6.11.1.8數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析把數(shù)據(jù)作隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)的分析，并將統(tǒng)計(jì)程序統(tǒng)計(jì)分析系統(tǒng)(SAS)用于此分析中。方差分析(F統(tǒng)計(jì)量)被用于檢驗(yàn)8種處理之間的統(tǒng)計(jì)顯著性差異(statisticallysignidicantdifferences)。顯著性概率小于或等于0.01的P值，則認(rèn)為是說明處理有效的有力證據(jù)。用Duncan′s新多重范圍試驗(yàn)來進(jìn)行均值分類(meanseparation)。用臨界范圍值來比較處理均值。6.11.2結(jié)果和討論6.11.2.1統(tǒng)計(jì)分析將8種(包括4種對照物)處理中的一種任意地施于8組盆載植物中的一組。每一組包括6盆，每盆有二株植物。將處理劑逐一地噴霧到每株植物上。這一設(shè)計(jì)方式被重復(fù)6次。以上所述的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)是人們熟悉的隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，其中8種處理包括處理的主要效果，每一重復(fù)樣品構(gòu)成一個(gè)區(qū)組。表ⅩⅩⅨ包括在研究中所測得的四種應(yīng)答變量的各自總平均值，亦即花的等級(jí)，植物高度，花結(jié)數(shù)和結(jié)莢數(shù)。處理和重復(fù)實(shí)驗(yàn)的每一種組合中花的等級(jí)、植物高度、花結(jié)數(shù)，以及結(jié)莢數(shù)示于以下表ⅩⅩⅩ，ⅩⅩⅩⅢ，ⅩⅩⅩⅣ和ⅩⅩⅩⅨ中。表ⅩⅩⅠⅩ應(yīng)答變量的處理均值處理花的等級(jí)植物高度花節(jié)數(shù)種莢數(shù)B15.8050352.834021.452811.1837B25.0138949.747922.66678.6977B35.5620959.978421.882412.9565B44.9102651.207721.50009.1628B55.6081948.486021.649112.2642B64.5769254.600023.673111.2000B75.4390249.973221.65859.8378B84.5416747.495821.91679.57456.11.2.1花粉等級(jí)的分析(表ⅩⅩⅩ至表ⅩⅩⅩⅡ)從每株植物上選出三朵單獨(dú)的花，并對其花粉不育性分極。對每株植物計(jì)算出這三個(gè)等級(jí)的平均值(表ⅩⅩⅩ)，并作為應(yīng)答變量進(jìn)行分析。方差分析結(jié)果(表ⅩⅩⅩⅠ)表明具有非常顯著的處理效果(P＜0.0001)。在事實(shí)上無處理效果的情況下而作出有處理效果的判斷結(jié)論，這種出錯(cuò)概率為0.01%或約為萬分之一。這是有力的證據(jù)，表明花的等級(jí)的均值受到不育性處理范圍的影響。Duncan′s多重范圍試驗(yàn)在0.05級(jí)下進(jìn)行，以檢查成對的處理均值之間的差異型式和大小。表ⅩⅩⅩⅡ包括Duncan′s多重范圍試驗(yàn)的結(jié)果。如表ⅩⅩⅩⅡ所示，在0.5級(jí)時(shí)，同一組的所有均值無顯著性差異，但組之間的任何二個(gè)處理均值的比較，則被認(rèn)為是顯著的。在判斷作出諸如處理2的花等級(jí)與處理3的花等級(jí)顯著不同的結(jié)論時(shí)，出錯(cuò)概率小于或等于5%，或約為1/20。源1，2，3和4AMS/載體(分別為B6，B8，B2和B4)的處理均值與僅用緩沖液處理，用苜蓿提取物(無AMS/載體)處理的均值和未處理植物(分別為B1，B3和B5)的均值明顯不同(表ⅩⅩⅩⅡ)。6.11.2.1.2植物高度分析(表ⅩⅩⅩⅢ至表ⅩⅩⅩⅤ)方差分析結(jié)果表明，在實(shí)驗(yàn)中處理對大豆植物高度無顯著影響(表ⅩⅩⅩⅢ和表ⅩⅩⅩⅣ)。誤差概率的結(jié)論是有明顯處理效果的約為18%(表ⅩⅩⅩⅣ)。而且，進(jìn)行了Duncan′s多重范圍試驗(yàn)，以評定每一對處理均值間差異的型式和大小。表ⅩⅩⅩⅤ中列出該試驗(yàn)的結(jié)果，表明可能不同的28對處理的均值中9對可被斷定有著顯著性差異。這一陳述不正確的概率小于或等于5%，或約為1/20。由此看來處理對植物高度總的影響不是顯著的。6.11.2.1.3花節(jié)數(shù)的分析(表ⅩⅩⅩⅥ至表ⅩⅩⅩⅤⅢ)方差分析結(jié)果表明，未發(fā)現(xiàn)處理有效的證據(jù)(表ⅩⅩⅩⅥ和表ⅩⅩⅩⅤⅡ)。判斷作出“花節(jié)數(shù)明顯地受到該研究中所作處理的影響”的結(jié)論的出差錯(cuò)概率將近90%(表ⅩⅩⅩⅤⅡ)。Duncan′s多重范圍試驗(yàn)也表明，在成對處理均值之間無顯著性差異(表ⅩⅩⅩⅤⅢ)6.11.2.1.4結(jié)莢數(shù)的分析(表ⅩⅩⅩⅠⅩ至ⅩLⅠ)方差分析結(jié)果表明，未發(fā)現(xiàn)任何不育性處理對每株植物的結(jié)莢數(shù)有顯著影響的證據(jù)(表ⅩⅩⅩⅠⅩ，ⅩL)。作出“結(jié)莢數(shù)受到不育性處理的明顯影響”的結(jié)論的出錯(cuò)概率約為30%或3/10(表ⅩL)。Duncan′s多重范圍試驗(yàn)表明，只有處理劑B2(源3AMS/載體)和處理劑B3(苜蓿提取物，無AMS/載體)的均值之間有差異，差錯(cuò)的概率僅為5%(表ⅩLⅠ)。6.11.2.1.5處理差異的統(tǒng)計(jì)顯著性概述根據(jù)方差分析資料，對于花粉不育性的顯微等級(jí)來說，處理差異是十分顯著的(P小于0.0001)。用以檢查成對處理之間差異大小的Duncan′s多重范圍試驗(yàn)揭示，源1，2，3和4AMS/載體(分別為B6，B8，B2和B4)的處理平均值與只用緩沖液，或用苜蓿提取物(無AMS/載體)的處理，以及未經(jīng)處理的植物(分別為B1，B3和B5)的處理平均值有顯著性差異。方差分析結(jié)果表明，未發(fā)現(xiàn)處理對大豆植物的高度有顯著影響。然而，Duncan′s多重范圍試驗(yàn)揭示，處理劑B6(源1AMS/載體)和B3(苜蓿提取物，無AMS/載體)的平均值與處理劑B8(源3AMS/載體)和B5(未作處理)的平均值有顯著性差異。方差分析或Duncan′s多重范圍試驗(yàn)均表明，未發(fā)現(xiàn)處理對每株植物的花節(jié)數(shù)有明顯的影響。根據(jù)方差分析試驗(yàn)，也無證據(jù)表明花節(jié)數(shù)明顯地受到任何處理的影響。然而，Duncan′s多重范圍試驗(yàn)揭示了處理劑B2(源3AMS/載體)和B3(苜蓿提取物，無AMS/載體)的平均值之間的差異。6.11.2.2不育性特征的描述用源1，2，3和4AMS/載體(分別為B6，B8，B2和B4)處理，觀察到雄性不育植物。而用大豆提取物(無AMS/載體)處理，41株植物中僅有1株是雄性不育的。僅用緩沖液處理，或用苜蓿提取物(無AMS/載體)處理，或者未處理的植物(分別為B1，B3和B5)中，未發(fā)現(xiàn)雄性不育植物(表ⅩLⅡ)。在處理后植物的花的顯微分極時(shí)所觀察到的有代表性的不育性型式(圖7-13)揭示了三種不同的型式。表ⅩLⅡ在6次重復(fù)實(shí)驗(yàn)中木豆不育性的總剖析被檢查的不育的能育處理植物數(shù)植物＊植物B1530＊＊(0%)53(100%)B2486(12%)42(88%)B3510(0%)51(100%)B4526(12%)46(88%)B5570(0%)57(100%)B65212(23%)40(77%)B7411(2%)40(98%)B84810(21%)38(79%)＊植物的花主要為1級(jí)(無花粉)，而少數(shù)花中5%以下的花粉被染上顏色(3級(jí))。不育植物無莢。＊＊植物的實(shí)際數(shù)目(括號(hào)內(nèi)為百分?jǐn)?shù))第一種型式顯示出具有含大量花粉粒(圖7)的花藥的花，其中花粉粒的大小和形狀是均勻的，并可用醋酸洋紅染色(圖8)。這類花的柱頭表面有大量的花粉粒附著(圖9)。大豆是自株傳粉品種，圖7-9表示在正常的大豆花中所見到的特征。第二種型式的特征在于此種花具有看上去正常的花藥，但花藥內(nèi)的物質(zhì)是不能被染色的異形花粉粒和正?；ǚ?圖10)的混合物。異常花粉系成不規(guī)則形狀，不能被染色，且高度液泡化(圖11)。在這一型式中，異常與正常花粉之比隨花而不同。第三種型式的特征在于此種花具有看上去正常的花藥，但花藥中沒有任何花粉粒(圖12)。這樣一類花的柱頭表面上無花粉和柱頭毛。這種花藥即使被壓碎后，在其內(nèi)也不會(huì)顯露出花粉粒(圖13)。6.11.2.3對統(tǒng)計(jì)分析的補(bǔ)充隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)被用作上文章節(jié)中花的分級(jí)，植物高度，花節(jié)數(shù)和種子結(jié)莢數(shù)的方差分析的基礎(chǔ)。另一方面，資料可被看作為單向的完全隨機(jī)設(shè)計(jì)。如果認(rèn)為區(qū)組(重復(fù)試驗(yàn))之間無顯著差異，而且不同區(qū)組的處理之間的差異是固定不變的(亦即區(qū)組與處理的交互影響不是顯著的)，則后一方法可能是有效的。然而，前面章節(jié)所述的結(jié)果并非此種情況。對四種從屬變量逐一進(jìn)行方差分析，結(jié)果表明區(qū)組對區(qū)組的變異在統(tǒng)計(jì)學(xué)上是顯著的(P＜0.05)，盡管花的等級(jí)這種效應(yīng)較之其他應(yīng)答變量要弱得多(P＝0.085)。通過把由于區(qū)組和區(qū)組與處理交互作用的效果與殘留平方和匯集起來，并用后者作為“合適”的術(shù)語來檢驗(yàn)處理效果，將減少檢驗(yàn)處理效果的精力。如果有顯著的區(qū)組之間的差異，和/或有顯著的區(qū)組與處理的交互作用，則以上描述是正確的。由于區(qū)組5和6是以后播種的，因而可以認(rèn)為區(qū)組(重復(fù)實(shí)驗(yàn))5和6與區(qū)組1和4不相同。因此，在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，在這些區(qū)組中的植物較之在區(qū)組1-4中的植物處于較早的發(fā)育階段，而當(dāng)它們的生長時(shí)間較之區(qū)組1-4中的植物多一周時(shí)，則給于噴霧。因而對花等級(jí)資料(不包括區(qū)組5和6)再次進(jìn)行了分析(表ⅩLⅢ)。方差分析結(jié)果又表明了很強(qiáng)的處理效果(P＝0.003)。也就是說，錯(cuò)誤地作出有處理效果的結(jié)論的概率約為0.3%，或者約為3/1000。而且，看來區(qū)組之間無顯著性差異(P＝0.47)或者區(qū)組與處理之間無顯著性交互作用(P＝0.48)。似乎區(qū)組5和6造成了早期分析中出現(xiàn)的顯著的區(qū)組效應(yīng)。表ⅩLⅠⅩ列出對花等級(jí)重新分析的Duncan′s多重范圍試驗(yàn)結(jié)果(不包括區(qū)組5和6)。然而，原始分析(表ⅩⅩⅩⅡ)應(yīng)被認(rèn)為較之表ⅩLⅤ更適合作出結(jié)論。當(dāng)分析中包括區(qū)組5和6時(shí)，即使有區(qū)組間的變異，這種影響在早期分析中也已考慮在內(nèi)，并可使研究者使用全部資料來評價(jià)處理效果。事實(shí)上，如果分析中包括組5和6，使處理效果變得更強(qiáng)。6.12在玉米后代中AMS/載體誘導(dǎo)的雄性不育的遺傳性的驗(yàn)證此處所描述的研究用以驗(yàn)證AMS/載體誘導(dǎo)的雄性不育對玉米后代的遺傳性。實(shí)驗(yàn)是在夏威夷州Waimanalo的一個(gè)個(gè)研究站的田間進(jìn)行的。共種值了四組玉米(表ⅩLⅤ)。所用的玉米近交系的編碼示于表ⅩLⅤⅠ。表ⅩLⅤ玉米種子來源組說明1來自AMS/載體處理過的近交系的不育植物×未處理的同源系的雜交種子2來自AMS/載體處理過的近交系的能育植物的自交種子3來自AMS/載體處理過的近交系×非同源的未經(jīng)處理的近交系的雜交種子。4.來自S2，S3，S4和S5代＊＊的近交系1，2，4的種子＊參見以下6.11.1節(jié)中更為詳細(xì)的描述;＊＊Sn系指第n代種子。表ⅩLⅤⅠ玉米品系的近交系編碼編碼種子公司品種編碼近交系1A632Ht，Lot950，GradeF近交系2B73Ht，Lot4551ST，Grade23-21F近交系3H95Ht，Lot150，GradeMF近交系4Mo17Ht，Lot055，GradeMF對1和4組進(jìn)行試驗(yàn)，專用以評價(jià)在玉米后代中AMS/載體誘導(dǎo)的雄性不育的遺傳性。對2組材料進(jìn)行試驗(yàn)的目的是用以確定不育性是否出現(xiàn)在那些最初經(jīng)AMS/載體處理未能轉(zhuǎn)化成不育性、而后進(jìn)行自交后產(chǎn)生的玉米植物后代中。3組試驗(yàn)的目標(biāo)是用以確定AMS/載體-近交系×非同源的未經(jīng)處理的近交系雜交后產(chǎn)生的F種子是否表現(xiàn)出不育性。1組資料的結(jié)果表明，玉米中AMS/載體-誘導(dǎo)的雄性不育性被遺傳給玉米的后代。該組由近交系2和4顯示于80%的雄性不育。在2組中，不育性表現(xiàn)在近交系1(1.7%不育)和近交系3(3.4%不育)的一些植物中。在3組中未表現(xiàn)出雄性不育。在4組中，近交系1，2和4顯示出90%以上的雄性不育。一般來說，被認(rèn)為能育的穗狀雄花中所有的花藥完全開裂。但1組的近交系2和4的能育植物則是二個(gè)例外的情況，此外，穗狀雄花每一小穗上僅出現(xiàn)1-10個(gè)花藥，它們開裂且脫落花粉。其余花藥被包裹在小穗內(nèi)，沒有開裂。顯示出未開裂花藥的不育植物的穗狀雄花則多半包裹在小穗內(nèi)。顯微鏡觀察揭示，能育的穗狀雄花的花藥具有球形的能被染色的花粉粒，而不育的穗狀雄花的花藥具有不規(guī)則形狀的，且不能被染色的異?；ǚ?。在認(rèn)為是能育的，且僅有一些花藥開裂的穗狀雄花中，在未開裂的花藥中有大量異常花粉，而在開裂的花藥中有大量正?；ǚ?。6.12.1材料和方法6.12.1.1玉米種子來源長須前，用苗端袋(shoottipbag)覆蓋上述6.9節(jié)所述的實(shí)驗(yàn)中的所有四種基因型玉米植物的穗。俟穗長須后，進(jìn)行三種型式的雜交。從三種不同雜交型式衍生得到的種子構(gòu)成本實(shí)驗(yàn)中1-3組的種子。這三組和另一組的情況如下1組鑒定各近交系中的雄性不育后，除去苗端袋，在不育植物的穗的須上撒以花粉，后者取自在田間分開播種的未經(jīng)處理的同源型近交基因型植物。成熟時(shí)將穗收割下來。使種子與玉米芯分開，并將其干燥至含水量為15%的狀態(tài)。這批種子(稱作為綜合品種1或S1)作為1組2組使產(chǎn)生花粉(不育)的經(jīng)AMS/載體處理的植物自交。從這種自交衍生得到的種子被作為2組。3組使經(jīng)AMS/載體處理的雄性不育的近交系與非同源的、未經(jīng)處理的近交系之間雜交。雜交方式如下經(jīng)處理的近交系1×未經(jīng)處理的近交系3;經(jīng)處理的近交系2×未經(jīng)處理的近交系4;和經(jīng)處理的近交系4×未經(jīng)處理的近交系2。以這些雜交衍生得到的種子被作為3組。4組種子經(jīng)過傳代，包括與未經(jīng)處理的同源品系雜交的三個(gè)經(jīng)AMS/載體處理的雄性不育近交系(1，2和4)的各4個(gè)代。這批包括S1-S5代的種子被作為4組。使1-3組的種子從各穗上脫落，并將其包裝在種子袋中。對于每一種子袋給予一個(gè)與種子來源相應(yīng)的處理號(hào)碼。例如1和2組的處理號(hào)碼I1R1B1系指其近交系1，來自6，9節(jié)中所述實(shí)驗(yàn)的重復(fù)樣品1，并用AMS/載體處理劑B處理。3組中處理號(hào)碼的1個(gè)例子是TI1B1XUTl3，它相應(yīng)于用AMS/載體處理過的(B1處理)近交系1和未經(jīng)處理的近交系3的雜種。4組的處理號(hào)碼可列舉出I1S2或I1S4，分別相應(yīng)于近交系1的S2子代或近交系2的S4子代。對1-3組作了準(zhǔn)備，將穗進(jìn)行行植，并有二個(gè)重復(fù)樣品，4組也進(jìn)行行植，但僅種植一個(gè)重復(fù)樣品。6.12.1.2播種用種子的準(zhǔn)備將1-3組中從每個(gè)穗所得到的種子進(jìn)行計(jì)數(shù)，并將其分成二堆，每堆32粒，而每一堆播種一個(gè)重復(fù)樣品。在單個(gè)穗所產(chǎn)生的種子數(shù)不超過32粒時(shí)，則僅僅播種一個(gè)重復(fù)樣品。在種子上涂覆克菌丹(Captan)，這是一種可濕性殺菌劑(DragonChemicalCorporation，Roanoke，Virginia)。將克菌丹與水相混，制成薄糊狀。將4滿湯匙的克菌丹混合在1升水中，并用磁攪拌機(jī)對此溶液進(jìn)行攪拌。將每只袋中32粒種子全傾入一只浸在克菌丹一水混合物中的濾茶器內(nèi)。然后濾去過量的克菌丹，并將種子放在擦手紙上，以去除其表面過量的水分，并使之晾干2小時(shí)。將涂有克菌丹的種子包裝在先前標(biāo)有合適處理號(hào)碼的紙袋中。種子經(jīng)仔細(xì)包裝后，派人送到夏威夷。6.12.1.3試驗(yàn)田的特點(diǎn)試驗(yàn)田是在夏威夷州Waimanalo村邊的Waimanalo研究站。該研究站位于海平面上海拔20米處的平地上，處于北緯21°，離太平洋3浬遠(yuǎn)。土壤是從瑚瑚和火山侵入巖形成的VerticHaplustoll，被認(rèn)為是最佳的農(nóng)田。土壤的pH值平均為6.0。該站的年平均溫度為24℃，月平均溫度在22-27℃的范圍內(nèi)。年平均降雨量為1320毫米，但月平均值在10-180毫米范圍內(nèi)。冬季降雨較為頻繁。晝長10.8-13.2小時(shí)。風(fēng)多半是持續(xù)和和緩的，風(fēng)速為8-15公里/時(shí)，但有時(shí)達(dá)到25-30公里/時(shí)。入射光值平均在540卡/厘米2/天以上，但在多云的冬季可低達(dá)220卡/厘米2/天。6.12.1.4試驗(yàn)田準(zhǔn)備和管理對105英尺×120英尺的田進(jìn)行耕犁，用盤耙耕作和旋轉(zhuǎn)碎土。用施肥機(jī)將NPK(氮-磷-鉀)以150∶90∶60公斤/公頃的比例所組成的基肥施肥。出苗后4周，在行間以80公斤N/公頃的劑量施肥。根據(jù)需要，可在任何一個(gè)星期一、星期三或星期五澆田。6.12.1.5實(shí)驗(yàn)方案本實(shí)驗(yàn)方案是一種隨機(jī)的完整區(qū)組設(shè)計(jì)，1，2和3組中穗系行植，有二個(gè)重復(fù)樣品。4組的穗也是行植，但僅播種成一個(gè)重復(fù)樣品。在各個(gè)區(qū)組或重復(fù)樣品中，處理(穗成行植)是完全隨機(jī)的。在各重復(fù)樣品中，每一處理植物系播種成10尺長的行。每一行播種32粒種子，各種子間的間距約為4英寸。在各區(qū)組中，成列播種，每一列為20行。在各列內(nèi)，行與行的間距為3英尺。各列之間的間距交替成2英尺、4英尺、2英尺、4英尺等。在兩列之間隔開4英尺間距之處，橫行播種先鋒雜種304C。而兩列之間間距為2英尺之處，則不播種任何種子。6.12.1.6田間播種按照指定的隨機(jī)編號(hào)，每一行分配一袋種子。播種系用手推播種機(jī)，手工進(jìn)行。6個(gè)人每人有一臺(tái)播種機(jī)，在給定時(shí)間進(jìn)行播種。每人在給定時(shí)間內(nèi)播種一行。每行播種完畢后，用手清掃播種機(jī)，以確保除去塵土等，然后再移至播種另一行。播種系一列一列地進(jìn)行，例如先播種第1列中的1-20行，然后再移至播種第2列的21-40行。1組的重復(fù)樣品1中所有的行播種完后再種1組重復(fù)樣品2。2組的播種僅在1組的播種完畢之后才開始。同樣，3組是在2組完畢后才進(jìn)行播種。4組被播種在共有12行的一列中，在這12行中的處理是隨機(jī)的。1-4組的播種完畢后，將未經(jīng)處理的近交系1-4成行播種(每行種一個(gè)近交系)，每行100英尺長，以作為雜交用的花粉來源。另外4行未經(jīng)處理的近交系1-4系在一周后播種，作為花粉的來源。在實(shí)驗(yàn)區(qū)三邊的一個(gè)六行邊界上播種先鋒304C。四周后在第四邊播種玉米。6.12.1.7實(shí)驗(yàn)性參數(shù)6.12.1.7.1花粉的目視分級(jí)玉米植物出土后一周，進(jìn)行植物群叢計(jì)數(shù)。分級(jí)前，將嚴(yán)重矮化的和/或嚴(yán)重地感染了病毒或疾病的植物，以及死的植物棄去。對剩下的植物計(jì)數(shù)，并確定花粉能育或不育的等級(jí)。在穗狀雄花已自旗葉中顯現(xiàn)出來后(并在穗已開始長須后)將黑色硬紙板放在穗狀雄花下面并搖動(dòng)后者。若穗狀雄花將花粉脫落在黑紙上，則它被定為能育級(jí)。在黑紙上未顯示出可見花粉的穗狀雄花定為不育級(jí)。給能育的穗狀雄花加上紅線標(biāo)記，而不育的穗狀雄花給以黃線標(biāo)記。對于那些其花粉的脫落有疑問的穗狀雄花，則不分等級(jí)，但同時(shí)用黃線和紅線作為標(biāo)記?；ǚ鄣姆旨?jí)是在每天上午8時(shí)至下午12∶30這段時(shí)間內(nèi)進(jìn)行的，并持續(xù)3周。每天對所有這4組進(jìn)行檢查和分級(jí)，并對全部的穗狀雄花進(jìn)行檢驗(yàn)，以證實(shí)它們前些天的分級(jí)。那些同時(shí)具有黃和紅二種標(biāo)簽的穗狀雄花，若其清楚地符合分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，則將其定為能育級(jí)或不育級(jí)。對持有黃色標(biāo)簽的近交系1和2的不育性穗狀雄花的田間觀察結(jié)果分別示于圖14和15。在分級(jí)期末，在各行分別清點(diǎn)帶有黃色標(biāo)簽(不育)的植物，帶有紅色標(biāo)簽的植物(能育)，以及植物的總數(shù)。6.12.1.7.2對花藥和花粉特征的顯微鏡觀察從田間收集各近交系中能育和不育的穗狀雄花的代表性樣品。將花藥從穗狀雄花中切開，并用醋酸洋紅染色。記錄各代表性樣品中花藥和花粉的形態(tài)特征。6.12.1.7.3植物高度、穗高度和達(dá)到75%長須的天數(shù)之測定記下每一行的植物高度、穗高度和達(dá)到75%長須高度的天數(shù)。在一行內(nèi)測定一株普通植物的植物高度。植物高度是指自地面至穗狀雄花頂端的高度，用英寸表示。自地面至穗基部的高度為穗高度，以英寸表示。在一行內(nèi)測定一株普通植物的穗高度。當(dāng)一行內(nèi)75%的植物在穗上顯現(xiàn)出須毛時(shí)，則記下日期和該天的月份。在一行中自播種之日起至75%植物長須的天數(shù)作為75%長須的天數(shù)。6.12.1.8雜交過程當(dāng)穗能被肉眼看到，并在其顯現(xiàn)出須毛前，立即用白色透明的苗端袋將1-4組植物所有的穗予以覆蓋。在雜交前一天，用剪刀將谷穗上的須毛剪開。雜交時(shí)，撒開苗端袋的頂端，并將花粉撒在須毛上。將穗(剩下的苗端袋仍附著在穗上)覆以傳粉袋。袋上標(biāo)有近交系號(hào)碼、花粉來源、進(jìn)行雜交的日期、以及從事雜交工作的人員姓名。1-4組所進(jìn)行的雜交情況概括在ⅩLⅤⅡ中。表ⅩLⅤⅡ在1-4玉米組所進(jìn)行的雜交組雜交1(1)近交系不育植物×非AMS/載體的等基因品系(2)一些能育植物的自交2(1)近交系不育植物×非AMS/載體的等基因品系(2)一些能育植物的自交3(1)一些自交4(1)近交系不育植物×非AMS/載體的等基因品系(2)一些能育植物的自交6.12.1.9收集數(shù)據(jù)和統(tǒng)計(jì)分析對于每一處理行，記錄下述數(shù)據(jù)植物總數(shù)、被測植物總數(shù)、能育植物數(shù)目、不育植物數(shù)目、不育植物的百分?jǐn)?shù)、植物高度、穗高度、以及達(dá)到75%植物長須的天數(shù)。按照完全隨機(jī)性區(qū)組設(shè)計(jì)，對1組進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。對2-4組的每一處理提供平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。6.12.2結(jié)果和討論6.12.2.1雄性不育的遺傳性在1和4組，對玉米后代中AMS/載體誘導(dǎo)的雄性不育的遺傳性進(jìn)行了鑒定。6.12.2.1.11組種子是由雄性不育植物(由AMS/載體誘導(dǎo))與來自未經(jīng)處理的同源近交基因型的花粉雜交所得到。在近交系2和4中，因有80%以上的植物是不育的(表ⅩLⅤⅢ和ⅩLⅠⅩ)由此證明了AMS/載體誘導(dǎo)的雄性不育的遺傳性。在近交系1中，在全部植物中僅有17%的植物是雄性不育的。6.12.2.1.24組驗(yàn)證4組中近交系1，2和4的4代(S2，S3S4和S5)的雄性不育的遺傳性，結(jié)果表明，每一代中90%以上的植物為雄性不育(表L)。6.12.2.1.32組在2組中，雄性不育僅在近交系1(1.7%不育)和3(3.4%不育)的一些植物中(表LⅠ)表現(xiàn)。該組的種子系由最初經(jīng)AMS/載體處理后不能轉(zhuǎn)化為不育性的植物自交得到。6.12.2.1.43組由經(jīng)AMS/載體處理的近交基因型和非同源的未處理的近交系之間雜交所得到的雜種未表現(xiàn)出雄性不育(表LⅡ)6.12.2.1.5未處理的對照物在無AMS/載體(未經(jīng)處理的對照物)的近交植物中未觀察到雄性不育(表LⅢ)。表ⅩLⅤⅢ采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)的方差分析，從屬變量α的區(qū)組因子(重復(fù)實(shí)驗(yàn))、主要影響(近交和處理)和相互作用的顯著性水平百分不植物穗高度達(dá)到75％長育率高度須的天數(shù)重復(fù)實(shí)驗(yàn)(區(qū)組)(.1245)(.0002)**(.0703)(.0001)**(1,2)近交(.0001)**(.0001)**(.0001)**(.0001)**(1，2，4)處理(.1817)(.2919)(.1175)(.1786)(B1,B4,B5,B6)近交(.1038)(.2090)(.5284)(.0158)處理α用“＊＊”表示十分顯著的結(jié)果(P小于或等于0.01);而用“＊”表示P小于或等于0.05(1組)表ⅩLⅠⅩ對不同種類近交系各從屬變量的Duncan′s多重范圍試驗(yàn)結(jié)果α從屬變量不同種類近交系的均值近交系2近交系4近交系1百分不育率(95.4)(85.3)(16.8)植物高度近交系1近交系2近交系4(69.4)(63.4)(61.9)穗高度近交系2近交系1近交系4(23.8)(21.5)(21.1)到達(dá)75%長須近交系2近交系4近交系1的天數(shù)(74.2)(73.9)(69.4)a在下面用相同粗線劃出的值無顯著差異，P小于或等于0.051組)表LⅠ2組中近交系組的應(yīng)答變量的數(shù)據(jù)的均值、標(biāo)準(zhǔn)偏差和樣品大小(N)從屬變量近交系百分不育率植物高度穗高度到達(dá)75%長須期的天數(shù)11.7±6.566.9±4.620.3±2.771.4±1.9n＝31n＝31n＝31n＝3133.4±6.858.9±3.715.6±2.571.9±1.0n＝17n＝17n＝17n＝1740.0±0.068.2±6.319.3±0.872.0±0.0n＝2n＝2n＝2n＝2表LⅡ3組中近交系雜種的應(yīng)答變量的數(shù)據(jù)的均值、標(biāo)準(zhǔn)偏差和樣品大小從屬變量近交系百分不育率植物高度穗高度到達(dá)70%長須期的天數(shù)1×30.0±0.094.1±5.828.8±3.268.4±0.5n＝12n＝12n＝12n＝122×40.0±0.091.2±6.132.5±3.769.3±1.1n＝26n＝26n＝26n＝264×20.0±0.092.9±2.931.0±3.869.3±1.4n＝6n＝6n＝6n＝6表LⅢ在近交系1，2，3和4的無AMS/載體(未處理的對照物)材料中的百分不育率、植物高度、穗高度和到達(dá)75%長須的天數(shù)近交植物能育不育%不植物穗高到達(dá)長須系總數(shù)數(shù)數(shù)育數(shù)高度度期的天數(shù)1241241006920712225225006120743310310005517744204204006424746.12.2.2花粉不育性和能育性的形態(tài)特征6.12.2.2.1目視特征在各近交系的有代表性的能育和不育植物中，對穗狀雄花的形態(tài)進(jìn)行了目視觀察(圖16和17)。6.12.2.2.1.11組在1組中，近交系2和4形成3種不同類型的花穗。在第一種類型的花穗中，未從小穗中顯現(xiàn)出花藥，而搖動(dòng)穗狀雄花時(shí)，無花粉脫落。這類穗狀雄花定為不育。在第二種類型中，僅有1-10個(gè)花藥從一個(gè)穗狀雄花中顯現(xiàn)出來，并開裂和有花粉脫落。這些穗狀雄花定為能育。在第三種類型中，每一穗狀雄花中的全部花藥均自小穗中顯現(xiàn)出來，并開裂和脫落大量的花粉。這些也被定為能育級(jí)。在1組中的近交系2和4各自僅有二個(gè)穗狀雄花屬于后一范疇。在近交系1中，定為不育級(jí)的植物在其穗狀雄花上可見的花藥，也無花粉脫落。定為能育級(jí)的植物有花藥自小穗中顯現(xiàn)出來，并顯示有大量花粉從花藥中脫落下來。在近交系1的一些植物中，花粉的脫落被延遲，在某些情況下必須對等級(jí)進(jìn)行修正。6.12.2.2.1.22組該組中屬于所有近交系的，定為能育等級(jí)的植物，其穗狀雄花帶有開裂的花藥，并有大量花粉脫落。而定為不育的植物，其所有的花藥均被裹在小穗內(nèi)，并無花粉脫落。6.12.2.2.1.33組3組中所有植物均有帶開裂花藥的穗狀雄花，花藥中有大量花粉脫落。6.12.2.2.1.44組定為不育級(jí)的穗狀雄花無花藥自小穗中顯現(xiàn)出來，也無花粉脫落。定為能育的植物有完全裂開的花藥和大量花粉脫落。6.12.2.2.1.5未處理的對照組所有穗狀雄花均有完全裂開的花藥，并有大量花粉脫落。6.12.2.2.2顯微特征用醋酸洋紅對定為能育或不育等級(jí)的穗狀雄花的代表性樣品的花藥染色，然后檢查其在花藥和花粉特性方面的差異(圖18-22)。6.12.2.2.2.11組凡花藥全開裂的，且花粉大量沖掉的穗狀雄花一般顯現(xiàn)出看上去正常的大而球形的花粉，其細(xì)胞質(zhì)染上的醋酸洋紅的顏色很深。凡僅有1-10個(gè)花藥自小穗中顯現(xiàn)出來，且開裂的穗狀雄花，則其僅在顯露和開裂的花藥中顯現(xiàn)出看上去正常的球形花粉粒，并有致密的細(xì)胞質(zhì)。在同樣的穗狀雄花中，保留在小穗中的，且不開裂的花藥，它顯現(xiàn)出異常的，不規(guī)則形狀的花粉，而且可染色的細(xì)胞質(zhì)非常少。一些未開裂的花藥中間凸出，而該凸出部分充滿看上去正常的花粉粒，而花藥的其余部分包含異常的花粉。在近交系1和2中，定為不育的穗狀雄花具有未開裂的，含有異?；ǚ鄣幕ㄋ?。用玻璃棒壓碎花藥有助于花藥釋放花粉粒。然而，在近交系4中，花藥內(nèi)未發(fā)現(xiàn)花粉粒。因此，在所有三個(gè)近交系中，與雄花不育相關(guān)的區(qū)組似乎處在造孢組織分化的狀態(tài)?；ㄋ幉婚_裂與存在異?；ǚ刍驘o花粉之間也有密切的聯(lián)系。6.12.2.2.2.22組顯微觀察揭示，所有定為能育的穗狀雄花，其花藥具有球形的大花粉粒，并有濃染色的細(xì)胞質(zhì)。定為不育的穗狀雄花的花藥不開裂，并有異常的，形狀不規(guī)則的，且不能染色的花粉。6.12.2.2.2.33組3組的全部穗狀雄花均定為能育?；ㄋ庨_裂?；ǚ哿３是蛐?，并具有濃染色的細(xì)胞質(zhì)。6.12.2.2.2.44組定為能育的穗狀雄花，其花藥顯現(xiàn)出正常的球形花粉，并有深染色的細(xì)胞質(zhì)。而定為不育的那些穗狀雄花具有未開裂的花藥，并含有異常花粉。6.12.2.2.2.5未處理的對照組所有4個(gè)近交系未經(jīng)處理的對照組植物的花粉粒均是球形的，并有致密的細(xì)胞質(zhì)，后者可用醋酸洋紅染成深紅色。6.12.2.3數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析6.12.2.3.11組已注意到，測量不育百分?jǐn)?shù)變量方面近交系之間有十分顯著的差異。也已注意到，在測量植物高度、穗高度、達(dá)到75%長須天數(shù)的特征方面，近交系之間有著差異。同時(shí)觀察到在所有四個(gè)從屬變量上，重復(fù)區(qū)(區(qū)組)之間有強(qiáng)至中等的影響(P＝0.0001至0.1245)，最小影響是在不育百分率的變量上(表ⅩLⅤⅢ)。對于四個(gè)從屬變量中任一個(gè)來說，顯然對前一代值物進(jìn)行AMS/載體處理(上述6，9節(jié)中的B1、B4、B5和B6)，對這一代無顯著影響。Duncan′s多重范圍試驗(yàn)也表現(xiàn)出類似的傾向(表ⅩLⅣ)。所有三種近交系的不育百分?jǐn)?shù)變量的平均值有顯著的差異。近交系1的植物高度明顯地不同于近交系2和4。近交系2和4的到達(dá)長須天數(shù)的從屬變量與近交系1的相應(yīng)變量有顯著的差異。6.12.2.3.22組和3組計(jì)算出2組和3組的所有從屬變量的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。在2組中，近交系1和3分別顯現(xiàn)出1.7%和3.4%的雄性不育植物。在3組中未發(fā)現(xiàn)有雄性不育的植物。有關(guān)其他從屬變量未發(fā)現(xiàn)引人注意的趨勢(表LⅠ和LⅡ)。6.12.2.3.34組該組無任何重復(fù)實(shí)驗(yàn)，將實(shí)際值列于表L中。7種子保藏下列種子已被保藏在Rockville，MD的美國典型培養(yǎng)物保藏中心，并已獲得所列的登記號(hào)種子說明登記號(hào)AMS1.29苜蓿AMS/載體源1.29(從40352U.S.D.A得到，PINo.223386)與保持株植物之間的雜交種B73-AMSZeamaysL.玉米的雄性不40350育B73Ht品種;經(jīng)AMS/載體處理無性誘導(dǎo)了雄性不育Mo17-AMSZeamaysL.玉米的雄性不育40351Mo17Ht品種，經(jīng)AMS/載體處理無性誘導(dǎo)了雄性不育A632-AMSZeamaysL.玉米的雄性不育40349A632Ht品種，經(jīng)AMS/載體處理無性誘導(dǎo)了雄性不育鑒于保存的實(shí)物純碎是用于本發(fā)明的一個(gè)方面進(jìn)行說明，因此本發(fā)明并不限于所保藏的具體種子的范圍，任何具有同等功能的種子均在本發(fā)明的范圍內(nèi)。事實(shí)上，根據(jù)上述說明書和附圖，除本文所表示和描述以外，本發(fā)明的各種變換對該
技術(shù)領(lǐng)域：
的熟練人員均是顯而易見的。這類變換將落在所附權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。權(quán)利要求1.一種AMS/載體，其特征在于它包括一個(gè)從供體植物中得到的胞質(zhì)因子，此因子(a)能夠在一個(gè)受體植物中無性誘導(dǎo)可遺傳的雄性不育性；(b)其后可從此受體植物中得到的；以及(c)存在于供體植物或者受體植物的提取物中，提取物又包括一個(gè)分子量約為1×106道爾頓的核酸和一個(gè)約為40-110毫微米(nm)的顆粒。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的AMS/載體，其特征在于供體植物是苜蓿植物。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的AMS/載體，其特征在于苜蓿植物具有U.S.D.A.植物序號(hào)(PINo.)172429。4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的AMS/載體，其特征在于苜蓿植物具有U.S.D.A.植物序號(hào)173733。5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的AMS/載體，其特征在于苜蓿植物具有U.S.D.A.植物序號(hào)221469。6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的AMS/載體，其特征在于苜蓿植物具有U.S.D.A.植物序號(hào)223386。7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的AMS/載體，其特征在于苜蓿植物具有U.S.D.A.植物序號(hào)243223。8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的AMS/載體，其特征在于苜蓿植物包括植物AMS1.29，保藏在ATCC，所給登錄號(hào)40352。9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的AMS/載體，其特征在于供體植物是玉米植物。10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的AMS/載體，其特征在于供體植物是大豆植物。11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的AMS/載體，其特征在于供體植物是高梁植物。12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的AMS/載體，其特征在于供體植物是向日葵植物。13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的AMS/載體，其特征在于供體植物是粟植物。14.根據(jù)權(quán)利要求1所述的AMS/載體，其特征在于供體植物是番茄植物。15.一種能夠在植物中誘導(dǎo)雄性不育性的植物提取物，其特征在于它包括一種非致死緩沖液和從供體植物中得到的胞質(zhì)因子，此因子(a)能夠在一個(gè)受體植物中無性誘導(dǎo)可遺傳的雄性不育性;(b)其后可從受體植物中得到的;以及(c)存在于供體植物或者受體植物或者受體植物的提取物中，提取物又包括一個(gè)分子量為1×106道爾頓的核酸和一個(gè)約為40-110毫微米的顆粒。16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的提取物，其特征在于供體植物是苜蓿植物。17.根據(jù)權(quán)利要求15所述的提取物，其特征在于供體植物是玉米植物。18.根據(jù)權(quán)利要求15所述的提取物，其特征在于供體植物是大豆植物。19.根據(jù)權(quán)利要求15所述的提取物，其特征在于供體植物是高粱植物。20.根據(jù)權(quán)利要求15所述的提取物，其特征在于供體植物是向日葵植物。21.根據(jù)權(quán)利要求15所述的提取物，其特征在于供體植物是是粟植物。22.根據(jù)權(quán)利要求15所述的提取物，其特征在于供體植物是番茄植物。23.一種雄性不育性植物，其特征在于它包括一種業(yè)已用權(quán)利要求1的AMS/載體無性誘導(dǎo)成可遺傳的雄性不育性的植物。24.一種雄性不育性植物，其特征在于它包括一種業(yè)已用權(quán)利要求2的AMS/載體無性誘導(dǎo)成可遺傳的雄性不育性的植物。25.一種雄性不育性植物，其特征在于它包括一種業(yè)已用權(quán)利要求3、4、5、6、7或8的AMS/載體無性誘導(dǎo)成可遺傳的雄性不育性的植物。26.根據(jù)權(quán)利要求23所述的植物，其特征在于它是一種苜蓿植物。27.根據(jù)權(quán)利要求23所述的植物，其特征在于它是一種玉米植物。28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的植物，其特征在于玉米植物包括B73-AMS，保藏在ATCC，所給登錄號(hào)40350。29.根據(jù)權(quán)利要求27所述的植物，其特征在于玉米植物包括Mol7-AMS，保藏在ATCC，所給登錄號(hào)40351。30.根據(jù)權(quán)利要求27所述的植物，其特征在于玉米植物包括A632-AMS，保藏在ATCC，所給登錄號(hào)40349。31.根據(jù)權(quán)利要求23所述的植物，其特征在于它是大豆植物。32.根據(jù)權(quán)利要求23所述的植物，其特征在于它是高粱植物。33.根據(jù)權(quán)利要求23所述的植物，其特征在于它是向日葵植物。34.根據(jù)權(quán)利要求23所述的植物，其特征在于它是粟植物。35.根據(jù)權(quán)利要求23所述的植物，其特征在于它是番茄植物。36.根據(jù)權(quán)利要求23所述的植物，其特征在于它是小麥植物。37.根據(jù)權(quán)利要求23所述的植物，其特征在于它是棉花植物。38.根據(jù)權(quán)利要求23所述的植物，其特征在于它是稻米植物。39.一種后代植物，其特征在于它由權(quán)利要求23、24、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37或38的植物通過無性繁殖獲得的。40.根據(jù)權(quán)利要求39所述述的后代植物，其特征在于所說的繁殖是細(xì)胞培養(yǎng)方法。41.根據(jù)權(quán)利要求39所述述的后代植物，其特征在于所說的繁殖是無性繁殖。42.一種種子，其特征在于它由權(quán)得利要求23或者24的植物與一個(gè)維持植物雜交得到的。43.一種種子，其特征在于它由權(quán)得利要求25的植物與一個(gè)維持植物雜交得到的。44.一種種子，其特征在于它由權(quán)得利要求26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37或38的植物與一個(gè)維持植物雜交得到的。45.一種后代植物，其特征在于它由權(quán)利要求42的種子生成的。46.一種后代植物，其特征在于它由權(quán)利要求43的種子生成的。47.一種后代植物，其特征在于它由權(quán)利要求44的種子生成的。48.一種在受體植物中無性誘導(dǎo)雄性不育性的方法，其特征在于它包括把權(quán)利要求1的AMS/載體應(yīng)用于所說的受體植物。49.一種在受體植物中無性誘導(dǎo)雄性不育性的方法，其特征在于它包括把權(quán)利要求2的AMS/載體應(yīng)用于所說的受體植物。50.一種在受體植物中無性誘導(dǎo)雄性不育性的方法，其特征在于它包括把權(quán)利要求8的AMS/載體應(yīng)用于所說的受體植物。51.一種在受體植物中無性誘導(dǎo)雄性不育性的方法，其特征在于它包括把權(quán)利要求15的提取物應(yīng)用于所說的受體植物。52.根據(jù)權(quán)利要求48、49、50或51所述的方法，其特征在于所說的應(yīng)用是用注射方式。53.根據(jù)權(quán)利要求48、49、50或51所述的方法，其特征在于所說的應(yīng)用是用噴灑方式。54.根據(jù)權(quán)利要求48、49、50或51所述的方法，其特征在于所說的應(yīng)用是用組織培養(yǎng)方式。55.根據(jù)權(quán)利要求48、49、50或51所述的方法，其特征在于所說的應(yīng)用是用電刺激方式。56.根據(jù)權(quán)利要求48、49、50或51所述的方法，其特征在于受體植物是苜蓿植物。57.根據(jù)權(quán)利要求48、49、50或51所述的方法，其特征在于受體植物是玉米植物。58.根據(jù)權(quán)利要求48、49、50或51所述的方法，其特征在于受體植物是大豆植物。59.根據(jù)權(quán)利要求48、49、50或51所述的方法，其特征在于受體植物是高粱植物。60.根據(jù)權(quán)利要求48、49、50或51所述的方法，其特征在于受體植物是向日葵植物。61.根據(jù)權(quán)利要求48、49、50或51所述的方法，其特征在于受體植物是粟植物。62.根據(jù)權(quán)利要求48、49、50或51所述的方法，其特征在于受體植物是番茄植物。63.根據(jù)權(quán)利要求48、49、50或51所述的方法，其特征在于受體植物是小麥植物。64.根據(jù)權(quán)利要求48、49、50或51所述的方法，其特征在于受體植物是棉花植物。65.根據(jù)權(quán)利要求48、49、50或51所述的方法，其特征在于受體植物是稻米植物。66.一種形成F1雜種的方法，其特征在于它包括父本植物與作為母本的權(quán)利要求23或24的植物雜交。67.一種形成F1雜種的方法，其特征在于它包括父本植物與作為母本的權(quán)利要求25的植物雜交。68.一種形成F1雜種的方法，其特征在于它包括父本植物與作為母本的權(quán)利要求45的植物雜交。69.一種形成F1雜種的方法，其特征在于它包括父本植物與作為母本的權(quán)利要求46的植物雜交。70.一種形成F1雜種的方法，其特征在于它包括父本植物與作為母本的權(quán)利要求47的植物雜交。71.一種形成F1雜種，其特征在于它按權(quán)利要求66的方法生成。72.一種形成F1雜種，其特征在于它按權(quán)利要求67的方法生成。73.一種形成F1雜種，其特征在于它按權(quán)利要求68的方法生成。74.一種形成F1雜種，其特征在于它按權(quán)利要求69的方法生成。75.一種形成F1雜種，其特征在于它按權(quán)利要求70的方法生成。76.根據(jù)權(quán)利要求71所述的F1雜種，其特征在于它是雄性不育性的。77.根據(jù)權(quán)利要求72所述的F1雜種，其特征在于它是雄性不育性的。78.根據(jù)權(quán)利要求73所述的F1雜種，其特征在于它是雄性不育性的。79.根據(jù)權(quán)利要求74所述的F1雜種，其特征在于它是雄性不育性的。80.根據(jù)權(quán)利要求75所述的F1雜種，其特征在于它是雄性不育性的。81.根據(jù)權(quán)利要求71所述的F1雜種，其特征在于它是雄性能育性的。82.根據(jù)權(quán)利要求72所述的F1雜種，其特征在于它是雄性能育性的。83.根據(jù)權(quán)利要求73所述的F1雜種，其特征在于它是雄性能育性的。84.根據(jù)權(quán)利要求74所述的F1雜種，其特征在于它是雄性能育性的。85.根據(jù)權(quán)利要求75所述的F1雜種，其特征在于它是雄性能育性的。86.一種權(quán)利要求71的F1雜種的種子。87.一種權(quán)利要求72的F1雜種的種子。88.一種權(quán)利要求73的F1雜種的種子。89.一種權(quán)利要求74的F1雜種的種子。90.一種權(quán)利要求75的F1雜種的種子。91.一種權(quán)利要求76的F1雜種的種子。92.一種權(quán)利要求77的F1雜種的種子。93.一種權(quán)利要求78的F1雜種的種子。94.一種權(quán)利要求79的F1雜種的種子。95.一種權(quán)利要求80的F1雜種的種子。96.一種權(quán)利要求81的F1雜種的種子。97.一種權(quán)利要求82的F1雜種的種子。98.一種權(quán)利要求83的F1雜種的種子。99.一種權(quán)利要求84的F1雜種的種子。100.一種權(quán)利要求85的F1雜種的種子。101.一種在受體植物中誘導(dǎo)無融合生殖的方法，其特征在于它包括把權(quán)利要求1的AMS/載體的有效量應(yīng)用于所說的受體植物。102.一種在受體植物中誘導(dǎo)無融合生殖的方法，其特征在于它包括把權(quán)利要求2的AMS/載體應(yīng)用于所說的受體植物。103.一種在受體植物中誘導(dǎo)無融合生殖的方法，其特征在于它包括把權(quán)利要求8的AMS/載體應(yīng)用于所說的受體植物。104.一種在受體植物中誘導(dǎo)無融合生殖的方法，其特征在于它包括把權(quán)利要求15的AMS/載體應(yīng)用于所說的受體植物。105.根據(jù)權(quán)利要求101、102、103或104所述的方法，其特征在于所說的應(yīng)用是以噴灑方式。106.根據(jù)權(quán)利要求101、102、103或104所述的方法，其特征在于所說的應(yīng)用是以注射方式。107.根據(jù)權(quán)利要求101、102、103或104所述的方法，其特征在于所說的應(yīng)用是以組織培養(yǎng)方式。108.根據(jù)權(quán)利要求101、102、103或104所述的方法，其特征在于所說的應(yīng)用是以電刺激方式。109.根據(jù)權(quán)利要求101、102、103或104所述的方法，其特征在于受體植物是苜蓿植物。110.根據(jù)權(quán)利要求101、102、103或104所述的方法，其特征在于受體植物是玉米植物。111.根據(jù)權(quán)利要求101、102、103或104所述的方法，其特征在于受體植物是高粱植物。112.根據(jù)權(quán)利要求101、102、103或104所述的方法，其特征在于受體植物是向日葵植物。113.根據(jù)權(quán)利要求101、102、103或104所述的方法，其特征在于受體植物是粟植物。114.根據(jù)權(quán)利要求101、102、103或104所述的方法，其特征在于受體植物是番茄植物。115.根據(jù)權(quán)利要求101、102、103或104所述的方法，其特征在于受體植物是小麥植物。116.根據(jù)權(quán)利要求101、102、103或104所述的方法，其特征在于受體植物是棉花植物。117.根據(jù)權(quán)利要求101、102、103或104所述的方法，其特征在于受體植物是稻米植物。118.一種生成無融合雜種的方法，其特征在于它包括用權(quán)利要求1的AMS/載體有效量處理所說的雜種的第一親本植物系，以及使所說的第一親本植物系與第二親本植物系雜交，獲得雜種種子。119.根據(jù)權(quán)利要求118所述的方法，其特征在于它包括進(jìn)一步使雜種種子生長，產(chǎn)生成熟植物，以及鑒定那些具有無融合生殖性質(zhì)的植物。120.根據(jù)權(quán)利要求118所述的方法，其特征在于它包括進(jìn)一步從經(jīng)鑒定的植物中獲得雜種種子。121.根據(jù)權(quán)利要求118、119或120所述的方法，其特征在于所說的植物是苜蓿植物。122.根據(jù)權(quán)利要求118、119或120所述的方法，其特征在于所說的植物是玉米植物。123.根據(jù)權(quán)利要求118、119或120所述的方法，其特征在于所說的植物是大豆植物。124.根據(jù)權(quán)利要求118、119或120所述的方法，其特征在于所說的植物是高粱植物。125.根據(jù)權(quán)利要求118、119或120所述的方法，其特征在于所說的植物是向日葵植物。126.根據(jù)權(quán)利要求118、119或120所述的方法，其特征在于所說的植物是粟植物。127.根據(jù)權(quán)利要求118、119或120所述的方法，其特征在于所說的植物是番茄植物。128.根據(jù)權(quán)利要求118、119或120所述的方法，其特征在于所說的植物是小麥植物。129.根據(jù)權(quán)利要求118、119或120所述的方法，其特征在于所說的植物是棉花植物。130.根據(jù)權(quán)利要求118、119或120所述的方法，其特征在于所說的植物是稻米植物。131.用權(quán)利要求118的方法生成的雜種種子。132.用權(quán)利要求120的方法生成的雜種種子。133.一種雜種植物，其特征在于它用權(quán)利要求119的方法生成，以及它的直系后代。134.根據(jù)權(quán)利要求131所述的種子，其特征在于所說的植物選自由玉米、苜蓿、大豆、高粱、向日葵、粟、番茄、小麥、棉花以及稻米組成的組。135.根據(jù)權(quán)利要求132所述的種子，其特征在于所說的植物選自由玉米、苜蓿、大豆、高粱、向日葵、粟、番茄、小麥、棉花以及稻米組成的組。136.根據(jù)權(quán)利要求133所述的種子，其特征在于所說的植物選自由玉米、苜蓿、大豆、高粱、向日葵、粟、番茄、小麥、棉花以及稻米組成的組。137.一種把一個(gè)生物活性分子胞內(nèi)輸送給植物的方法，其特征在于它包括應(yīng)用與權(quán)利要求1的AMS/載體有關(guān)的大約為40-110毫微米的顆粒，所說的顆粒含有一個(gè)生物活性分子。138.一種植物輸送系統(tǒng)，其特征在于它包括一個(gè)來自苜蓿植物的大約為40-110毫微米的顆粒，該苜蓿植物可選自由具有U.S.D.A.植物序號(hào)為172429、173733、221469、223386和243223的植物組成的組。139.一種在一個(gè)植物中表達(dá)一段異種基因順序的方法，其特征在于它包括應(yīng)用權(quán)利要求1的大約1×106道爾頓的核酸，所說的核酸包括在所說的植物中能夠表達(dá)的一段異種基因順序。140.一種植物表達(dá)載體，其特征在于它包括一段來自苜蓿植物的分子量大約為1×106道爾頓的核酸，該苜蓿植物可選自由具有U.S.D.A.植物序號(hào)為172429、173733、221469、223386和243223的植物組成的組。141.一種權(quán)利要求140的表達(dá)載體的突變體，衍生物或者片段。全文摘要本發(fā)明涉及無性誘導(dǎo)植物可貴傳的雄性不育性和無融合生殖的方法。還針對可從某些植物得到的因子，當(dāng)應(yīng)用于某些受體植物時(shí)，在該受體中誘導(dǎo)可貴傳的雄性不育性。這種能無性傳遞的雄性不育性因子，稱為AMS/載體，存在于某些雄性不育苜蓿植物的提取物中，在提取物中它們與唯一的分子量約為1×10文檔編號(hào)C12N15/09GK1040123SQ8910056公開日1990年3月7日申請日期1989年1月28日優(yōu)先權(quán)日1988年7月27日發(fā)明者埃利·瓊斯·馬克森,諾曼·帕特里克·馬克森申請人:馬克斯?fàn)枴ず２祭锲澒?