專利名稱：膦酸代謝植物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明總的來講涉及植物的除草劑抗性，更具體地講涉及一類新的膦酸(phosphonate)代謝基因，以及涉及應(yīng)用這些基因改進(jìn)植物對膦酸除草劑(phosphonate herbicide)耐性的方法。
現(xiàn)有技術(shù)的描述含磷有機(jī)分子可以是天然存在的或合成衍生的。含磷-碳(C-P)鍵有機(jī)分子也在自然界發(fā)現(xiàn)或作為合成化合物，它如果多少被天然酶途徑降解，也通常不是被快速降解。含有直接碳-磷(C-P)鍵取代更通常已知的磷酸酯的碳-氧-磷鍵的合成的有機(jī)膦酸化合物和次膦酸化合物(Metcalf等，Gene 12927-32，1993)因此已經(jīng)廣泛地用作殺蟲劑、抗生素和除草劑(Chen等，J.Biol.Chem.2654461-4471，1990；Hilderbrand等，The role of phosphonates in living systems，Hilderbrand，R.L.編輯，第5-29頁，CRC Press.Inc.，Boca Raton.FL，1983)。膦酸在自然界中普遍存在，膦酸被單獨發(fā)現(xiàn)和在多種生物中的多種多樣的大分子結(jié)構(gòu)中發(fā)現(xiàn)(Jiang等，J.Bacteriol.1776411-6421，1995)。膦酸分子的降解通過多種已知途徑-C-P裂解酶途徑、膦酸酶途徑和C-N水解途徑進(jìn)行(Wanner，Biodegradation 5175-184，1994；Barry等，美國專利第5,463,175號，1995)。已經(jīng)鑒定了能夠進(jìn)行這些步驟的細(xì)菌分離物(Shinabarger等，J.Bacteriol.168702-707，1986；Kishore等，J.Biol Chem.26212，164-12,168，1987；Pipke等，Appl.Environ.Microbiol.541293-1296，1987；Jacob等，Appl. Environ.Microbiol.542953-2958，1988；Lee等，J.Bacteriol.1742501-2510，1992；Dumora等，Biochim.Biophys.Acta997193-198，1989；Lacoste等，J.Gen Microbiol.1381283-1287，1992)。然而，除膦酸酶和草甘膦氧化酶(GOX)外，尚未鑒定能夠進(jìn)行這些反應(yīng)的其它酶。
幾項研究一直集中于鑒定膦酸的C-P裂解酶降解所需的基因。Wackett等(J.Bacteriol.169710-717，1987)公開了放射形土壤桿菌(Agrobacterium radiobacter)對膦酸降解的廣泛的底物特異性以及具體利用草甘膦作為唯一磷酸源。Shinabarger等和Kishore等公開了假單胞菌屬物種將膦酸除草劑草甘膦通過肌氨酸中間體經(jīng)C-P裂解酶降解為甘氨酸和無機(jī)磷酸。
先前已經(jīng)表明，大腸桿菌B菌株能夠利用膦酸(Chen等)，而大腸桿菌K-12菌株不能降解膦酸。然而，隨后表明，K-12菌株含有一組完整的能夠利用膦酸的隱蔽性基因(psiD或phn)(Makino等)，因為根據(jù)在含甲基膦酸或乙基膦酸作為唯一磷源的低磷酸培養(yǎng)基上的生長，容易選擇出突變體。隨后表明，適應(yīng)于在甲基膦酸或乙基膦酸上生長的這樣的K-12菌株能夠利用其它膦酸作為唯一磷源(Wackett等，J.Bacteriol.1691753-1756，1987)。
Avila等(J.Am.Chem.Soc.1096758-6764，1987)關(guān)心與氨甲基膦酸相關(guān)的生物降解和解毒過程的機(jī)制評估，包括闡明中間體、產(chǎn)物和降解性去磷酸化過程的機(jī)制。Avila等研究了由先前適應(yīng)于在乙基膦酸上生長的大腸桿菌K-12培養(yǎng)物中的多種氨基膦酸底物生成去磷酸化生物降解產(chǎn)物。此外，Avila等在某些研究中利用N-乙酰-AMPA(N-乙酰-氨基-甲基-膦酸)作為唯一磷酸源，以便表明乙酰化AMPA對于C-P鍵裂解不是抑制性的。另外，Avila等注意到，N-乙酰-AMPA在大腸桿菌K-12生長期間能夠充當(dāng)唯一磷酸源，然而，當(dāng)將AMPA用作唯一磷酸源時，他們沒有觀察到N-乙酰-AMPA的生成。他們的結(jié)果表明，AMPA在大腸桿菌中不是乙?；牡孜?。
Chen等通過互補(bǔ)克隆到膦酸利用缺陷的大腸桿菌K-12菌株中，這使得所述K-12菌株能夠利用膦酸作為唯一磷酸源，從大腸桿菌B中鑒定出功能性psiD基因座(J.Biol.Chem.2654461-4471，1990)。Chen等因此公開了在15.5kb BamHI片段上鑒定出的psiD互補(bǔ)性基因座的DNA序列，含有17個可讀框，命名為phnA-phnQ，包含大腸桿菌B的phn操縱子。隨后發(fā)現(xiàn)大腸桿菌K-12的隱蔽性phn(psiD)操縱子在phnE中含有一個8個堿基對的插入。導(dǎo)致phnE中移碼，這不僅產(chǎn)生缺陷型phnE基因產(chǎn)物，而且明顯引起對該操縱子中下游基因表達(dá)的極性效應(yīng)，這防止膦酸利用(Makino等，J.Bacteriol.1732665-2672，1991)。Makino等的研究已經(jīng)更精確地描述該操縱子含有基因phnC-phnP。進(jìn)一步的研究已經(jīng)涉及對該操縱子中每個基因的功能性質(zhì)的了解(Chen等，J.Biol.Chem.2654461-4471，1990；Makino等，J.Bacteriol.1732665-2672，1991；Wanner等，F(xiàn)EMS Microbiol.Lett.100133-140，1992；Metcalf等，Gene 12927-32，1993；Ohtaki等，Actinomyceteol.866-68，1994)。在所有這些研究中，已經(jīng)根據(jù)與含結(jié)構(gòu)螺旋-回折-螺旋基序的其它核苷酸結(jié)合蛋白的相似性，暗示phnO基因作為調(diào)節(jié)蛋白。此外，phn操縱子中基因的誘變證明至少對于所測試的膦酸，phnO不是膦酸利用所需的，這進(jìn)一步支持了所提出的該基因的調(diào)節(jié)功能(Metcalf等，J.Bacteriol.173587-600，1991)。已經(jīng)從其它細(xì)菌中鑒定出同源phn序列，包括與大腸桿菌phnO基本上相似的基因，采用由大腸桿菌phnO基因的核苷酸序列推導(dǎo)出的核苷酸序列，從S.griseus中分離出該基因(Jiang等，J.Bacteriol.1776411-6421，(1995)；McGrath等，Eur，J.Biochem.234225-230(1995)；Ohtaki等，Actinomyceteol.866-69(1994))。然而，關(guān)于phnO，除作為調(diào)節(jié)因子外沒有提出其它功能。在最近的綜述中，再次引述了CP裂解酶操縱子中phnO的調(diào)節(jié)作用(Berlyn，Microbiol.Molec.Biol.Rev.62814-984，1998)。
分子生物學(xué)的進(jìn)展，特別是植物學(xué)結(jié)合重組DNA技術(shù)的進(jìn)展，已經(jīng)使得人們能夠構(gòu)建含有農(nóng)學(xué)上重要的非天然基因的重組植物。另此外，當(dāng)將這類基因摻入植物并在植物中表達(dá)時，這類基因理想地付給所述重組植物以某些有益性狀或特征。一種這樣的性狀是除草劑抗性。能夠在除草劑存在下生長的重組植物具有優(yōu)于除草劑敏感性物種的非常大的優(yōu)點。另外，除草劑耐性植物通過減少耕地除草和控制自生植物的需要，為農(nóng)作物生產(chǎn)提供更加成本有效的方法。
數(shù)十年來，一直在使用化學(xué)除草劑來抑制植物的代謝，特別是用于農(nóng)學(xué)目的，作為作物大田中除草或控制自生植物的方法。已經(jīng)證明對于這些目的特別有用的一類除草劑被稱為膦酸除草劑。也許在農(nóng)學(xué)上最為成功的膦酸除草劑是草甘膦(N-膦?；?甲基-甘氨酸)。
已經(jīng)構(gòu)建了耐受膦酸除草劑草甘膦的重組植物。當(dāng)應(yīng)用于植物時，草甘膦被吸收到植物組織中，抑制芳族氨基酸的形成，這是通過抑制質(zhì)體定位的5-烯醇丙酮酰(pyruvyl)-3-磷酸莽草酸合酶的活性而介導(dǎo)的，5-烯醇丙酮酰(pyruvyl)-3-磷酸莽草酸合酶也稱為EPSP合酶或EPSPS，該酶被普遍認(rèn)為是植物、細(xì)菌和真菌特有的。已經(jīng)用對草甘膦抑制的敏感性低得多的細(xì)菌EPSPS酶轉(zhuǎn)化了重組植物。因此，表達(dá)該細(xì)菌EPSPS的植物對草甘膦的敏感性低得多，通常被鑒定為草甘膦耐性。因此，可以將更大量的草甘膦應(yīng)用于這樣的重組植物，確保對該除草劑感病或敏感的植物死亡。然而，已經(jīng)鑒定出其它基因，當(dāng)將其轉(zhuǎn)化到植物基因組中時，它們編碼也提供草甘膦耐性的酶。一種這樣的酶被描述為GOX或草甘膦氧化還原酶。GOX的作用通過催化草甘膦降解為氨甲基膦酸(AMPA)和乙醛酸，提供保護(hù)植物抵抗膦酸除草劑草甘膦。由于草甘膦降解產(chǎn)生的AMPA可以引起褪色和矮化或植物生長減低以及其它不希望有的特性。許多植物種也對外源應(yīng)用的AMPA敏感，以及對由于GOX介導(dǎo)的草甘膦除草劑降解產(chǎn)生的內(nèi)源AMPA敏感。沒有描述公開了保護(hù)植物抵抗膦酸除草劑(例如AMPA)應(yīng)用的方法。
Barry等(美國專利第5，633，435號)公開了編碼EPSP合酶的基因，它們可用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)化的細(xì)菌和耐受作為除草劑的草甘膦的植物，以及公開了應(yīng)用這樣的基因作為在種植的轉(zhuǎn)基因作物大田中選擇性除草的方法。Barry等(美國專利第5,463,175號)公開了編碼草甘膦氧化還原酶(GOX)酶的基因，所述基因可用于產(chǎn)生降解草甘膦除草劑的轉(zhuǎn)化細(xì)菌和植物以及耐受作為除草劑的草甘膦的作物。Barry等(美國專利第5,463,175號)公開了AMPA作為GOX介導(dǎo)的草甘膦代謝產(chǎn)物的形成。已經(jīng)報道了AMPA對于大多數(shù)植物種(Franz，1985)而不是對于所有植物種(Maier，1983；Tanaka等，1986)的植物毒性比草甘膦低得多。其編碼的蛋白能夠中和或代謝草甘膦降解產(chǎn)生的AMPA的基因的共表達(dá)將提供比單獨應(yīng)用GOX大得多的改進(jìn)。因此，克服對由于草甘膦降解而形成AMPA的敏感性的方法、或當(dāng)AMPA用作除草劑或在植物轉(zhuǎn)化方法中用作選擇劑時抗AMPA的方法將可用于在轉(zhuǎn)基因植物和對這類化合物敏感的其它生物中提供增強(qiáng)的或改進(jìn)的除草劑耐性。
已經(jīng)描述了應(yīng)用草甘膦作為化學(xué)殺配子劑(美國專利第4,735,649)。其中，公開了草甘膦可以在最適條件下殺傷約95％的雄配子，而留下約40-60％的能夠受精的雌配子。另外，在所公開的應(yīng)用水平上通常觀察到矮化效應(yīng)，表現(xiàn)為植株大小減小并且有少量褪色。因此，同大多數(shù)殺配子劑的情況一樣，采用草甘膦作為殺配子劑的主要缺點是由于對雄配子缺乏足夠的選擇性而產(chǎn)生的植物毒性副作用。可以通過用草甘膦處理后在表達(dá)GOX的轉(zhuǎn)基因植物中產(chǎn)生AMPA，實現(xiàn)這些植物毒性表現(xiàn)。因此，提供在表達(dá)GOX的轉(zhuǎn)基因植物中防止作為應(yīng)用草甘膦作為殺配子劑的副作用的矮化效應(yīng)和褪色的方法可能是有利的。此外，一個更有效的方法可能最理想殺傷95％以上的雄配子或防止雄配子成熟的方法，并且將留下60％以上的基本上不受影響的雌配子。認(rèn)為與編碼能夠?qū)MPAN-?；拿傅霓D(zhuǎn)?；富蛞黄疬M(jìn)行GOX的組織特異性共表達(dá)，將達(dá)到這一目標(biāo)。
現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌phnO基因編碼具有轉(zhuǎn)?；?、?；D(zhuǎn)移酶或?；?CoA轉(zhuǎn)?；富钚缘拿?，其中優(yōu)選的底物是顯示出末端胺的膦酸，特別是氨甲基膦酸(AMPA)。從酰基-CoA將?；D(zhuǎn)移至AMPA的游離末端胺上，導(dǎo)致形成N-?；疉MPA。不知道植物在多大程度上將AMPA酰化，并且已經(jīng)表明某些植物對AMPA敏感，而對?；?AMPA不敏感。因此，在植物中表達(dá)phnO將在增強(qiáng)膦酸除草劑耐性方面是有用的，特別是當(dāng)在植物轉(zhuǎn)化中將AMPA用作除草劑或選擇劑時，更尤其是當(dāng)在結(jié)合表達(dá)GOX基因的重組植物，將草甘膦用作除草劑時是有用的。
發(fā)明概述因此簡而言之，本發(fā)明涉及包含一類編碼能夠?qū)㈧⑺峄衔颪-?；牡鞍椎男禄虻奈镔|(zhì)組合物，涉及應(yīng)用這些基因和所編碼的蛋白以改進(jìn)植物對膦酸除草劑耐性的方法。本發(fā)明也涉及用編碼能夠?qū)㈧⑺峄衔颪-?；牡鞍椎幕蜣D(zhuǎn)化的重組植物和微生物的選擇方法，涉及能夠?qū)⒒衔颪-氨基-甲基-膦酸(N-AMPA)和其它相關(guān)膦酸化合物N-?；碾?。另外，本發(fā)明也涉及應(yīng)用用轉(zhuǎn)酰基酶基因轉(zhuǎn)化植物以防止自花受精的方法或涉及增強(qiáng)植物中異花受精的方法。
因此在發(fā)現(xiàn)由本發(fā)明達(dá)到的幾個優(yōu)點中，可以注意到提供了產(chǎn)生穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的除草劑耐性重組植物，它們已經(jīng)在其基因組中插入了編碼所需基因產(chǎn)物、最好是N-?；?轉(zhuǎn)移酶的多核苷酸序列。所述多核苷酸序列最好由含啟動子序列的盒組成，所述啟動子在植物中起作用并有效連接于結(jié)構(gòu)DNA序列的5’，所述結(jié)構(gòu)DNA序列當(dāng)轉(zhuǎn)錄出RNA序列時，編碼N-?；D(zhuǎn)移酶肽。所述啟動子序列可以相對于所述結(jié)構(gòu)DNA序列是異源的，并且引起在植物組織中所述轉(zhuǎn)移酶的足夠表達(dá)，以為用所述多核苷酸序列轉(zhuǎn)化的植物提供除草劑耐性。所述結(jié)構(gòu)序列最好有效連接于在植物中起作用的3’非翻譯聚腺苷酸化序列的3’，并且當(dāng)所述3’非翻譯聚腺苷酸化序列與所述結(jié)構(gòu)序列一起轉(zhuǎn)錄為RNA時，使得聚腺苷酸核苷酸序列添加至所轉(zhuǎn)錄的RNA的3’端。所述結(jié)構(gòu)DNA序列的表達(dá)在所述植物組織中產(chǎn)生足夠水平的所述轉(zhuǎn)?；?，以增強(qiáng)所述轉(zhuǎn)化植物的除草劑耐性。
作為再一實施方案，所述結(jié)構(gòu)DNA序列也可以含有一個額外的編碼氨基末端肽序列的5’序列，該序列在植物中起作用，以將所述結(jié)構(gòu)序列轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的肽導(dǎo)向胞內(nèi)細(xì)胞器。這一額外的編碼序列最好與編碼所述轉(zhuǎn)?；傅慕Y(jié)構(gòu)序列符合讀框地連接。所述氨基末端肽序列可以或者是信號肽或者是轉(zhuǎn)運(yùn)肽。所述胞內(nèi)細(xì)胞器可以是葉綠體、線粒體、液泡、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或其它這樣的結(jié)構(gòu)。所述結(jié)構(gòu)DNA序列也可以連接于可以用來增強(qiáng)所述所需基因產(chǎn)物表達(dá)的5’序列，例如非翻譯前導(dǎo)序列(UTL’s)、內(nèi)含子序列或這些序列的組合等。也可以將內(nèi)含子序列引入編碼所述轉(zhuǎn)?；傅慕Y(jié)構(gòu)DNA序列中。另一方面，葉綠體轉(zhuǎn)化或質(zhì)體轉(zhuǎn)化可以導(dǎo)致轉(zhuǎn)?；妇幋a序列和酶定位至葉綠體或質(zhì)體，消除了核基因組轉(zhuǎn)化、從所述核基因組表達(dá)和隨后將所述基因產(chǎn)物導(dǎo)向亞細(xì)胞器的需要。
最好是，所述重組植物表達(dá)編碼催化AMPA形成的酶的基因。AMPA形成可以產(chǎn)生于天然存在下前體的代謝、例如提供給所述植物的草甘膦的前體，或可以產(chǎn)生于通過某些分解代謝途徑形成AMPA。GOX與AMPA轉(zhuǎn)?；副磉_(dá)的共表達(dá)，提供了意想不到的對某些膦酸除草劑更具抗性的植物。然而，允許僅用N-轉(zhuǎn)?；皋D(zhuǎn)化的植物在AMPA或者相似或相關(guān)化合物存在下生長的一個實施方案，將提供用于鑒定遺傳轉(zhuǎn)化的植物、愈傷組織或胚胎發(fā)生組織的有用的選擇方法。
按照本發(fā)明的另一方面，提供用于選擇性地增強(qiáng)或改進(jìn)重組植物的除草劑耐性的方法，所述重組植物在其核基因組、葉綠體基因組、質(zhì)體基因組或線粒體基因組中已經(jīng)插入了一種包含編碼N-?；D(zhuǎn)移酶的多核苷酸序列的盒。
再一實施方案包括對在表達(dá)GOX基因的轉(zhuǎn)化植物中選擇性地增強(qiáng)除草劑耐性的方法的改進(jìn)，所述GOX基因編碼在產(chǎn)生轉(zhuǎn)酰基酶的相同植物中表達(dá)的草甘膦氧化還原酶。
按照本發(fā)明的另一方面，提供通過將包含編碼N-酰基轉(zhuǎn)移酶的多核苷酸序列的盒插入植物細(xì)胞基因組中，產(chǎn)生遺傳轉(zhuǎn)化的除草劑耐性植物的方法。
再一實施方案包括產(chǎn)生對來自表達(dá)GOX基因的植物細(xì)胞的遺傳轉(zhuǎn)化除草劑耐性植物的方法的改進(jìn)，所述GOX基因編碼在產(chǎn)生轉(zhuǎn)酰基酶的相同植物細(xì)胞中表達(dá)的草甘膦氧化還原酶。
在任一上述實施方案中，所述除草劑耐性植物或植物細(xì)胞可以選自玉米、小麥、棉花、水稻、大豆、甜菜、canola、亞麻、大麥、油料種子油菜、向日葵、馬鈴薯、煙草、番茄、苜蓿、萵苣、蘋果、楊樹、松樹、桉樹、金合歡、楊樹、美國楓香、radiata pine、火炬松、云杉、柚木、苜蓿、三葉草和其它飼料作物、草坪草、油棕、甘蔗、香蕉、咖啡、茶樹、可可、蘋果、胡桃、杏仁、葡萄、花生、pulses、矮牽牛、萬壽菊、長春花、秋海棠、天竺葵、三色堇、鳳仙花、燕麥、高粱和小米。
按照本發(fā)明的另一方面，提供能夠?qū)⒒衔颪-氨甲基膦酸(N-AMPA或AMPA)N-酰化的肽或當(dāng)應(yīng)用于、引入植物代謝或由植物代謝產(chǎn)生時能夠引起植物毒性效應(yīng)的其它這樣的化合物。一種這樣的肽是得自大腸桿菌phnO結(jié)構(gòu)基因序列表達(dá)的N-氨甲基膦酸轉(zhuǎn)酰基酶(AAT)。也設(shè)想了結(jié)構(gòu)和功能與大腸桿菌phnO基因產(chǎn)物相似的其它肽。
本發(fā)明的另一方面提供用含轉(zhuǎn)酰基酶基因的載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞的選擇方法，所述轉(zhuǎn)酰基酶基因表達(dá)能夠?qū)MPA和相似的化合物N-?；拿?。所述方法包括以下步驟用所述載體轉(zhuǎn)化一個細(xì)胞群體，以及在通過在足以抑制任何非轉(zhuǎn)化細(xì)胞生長或存活的量的AMPA存在下溫育來選擇所述轉(zhuǎn)化細(xì)胞后，從所述群體中的非轉(zhuǎn)化細(xì)胞分離和純化所述轉(zhuǎn)化細(xì)胞。所述轉(zhuǎn)化細(xì)胞可以是細(xì)菌細(xì)胞、植物細(xì)胞或真菌細(xì)胞。細(xì)菌細(xì)胞可以是其中腸桿菌科(Enterobacteraceae)、分枝桿菌科(Mycobacteraceae)、土壤桿菌科(Agrobacteraceae)和放線細(xì)菌科(Actinobacteraceae)包括的任一科的成員。真菌細(xì)胞可以是Ascomycota、Basidiomycota等的成員。植物細(xì)胞可以得自Plantae科的任何成員。
本發(fā)明的再一實施方案提供從來源于用轉(zhuǎn)?；富蜣D(zhuǎn)化的植物的組織、細(xì)胞或植物其它部分產(chǎn)生植物的方法，所述轉(zhuǎn)?；富驗閜hnO基因、gox基因、其中GOX和轉(zhuǎn)?；鸽挠煞g融合體或轉(zhuǎn)錄融合體、或編碼GOX和轉(zhuǎn)?；鸽牡亩囗樂醋踊虻漠a(chǎn)生。
本發(fā)明的再一實施方案提供用于產(chǎn)生以組織特異性方式表達(dá)作為反義基因的全部或部分phnO基因或相似轉(zhuǎn)?；富蚧騁OX基因的植物的方法。
其它方面也包括試劑，例如針對AMPA轉(zhuǎn)?；傅目贵w，和用于鑒定轉(zhuǎn)?；富蛐蛄械亩嗪塑账?。這些試劑可以包括在試劑盒中，所述試劑盒含有AMPA轉(zhuǎn)?；?、為AMPA轉(zhuǎn)?；富蛐蛄谢蚺c其互補(bǔ)的多核苷酸、用于熱擴(kuò)增AMPA轉(zhuǎn)?；富蛐蛄械亩嗪塑账?、針對AMPA轉(zhuǎn)?；?、用于在實驗室中或大田中檢測AMPA轉(zhuǎn)酰基酶的抗體、以及用于試劑盒形式以及用于本文設(shè)想的其它測定中的任何其它必需的試劑。
本發(fā)明的再一目的是提供應(yīng)用膦酸除草劑作為化學(xué)雜交劑的方法。該方法提供選擇性殺配子效應(yīng)和產(chǎn)生雄性不育植物?？梢詫⑦@樣的植物工程改造，使得gox或phnO、或gox和phnO不能在繁殖所需的植物組織中表達(dá)，引起對所應(yīng)用的抑制成熟配子結(jié)構(gòu)形成的植物毒性化合物的敏感性。
附圖簡述

圖1說明了[14C]同位素檢測HPLC色譜圖，表示僅含[14C]草甘膦(11.3分鐘，98.8％)和微量[14C]AMPA(5.8分鐘，0.16％)和未鑒定的[14C]物質(zhì)(10.2分鐘，1％)的施藥溶液樣品。
圖2說明了所觀察的放射性代謝物[14C]AMPA、[14C]草甘膦和N-乙酰-[14C]-AMPA以及鑒定為N-乙酰-N-甲基-[14C]-AMPA的雜質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)的混合物的HPLC圖形。
圖3說明了來自用GOX和AMPA轉(zhuǎn)酰基酶轉(zhuǎn)化、并用[14C]草甘膦處理的玉米愈傷組織的提取物的代表性HPLC圖形。所述峰表示[14C]草甘膦(10.8分鐘，所觀察的總[14C]的92.5％)、[14C]AMPA主要由GOX介導(dǎo)的草甘膦降解產(chǎn)生(5.98分鐘，所觀察的總[14C]的1.71％)和由于在愈傷組織中表達(dá)的重組AMPA轉(zhuǎn)?；附閷?dǎo)的[14C]AMPA酰化產(chǎn)生的N-乙酰-[14C]APMA(13.29分鐘，所觀察的總[14C]的4.54％)。
圖4說明質(zhì)粒pMON17261。
圖5說明質(zhì)粒pMON32571。
圖6說明質(zhì)粒pMON32936。
圖7說明質(zhì)粒pMON32946。
圖8說明質(zhì)粒pMON32948。
發(fā)明詳述提供本發(fā)明的以下詳細(xì)描述，以有助于本領(lǐng)域技術(shù)人員實施本發(fā)明。雖然如此，以下詳細(xì)描述不應(yīng)該解釋為過度限制本發(fā)明，因為在不偏離本發(fā)明性發(fā)現(xiàn)的精神或范圍的情況下，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本文討論的實施方案進(jìn)行各種修改和改變。
許多詞語和短語是分子生物學(xué)、微生物學(xué)、蛋白質(zhì)化學(xué)和植物學(xué)領(lǐng)域眾所周知的，一般具有其普遍和通常理解的含義，除非另有說明(otherwise to be taken in context)。然而，本文所用的以下詞語和短語具有以下一般敘述的含義。
AMPA轉(zhuǎn)?；?。本文所用的AMPA轉(zhuǎn)酰基酶是指在從?；d體化合物(例如輔酶A，它是眾所周知的，并且在生物學(xué)和化學(xué)領(lǐng)域中縮寫為CoA)轉(zhuǎn)移?；瘜W(xué)基團(tuán)中起作用的酶。特別是，AMPA轉(zhuǎn)?；笇Ⅴ；瘜W(xué)基團(tuán)從?；d體轉(zhuǎn)移至氨甲基膦酸的游離氨基，眾所周知氨甲基膦酸是草甘膦氧化還原酶介導(dǎo)的草甘膦代謝的副產(chǎn)物。AMPA轉(zhuǎn)?；?AAT)在本文中也可以稱為AMPA乙?；D(zhuǎn)移酶、AMPA轉(zhuǎn)酰基酶或乙酰-AMPA合酶(AAS)，在本文中已經(jīng)表明它具有乙酰轉(zhuǎn)移酶活性、丙酰轉(zhuǎn)移酶活性、丙二酸單酰(malonyl)轉(zhuǎn)移酶活性和琥珀酰轉(zhuǎn)移酶活性。因此，用作能夠以AMPA轉(zhuǎn)?；钙鹱饔玫孽；d體形式的底物的這些化合物的任何生物功能等同物(乙酰、丙酰、丙二酸單?；蜱牾?，均在本發(fā)明范圍內(nèi)。已經(jīng)鑒定一種AMPA轉(zhuǎn)?；?，并且該酶在本文中通過實施例表明按照本文包括的描述起作用，該酶先前在本領(lǐng)域中已經(jīng)被成為PhnO，這是一種由大腸桿菌phn操縱子中的phnO基因編碼的蛋白。
生物功能等同物在本發(fā)明AMPA轉(zhuǎn)?；傅鞍追矫姹疚氖褂玫倪@種等同物是這樣的肽、多肽和蛋白，它們所含的序列或部分表現(xiàn)出與本發(fā)明的新肽(例如PhnO)有序列相似性，并且表現(xiàn)出與本文公開的多肽相同或相似的功能特性，包括轉(zhuǎn)?；富钚浴Ｉ锏韧镆舶ㄅc針對PhnO產(chǎn)生的抗體反應(yīng)即與其特異性結(jié)合、并表現(xiàn)出相同或相似轉(zhuǎn)?；富钚缘碾摹⒍嚯暮偷鞍?，所述抗體包括單克隆抗體和多克隆抗體。
在編碼轉(zhuǎn)?；傅幕蚍矫姹疚氖褂玫纳锕δ艿韧锸沁@樣的多核苷酸，它們與本文設(shè)想并描述的多核苷酸序列反應(yīng)，即它們能夠與編碼在AMPA?；D(zhuǎn)移中起作用的轉(zhuǎn)?；?、或編碼本文設(shè)想并描述的大致相似的轉(zhuǎn)酰基酶蛋白的多核苷酸或與其互補(bǔ)的多核苷酸的多核苷酸序列雜交。與本文描述的蛋白大致相似的蛋白是生物功能等同物，并表現(xiàn)出與本文公開的所述多肽相同或相似的功能特性，包括改進(jìn)的除草劑耐性或改進(jìn)的除草劑抗性。生物等同肽含有例如表現(xiàn)出與本發(fā)明的新肽(例如PhnO)有序列相似性的一個或更多個活性位點的序列或部分。生物等同物也包括與針對PhnO序列和PhnO樣肽序列產(chǎn)生的抗體反應(yīng)即與其特異性結(jié)合、并表現(xiàn)出相同或相似除草劑耐性或除草劑抗性方面改進(jìn)的肽、多肽和蛋白，所述抗體包括單克隆抗體和多克隆抗體。
如本文所用的葉綠體或質(zhì)體定位的是指或者為多核苷酸或者為多肽的生物分子，它們定位于葉綠體或質(zhì)體中，使得所述分子與細(xì)胞質(zhì)環(huán)境分離，并在葉綠體或質(zhì)體胞質(zhì)中起作用以提供本發(fā)明中宣布的效應(yīng)。生物分子定位至葉綠體或質(zhì)體，在多核苷酸方面，可以通過人工機(jī)械方法，例如電穿孔、機(jī)械微注射或通過多核苷酸包被的微粒轟擊而發(fā)生，或在多肽方面，可以通過分泌或輸入方法而發(fā)生，其中使用用來將所連接的多肽導(dǎo)向、插入、輔助或定位到葉綠體或質(zhì)體中的天然存在的、非天然存在的或異源質(zhì)體或葉綠體引導(dǎo)肽序列。
事件是指由于外源DNA插入核DNA、線粒體DNA、質(zhì)體DNA或葉綠體DNA中一個或更多個特有位點而得到的轉(zhuǎn)基因植物或植物組織。
表達(dá)編碼DNA分子(例如結(jié)構(gòu)基因)所經(jīng)歷的產(chǎn)生基因產(chǎn)物的胞內(nèi)過程的組合，所述胞內(nèi)過程包括轉(zhuǎn)錄、翻譯以及其它胞內(nèi)蛋白和RNA的加工和穩(wěn)定功能。
非天然存在的基因本發(fā)明的非天然存在的?；D(zhuǎn)移酶基因含有編碼植物功能性RNA序列的遺傳信息，但最好是編碼?；D(zhuǎn)移酶蛋白的基因，所述酰基轉(zhuǎn)移酶蛋白無論是天然存在的還是天然存在的蛋白的變體，其制備方式涉及任何類別的遺傳分離或操作。這包括從其天然存在的狀態(tài)分離所述基因；通過密碼子修飾對所述基因進(jìn)行操作；定點誘變、截短、引入或除去限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點；通過體外方法(例如亞磷酰胺化學(xué)合成法等)、熱擴(kuò)增方法(例如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、反相聚合酶反應(yīng)等)和任何其它操作性或分離性方法合成或再合成編碼本發(fā)明的轉(zhuǎn)?；傅奶烊淮嬖诘男蛄?。
有效連接的(operably linked)符合讀框地連接、使得一個區(qū)段的特性影響另一個區(qū)段表達(dá)的核酸區(qū)段。例如，具有聚合酶加載、結(jié)合并起始轉(zhuǎn)錄功能的特性的啟動子序列影響與所述啟動子連接的序列的表達(dá)。
植物可表達(dá)的編碼區(qū)因為含有促進(jìn)目的基因表達(dá)的典型的植物調(diào)節(jié)元件而可在植物中表達(dá)(即可以在植物中被轉(zhuǎn)錄和/或翻譯)的編碼區(qū)。
質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)肽可用于將所連接的氨基酸(例如蛋白融合體)導(dǎo)向或定位至亞細(xì)胞區(qū)室或亞細(xì)胞器(例如質(zhì)體或葉綠體)的任何氨基酸序列。促進(jìn)進(jìn)入線粒體的氨基酸序列完全不同于質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)肽或與其不相似，也被描述為轉(zhuǎn)運(yùn)肽，但它不能起作用以將肽序列導(dǎo)向質(zhì)體或葉綠體細(xì)胞器。
轉(zhuǎn)基因植物的后代包括至少含有一種異源基因或轉(zhuǎn)基因的所述轉(zhuǎn)基因植物的任何后代，或從在其譜系中具有所述轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因植物得到的任何后來的植物。后代不限于一個世代，而是包括所述轉(zhuǎn)基因植入的許多后代，只要它們含有或表達(dá)所述轉(zhuǎn)基因。含有轉(zhuǎn)基因胚的種子以及得自所述轉(zhuǎn)基因植物及其后代的種子，也是本發(fā)明的重要部分。含有所需轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞、組織、種子或植物是原始轉(zhuǎn)基因細(xì)胞、組織或植物的后代。
啟動子DNA序列或一組DNA序列上的識別位點，它為結(jié)構(gòu)基因提供表達(dá)控制元件，并且RNA聚合酶與其特異性結(jié)合并起動該基因的RNA合成(轉(zhuǎn)錄)。
R0是得自培養(yǎng)的植物組織或細(xì)胞轉(zhuǎn)化的原代再生植株。得自所述R0的后來的后代或世代稱為R1(第一代)、R2(第二代)等。
再生通過由植物細(xì)胞或植物組織(例如植物原生質(zhì)體或外植體)培育植株而產(chǎn)生全株的過程。
結(jié)構(gòu)編碼序列是指編碼肽、多肽或蛋白的DNA序列，所述肽、多肽或蛋白是從所述結(jié)構(gòu)編碼序列轉(zhuǎn)錄出信使RNA(mRNA)、然后由mRNA翻譯產(chǎn)生所需肽、多肽或蛋白產(chǎn)物后而產(chǎn)生的。
結(jié)構(gòu)基因被表達(dá)而產(chǎn)生多肽的基因。
大致同源性當(dāng)本文使用該術(shù)語時，大致同源性是指約40％至約65％、約66％至約75％、約76％至約86％、約87％至約90％、91％至約95％、以及約96％至約99％的核酸序列與參比多核苷酸序列(例如大腸桿菌phnO基因序列)同源。與第二多核苷酸分子大致同源的第一多核苷酸分子是所述第二多核苷酸或與其互補(bǔ)，使得所述第一多核苷酸分子與所述第二多核苷酸分子或其互補(bǔ)序列在嚴(yán)格雜交條件下雜交，嚴(yán)格性定義為導(dǎo)致第一多核苷酸與第二多核苷酸雜交所需的最適鹽濃度和溫度。改變嚴(yán)格性的方法是本領(lǐng)域眾所周知的，但可能在Sambrook等(編輯)，Molecular CloningA Laboratory Manual，第二版，1989，Cold Spring Harbor Press；或Ausubel等(編輯)，Short Protocols inMolecular Biology，第三版，1995，John Wiley and Sons，Inc.中給出的參考文獻(xiàn)。認(rèn)為在本發(fā)明范圍內(nèi)的多肽是與參比多肽序列、最好與大腸桿菌PhnO肽序列約40％至約65％、約66％至約75％、約76％至約86％、約87％至約90％、91％至約95％、以及約96％至約99％相似的那些多肽。
終止子如本文在計劃用于在植物中表達(dá)的植物特異性序列方面使用的，為3’端轉(zhuǎn)錄終止和聚腺苷酸化序列。
轉(zhuǎn)化將外源多核苷酸序列(例如質(zhì)?；虿《据d體或重組多核苷酸分子)引入細(xì)胞、原生質(zhì)體、質(zhì)體或葉綠體、或線粒體中的方法，其中所述外源多核苷酸序列或者摻入包含于所述細(xì)胞中的內(nèi)源多核苷酸序列中，或者能夠自主復(fù)制。轉(zhuǎn)化的細(xì)胞是通過將一種或更多種外源多核苷酸分子引入該細(xì)胞中已經(jīng)改變的細(xì)胞。穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的細(xì)胞是全部或部分所述外源多核苷酸已經(jīng)摻入所述細(xì)胞的核基因組物質(zhì)、線粒體基因組物質(zhì)或質(zhì)體或葉綠體基因組物質(zhì)中、使得所述外源多核苷酸賦予所述細(xì)胞以及所述轉(zhuǎn)化細(xì)胞的后代某個或某些基因型或表型性狀，所述性狀可通過以下方法測定檢測外源引入的多核苷酸、所述外源多核苷酸的mRNA或蛋白產(chǎn)物、通常由所述細(xì)胞在缺乏所述外源多核苷酸時不產(chǎn)生的、或在所述細(xì)胞中沒有發(fā)現(xiàn)的代謝物、或目測檢查得自所述轉(zhuǎn)化細(xì)胞的細(xì)胞、植物組織或植物。
轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)基因是一種多核苷酸序列，所述多核苷酸序列已經(jīng)被轉(zhuǎn)移至細(xì)胞并包含表達(dá)盒，所述表達(dá)盒含有編碼所需多肽的結(jié)構(gòu)基因序列。所述轉(zhuǎn)基因能夠在受體轉(zhuǎn)化細(xì)胞、組織或生物中表達(dá)。這可以包括完整的質(zhì)?；蚱渌d體，或可以僅僅包括所述轉(zhuǎn)移的多核苷酸的植物功能性編碼序列。轉(zhuǎn)基因細(xì)胞是得自或再生自轉(zhuǎn)化細(xì)胞(包括原始轉(zhuǎn)化細(xì)胞)的任何細(xì)胞。典型的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞包括得自轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞和得自穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物的特定細(xì)胞(例如葉片、根、莖、分生組織和其它組織體細(xì)胞或生殖細(xì)胞或種系和絨氈層細(xì)胞)的植物愈傷組織。轉(zhuǎn)基因事件是將至少一種外源多核苷酸插入植物細(xì)胞或原生質(zhì)體的核基因組、質(zhì)體基因組或線粒體基因組而得到的植物或其后代。轉(zhuǎn)基因植物是已經(jīng)被遺傳修飾以含有異源多核苷酸序列并將其表達(dá)為蛋白或RNA或不是先前所述植物組合物中一部分的DNA分子的植物或其后代。如本文具體例舉的，例如遺傳修飾轉(zhuǎn)基因棉花植株，使其含有并表達(dá)有效連接于在植物細(xì)胞或組織中或在全株中起作用的轉(zhuǎn)錄和翻譯控制序列并在其調(diào)控之下的至少一種異源DNA序列。轉(zhuǎn)基因植物也可以稱為轉(zhuǎn)化植物。轉(zhuǎn)基因植物也指原始轉(zhuǎn)基因植物的后代，其中那些后代含有所述異源編碼序列并能夠在本文所述植物可表達(dá)轉(zhuǎn)錄和翻譯控制序列的調(diào)節(jié)控制下表達(dá)所述異源編碼序列。轉(zhuǎn)基因植物可以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因花、種子、球莖、根、塊莖、果實和花粉等，并且可以通過常規(guī)育種方法與植物親和系雜交，產(chǎn)生雜種轉(zhuǎn)基因植物。
載體能夠在宿主細(xì)胞中復(fù)制和/或可以有效連接另一DNA或其它多核苷酸序列以導(dǎo)致所連接的序列復(fù)制的DNA分子或其它多核苷酸分子。質(zhì)粒是一種典型的載體。
按照本發(fā)明，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)當(dāng)用編碼能夠降解草甘膦的酶的某些基因轉(zhuǎn)化植物時，植物可以產(chǎn)生植物毒性化合物。特別是，草甘膦氧化還原酶(GOX)介導(dǎo)的草甘膦代謝產(chǎn)生鑒定為N-氨甲基-膦酸(AMPA)的植物毒性化合物。其它研究已經(jīng)表明，AMPA的N-?；苌?N-?；?氨甲基-膦酸(N-?；?AMPA或?；?AMPA)對大多數(shù)植物種的植物毒性低得多。已經(jīng)鑒定了能夠通過?；瘷C(jī)制共價修飾AMPA、導(dǎo)致N-酰基-AMPA形成的酶。特別是一種酶引起外源供應(yīng)的AMPA被N-乙?；?。在表達(dá)該酶與GOX的植物中，沒有觀察到AMPA植物毒性效應(yīng)。
在此設(shè)想的本發(fā)明利用包含用于調(diào)節(jié)基因表達(dá)的元件的重組多核苷酸盒，在所述多核苷酸盒可以插入序列，例如編碼有用蛋白的結(jié)構(gòu)基因。最好采用本領(lǐng)域熟知的限制性內(nèi)切核酸酶，完成將這樣的序列插入表達(dá)盒中，然而其它插入方法也是已知的。例如定點重組法有效地將所需序列插入這樣的表達(dá)盒中。表達(dá)盒至少含有一種植物有效的啟動子，以用于起始信使RNA分子的產(chǎn)生，從所述信使RNA分子翻譯所述有用的蛋白。盒也含有鑒定為3’序列的植物有效序列，其作用是終止轉(zhuǎn)錄，并提供被3’聚腺苷酸化的非翻譯序列。因此，計劃用于植物的表達(dá)盒應(yīng)該至少含有一種啟動子序列，并且在其3’端與轉(zhuǎn)錄終止和聚腺苷酸化序列的3’連接。最好是，存在含有一個或更多個特有限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點的多克隆序列或接頭序列，將所述啟動子和便于插入結(jié)構(gòu)基因序列和其它元件的3’序列橋接。計劃用于植物的表達(dá)盒也最好含有一段插入所述啟動子和所述3’序列之間的5’非翻譯序列。已經(jīng)表明，5’非翻譯序列(UTL)增強(qiáng)植物中的基因表達(dá)。也設(shè)想了內(nèi)含子作為可以存在于本發(fā)明的這種表達(dá)盒中的序列。也已經(jīng)表明，植物有效內(nèi)含子的存在增強(qiáng)某些植物種(特別是玉米)中的基因表達(dá)。內(nèi)含子可以存在于表達(dá)盒中沿所述盒序列的任何編號的位置。這可以包括所述啟動子和所述3’終止序列之間和/或結(jié)構(gòu)基因內(nèi)的位置。在表達(dá)盒中可以存在一個以上的內(nèi)含子，然而對于本文設(shè)想的發(fā)明的目的，最好在表達(dá)盒用于單子葉植物和植物組織中時存在內(nèi)含子。增強(qiáng)子序列也是本領(lǐng)域熟知的，并且可以存在，盡管不必作為表達(dá)盒的一部分，因為已知增強(qiáng)子序列在存在于驅(qū)動目的基因表達(dá)的啟動子的上游或下游或甚至距啟動子很遠(yuǎn)時起作用。
定位至植物核基因組并且以雙鏈DNA形式存在的基因的表達(dá)，涉及由RNA聚合酶從所述DNA的一條鏈轉(zhuǎn)錄以產(chǎn)生初級信使RNA轉(zhuǎn)錄物(mRNA)，并且隨后在細(xì)胞核內(nèi)加工所述mRNA初級轉(zhuǎn)錄物。這種加工涉及將聚腺苷酸核苷酸添加至所述RNA的3’末端的3’非翻譯多核苷酸序列。DNA轉(zhuǎn)錄為mRNA由通常稱為“啟動子”的DNA序列來調(diào)節(jié)。所述啟動子包含一端堿基序列，所述堿基序列發(fā)送信號使RNA聚合酶與該DNA結(jié)合并啟動采用模板DNA鏈的mRNA轉(zhuǎn)錄，以制備相應(yīng)的RNA互補(bǔ)鏈。
本領(lǐng)域技術(shù)人員會認(rèn)識到，有許多在植物細(xì)胞中有活性的啟動子，并且已經(jīng)描述于文獻(xiàn)中。這樣的啟動子可以得自植物、植物病毒或植物共生體、腐生、共生或致病微生物，包括但不限于胭脂堿合酶(NOS)和章魚堿合酶(OCS)啟動子(它們在根癌土壤桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)的腫瘤誘導(dǎo)質(zhì)粒上攜帶)、花椰菜花葉病毒(CaMV)19S和35S啟動子、來自核酮糖1，5-二磷酸羧化酶小亞基(ssRUBISCO，一種非常豐富的植物多肽)的光誘導(dǎo)型啟動子、水稻Actl啟動子、玄參花葉病毒(FMV)35S啟動子、甘蔗桿狀DNA病毒啟動子、遍在蛋白啟動子、花生褪綠線死病病毒啟動子、鴨趾草黃色病毒(comalina yellow virus)啟動子、葉綠素a/b結(jié)合蛋白啟動子和分生組織增強(qiáng)啟動子Act2、Act8、Act11和EF1a等。所有這些啟動子均已經(jīng)用來產(chǎn)生各種類型的DNA構(gòu)建體，所述DNA構(gòu)建體已經(jīng)在植物中表達(dá)(參見例如McElroy等，1990；Barry和Kishore，USP5,463,175)并且在本發(fā)明范圍內(nèi)。也設(shè)想了葉綠體或質(zhì)體特異性啟動子、葉綠體或質(zhì)體功能性啟動子以及葉綠體和質(zhì)體有效啟動子。最好是，所選定的特定啟動子應(yīng)該能夠引起在植物中的足夠表達(dá)，以導(dǎo)致產(chǎn)生有效量的轉(zhuǎn)?；?，以賦予植物基本上耐受膦酸除草劑和膦酸除草劑代謝產(chǎn)物。提供所需耐性所需的轉(zhuǎn)?；傅牧靠梢愿鶕?jù)植物種而變化。
一組優(yōu)選的啟動子是組成型啟動子，例如CaMV35S或FMV35S啟動子，它們在大多數(shù)植物器官中產(chǎn)生高水平的表達(dá)。增強(qiáng)形式或重復(fù)形式的CaMV35S和FMV35S啟動子在本發(fā)明的實施中特別有用(Kay等，1987；Rogers，USP5,378,619)。另外，也可能優(yōu)選導(dǎo)致在所述植物的特定組織(例如葉片、莖、根、塊莖、種子、果實等)中表達(dá)所述轉(zhuǎn)酰基酶基因，并且所選定的啟動子應(yīng)該具有所需的組織和發(fā)育特異性。因此，應(yīng)該通過選擇具有所需組織表達(dá)能力和接近的啟動子強(qiáng)度的啟動子，并且選擇在所述靶組織中產(chǎn)生所需除草劑耐性的轉(zhuǎn)化體，來優(yōu)化啟動子功能。這種從轉(zhuǎn)化體庫中的選擇方法常規(guī)用于植物的異源結(jié)構(gòu)基因表達(dá)，因為在含有相同的異源基因的轉(zhuǎn)化體之間由于在所述植物基因組中基因插入位點而有變異。(通常稱為“位置效應(yīng)”)。除已知在植物細(xì)胞中引起DNA轉(zhuǎn)錄(組成型或組織特異性)啟動子外，通過篩選植物cDNA文庫中選擇性表達(dá)或最好在靶組織中表達(dá)的基因，然后確定啟動子區(qū)，可以鑒定其它啟動子以用于本發(fā)明。
最好是，所使用的啟動子在除其它組織外的所有分生組織中具有相對高的表達(dá)，因為現(xiàn)在已知膦酸除草劑可以被轉(zhuǎn)運(yùn)到該類型植物組織中并在其中積累。另一方面，可以用嵌合基因的組合來累積性地導(dǎo)致必需的轉(zhuǎn)酰基酶總體表達(dá)水平，以產(chǎn)生除草劑耐性表型。提供相對高水平表達(dá)的啟動子可以引起所需蛋白在植物中產(chǎn)生至范圍為0.1毫克/克鮮重植物組織、至0.5毫克/克鮮重植物組織、至1.0毫克/克鮮重植物組織、至2.0毫克/克鮮重植物組織或更高的水平。在田間遺傳上等基因作物中所需蛋白的植物內(nèi)水平可以跨越一定的范圍，但一般水平為在特定樣品中所分析的所有植株平均值的70％內(nèi)、更優(yōu)選在50％內(nèi)、甚至更優(yōu)選在25％內(nèi)。
如有需要，可以對用于本發(fā)明的DNA構(gòu)建體(即嵌合植物基因)中的啟動子進(jìn)行修飾，以影響其控制特征。例如，可以將CaMV35S啟動子連接于擬南芥(Arabidopsis thaliana)核酮糖-1.5-二磷酸羧化酶小亞基基因(ssRUBISCO)，所述基因代表在缺乏光時表達(dá)ssRUBiSCO的部分、以產(chǎn)生在葉片中有活性、但在根中無活性的啟動子。所產(chǎn)生的嵌合啟動子可以如本文所述使用。對于該描述的目的，短語“CaMV35S”啟動子因此包括CaMV35S啟動子的變異，例如通過與操縱基因區(qū)連接、隨機(jī)或控制誘變等衍生的啟動子。此外，可以改變所述啟動子，使其含有多個“增強(qiáng)子序列”以有助于提高基因表達(dá)。Kay等(1987)已經(jīng)報道了這樣的增強(qiáng)子序列的實例。
由本發(fā)明DNA構(gòu)建體產(chǎn)生的一種RNA也含有5’非翻譯前導(dǎo)序列。這種序列可以得自選擇以表達(dá)所述基因的啟動子，并且可以對其進(jìn)行特異性修飾，以便增加所述mRNA的翻譯。所述非翻譯或5’非翻譯前導(dǎo)序列(NTR或UTR)可以得自非相關(guān)的啟動子或編碼序列。例如，所述5’非翻譯區(qū)也可以得自病毒RNA、得自合適的真核生物基因或得自合成基因序列。本發(fā)明不限于在以下實施例之一中提出的構(gòu)建體，其中所述非翻譯區(qū)得自伴隨所述啟動子序列的5’非翻譯序列。可用于本發(fā)明中的植物基因前導(dǎo)序列的實例是小麥葉綠素a/b結(jié)合蛋白(cab)前導(dǎo)序列和矮牽牛熱激蛋白70(hsp70)前導(dǎo)序列(Winter，1988)。
對于在單子葉植物中的最佳表達(dá)，在所述DNA表達(dá)構(gòu)建體中也應(yīng)該包括內(nèi)含子。該內(nèi)含子通常置于非翻譯序列中的mRNA5’端附近。該內(nèi)含子可以得自但不限于一組內(nèi)含子，包括玉米hsp70內(nèi)含子(Brown等，美國專利第5,424,412號；1995)或水稻Actl內(nèi)含子(McElroy等，1990)。
當(dāng)在質(zhì)?；蚱渌嗪塑账針?gòu)建體中包括一個以上的表達(dá)盒時，包含一種DNA分子的第一表達(dá)盒通常含有一個組成型啟動子、一個編碼草甘膦氧化還原酶(GOX)的結(jié)構(gòu)DNA序列和一個3’非翻譯區(qū)。包含一種DNA分子的第二表達(dá)盒通常含有一個組成型啟動子、一個編碼N-酰基轉(zhuǎn)移酶(能夠與AMPA反應(yīng)產(chǎn)生N-?；?AMPA)的結(jié)構(gòu)DNA序列和一個3’非翻譯區(qū)。也設(shè)想了包含一種DNA分子的另外的表達(dá)盒。例如，在本發(fā)明設(shè)想的植物中也可以表達(dá)下述基因以及提供增強(qiáng)的除草劑耐性的基因編碼殺蟲或殺真菌活性、耐干旱或耐熱、抗生素類化合物、藥用化合物或試劑(例如腫瘤抑制蛋白或抗體組分)、生物聚合物、其它商業(yè)上有用的化合物等的基因。已經(jīng)描述了在植物細(xì)胞中有活性的許多組成型啟動子。用于組成型表達(dá)或者GOX或者N-?；D(zhuǎn)移酶的合適啟動子包括但不限于花椰菜花葉病毒(CaMV)35S啟動子(Odell等，1985)、玄參花葉病毒(FMV)35S(Sanger等，1990)、甘蔗桿狀DNA病毒啟動子(Bouhida等，1993)、鴨趾草黃斑駁病毒啟動子(Medberry和Olszewski1993)、來自核酮糖1，5-二磷酸羧化酶小亞基(ssRUBISCO)的光誘導(dǎo)型啟動子(Coruzzi等，1984)、水稻胞質(zhì)丙糖磷酸異構(gòu)酶(TPI)啟動子(Xu等，1994)、擬南芥屬的腺嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(APRT)啟動子(Moffatt等，1994)、水稻肌動蛋白1基因啟動子(Zhong等，1996)以及甘露堿合酶和章魚堿合酶啟動子(Ni等，1995)。所有這些啟動子已經(jīng)用來產(chǎn)生各種類型的植物可表達(dá)重組DNA構(gòu)建體。已經(jīng)用這些啟動子和其它啟動子中的許多通過來自大腸桿菌的報道基因(例如uidA(β-葡糖醛酸糖苷酶)基因的表達(dá)，進(jìn)行了組成型啟動子的比較分析(Li等，1997；Wen等，1993)。
可以選擇用于含一種DNA分子的所述第二盒的啟動子，以控制或限制需要細(xì)胞死亡的特異性表達(dá)。在一個優(yōu)選實施方案中，所述啟動子將能夠指導(dǎo)僅在或主要在對于植物存活或植物生存力重要的組織中表達(dá)，同時限制含一種DNA的所述第二盒在其它非必需組織中的表達(dá)。例如，分化為花粉發(fā)育組織或終端組織的組織，例如花粉本身、花藥的絨氈層細(xì)胞層或花藥組織。另一方面，能夠調(diào)節(jié)特定細(xì)胞和組織類型中基因表達(dá)的植物啟動子是眾所周知的。在本發(fā)明實施方案中最優(yōu)選的植物啟動子是在雄性生殖組織發(fā)育期間或花粉中特異性表達(dá)的啟動子，并且所述啟動子的表達(dá)水平足以產(chǎn)生與包含一種DNA分子的所述第一表達(dá)盒組成型啟動子轉(zhuǎn)錄的有義RNA互補(bǔ)的抑制性RNA分子。這些類型的啟動子的實例包括TA29煙草絨氈層特異性啟動子(Mariani等，1990)、來自矮牽牛的PA1和PA2查耳酮二氫黃酮異構(gòu)酶啟動子(van Tunen等，1990)、來自甘藍(lán)(Brassica oleracea)的SLG基因啟動子(Heizmann等，1991)和來自番茄的LAT基因啟動子(Twell等，1991)。
已經(jīng)分離出來自水稻的花藥和花粉特異性啟動子。實例包括Osg6B啟動子，已經(jīng)表明它驅(qū)動β-葡糖醛酸糖苷酶基因在轉(zhuǎn)基因水稻的未成熟花藥中表達(dá)。在小穗、葉片或根的其它組織中沒有檢測到活性(Yokoi等，1997)。已經(jīng)表明來自水稻的PS1花粉特異性啟動子在水稻花粉中特異性地表達(dá)β-葡糖醛酸糖苷酶基因(Zou等，1994)。已經(jīng)鑒定出在水稻花藥絨氈層中特異性地表達(dá)的另外的水稻基因(Tsuchiya等，1994；Tsuchiya等，1997)。例如，通過構(gòu)建cDNA文庫以鑒定花藥特異性克隆，可以進(jìn)行主要在水稻花藥發(fā)育期間表達(dá)的其它基因的分離(Qu等)。
本領(lǐng)域技術(shù)人員會認(rèn)識到用于分離在植物起作用的啟動子的方法，其中所述啟動子來自多種基因或基因家族的成員，這些基因或基因家族成員在例如根、莖、分生組織、葉片、花、果實、花粉或涉及產(chǎn)生花粉的植物細(xì)胞類型的特定植物組織中高表達(dá)(Stinson等，1987；Brown和Crouch，1990；McCormick等，1989)。組織特異性啟動子的其它實例包括玉米聚半乳糖醛酸外切酶基因的啟動子(Dubald等，1993)和Zmc13 mRNA啟動子(Hanson等，1989)。已經(jīng)表明優(yōu)先在番茄花粉中表達(dá)的啟動子是LAT52和LAT59啟動子(Twell等，1991)。在美國專利第5,470,359號中公開了玉米pZtap啟動子序列的一部分(psgB6-1)。
本發(fā)明的重組DNA分子通常包含一種有效或操作性地連接于以下組分的啟動子一個編碼5’非翻譯區(qū)的DNA序列；一個植物內(nèi)含子的DNA序列；一個編碼葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽(CTP)的結(jié)構(gòu)序列；一個編碼改進(jìn)的除草劑耐性的基因的DNA編碼序列和一個3’非翻譯區(qū)。
所述5’非翻譯前導(dǎo)序列可以得自選擇以表達(dá)所述異源DNA序列的啟動子，如有需要，可以對其進(jìn)行特異性地修飾，以便增加mRNA的翻譯。5’非翻譯區(qū)也可以得自病毒RNA、得自合適的真核生物基因或得自合成基因序列。本發(fā)明不限于其中所述非翻譯區(qū)得自伴隨所述啟動子序列的5’非翻譯序列的構(gòu)建體。所述前導(dǎo)序列也可以得自非相關(guān)啟動子或編碼序列。
植物有效的重組DNA分子的3’非翻譯區(qū)含有一個在植物中起作用以使得腺苷酸核苷酸添加到所述RNA的3’末端的聚腺苷酸化信號。所述3’非翻譯區(qū)可以得自在植物細(xì)胞中表達(dá)的各種基因。胭脂堿合酶3’非翻譯區(qū)(Fraley等，1983)、豌豆ssRUBISCO的3’非翻譯區(qū)(Coruzzi等，1994)、大豆7S種子貯存蛋白基因的3’非翻譯區(qū)(Schuler等，1982)和豌豆ssRUBISCO基因的豌豆小亞基通常因具有這種能力而被應(yīng)用。含有土壤桿菌腫瘤誘導(dǎo)(Ti)質(zhì)粒基因的聚腺苷酸化信號的3’轉(zhuǎn)錄的非翻譯區(qū)也是合適的。
適用于在單子葉植物中表達(dá)的植物內(nèi)含子的實例包括例如玉米hsp70內(nèi)含子、水稻肌動蛋白1內(nèi)含子、玉米ADH1內(nèi)含子、擬南芥屬SSU內(nèi)含子、擬南芥屬EPSPS內(nèi)含子、矮牽牛EPSPS內(nèi)含子和本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它內(nèi)含子。
可能特別有利的是指導(dǎo)賦予除草劑耐性的蛋白定位至亞細(xì)胞區(qū)室，例如定位至線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、液泡、葉綠體或其它質(zhì)體區(qū)室。通過在其氨基末端包含一個葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽(CTP)，可以將蛋白導(dǎo)向葉綠體。先前已經(jīng)鑒定出天然存在的、作為含有氨基末端葉綠體引導(dǎo)肽(將所述前體引導(dǎo)至葉綠體輸入機(jī)器)的較大的前體蛋白合成的葉綠體定向蛋白，這是本領(lǐng)域眾所周知的。葉綠體引導(dǎo)肽通常由位于葉綠體細(xì)胞器內(nèi)的特異性內(nèi)切蛋白酶切割，由此從所述前體將所述定向的成熟酶、最好是活性酶釋放出到葉綠體環(huán)境中。適合于指導(dǎo)所述除草劑耐性基因或轉(zhuǎn)?；富虍a(chǎn)物引導(dǎo)至植物細(xì)胞的葉綠體或質(zhì)體的肽的編碼序列的實例包括矮牽牛EPSPS CTP、擬南芥屬EPSPS CTP2和內(nèi)含子以及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它序列。這樣的引導(dǎo)序列可供用于將所需的已表達(dá)蛋白轉(zhuǎn)移至其最有效起作用的細(xì)胞結(jié)構(gòu)中，或通過將所需的已表達(dá)蛋白轉(zhuǎn)移至所需表型功能所必需的細(xì)胞過程集中的細(xì)胞區(qū)域。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)葉綠體引導(dǎo)肽在草甘膦抗性植物的選擇中特別有用(Barry等，美國專利第5,463,175號；Barry等，美國專利第5,633,435號)。草甘膦通過抑制在葉綠體內(nèi)發(fā)生的芳族氨基酸生物合成而起作用，以殺傷所述細(xì)胞。因此，將所述抗性基因產(chǎn)物集中于葉綠體中，提供了增強(qiáng)的對所述除草劑的抗性。本文的實施例可供用于也被引導(dǎo)至或定位至葉綠體中并在其中集中的轉(zhuǎn)?；?。葉綠體引導(dǎo)肽的具體實例是本領(lǐng)域眾所周知的，包括擬南芥核酮糖二磷酸羧化酶小亞基asrlA轉(zhuǎn)運(yùn)肽、擬南芥EPSPS轉(zhuǎn)運(yùn)肽和玉蜀黍(Zea maize)核酮糖二磷酸羧化酶小亞基轉(zhuǎn)運(yùn)肽。在此中已經(jīng)發(fā)揮作用以將異源蛋白定位至葉綠體的一種CTP得自擬南芥核酮糖二磷酸羧化酶小亞基atslA轉(zhuǎn)運(yùn)肽。編碼本文使用該轉(zhuǎn)運(yùn)肽變體的多核苷酸序列提供了天然轉(zhuǎn)運(yùn)肽氨基酸序列加上重復(fù)的轉(zhuǎn)運(yùn)肽切割位點，在本文中已經(jīng)表明可用于將活性重組轉(zhuǎn)?；概渲玫饺~綠體(SEQ ID NO9)。
將植物有效除草劑耐性或除草劑抗性基因定位至葉綠體或質(zhì)體的一種替代方法包括葉綠體或質(zhì)體轉(zhuǎn)化?？梢援a(chǎn)生其中僅線粒體DNA或葉綠體DNA已經(jīng)改變以摻入本申請中設(shè)想的分子的重組植物。在葉綠體中起作用的啟動子是本領(lǐng)域已知的(Hanley-Bowden等，Trends inBiochemical Sciences 1267-70，1987)。例如Daniell等(美國專利第5,693,507號；1997)和Maliga等(美國專利第5,451,513號；1995)已經(jīng)描述獲得含已經(jīng)插入異源DNA的葉綠體的細(xì)胞的方法和組合物。
AMPA在植物中積累可以引起植物毒性癥狀，它在表型上表現(xiàn)為葉片褪綠、生長停滯、不育和死亡，盡管不是所有這些癥狀都在每種植物種中表現(xiàn)出來。本文已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，AMPA分子通過轉(zhuǎn)?；M(jìn)行酶修飾，產(chǎn)生N-?；?AMPA，提供了克服AMPA植物毒性效應(yīng)的方法。分析AMPA轉(zhuǎn)化為N-?；?AMPA的一種方法涉及在一定體積水性反應(yīng)中提供[14C]標(biāo)記的AMPA作為所述轉(zhuǎn)?；傅囊环N底物，提供?；?CoA作為該酶的另一種底物，并且如本文實例中描述的通過在陰離子交換柱上進(jìn)行HPLC，從N-?；?[14C]-AMPA產(chǎn)物分離[14C]標(biāo)記的AMPA底物。令人驚訝的是，已經(jīng)表明所述轉(zhuǎn)?；改軌蚶闷渌；?CoA化合物作為底物，以將所述AMPA底物轉(zhuǎn)?；?。特別是，已經(jīng)表明丙酰-CoA是體外轉(zhuǎn)?；磻?yīng)的反應(yīng)性特別強(qiáng)的底物，產(chǎn)生N-丙酰-[14C]-AMPA。當(dāng)采用AMPA作為酰基受體底物時，較大的?；?CoA化合物，即丁酰-CoA或甲基丙二酸單酰-CoA和其碳鏈長度大于C3的共價連接于CoA的其它有機(jī)分子證明在轉(zhuǎn)?；磻?yīng)中效率較低。雖然有這種信息，本領(lǐng)域技術(shù)人員仍然會認(rèn)識到，與PhnO包含的底物特異性相比，因氨基酸序列與本文鑒定的PhnO或PhnO樣酶同源而大致相關(guān)的其它轉(zhuǎn)?；福瑢⒃谒鯝MPA轉(zhuǎn)?；阜磻?yīng)中具有相似的底物特異性。這些其它酶在概念上也在本文所述發(fā)明的范圍和精神內(nèi)。例如，由各種各樣的在對植物毒性化合物(例如AMPA)轉(zhuǎn)酰基中可以用作底物的?；?CoA和?；d體蛋白化合物，介導(dǎo)脂肪酸生物合成。能夠用脂肪酸中間體進(jìn)行AMPA轉(zhuǎn)?；霓D(zhuǎn)酰基酶可以想象地通過消除AMPA植物毒性而提供植物保護(hù)。例如PhnO的、能夠轉(zhuǎn)?；拿冈诜N類繁多的含CP鍵并另外含有一個CN鍵的毒性化合物的解毒中可能是有用的。
用包含phnO基因序列或phnO樣基因序列的一種或更多種表達(dá)載體轉(zhuǎn)化細(xì)菌、酵母或真菌細(xì)胞、植物細(xì)胞或全株的方法和組合物是本說明書的其它方面。轉(zhuǎn)基因細(xì)菌、酵母或真菌細(xì)胞、植物細(xì)胞或得自這種轉(zhuǎn)化方法的植物或得自這種轉(zhuǎn)基因植物的后代和種子也是本發(fā)明的其它實施方案。
轉(zhuǎn)化細(xì)菌和酵母或真菌細(xì)胞的方法是本領(lǐng)域眾所周知的。通常，轉(zhuǎn)化方法與用來轉(zhuǎn)化其它細(xì)菌(例如大腸桿菌)或酵母(例如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))的熟知的方法類似。植物細(xì)胞的DNA轉(zhuǎn)化方法包括但不限于土壤桿菌介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)化、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化、將基因轉(zhuǎn)移到花粉中、注射到生殖器官中、注射到未成熟胚中、質(zhì)體或葉綠體轉(zhuǎn)化和微粒轟擊。這些方法中的每一種方法具有不同的優(yōu)點和缺點。因此，將基因引入特定植物種的一種特定方法對于另一種植物種可能不是最有效的，但本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知哪種方法可用于特定植物種。
有許多將轉(zhuǎn)化DNA區(qū)段引入細(xì)胞中的方法，但不是所有的方法都適合于將DNA傳遞至植物細(xì)胞。認(rèn)為合適的方法事實上包括可以將DNA引入細(xì)胞中的任何方法，例如通過土壤桿菌感染、雙元細(xì)菌人工染色體(BIBAC)載體(Hamilton等，1996)、例如通過以下方法直接傳遞DNAPEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(Omirulleh等，1993)、干燥/抑制介導(dǎo)的DNA攝入、電穿孔、與碳化硅纖維一起攪拌、DNA包被粒子的加速等。在某些實施方案中，加速方法是優(yōu)選的，包括例如微粒轟擊等。
將DNA引入細(xì)胞中的技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。已經(jīng)描述了用于將基因傳遞至細(xì)胞中的4種常用方法(1)化學(xué)方法(Graham和van der Eb，1973；Zatloukal等，1992)；(2)物理方法，例如微注射(Capecchi，1980)、電穿孔(Wong和Neuman，1982；Fromm等，1985；美國專利第5,384,253號)和基因槍(Johnston和Tang，1994；Fynan等，1993；Luthra等，1997)；(3)病毒載體(Clapp，1993；Lu等，1993；Eglitis和Anderson，1988a；1988b)；和(4)受體介導(dǎo)的機(jī)制(Curiel等，1991；1992；Wagner等，1992)。
已經(jīng)發(fā)表了主要利用根癌土壤桿菌的、用于棉花(美國專利第5,004,863號；美國專利第5,159,135號；美國專利第5,518,908號)、大豆(美國專利第5,569,834號；美國專利第5,416,011號；McCabe等(1988)；Christou等(1988))、蕓苔屬(Brassica)(美國專利第5,463,174號)、花生(Cheng等(1996)；De Kathen和Jabobsen(1990))的轉(zhuǎn)化雙子葉植物并獲得轉(zhuǎn)基因植物的方法。
也已經(jīng)報道了利用電穿孔、微粒轟擊和土壤桿菌的單子葉植物轉(zhuǎn)化。在天門冬(Bytebier等(1987))、大麥(Wan和Lemaux(1994))、玉米(Rhodes等(1988)；Ishida等(1996)；Gordon-Kamm等(1990)；Fromm等(1990)；Koziel等(1993)；Armstrong等(1995))、燕麥(Somers等(1992))、鴨茅(Hom等(1988))、水稻(Toriyama等(1988)；Park等(1996)；Abedinia等(1997)；Zhang和Wu(1988)；Zhang等(1988)；Battraw和Hall(1990)；Christou等(1991)；Park等(1996))、黑麥(De La Pena等(1987))、甘蔗(Bower和Birch(1992))、葦狀羊茅(Wang等(1992))和小麥(Vasil等(1992)；Weeks等(1993))中已經(jīng)達(dá)到轉(zhuǎn)化和植株再生。在Davey等(1986)中也討論了用于單子葉植物轉(zhuǎn)化和植株再生的技術(shù)。
也可以產(chǎn)生其中僅線粒體或DNA或葉綠體DNA已經(jīng)改變以摻入本申請中設(shè)想的分子的重組植物。在葉綠體中起作用的啟動子是本領(lǐng)域已知的(Handley-Bowden等，Trends in Biochemical Sciences 1267-70，1987)。Daniell等，美國專利第5,693,507號(1997)和Maliga等(美國專利第5,451,513號；1995)已經(jīng)描述獲得含已經(jīng)插入異源DNA的葉綠體的細(xì)胞的方法和組合物。已經(jīng)用異源DNA轉(zhuǎn)化、改變核基因組和葉綠體或質(zhì)體基因組的重組植物也在本發(fā)明范圍內(nèi)。
本發(fā)明公開了包含編碼AMPA轉(zhuǎn)?；傅亩嗪塑账嵝蛄械腄NA構(gòu)建體。本文公開了用于鑒定和分離編碼在AMPA的N-?；衅鹱饔玫碾牡漠愒椿虻姆椒?。用于構(gòu)建并在植物中表達(dá)合成基因的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，并且詳細(xì)描述于美國專利第5,500,365號，用于單子葉植物的方法特別描述于美國專利第5,689,052號。本發(fā)明設(shè)想了在單子葉植物和雙子葉植物的轉(zhuǎn)化中，單獨應(yīng)用AMPA轉(zhuǎn)酰基酶基因或結(jié)合編碼GOX介導(dǎo)的草甘膦降解酶的基因應(yīng)用AMPA轉(zhuǎn)?；富?。為了增強(qiáng)這些基因的表達(dá)，本發(fā)明提供DNA構(gòu)建體，所述DNA構(gòu)建體包含編碼這些類型蛋白(所述蛋白被定位至植物細(xì)胞質(zhì))的多核苷酸序列以及編碼質(zhì)體引導(dǎo)肽、位于編碼所述AMPA轉(zhuǎn)酰基酶和/或GOX蛋白的多核苷酸序列上游的序列。
一方面，本發(fā)明提供的核苷酸信息可供用于制備有能力與選定的本文公開的多核苷酸的基因序列特異性雜交的相對短的DNA序列。在這些方面，根據(jù)所選定的編碼AMPA轉(zhuǎn)酰基酶多肽的多核苷酸序列例如SEQ ID NO1、SEQ ID NO2和SEQ ID NO3中所示序列的考慮，制備合適長度的核酸探針。也可以根據(jù)所選定的編碼質(zhì)體引導(dǎo)肽的多核苷酸序列例如SEQ ID NO9、SEQ ID NO11、SEQ ID NO13和SEQ ID NO14中所示序列的考慮，制備這樣的核酸探針。這樣的核酸探針與編碼AMPA轉(zhuǎn)?；付嚯幕蛸|(zhì)體引導(dǎo)肽序列的基因序列特異性雜交的能力，使得它們在許多實施方案中特別有用。最為重要的是，所述探針可以用于種類繁多的檢測特定樣品中互補(bǔ)序列的存在的測定。
在某些實施方案中，最好使用寡核苷酸引物。用本發(fā)明的多核苷酸設(shè)計這樣的引物的序列，以用于利用PCRTM技術(shù)對來自任何合適生物的AMPA轉(zhuǎn)酰基酶基因的特定序列進(jìn)行檢測、擴(kuò)增或突變。所述方法也可以用來對編碼質(zhì)體引導(dǎo)肽的多核苷酸的特定序列進(jìn)行檢測、擴(kuò)增或突變。與編碼本發(fā)明的AMPA轉(zhuǎn)?；付嚯暮唾|(zhì)體引導(dǎo)肽的多核苷酸相關(guān)的基因區(qū)段，也可以采用這樣的引物，通過PCRTM進(jìn)行擴(kuò)增。
為了提供按照本發(fā)明的某些優(yōu)點，用于雜交研究或測定的優(yōu)選核酸序列包括與順式鄰接編碼AMPA轉(zhuǎn)?；傅亩嗪塑账嵝蛄?例如SEQ ID NO5或SEQ ID NO6所示的序列)、或編碼AMPA轉(zhuǎn)?；傅亩嗪塑账嵝蛄械闹辽匍L度為14-30等的連續(xù)核苷酸大致互補(bǔ)的序列；或與編碼質(zhì)體引導(dǎo)肽的序列的至少長度為14-30等的連續(xù)核苷酸大致互補(bǔ)的序列。所謂“大致互補(bǔ)”是指在一種多核苷酸在序列中與靶多核苷酸序列優(yōu)選約70％互補(bǔ)、或更優(yōu)選約80％互補(bǔ)、或甚至更優(yōu)選約90％互補(bǔ)、或最優(yōu)選約99-100％互補(bǔ)。
長度至少為14個核苷酸的大小有助于確保該片段具有足夠的長度，以形成穩(wěn)定并且選擇性的雙鏈體分子。一般優(yōu)選在長度為14個堿基以上區(qū)段范圍內(nèi)具有互補(bǔ)序列的分子。為了提高所述雜交體的穩(wěn)定性和選擇性，并因此提高所獲得的特定雜交分子的質(zhì)量和程度，人們一般優(yōu)選設(shè)計具有14-20個核苷酸或需要時可更長的基因互補(bǔ)序列的核酸分子。通過例如直接用化學(xué)方法，例如亞磷酰胺化學(xué)；應(yīng)用核酸復(fù)制技術(shù)，例如美國專利第4,683,195號和第4,683,202號的PCRTM技術(shù)，所述專利具體通過引用結(jié)合到本文中；或通過從含有合成插入片段和合適的限制位點的重組質(zhì)粒中切下所選擇的DNA片段，可以容易地制備這樣的片段。
本發(fā)明也設(shè)想了包含本發(fā)明多核苷酸的表達(dá)載體。因此，在一個實施方案中，表達(dá)載體是分離并純化的DNA分子，它包含有效連接于編碼本發(fā)明多肽的編碼區(qū)的一個啟動子，所述編碼區(qū)有效連接于轉(zhuǎn)錄終止區(qū)，由此所述啟動子驅(qū)動所述編碼區(qū)的轉(zhuǎn)錄。所述編碼區(qū)可以包括一種編碼AMPA轉(zhuǎn)酰基酶的區(qū)段或序列以及編碼質(zhì)體引導(dǎo)肽的區(qū)段或序列。所述包含表達(dá)載體的DNA分子也可以含有一種植物功能性內(nèi)含子，也可以含有其它植物功能性元件，例如編碼非翻譯序列(UTL)的序列和作為轉(zhuǎn)錄或翻譯的增強(qiáng)子起作用的序列。
本文所用的術(shù)語“操作性連接的(operatively linked)”或“有效連接的(operably linked)”是指作為啟動子起作用的序列與編碼區(qū)連接，其連接方式使得該編碼區(qū)的轉(zhuǎn)錄受該啟動子的控制和調(diào)節(jié)。將啟動子操作性連接于編碼區(qū)以調(diào)節(jié)上游和下游的方法是本領(lǐng)域熟知的。
優(yōu)選的植物轉(zhuǎn)化載體包括衍生自根癌土壤桿菌Ti質(zhì)粒的載體以及Herrera-Estrella(1983)、Bevan(1983)、Klee(1985)和歐洲專利申請?zhí)朎P0120516(每個文獻(xiàn)具體通過引用結(jié)合到本文中)公開的那些載體。另外，定向至葉綠體或質(zhì)體轉(zhuǎn)化的植物優(yōu)選轉(zhuǎn)化載體包括在美國專利第5,693,507號(1997)、美國專利第5,451,513號(1995)、McBride等(1995)、Staub等(1995a)、Staub等(1995b)和WO95/24492(每個文獻(xiàn)具體通過引用結(jié)合到本文中)中公開的那些載體。
當(dāng)本發(fā)明的表達(dá)載體將用于轉(zhuǎn)化植物時，選擇能夠在該特定植物種中驅(qū)動表達(dá)的啟動子。在不同植物種中有功能的啟動子也是本領(lǐng)域熟知的?？捎糜谠谥参镏斜磉_(dá)所述多肽的啟動子是如描述的誘導(dǎo)型啟動子、病毒啟動子、合成啟動子或組成型啟動子的那些啟動子(Odell等，1985)和/或時序調(diào)節(jié)、空間調(diào)節(jié)和時空調(diào)節(jié)的那些啟動子。優(yōu)選的啟動子包括增強(qiáng)的CaMV35S啟動子和FMV35S啟動子。
以雙鏈DNA形式存在的基因定位至植物核基因組的表達(dá)涉及由RNA聚合酶從所述DNA的編碼鏈轉(zhuǎn)錄信使RNA(mRNA)，并且隨后在細(xì)胞核內(nèi)加工所述mRNA初級轉(zhuǎn)錄物。來自葉綠體或質(zhì)體內(nèi)表達(dá)的基因也產(chǎn)生在翻譯之前不進(jìn)一步加工的mRNA轉(zhuǎn)錄物。在任一事件中，DNA轉(zhuǎn)錄出mRNA均受稱為“啟動子”的DNA區(qū)域的調(diào)節(jié)。包含所述啟動子的DNA表現(xiàn)為一種堿基序列，該序列發(fā)送信號使RNA聚合酶與該DNA結(jié)合并啟動采用所述DNA鏈之一作為模板的轉(zhuǎn)錄mRNA，以制備相應(yīng)的RNA鏈。所選定的特定啟動子應(yīng)該能夠引起AMPA轉(zhuǎn)酰基酶編碼序列的足夠表達(dá)，以導(dǎo)致產(chǎn)生除草劑耐性或除草劑抗性有效量的、定位至所需胞內(nèi)位置的轉(zhuǎn)?；傅鞍?。
在植物組織中結(jié)構(gòu)基因可以由各種各樣的啟動子驅(qū)動。啟動子可以是近組成型的(near-constitutive)(即它們在所有組織中均驅(qū)動轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)錄)，例如CaMV35S啟動子；或影響雙子葉植物或單子葉植物的組織特異性或發(fā)育特異性的啟動子。當(dāng)啟動子為近組成型啟動子，例如為CaMV35S或FMV35S時，在許多轉(zhuǎn)化植物組織和大多數(shù)植物器官(例如愈傷組織、葉片、種子、莖、分生組織、花和根)中發(fā)現(xiàn)多肽表達(dá)的增加。增強(qiáng)的或重復(fù)形式的CaMV35S和FMV35S啟動子在本發(fā)明的實施中特別有用(Kay等，1987；Rogers，美國專利5,378,619)。
本領(lǐng)域技術(shù)人員會認(rèn)識到，有許多啟動子在植物細(xì)胞中有活性，并且已經(jīng)在文獻(xiàn)中進(jìn)行了描述。這樣的啟動子可以得自植物或植物病毒，包括但不限于胭脂堿合酶(NOS)啟動子和章魚堿合酶(OCS)啟動子(它們載于根癌土壤桿菌的腫瘤誘導(dǎo)質(zhì)粒上)、花椰菜花葉病毒(CaMV)19S和35S啟動子、來自核酮糖1，5-二磷酸羧化酶(ssRUBISCO，一種非常豐富的植物多肽)小亞基的光誘導(dǎo)型啟動子、水稻Actl啟動子和玄參花葉病毒(FMV)35S啟動子。所有這些啟動子已經(jīng)用來創(chuàng)造各種類型的DNA構(gòu)建體，所述構(gòu)建體已經(jīng)在植物中表達(dá)(參見例如McElroy等，1990，美國專利5,463,175)。
另外，也可能最好采用含有組織特異性啟動子的植物整合型載體，促使例如AMPA轉(zhuǎn)?；傅幕蛟谥参锏奶囟ńM織中表達(dá)，所述AMPA轉(zhuǎn)?；柑岣叱輨┠托曰虺輨┛剐?。具體的靶組織可以包括葉片、莖、根、塊莖、種子、果實等，并且所選擇的啟動子應(yīng)該具有所需的組織和發(fā)育特異性。因此，應(yīng)該通過選擇具有所需組織表達(dá)能力和接近的啟動子強(qiáng)度的啟動子，并選擇在所述靶組織中產(chǎn)生所需轉(zhuǎn)酰基酶活性的轉(zhuǎn)化體，使啟動子功能最佳化。在異源結(jié)構(gòu)基因在植物中表達(dá)方面，這種來自轉(zhuǎn)化體庫的選擇方法是常規(guī)使用的，因為在含有同一異源基因的轉(zhuǎn)化體之間由于在所述植物基因組中基因插入位點而有變異(通常稱為“位置效應(yīng)”)。除已知在植物細(xì)胞中引起DNA轉(zhuǎn)錄(組成型或組織特異性的)的啟動子外，可以通過在植物cDNA文庫中篩選選擇性或優(yōu)選在靶組織中表達(dá)的基因，然后確定啟動子區(qū)，來鑒定其它啟動子以用于本發(fā)明中。葉綠體或質(zhì)體功能性啟動子是本領(lǐng)域已知的(Hanley-Bowden等，Daniell等，Maliga等)。
其它典型的組織特異性啟動子是玉米蔗糖合成酶1(Yang等，1990)、玉米乙醇脫氫酶1(Vogel等，1989)、玉米集光復(fù)合體(Simpson，1986)、玉米熱激蛋白(Odell等，1985)、豌豆小亞基RuBP羧化酶(Poulsen等，1986；Cashmore等，1983)、Ti質(zhì)粒甘露堿合酶(McBride和Summerfelt，1989)、Ti質(zhì)粒胭脂堿合酶(Langridge等，1989)、矮牽牛查耳酮異構(gòu)酶(Van Tunen等，1988)、菜豆富甘氨酸蛋白1(Keller等，1989)、CaMV35s轉(zhuǎn)錄物(Odell等，1985)和馬鈴薯patatin(Wenzler等，1989)啟動子。優(yōu)選的啟動子是花椰菜花葉病毒(CaMV35S)啟動子和S-E9小亞基RuBP羧化酶啟動子。
如有需要，可以對用于本發(fā)明DNA構(gòu)建體中的啟動子進(jìn)行修飾，以影響其控制特性。例如，可以將CaMV35S啟動子連接于ssRUBISCO基因代表在缺乏光時表達(dá)ssRUBISCO的部分，以產(chǎn)生在葉片有活性而在根中無活性的啟動子。為了這種描述，短語“CaMV35S”啟動子因此包括CaMV35S啟動子的變異，例如由于與操縱基因區(qū)連接、隨機(jī)誘變或控制誘變等得到的啟動子。此外，可以將所述啟動子改變，以含有多個“增強(qiáng)子序列”，以有助于提高基因表達(dá)。這類增強(qiáng)子序列的實例已經(jīng)由Kay等(1987)報道。葉綠體或質(zhì)體特異性啟動子是本領(lǐng)域已知的(Daniell等，美國專利第5,693,507號；其通過引用結(jié)合到本文中)。例如可得自例如以下的葉綠體基因的啟動子得自菠菜或豌豆的psbA基因、得自玉米的rbcL和atpB啟動子區(qū)和rRNA啟動子。任何葉綠體或質(zhì)體有效啟動子均在本發(fā)明范圍內(nèi)。
由用組織特異性啟動子轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞產(chǎn)生的本發(fā)明轉(zhuǎn)基因植物，可以與由用不同的組織特異性啟動子轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞產(chǎn)生的第二轉(zhuǎn)基因植物雜交，以產(chǎn)生在一個以上的特定組織中表現(xiàn)出轉(zhuǎn)化效應(yīng)的雜種轉(zhuǎn)基因植物。
由本發(fā)明DNA構(gòu)建體產(chǎn)生的RNA也可以含有5’非翻譯前導(dǎo)序列(5’UTL)。該序列可以得自選擇用來表達(dá)所述基因的啟動子，并且可以對其進(jìn)行特異性地修飾，以增加所述mRNA的翻譯。5’非翻譯區(qū)也可以得自病毒RNA、合適的真核生物基因或合成的基因序列。本發(fā)明不限于其中非翻譯區(qū)得自伴隨所述啟動子序列的5’非翻譯序列的構(gòu)建體?？捎糜诒景l(fā)明的一種植物基因前導(dǎo)序列是矮牽牛熱激蛋白70(hsp70)前導(dǎo)序列(Winter等，1988)。
5’UTL當(dāng)定位至所述DNA序列時能夠調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄起始位點和編碼序列起點之間的基因表達(dá)。已經(jīng)進(jìn)行了前導(dǎo)序列的編譯(compilation)，以預(yù)測最適或亞適序列，并產(chǎn)生“共有序列”和優(yōu)選的前導(dǎo)序列(Joshi，1987)。設(shè)想優(yōu)選的前導(dǎo)序列包括包含預(yù)測指導(dǎo)所連接的結(jié)構(gòu)基因最佳表達(dá)的序列的那些前導(dǎo)序列，即包括可以增加或保持mRNA穩(wěn)定性并防止翻譯不正確起始的優(yōu)選共有前導(dǎo)序列。按照本說明書，這類序列的選擇是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。最優(yōu)選由在植物、特別是在玉米中高表達(dá)的基因衍生的序列。一個特別有用的前導(dǎo)序列可以是矮牽牛HSP70前導(dǎo)序列。
按照本發(fā)明，設(shè)計用來特異性增強(qiáng)所述多肽在所述轉(zhuǎn)化植物中表達(dá)的表達(dá)載體，可以包括編碼質(zhì)體或葉綠體引導(dǎo)肽的某些區(qū)域，在本文中以各種形式縮寫為CTP、CTP1、CTP2等，每種代表一種不同或變異的引導(dǎo)肽序列。這些區(qū)域當(dāng)與某些GOX或AMPA轉(zhuǎn)?；傅鞍仔蛄薪Y(jié)合時便于涉及所編碼蛋白的轉(zhuǎn)錄、翻譯和表達(dá)的細(xì)胞過程完全被利用。這種引導(dǎo)肽以多種方式起作用，例如通過將所表達(dá)的蛋白轉(zhuǎn)移至其最為有效操作的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，或通過將所表達(dá)的蛋白轉(zhuǎn)移至表達(dá)所必需的細(xì)胞過程集中的細(xì)胞區(qū)域。CTP的應(yīng)用也可以提高形態(tài)正常植株的回收率以及提高可以回收轉(zhuǎn)基因植物的頻率。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)葉綠體引導(dǎo)肽在草甘膦抗性選擇標(biāo)記系統(tǒng)中特別有用。在該系統(tǒng)中，轉(zhuǎn)化以表達(dá)賦予草甘膦抗性的蛋白的植物與將所述肽引導(dǎo)至植物細(xì)胞的葉綠體的CTP一起轉(zhuǎn)化。草甘膦抑制導(dǎo)致包括氨基酸和維生素在內(nèi)的芳族化合物生物合成的莽草酸途徑。具體地說，草甘膦通過抑制5-烯醇丙酮酰-3-磷酸莽草酸合酶(EPSP合酶和EPSPS)，抑制磷酸烯醇丙酮酸和3-磷酸莽草酸轉(zhuǎn)化為5-烯醇丙酮酰-3-磷酸莽草酸。引入編碼EPSPS的轉(zhuǎn)基因允許所述植物細(xì)胞抵抗草甘膦的效應(yīng)，特別是當(dāng)所述轉(zhuǎn)基因編碼草甘膦不敏感性EPSPS酶時。因此，由于除草劑草甘膦的作用是通過中斷芳族氨基酸的生物合成、特別是中斷所述細(xì)胞葉綠體中的芳族氨基酸的生物合成而殺傷所述細(xì)胞，所以CTP通過將細(xì)胞表達(dá)的草甘膦抗性酶集中在葉綠體中，即細(xì)胞的靶細(xì)胞器中，而提供對所述除草劑的提高的抗性。典型的除草劑抗性酶包括EPSPS和草甘膦氧化還原酶(GOX)基因(參見Comai，1985，美國專利第4,535,060號，其具體通過引用全部結(jié)合到本文中)。
CTP可以將蛋白導(dǎo)向葉綠體和其它質(zhì)體。例如，所述靶細(xì)胞器可以是造粉體。本發(fā)明優(yōu)選的CTP包括導(dǎo)向葉綠體以及其它質(zhì)體的那些CTP。優(yōu)選CTP的具體實例包括玉米RUBISCO SSU蛋白CTP和功能相關(guān)的肽，例如擬南芥RUBISCO小亞基CTP和擬南芥EPSPS CTP。這些CTP例如為分別示于SEQ ID NO9、SEQ ID NO11、SEQ IDNO13和SEQ ID NO14中的多核苷酸序列和氨基酸序列。
也可以產(chǎn)生其中僅線粒體或葉綠體DNA已經(jīng)被改變以摻入本申請中設(shè)想的分子的重組植物、細(xì)胞、種子和其它植物組織。在葉綠體中起作用的啟動子是本領(lǐng)域已知的(Hanley-Bowden等，Trends inBiochemical Sciences 1267-70，1987)。獲得含插入異源DNA的葉綠體的細(xì)胞的方法和組合物已經(jīng)描述于美國專利第5,693,507號(1997)。McBrie等(WO95/24492)公開了編碼CrylAδ-內(nèi)毒素蛋白的基因在煙草植株葉綠體基因組中的定位和表達(dá)。
本發(fā)明的一個典型實施方案包括賦予植物除草劑耐性或除草劑抗性的酶或蛋白的編碼基因的質(zhì)體或葉綠體定向或質(zhì)體或葉綠體定位。質(zhì)體或葉綠體引導(dǎo)序列已經(jīng)從許多核編碼的植物基因中分離出來，并且已經(jīng)顯示出引導(dǎo)胞質(zhì)合成的蛋白輸入質(zhì)體或葉綠體(Keegstra和Olsen的綜述，1989)。本領(lǐng)域熟知的各種各樣的質(zhì)體引導(dǎo)序列可以用于實施本發(fā)明，它們包括但不限于ADPGPP、EPSP合酶或ssBUBISCO。另外，用于單子葉作物的質(zhì)體引導(dǎo)序列(肽和核酸)可以包含含內(nèi)含子序列的基因組編碼片段以及在編碼的質(zhì)體引導(dǎo)序列中的重復(fù)(duplicated)蛋白酶切位點。
用于雙子葉作物的優(yōu)選CTP序列在本文中稱為(SEQ ID NO9)，它包含一個含葉綠體引導(dǎo)肽序列的基因組編碼片段，所述葉綠體引導(dǎo)肽序列得自擬南芥的EPSP合酶基因，其中豌豆ssRUBISCO CTP的轉(zhuǎn)運(yùn)肽切割位點取代了天然的EPSP合酶CTP切割位點(Klee等，1987)。
為了使在單子葉植物中的表達(dá)最佳化，在所述DNA表達(dá)構(gòu)建體中也可以包含內(nèi)含子。這樣的內(nèi)含子通常置于非翻譯序列中mRNA5’端附近。這種內(nèi)含子可以得自但不限于以下一組內(nèi)含子玉米熱激蛋白(HSP)70內(nèi)含子(美國專利5,424,412；1995)、水稻Actl內(nèi)含子(McElroy等，1990)、Adh內(nèi)含子1(Callis等，1987)或蔗糖合酶內(nèi)含子(Vasil等，1989)。
本發(fā)明基因的定位至植物核基因組的3’非翻譯區(qū)也含有一個聚腺苷酸化信號，它在植物中起作用以引起腺苷酸核苷酸添加至所述mRNA的3’端。RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄核基因組編碼DNA序列一直到聚腺苷酸化發(fā)生的位點。通常，位于聚腺苷酸化位點下游數(shù)百個堿基對的DNA序列用來終止轉(zhuǎn)錄。那些DNA序列在此稱為轉(zhuǎn)錄終止區(qū)。轉(zhuǎn)錄的信使RNA(mRNA)的有效聚腺苷酸化需要那些區(qū)。優(yōu)選的3’區(qū)的實例是(1)土壤桿菌腫瘤誘導(dǎo)(Ti)質(zhì)粒基因(例如胭脂堿合酶(NOS)基因)的含聚腺苷酸化信號的3’轉(zhuǎn)錄的非翻譯區(qū)，和(2)植物基因例如豌豆核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶小亞基基因(在此命名為E9)的3’端(Fischhoff等，1987)。構(gòu)建體將通常包括目的基因與用作終止轉(zhuǎn)錄的信號并且在構(gòu)建體中計劃用于核基因組表達(dá)的3’端DNA序列，便于所產(chǎn)生的mRNA聚腺苷酸化。最優(yōu)選的3’元件設(shè)想為得自根癌土壤桿菌胭脂堿合酶基因的那些3’元件(nos3’端)(Bevan等，1983)、根癌土壤桿菌章魚堿合酶基因T7轉(zhuǎn)錄物的終止子和馬鈴薯或番茄的蛋白酶抑制劑I或II基因的3’端。如有需要，可以再包括調(diào)節(jié)元件例如TMVΩ元件(Gallie等，1989)。
按照本發(fā)明且如上所述，編碼賦予植物除草劑耐性或除草劑抗性特征的酶的葉綠體或質(zhì)體定位基因，不需要提供轉(zhuǎn)錄終止和聚腺苷酸化信號的序列，而是可能僅需要所述基因3’端的轉(zhuǎn)錄終止信息。對于引入葉綠體或質(zhì)體、或引入葉綠體或質(zhì)體基因組中的編碼序列，mRNA轉(zhuǎn)錄的終止與細(xì)菌基因表達(dá)領(lǐng)域中熟知的方法相似。例如，通過干環(huán)結(jié)構(gòu)或類似于依賴于rho的序列的結(jié)構(gòu)，可以在或者多順反子或單順反子序列中終止轉(zhuǎn)錄。
轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子或增強(qiáng)子重復(fù)可以用來增加表達(dá)。這些增強(qiáng)子通常發(fā)現(xiàn)位于在真核細(xì)胞中起作用的啟動子中的轉(zhuǎn)錄起始處的5’，但通?？梢砸哉蚧蚍聪虿迦胨鼍幋a序列的5’或3’。增強(qiáng)子的實例包括得自CaMV35S啟動子、章魚堿合酶基因(Ellis等，1987)、水稻肌動蛋白基因和非植物真核生物(例如酵母；Ma等，1988)啟動子的元件。
在本發(fā)明的某些實施方案中，內(nèi)部核糖體結(jié)合位點(IRES)元件的應(yīng)用用來產(chǎn)生多基因或多順反子信息。IRES元件能夠繞過依賴于5’甲基化帽翻譯的核糖體掃描模型，并在內(nèi)部位點開始翻譯(Pelletier和Sonenberg，1988)。已經(jīng)描述了得自小RNA病毒科兩個成員(脊髓灰質(zhì)炎病毒和腦心肌炎病毒)的IRES元件(Pelletier和Sonenberg，1988)，以及得自哺乳動物信息的IRES元件(Macejak和Sarnow，1991)。IRES元件可以連接于異源可讀框。多個可讀框可以一起轉(zhuǎn)錄，每個可讀框由一個IRES分隔，產(chǎn)生多順反子信息。借助所述IRES元件，核糖體可以達(dá)到每個可讀框，進(jìn)行有效的翻譯。采用單啟動子/增強(qiáng)子可以有效表達(dá)多基因，以轉(zhuǎn)錄一個單一信息。
任何異源可讀框均可以連接于IRES元件。這包括以下蛋白的基因分泌蛋白、由獨立的基因編碼的多亞基蛋白、胞內(nèi)蛋白或膜結(jié)合蛋白和選擇標(biāo)記。這樣，可以用一種構(gòu)建體和一種選擇標(biāo)記，將幾種蛋白的表達(dá)同時工程化到一個細(xì)胞中。
計劃利用葉綠體或質(zhì)體特異性轉(zhuǎn)錄和翻譯機(jī)器在葉綠體或質(zhì)體內(nèi)表達(dá)的構(gòu)建體可以含有或者單順反子或多順反子序列。
選擇哪種表達(dá)載體以及選擇哪種與多肽編碼區(qū)最終操作性連接的啟動子直接取決于所需的功能特性，例如蛋白表達(dá)的位置和時間以及待轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。在構(gòu)建重組DNA分子的領(lǐng)域中有固有的眾所周知的限制。然而，可用于實施本發(fā)明的載體能夠指導(dǎo)與其操作性連接的多肽編碼區(qū)的表達(dá)。
可用于在高等植物中表達(dá)基因的典型的載體是本領(lǐng)域眾所周知的，并且包括衍生自描述的根癌土壤桿菌的腫瘤誘導(dǎo)(Ti)質(zhì)粒(Rogers等，1987)的載體。然而，已知幾種其它植物整合型載體系統(tǒng)在植物中起作用，包括描述的pCaMVCN轉(zhuǎn)移控制載體(Fromm等，1985)。pCaMVCN(可得自Pharmacia，Piscataway，NJ)包括CaMV35S啟動子。
在優(yōu)選實施方案中，用來表達(dá)所述多肽的載體包括一個在植物細(xì)胞中有效的選擇標(biāo)記，最好是抗藥性選擇標(biāo)記。一個優(yōu)選的抗藥性標(biāo)記是其表達(dá)導(dǎo)致卡那霉素抗性的基因，即已描述的含有胭脂堿合酶啟動子、Tn5新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶II(nptII)和胭脂堿合酶3’非翻譯區(qū)的嵌合基因(Rogers等，1988)。
用于制備表達(dá)載體的方法是本領(lǐng)域眾所周知的。用來轉(zhuǎn)化植物的表達(dá)(轉(zhuǎn)化)載體和制備那些載體的方法描述于美國專利4,971,908、4,940,835、4,769,061和4,757,011(每個文獻(xiàn)具體通過引用結(jié)合到本文中)?？梢孕揎椖切┹d體，以使其包括按照本發(fā)明的編碼序列。
已經(jīng)開發(fā)了多種方法以通過互補(bǔ)粘性末端或平端將DNA操作性地連接于載體。例如，可以將互補(bǔ)同聚物序列段加至待插入的DNA區(qū)段以及加至載體DNA。然后通過互補(bǔ)同聚物尾之間的氫鍵連接所述載體和DNA區(qū)段，形成重組DNA分子。
編碼有能力賦予細(xì)胞除草劑抗性酶活性提高的多肽的編碼區(qū)，最好是單獨的或結(jié)合編碼GOX酶或GOX功能等同體的的基因的編碼AMPA轉(zhuǎn)?；傅亩嗪塑账峄蜻@種多核苷酸的功能等同體。按照這樣的實施方案，也優(yōu)選包含SEQ ID NO3、SEQ ID NO7或SEQ IDNO19的DNA序列的編碼區(qū)。
已經(jīng)表明結(jié)合質(zhì)體引導(dǎo)肽編碼基因成功地轉(zhuǎn)化植物、以足夠的除草劑防護(hù)水平表達(dá)所述AMPA轉(zhuǎn)酰基酶的特定的AMPA轉(zhuǎn)?；妇幋a基因，是包含在所述質(zhì)粒載體中的那些基因。含質(zhì)體引導(dǎo)序列的優(yōu)選質(zhì)粒包括pMON17261、pMON10151、pMON10149、pMON32570、pMON32571、pMON32572、pMON32573、pMON32926、pMON32931、pMON32932、pMON32936、pMON32938、pMON32946、pMON32947、pMON32948和pMON32950。這些質(zhì)粒含有編碼SEQ ID NO9、SEQ ID NO11、SEQ ID NO13和SEQ ID NO14中所示引導(dǎo)序列的多核苷酸序列。公開了包含連接于編碼序列的植物有效啟動子的表達(dá)盒，某些表達(dá)盒具有或不具有5’非翻譯序列和/或內(nèi)含子序列，其中所述編碼序列含有連接于植物有效終止序列的至少一個AMPA轉(zhuǎn)酰基酶或轉(zhuǎn)乙?；?，特別是在SEQ ID NO23、SEQ ID NO25、SEQ ID NO27、SEO IDNO29和SEQ ID NO31中提出的表達(dá)盒。
本文所述的研究已經(jīng)鑒定出在植物中增強(qiáng)AMPA轉(zhuǎn)酰基酶表達(dá)的方法，所述轉(zhuǎn)酰基酶當(dāng)加入感病植物的核基因組、質(zhì)體或葉綠體基因組中時賦予也表達(dá)GOX或相似基因的植物抵抗草甘膦和相關(guān)除草劑的保護(hù)。美國專利5,500,365(具體通過引用結(jié)合到本文中)描述了用于合成植物基因以優(yōu)化所合成基因編碼的蛋白的表達(dá)水平的方法。該方法涉及對外源轉(zhuǎn)基因結(jié)構(gòu)基因序列的修飾，以使其更“象植物”，并因此更有可能被所述植物翻譯和表達(dá)。用于最好在單子葉植物中增加轉(zhuǎn)基因表達(dá)的相似方法公開于美國專利5,689,052(其具體通過引用結(jié)合到本文中)。農(nóng)學(xué)、園藝、觀賞和其它經(jīng)濟(jì)或商業(yè)上有用的植物可以按照本文所述的方法制備。
這類植物可以共表達(dá)所述AMPA轉(zhuǎn)?；富蚝?或GOX基因以及以下其它物質(zhì)抗真菌、抗細(xì)菌或抗病毒的致病相關(guān)肽、多肽或蛋白；殺蟲蛋白；賦予除草劑抗性的其它蛋白；和涉及提高植物制品質(zhì)量或植物農(nóng)藝性能的蛋白。在植物中同時共表達(dá)異源多種蛋白是有利的，因為它可以利用一種以上的作用方式來防治植物病害，或改進(jìn)所述植物或由所述植物代謝產(chǎn)生的產(chǎn)物的品質(zhì)。
設(shè)想了可能希望引入包含一種以上基因的大DNA序列。利用細(xì)菌或酵母人工染色體(分別為BAC或YAC)或甚至植物人工染色體，可以有助于這種序列的引入。例如，Hamilton等(1996)公開了應(yīng)用BAC進(jìn)行土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化。
最后，用于引入單子葉植物基因組中的最理想的DNA序列可以是編碼所需性狀(例如增產(chǎn))的同源基因或基因家族，并且將其引入置于新啟動子或增強(qiáng)子等、或許甚至同源或組織特異性(例如根頸/根鞘、輪生體、莖、穗梗(earshank)、籽?；蛉~片特異性)啟動子或控制元件的控制之下。事實上，設(shè)想了本發(fā)明的具體應(yīng)用可以是產(chǎn)生包含被以組織特異性方式導(dǎo)向的轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)化體。例如，除草劑抗性或除草劑耐性基因可以在所述植物的生殖組織中特異性地表達(dá)，或可以以負(fù)方式在所述組織中特異性地受調(diào)節(jié)，這可以提供用于增強(qiáng)那些組織的除草劑耐性或敏感性的方法。這樣的調(diào)節(jié)控制方法可以提供用于調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)基因逃逸到環(huán)境中或用于防止有產(chǎn)權(quán)的或許可使用的知識產(chǎn)權(quán)或工業(yè)化財產(chǎn)(commercialized property)的違法使用的方法。
用于在轉(zhuǎn)基因植物中組織特異性地導(dǎo)向基因表達(dá)的載體通常將包括組織特異性啟動子，也可以包括其它組織特異性控制元件，例如增強(qiáng)子序列。按照本說明書，在某些植物組織中指導(dǎo)特異性的或增強(qiáng)的表達(dá)的啟動子是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。
也設(shè)想了通過將組成型表達(dá)的基因(在所有組織中)和僅在不需要所述基因產(chǎn)物的那些組織中表達(dá)的反義基因共同引入，可以功能性地實現(xiàn)組織特異性表達(dá)。例如，可以引入編碼大腸桿菌AMPA轉(zhuǎn)?；傅幕?，使得采用花椰菜花葉病毒的35S啟動子將其在所有組織中表達(dá)。或者，水稻肌動蛋白啟動子或雙子葉植物或單子葉植物種的組蛋白啟動子也可以用于組成型基因表達(dá)。此外，設(shè)想了組合得自一種以上啟動子的元件的啟動子可能是有用的。例如，美國專利5,491,288公開了將花椰菜花葉病毒啟動子與組蛋白啟動子組合。因此，采用例如玉米醇溶蛋白啟動子在玉米籽粒中表達(dá)AMPA轉(zhuǎn)?；富虻姆戳x轉(zhuǎn)錄物，可能防止所述轉(zhuǎn)?；冈诜N子中累積。因此，在既表達(dá)GOX又表達(dá)轉(zhuǎn)?；傅闹参镏?，應(yīng)用草甘膦除草劑可能導(dǎo)致種子組織不能成熟。相反，對所述GOX基因的反義抑制可能實現(xiàn)相同的結(jié)果。最好是，在特定組織中抑制所述轉(zhuǎn)?；缚赡苁歉鼮橛欣模貏e是當(dāng)已經(jīng)證明特定組織不耐受AMPA或相關(guān)化合物時。本發(fā)明人特別設(shè)想了，一種相似的策略可以與本發(fā)明一起使用，以指導(dǎo)可篩選標(biāo)記或選擇標(biāo)記在種子組織中的表達(dá)。
另一方面，人們可能希望獲得按照本發(fā)明使用的新組織特異性啟動子序列。為此，人們可以首先從所關(guān)注的組織中分離cDNA克隆，并例如采用RNA印跡法鑒定在該組織中特異性表達(dá)的那些克隆。理想的是，人們有可能鑒定出不以高拷貝數(shù)存在、但所述基因產(chǎn)物在特定組織中相對豐富的基因?？梢圆捎帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的分子生物學(xué)技術(shù)，將相應(yīng)的基因組克隆的啟動子和控制元件定位。
設(shè)想了僅需要在特定條件下在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)某些基因。例如，建議賦予對環(huán)境脅迫因素例如干旱的抗性的某些基因僅需要在真正的脅迫條件下表達(dá)。進(jìn)一步設(shè)想了這類基因在植物的整個發(fā)育期間的表達(dá)可能具有有害效應(yīng)。已知存在著大量對環(huán)境應(yīng)答的基因。例如，由光通過植物光敏素介導(dǎo)調(diào)節(jié)某些基因，例如編碼核酮糖二磷酸羧化酶小亞基的rbcS的表達(dá)。其它基因由次級刺激物誘導(dǎo)。例如，脫落酸(ABA)的合成由某些環(huán)境因素誘導(dǎo)，包括但不限于水脅迫。已經(jīng)表明許多基因由ABA誘導(dǎo)(Skrivet和Mundy，1990)。也預(yù)期可能僅需要在實際存在除草劑的條件下表達(dá)賦予對應(yīng)用除草劑的抗性的基因。因此，對于某些所需性狀，將需要在轉(zhuǎn)基因植物中誘導(dǎo)型地表達(dá)基因。
在本發(fā)明的某些實施方案中，提出僅需要在植物發(fā)育的某個時期在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)基因。發(fā)育的定時通常與組織特異性基因表達(dá)相關(guān)。例如，在傳粉后約15天在胚乳中啟動玉米醇溶蛋白貯存蛋白的表達(dá)。
也設(shè)想了在細(xì)胞內(nèi)使DNA插入特異性地定向可能是有用的。例如，將所引入的DNA導(dǎo)向細(xì)胞核、特別是導(dǎo)向到一種植物染色體內(nèi)內(nèi)的精確位置中，以便達(dá)到定點整合可能是有用的。例如，使用以取代該細(xì)胞中現(xiàn)有基因、或互補(bǔ)根本無功能或根本不存在的基因的基因通過轉(zhuǎn)化引入可能是有用的。
也設(shè)想了用本發(fā)明表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的植物。也設(shè)想了得自這樣的轉(zhuǎn)化細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因植物。本領(lǐng)域技術(shù)人員會認(rèn)識到，可以采用本領(lǐng)域熟知的方法，將含本發(fā)明結(jié)構(gòu)編碼序列的嵌合植物基因插入植物基因組中。用于植物細(xì)胞的DNA轉(zhuǎn)化的這樣的方法包括土壤桿菌介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)化、應(yīng)用脂質(zhì)體、采用病毒或花粉的轉(zhuǎn)化、電穿孔、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化、將基因轉(zhuǎn)移到花粉中、注射到生殖器官中、注射到未成熟胚和微粒轟擊。這些方法中的每一種方法具有不同的優(yōu)點和缺點。因此，將基因引入特定植物品系的一種特定方法對于另一種植物品系可能不是最有效的，但眾所周知哪種方法可用于特定植物品系。
有許多將轉(zhuǎn)化DNA區(qū)段引入細(xì)胞中的方法，但不是所有的方法都適合于將DNA傳遞至植物細(xì)胞。認(rèn)為合適的方法事實上包括可以將DNA引入細(xì)胞中的任何方法，例如通過根癌土壤桿菌和相關(guān)的土壤桿菌菌株感染、例如通過以下方法直接傳遞DNAPEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(Omirulleh等，1993)、干燥/抑制介導(dǎo)的DNA攝入、電穿孔、與碳化硅纖維一起攪拌、DNA包被粒子的加速等。在某些實施方案中，加速方法是優(yōu)選的，包括例如微粒轟擊等。
將DNA引入細(xì)胞中的技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。已經(jīng)描述了用于將基因傳遞至細(xì)胞中的4種常用方法(1)化學(xué)方法(Graham和van der Eb，1973)；(2)物理方法，例如微注射(Capecchi，1980)、電穿孔(Wong和Neumann，1982；Fromm等，1985)和基因槍(Johnston和Tang，1994；Fynan等，1993)；(3)病毒載體(Clapp，1993；Lu等，1993；Eglitis和Anderson，1988a；1988b)；和(4)受體介導(dǎo)的機(jī)制(Curiel等，1991；1992；Wagner等，1992)。
將短高壓電脈沖施加到多種動物和植物細(xì)胞上，導(dǎo)致在質(zhì)膜中形成納米大小的孔。DNA或者通過這些孔，或者由于伴隨孔封閉的膜組分重分配，而被直接吸收到細(xì)胞質(zhì)中。電穿孔可能非常有效，并且既可以用于瞬時表達(dá)所克隆的基因，又可以用來建立攜帶整合拷貝目的基因的細(xì)胞系。與磷酸鈣介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染和原生質(zhì)體融合相反，電穿孔時常產(chǎn)生攜帶一個整合拷貝、或最多幾個整合拷貝的外源DNA的細(xì)胞系。
通過電穿孔的方法引入DNA是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。為了通過電穿孔實現(xiàn)轉(zhuǎn)化，人們可以利用或者易碎的組織例如細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)物、或胚胎發(fā)生愈傷組織，或者人們可以直接轉(zhuǎn)化未成熟胚或其它構(gòu)成組織。人們可以通過將選定細(xì)胞暴露于果膠降解酶(果膠溶酶)，或者以控制的方式機(jī)械制造傷口使所述細(xì)胞對轉(zhuǎn)化更加敏感，部分降解其細(xì)胞壁。則這種細(xì)胞可以是通過電穿孔進(jìn)行DNA轉(zhuǎn)移的受體，可以在該階段進(jìn)行電穿孔，然后根據(jù)新?lián)饺氲腄NA的性質(zhì)，通過合適的選擇或篩選方案鑒定轉(zhuǎn)化細(xì)胞。
將轉(zhuǎn)化DNA區(qū)段傳遞到植物細(xì)胞的再一種有利方法是微粒轟擊。在該方法中，可以用核酸包被粒子，然后通過推進(jìn)力將其傳遞至細(xì)胞中。典型的粒子包括由鎢、金、鉑等構(gòu)成的粒子。采用這些粒子，所述小金屬粒子表面上的DNA穿過細(xì)胞壁被攜帶到胞質(zhì)中(Klein等，1987；Klein等，1988；Kawata等，1988)。金屬粒子穿透數(shù)層細(xì)胞，因此使得可以轉(zhuǎn)化組織外植體內(nèi)的細(xì)胞。對于鑒定葉綠體或質(zhì)體定向轉(zhuǎn)化事件，優(yōu)選微粒轟擊法。
微粒轟擊除了是可再現(xiàn)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的有效方法外，其一個優(yōu)點是既不需要分離原生質(zhì)體(Cristou等，1988)，又不需要對土壤桿菌感染的敏感性。用于通過加速將DNA傳遞至植物細(xì)胞中的方法的一個說明性實施方案是Biolistics粒子傳遞系統(tǒng)，它可以用來將包有DNA或細(xì)胞的粒子通過篩網(wǎng)，例如不銹鋼篩網(wǎng)或Nytex篩網(wǎng)，推進(jìn)到覆蓋有懸浮液中的植物培養(yǎng)細(xì)胞的濾膜表面上。所述篩網(wǎng)分散所述粒子，使得它們不會以大聚集物傳遞至受體細(xì)胞。人們認(rèn)為間插在發(fā)射裝置和待轟擊的細(xì)胞之間的篩網(wǎng)減小轟擊粒子聚集物的大小，并且可能通過減小太大的轟擊粒子對受體細(xì)胞施加的損害，而導(dǎo)致轉(zhuǎn)化率較高。
關(guān)于所述轟擊，最好是將懸浮液中的細(xì)胞在濾膜或固體培養(yǎng)基上濃縮。或者，可以在固體培養(yǎng)基上布置未成熟胚或其它靶細(xì)胞。待轟擊的細(xì)胞位于微粒(microprojectile)阻止板之下適當(dāng)?shù)木嚯x處。如有需要，還可在加速裝置和待轟擊細(xì)胞之間放置一個或多個篩網(wǎng)。通過利用本文敘述的技術(shù)，人們可以獲得高達(dá)1000個或更多的瞬時表達(dá)標(biāo)記基因的細(xì)胞轉(zhuǎn)化灶。在轟擊后48小時轉(zhuǎn)化灶中表達(dá)所述外源基因產(chǎn)物的細(xì)胞數(shù)范圍通常為1-10個，平均1-3個。
在轟擊轉(zhuǎn)化中，人們可以優(yōu)化轟擊前培養(yǎng)條件和轟擊參數(shù)，以產(chǎn)生最大數(shù)目的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體。轟擊的物理參數(shù)和生物學(xué)參數(shù)在該技術(shù)中均是重要的。物理因素是涉及操作所述DNA/微粒沉淀或影響宏彈(macroprojectile)或微彈射程和速度的因素。生物學(xué)因素包括涉及在轟擊之前以及緊隨轟擊后的細(xì)胞操作的所有步驟、有助于減輕與轟擊相關(guān)創(chuàng)傷的靶細(xì)胞的滲透調(diào)節(jié)以及轉(zhuǎn)化DNA的性質(zhì)，例如線性化DNA或完整的超螺旋質(zhì)粒。人們認(rèn)為轟擊前操作對于成功轉(zhuǎn)化未成熟植物胚尤為重要。
因此，設(shè)想了人們可能需要在小規(guī)模研究中調(diào)節(jié)各種轟擊參數(shù)，以全面優(yōu)化所述條件。人們可能特別希望調(diào)節(jié)諸如間隙距離、飛行距離、組織距離和氦氣壓之類的物理參數(shù)。人們也可以通過修改影響受體細(xì)胞生理狀態(tài)和可能因此影響轉(zhuǎn)化和整合效率的條件，使創(chuàng)傷減少因素(TRF)最小化。例如，可以調(diào)節(jié)滲透狀態(tài)、組織水合作用和受體細(xì)胞的傳代培養(yǎng)階段或細(xì)胞周期，以使轉(zhuǎn)化最佳。根據(jù)本說明書，其它常規(guī)調(diào)節(jié)的實施是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。
粒子介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。美國專利5,015,580(其具體通過引用結(jié)合到本文中)描述了采用這種技術(shù)轉(zhuǎn)化大豆。
土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移是將基因引入植物細(xì)胞中的廣泛適用的系統(tǒng)，因為可以將所述DNA引入全部植物組織中，由此繞過由原生質(zhì)體再生完整植株的需要。應(yīng)用土壤桿菌介導(dǎo)的植物整合型載體將DNA引入植物細(xì)胞是本領(lǐng)域熟知的。參見例如已描述的方法(Fraley等，1985；Rogers等，1987)。在美國專利5,004,863(其具體通過引用結(jié)合到本文中)中描述了用土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移對棉花植株進(jìn)行基因工程；在美國專利5,349,124(其具體通過引用結(jié)合到本文中)中描述了萵苣植株的相似轉(zhuǎn)化；以及在美國專利5,416,011(其具體通過引用結(jié)合到本文中)中描述了大豆的土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化。此外，Ti-DNA的整合是一種相對精確的方法，幾乎不導(dǎo)致重排。轉(zhuǎn)移的DNA區(qū)由邊界(border)序列限定，通常將間插DNA插入植物基因組中，如已描述的(Spielmann等，1986；Jorgensen等，1987)。
現(xiàn)代土壤桿菌轉(zhuǎn)化載體能夠在大腸桿菌以及土壤桿菌中復(fù)制，提供方便的操作，如已描述的(Klee等，1985)。此外，近來在用于土壤桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移的載體方面的技術(shù)進(jìn)展已經(jīng)改進(jìn)了所述載體中基因和限制位點的布置，以便于構(gòu)建能夠表達(dá)各種多肽編碼基因的載體。已描述的載體(Rogers等，1987)具有方便的多接頭區(qū)，多接頭區(qū)側(cè)翼為用于指導(dǎo)所插入多肽編碼基因表達(dá)的啟動子和聚腺苷酸化位點，這些載體適用于本發(fā)明目的。另外，含有致瘤性(armed)和非致瘤性(disarmed)Ti基因的土壤桿菌可以用于轉(zhuǎn)化。在土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化有效的那些植物品種中，所述基因轉(zhuǎn)移由于其易得和限定的特性而成為選擇的方法。
土壤桿菌介導(dǎo)的葉圓盤和其它組織(例如子葉和下胚軸)的轉(zhuǎn)化看來限于土壤桿菌天然感染的植物。土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化在雙子葉植物中是最有效的?？磥韼缀鯖]有單子葉植物是土壤桿菌的天然宿主，盡管如已描述的用土壤桿菌載體已經(jīng)在天門冬中產(chǎn)生了轉(zhuǎn)基因植物(Bytebier等，1987)。最近也已經(jīng)用土壤桿菌轉(zhuǎn)化了其它單子葉植物。在該組中包括玉米(Ishida等)和水稻(Cheng等)。
用土壤桿菌轉(zhuǎn)化法產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因植物通常在一條染色體上僅含有單個基因。這種轉(zhuǎn)基因植物對于所加入的基因可以稱為雜合的。然而，因為使用詞語“雜合的”通常暗示在一對染色體的第二條染色體的同一基因座上存在互補(bǔ)基因，而在含一個所加入基因的植物中沒有這種基因，所以人們認(rèn)為這種植物更準(zhǔn)確的名稱是獨立分離子，因為所加入的外源基因在有絲分裂和減數(shù)分裂期間獨立地分離。
當(dāng)所述植物作為雜種商品化時，例如玉米，可能優(yōu)選獨立分離子。在這種情況下，使含有該基因的獨立分離子與另一植株雜交，以形成目的基因雜合的雜種植物。
另一種優(yōu)選是所加入的結(jié)構(gòu)基因純合的轉(zhuǎn)基因植物，即含有兩個所加入基因的轉(zhuǎn)基因植物，一對染色體的每條染色體上的同一基因座都有一個基因。通過使含有單個所加入基因的獨立分離子轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行有性雜交(自交)，使所產(chǎn)生的某些種子萌發(fā)，并分析所產(chǎn)生的植株的目的基因活性和孟德爾遺傳性，表明相對于對照(天然的非轉(zhuǎn)基因植物)或獨立分離子轉(zhuǎn)基因植物為純合性，可以獲得純合的轉(zhuǎn)基因植物。
可以使兩種不同的轉(zhuǎn)基因植物交配，以產(chǎn)生含有兩個獨立分離的所加入的外源基因的后代。使合適的子代自交可以產(chǎn)生兩個所加入的編碼目的多肽的外源基因均純合的植物。也設(shè)想了與親本植株回交和與非轉(zhuǎn)基因植物異型雜交(out-crossing)。
采用基于磷酸鈣沉淀法、聚乙二醇處理、電穿孔和這些處理的組合的方法，可以完成植物原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(參見例如Potrykus等，1985；Lorz等，1985；Fromm等，1985；Uchimiya等，1986；Callis等，1987；Marcotte等，1988)。
這些系統(tǒng)對不同植物種質(zhì)的應(yīng)用取決于由原生質(zhì)體再生該特定植物品種的能力。描述了用于由原生質(zhì)體再生谷類作物的說明性方法(參見例如Fujimura等，1985；Toriyama等，1986；Yamada等，1986；Abdullah等，1986)。
為了轉(zhuǎn)化不能由原生質(zhì)體成功再生的植物種質(zhì)，可以利用將DNA引入完整細(xì)胞或組織的其它方法。例如，如已描述的，可以實現(xiàn)由未成熟胚或外植體再生谷類作物(Vasil，1988)。
未修飾的細(xì)菌基因通常在轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞中表達(dá)差。植物密碼子選擇比單細(xì)胞生物例如細(xì)菌更加非常類似人類和的其它高等生物的密碼子選擇。幾篇報道已經(jīng)公開了改進(jìn)重組基因在植物中表達(dá)的方法(Murray等，1989；Diehn等，1996；Iannacone等，1997；Rouwendal等，1997；Futterer等，1997；和Futterer和Hohn，1996)。這些報道公開了各種方法，用于根據(jù)植物密碼子頻率表將編碼序列工程化，以代表更有效翻譯的序列；采用避免可疑的聚腺苷酸化或富A/T結(jié)構(gòu)域或內(nèi)含子剪接共有序列的重組序列，改進(jìn)密碼子第三堿基位置偏倚。
美國專利5,500,365(其具體通過引用結(jié)合到本文中)描述了合成植物基因以優(yōu)化所合成基因編碼的蛋白的表達(dá)水平的優(yōu)選方法。該方法涉及修飾外源轉(zhuǎn)基因的結(jié)構(gòu)基因序列，以使其更“象植物”，并因此更有可能被所述單子葉植物或雙子葉植物翻譯和表達(dá)。然而，美國專利5,689,052中公開的方法提供了最好是在單子葉植物中的轉(zhuǎn)基因表達(dá)的增強(qiáng)，其通過引用結(jié)合到本文中。簡而言之，按照Brown等的方法，降低編碼所需蛋白的多核苷酸序列中罕用和半罕用單子葉植物密碼子的頻率，并用更優(yōu)選的單子葉植物密碼子取代。在單子葉植物中由修飾的多核苷酸序列編碼的所需多肽累積的增加是提高優(yōu)選密碼子頻率的結(jié)果，所述優(yōu)選密碼子頻率的提高是通過以連續(xù)6個核苷酸的片段分析所述編碼序列，并基于就單子葉植物中最稀少的284、484和664六聚體的出現(xiàn)頻率而論的所述六聚體出現(xiàn)的頻率，改變所述序列來實現(xiàn)。此外，Brown等公開了通過應(yīng)用降低罕用密碼子頻率的方法以及以下方法增加重組基因表達(dá)在所述核苷酸序列中減少聚腺苷酸化信號和內(nèi)含子剪接位點的出現(xiàn)，除去所述核苷酸序列中自身互補(bǔ)的序列，并用非自身互補(bǔ)的核苷酸取代這種序列，同時維持編碼所述多肽的結(jié)構(gòu)基因，并降低所述核苷酸序列中5’-CG-3’二核苷酸對出現(xiàn)的頻率。按順序進(jìn)行這些步驟，并且有累積效應(yīng)，產(chǎn)生對于所需多肽中存在的大多數(shù)氨基酸而言含有單子葉植物優(yōu)先利用的更優(yōu)選的單子葉植物密碼子的核苷酸序列。
因此，可以采用諸如本文公開的轉(zhuǎn)化方法，通過轉(zhuǎn)化植物在那些植物中增加編碼目的多肽的基因量。特別是，葉綠體或質(zhì)體轉(zhuǎn)化可以在含這些亞細(xì)胞器結(jié)構(gòu)的組織中產(chǎn)生以至多約10,000拷貝/細(xì)胞存在的所需編碼序列(McBride等，Bio/Technology13362-365，1995)。
也可以如已描述的(Zhou等，1983；Hess，1987)通過將DNA直接轉(zhuǎn)移到花粉中，將DNA引入植物中。如已描述的方法(Pena等，1987)，通過將所述DNA注射到植物生殖器官中，可以獲得多肽編碼基因的表達(dá)。也可以將DNA直接注射到未成熟胚的細(xì)胞中，并如描述的方法(Neuhaus等，1987；Benbrook等，1986)通過干燥的胚的再水合，將DNA引入細(xì)胞中。
在實現(xiàn)將外源DNA傳遞至受體細(xì)胞后，獲得轉(zhuǎn)基因植物的下一步一般涉及鑒定轉(zhuǎn)化細(xì)胞，用于進(jìn)一步培養(yǎng)和植株再生。如本文所述，為了提高鑒定轉(zhuǎn)化體的能力，人們可能需要使用選擇標(biāo)記基因或可篩選標(biāo)記基因作為可表達(dá)的目的基因，或除可表達(dá)的目的基因外，可以使用所述標(biāo)記或可篩選標(biāo)記基因。在這種情況下，于是人們通常應(yīng)該通過將所述細(xì)胞暴露于一種或更多種選擇劑來分析潛在轉(zhuǎn)化的細(xì)胞群體，或人們應(yīng)該篩選具有所需標(biāo)記基因性狀的細(xì)胞。
轉(zhuǎn)化細(xì)胞鑒定方法的一個典型實施方案涉及將轉(zhuǎn)化的培養(yǎng)物暴露于選擇劑，例如代謝抑制劑、抗生素、除草劑等。已經(jīng)被轉(zhuǎn)化并穩(wěn)定整合了賦予對所用的選擇劑抗性的標(biāo)記基因的細(xì)胞，將在培養(yǎng)物中生長并分裂。敏感細(xì)胞經(jīng)不起進(jìn)一步培養(yǎng)。優(yōu)選標(biāo)記基因的一個實例是賦予草甘膦抗性。當(dāng)將該基因用作選擇標(biāo)記時，推定的轉(zhuǎn)化細(xì)胞培養(yǎng)物用草甘膦處理。處理后，將可得到轉(zhuǎn)基因細(xì)胞用于進(jìn)一步培養(yǎng)，而不能得到敏感的或非轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。該方法詳細(xì)地描述于美國專利5,569,834，其具體通過引用結(jié)合到本文中。優(yōu)選選擇標(biāo)記系統(tǒng)的另一實例是新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(nptII)抗性系統(tǒng)，該系統(tǒng)賦予對抗生素卡那霉素的抗性，如美國專利5,569,834(其具體通過引用結(jié)合到本文中)中所述。另外，在用該系統(tǒng)轉(zhuǎn)化后，當(dāng)用卡那霉素處理時，將可得到轉(zhuǎn)化細(xì)胞用于進(jìn)一步培養(yǎng)，而不能得到非轉(zhuǎn)化細(xì)胞。再一優(yōu)選選擇標(biāo)記系統(tǒng)涉及應(yīng)用賦予對巴龍霉素抗性的基因構(gòu)建體。該類型選擇標(biāo)記系統(tǒng)的應(yīng)用描述于美國專利5,424,412(其具體通過引用結(jié)合到本文中)。
另一優(yōu)選的選擇標(biāo)記系統(tǒng)涉及應(yīng)用本發(fā)明設(shè)想的基因。特別是，可以將phnO基因或編碼AMPA轉(zhuǎn)?；傅拇笾孪嗨频幕蛴米鬟x擇標(biāo)記。通過在AMPA存在下培養(yǎng)所述細(xì)胞，可以從沒有摻入重組分子的細(xì)胞群體中選擇已經(jīng)在其基因組中具有所引入的重組DNA分子的植物細(xì)胞。本領(lǐng)域技術(shù)人員會認(rèn)識到這種選擇標(biāo)記系統(tǒng)具有的優(yōu)于先前的選擇標(biāo)記系統(tǒng)的具體優(yōu)點。用于整合到植物基因組中的重組DNA中的選擇標(biāo)記減少整合的靶DNA量，因為所述選擇標(biāo)記也將用于由轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞產(chǎn)生的植株中的改善的除草劑耐性或改善的除草劑抗性。這種選擇標(biāo)記也提供以前未知的另一種標(biāo)記系統(tǒng)，特別是在常常僅有數(shù)目有限的可利用的選擇標(biāo)記的大田中提供這種標(biāo)記系統(tǒng)。
壯觀霉素是一種質(zhì)體或葉綠體蛋白合成的抑制劑，但不是由核基因組編碼的胞質(zhì)核糖體的蛋白合成的抑制劑，通過利用葉綠體或質(zhì)體對壯觀霉素的敏感性，簡化transplastonomic選擇(質(zhì)體或葉綠體轉(zhuǎn)化事件的選擇)。壯觀霉素防止光合作用所需的葉綠體蛋白的積累，因此可以基于在其顏色方面的差異辨別抗壯觀霉素轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞抗性轉(zhuǎn)化細(xì)胞是綠色的，而敏感細(xì)胞由于質(zhì)體蛋白合成受抑制則是白色的。用合適的細(xì)菌aad基因轉(zhuǎn)化葉綠體或質(zhì)體，或用編碼壯觀霉素抗性質(zhì)體或葉綠體功能核糖體RNA的基因轉(zhuǎn)化葉綠體或質(zhì)體，提供了選擇和維持transplastonomic事件的方法(Maliga，Trends in Biotechnology 11101-106，1993)。
還設(shè)想了可篩選和可選擇標(biāo)記的組合將可用于鑒定轉(zhuǎn)化細(xì)胞。在某些細(xì)胞或組織類型中，例如草甘膦或卡那霉素的選擇劑可能或者未提供足夠的殺傷活性以清楚地識別轉(zhuǎn)化細(xì)胞，或者可能引起對轉(zhuǎn)化體以及同樣對非轉(zhuǎn)化體的顯著的非選擇性抑制，因此使得所述選擇技術(shù)不很有效。提出用一種生長抑制化合物例如草甘膦在低于引起100％抑制的那些濃度的濃度下進(jìn)行選擇，然后篩選例如卡那霉素的可篩選標(biāo)記基因表達(dá)的生長中的組織，將使得人們可以從經(jīng)不起單獨選擇的細(xì)胞或組織類型中回收轉(zhuǎn)化體。我們提出選擇和篩選的組合可能使得人們能夠在更多細(xì)胞類型和組織類型中鑒定轉(zhuǎn)化體。本發(fā)明的轉(zhuǎn)?；傅目傻眯钥梢韵ㄟ^提供額外的選擇方法進(jìn)行組合選擇和篩選的必要性。
由或者單一植物原生質(zhì)體或者各種外植體發(fā)育或再生植株是本領(lǐng)域熟知的(Weissbach和Weissbach，1988)。這種再生和生長過程通常包括以下步驟選擇轉(zhuǎn)化細(xì)胞、將那些個體化細(xì)胞培養(yǎng)至通常的胚胎發(fā)育階段至生根的小植株階段。轉(zhuǎn)基因胚和種子的再生是相似的。此后將所產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因生根苗種植在合適的植物生長介質(zhì)例如土壤中。
得自葉片外植體、含有由土壤桿菌引入的編碼目的多肽的外來、外源基因的植株的發(fā)育或再生，可以采用本領(lǐng)域熟知的方法完成，如已描述的方法(Horsch等，1985)。在該方法中，在選擇劑存在下，并于誘導(dǎo)被轉(zhuǎn)化的植物品系苗再生的培養(yǎng)基中培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體，如已描述的方法(Fraley等，1983)。特別是，美國專利5,349,124(其具體通過引用結(jié)合到本文中)詳細(xì)描述了創(chuàng)造表達(dá)雜種晶體蛋白的基因轉(zhuǎn)化萵苣細(xì)胞和由其產(chǎn)生的植株，其中所述雜種晶體蛋白賦予這種植株對鱗翅目幼蟲的殺蟲活性。
該方法通常在2-4個月內(nèi)產(chǎn)生苗，然后將這些苗轉(zhuǎn)移至合適的含所述選擇劑和防止細(xì)菌生長的抗生素的促進(jìn)生根培養(yǎng)基。然后將在所述選擇劑存在下生根形成小植株的苗移植至土壤或其它介質(zhì)中，以允許產(chǎn)生根。這些步驟根據(jù)所用的具體植物品系而不同，這種變化是本領(lǐng)域眾所周知的。
最好是，讓所述再生植株自花授粉以提供純合的轉(zhuǎn)基因植物，或使得自所述再生植株的花粉與農(nóng)學(xué)上重要的種子生長的植株(最好是近交系)雜交。相反，用得自這些重要系植株的花粉給再生植株傳粉。采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法，培育本發(fā)明的含有所需多肽的轉(zhuǎn)基因植物。
在一個實施方案中，本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物因此具有增加量的編碼AMPA轉(zhuǎn)?；付嚯牡木幋a區(qū)，所述多肽也可以與質(zhì)體引導(dǎo)肽一起表達(dá)。優(yōu)選的轉(zhuǎn)基因植物是獨立分離子，并且可以將該基因及其活性傳遞給其后代。更優(yōu)選的轉(zhuǎn)基因植物是該基因純合的，并且當(dāng)有性交配時將該基因傳遞至其所有后代?？梢詫⒌米赞D(zhuǎn)基因植物的種子種植在大田或溫室中，使所得的性成熟轉(zhuǎn)基因植物自花傳粉，以產(chǎn)生純育植株。這些植株的后代成為純育系，評價其所述轉(zhuǎn)酰基酶轉(zhuǎn)基因表達(dá)以及改善的除草劑耐性，特別是當(dāng)所述轉(zhuǎn)?；皋D(zhuǎn)基因與編碼GOX酶的基因一起共表達(dá)時。
按照本發(fā)明的基因和轉(zhuǎn)?；覆粌H包括本文公開的全長序列，而且也包括保留本文所具體例舉序列的特征性改善的除草劑防護(hù)活性的這些序列的片段或融合蛋白。
本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該明顯看出，可以通過幾種方法鑒定并獲得AMPA轉(zhuǎn)?；富蚝碗摹Ｌ囟ǖ幕蚧蚱洳糠挚梢缘米耘囵B(yǎng)物保藏機(jī)構(gòu)，或例如利用基因機(jī)合成構(gòu)建?？梢圆捎弥苽潼c突變的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)容易地構(gòu)建這些基因的變異物。此外，采用市售的外切核酸酶或內(nèi)切核酸酶，按照標(biāo)準(zhǔn)方法，可以制備這些基因的片段。例如，諸如Bal31的酶或定點誘變可以用來從這些基因的末端有規(guī)則地切下核苷酸。此外，采用多種其它限制酶可以獲得編碼活性片段的基因。蛋白酶可以用來直接獲得這些轉(zhuǎn)酰基酶的活性片段。
采用本文提供的內(nèi)容，也可以從大腸桿菌菌株和/或DNA文庫中分離出等同的AMPA轉(zhuǎn)?；负?或編碼這些轉(zhuǎn)?；傅幕颉＠?，本文公開和要求保護(hù)的抗轉(zhuǎn)?；傅目贵w可以用來從蛋白混合物中鑒定并分離出其它轉(zhuǎn)酰基酶。具體地說，可以針對本文公開的轉(zhuǎn)酰基酶產(chǎn)生抗體，并且用這些抗體通過免疫沉淀、柱免疫純化、酶聯(lián)免疫測定(ELISA)或蛋白質(zhì)印跡法，特異性地鑒定出等同的AMPA轉(zhuǎn)?；?。
用于鑒定本發(fā)明的肽和基因的另一方法是通過應(yīng)用寡核苷酸探針。這些探針是具有可檢測標(biāo)記的核苷酸序列。正如本領(lǐng)域眾所周知的，如果所述探針分子和靶核酸樣品中的序列通過在這兩種分子之間形成強(qiáng)結(jié)合而雜交，則可以合理地假設(shè)所述探針和靶樣品含有基本上相同的多核苷酸序列。所述探針的可檢測標(biāo)記提供了以已知方式確定雜交是否已發(fā)生的手段。這種探針分析提供了本發(fā)明AMPA轉(zhuǎn)?；富虻目焖勹b定方法。
采用標(biāo)準(zhǔn)方法，利用DNA合成儀可以合成用作按照本發(fā)明探針的核苷酸區(qū)段。在所述核苷酸區(qū)段作為探針的應(yīng)用中，用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何合適的標(biāo)記來標(biāo)記所述特定的探針，所述標(biāo)記包括放射性標(biāo)記和非放射性標(biāo)記。典型的放射性標(biāo)記包括32P、125I、35S等。采用DNA酶和DNA聚合酶，通過常規(guī)切口平移反應(yīng)，可以從與所述DNA樣品互補(bǔ)的核苷酸序列構(gòu)建用放射性同位素標(biāo)記的探針。然后可以將探針和樣品在雜交緩沖液中混合，并于合適的溫度下保持直至發(fā)生退火。此后，洗滌下膜上無關(guān)的物質(zhì)，留下樣品和結(jié)合的探針分子，通常通過放射自顯影和/或液體閃爍計數(shù)檢測和定量。
非放射性標(biāo)記包括例如配體，如生物素或甲狀腺素；以及酶，例如水解酶或過氧化物酶；或各種化學(xué)發(fā)光劑，例如螢光素，或熒光化合物如熒光蛋白、羅丹明、德克薩斯紅及其衍生物等。所述探針也可以在兩端用不同類型的標(biāo)記物來標(biāo)記以易于分離，例如在上述末端采用同位素標(biāo)記來標(biāo)記，而在另一端采用生物素標(biāo)記，或可以在兩端用具有重疊吸收譜和發(fā)射譜的不同熒光發(fā)射體來標(biāo)記。
雙鏈體的形成和穩(wěn)定性取決于雜交體兩條鏈之間的大致互補(bǔ)，如上所述，可以容許一定程度的錯配。因此，本發(fā)明的探針包括所述序列的突變(單突變和多突變)、缺失、插入以及它們的組合，其中所述突變、插入和缺失允許與所述目的靶多核苷酸形成穩(wěn)定的雜交體。以許多方式，采用目前本領(lǐng)域一般技術(shù)人員已知的方法，也許通過將來可能已知的其它方法，可以在給定的多核苷酸序列中產(chǎn)生突變、插入和缺失。
所列的所述探針的可能變異是部分由于遺傳密碼的豐余性引起的。由于遺傳密碼的豐余性，對于用來制備蛋白的大多數(shù)氨基酸而言，可以使用一種以上的編碼核苷酸三聯(lián)體(密碼子)。因此，不同的核苷酸序列可能編碼一種特定的氨基酸。因此，大腸桿菌AMPA轉(zhuǎn)?；负碗暮唾|(zhì)體引導(dǎo)肽的氨基酸序列以及編碼它們的多核苷酸，可以由編碼所述蛋白或肽的同一氨基酸序列的等同核苷酸序列制備。因此，本發(fā)明包括這種等同的核苷酸序列。此外，反向或互補(bǔ)序列是本發(fā)明的一個方面，可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員容易地使用。另外，已經(jīng)表明，已鑒定結(jié)構(gòu)和功能的蛋白可以通過改變氨基酸序列來構(gòu)建，只要這種改變不改變蛋白的二級結(jié)構(gòu)(Kaiser和Kezdy，1984)。因此，本發(fā)明包括本文描述的氨基酸序列的突變體，其中所述突變體不改變所述蛋白的二級結(jié)構(gòu)，或如果結(jié)構(gòu)被改變，則基本上保留所述生物活性。此外，如本發(fā)明中所討論的，本發(fā)明也包括帶有編碼AMPA轉(zhuǎn)?；傅幕蚝?或編碼質(zhì)粒引導(dǎo)肽的基因的整個基因或其部分的生物的突變體。這樣的突變體可以采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)制備。例如，可以用UV輻射制備宿主生物的突變體。同樣，這樣的突變體可以包括也可以采用本領(lǐng)域熟知的方法制備的無孢子宿主細(xì)胞。
定點誘變是可用于通過對編碼這種肽的結(jié)構(gòu)基因進(jìn)行特異性誘變來制備單個的、新的特有的有用肽或生物功能等同蛋白或肽的技術(shù)。所述技術(shù)還提供制備并測試序列變異體的現(xiàn)成可用的能力，其中所述變異體例如通過以下方法來改變基因的編碼序列而制備將一個或多個核苷酸序列變化引入所述DNA中用以產(chǎn)生新的或有用的限制性內(nèi)切核酸酶切割識別序列，或以用以改變所述編碼序列，使得基因的密碼子和G/C百分比代表特定屬或物種更常用的密碼子和G/C百分比。定點誘變允許通過利用特異性誘變寡核苷酸序列產(chǎn)生缺失、插入或置換突變，所述特異性誘變寡核苷酸序列包含所需突變的DNA序列。誘變寡核苷酸通常提供具有足夠大小的引物序列以及在所需突變靶位點的兩側(cè)形成穩(wěn)定雙鏈體的序列復(fù)雜性。通常最好是長約17-25個核苷酸的引物，并且在所需突變靶位點兩側(cè)具有重疊的約5-10個殘基。
一般而言，定點誘變技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的，如各種出版物例舉的。正如人們將認(rèn)識到的，該技術(shù)通常使用以單鏈和雙鏈形式存在的噬菌體載體?？捎糜诙c誘變的典型載體包括載體例如M13噬菌體。這些噬菌體容易從市場上獲得，并且其用法一般是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。雙鏈質(zhì)粒也常規(guī)用于定點誘變，通常含有絲狀噬菌體的復(fù)制起點，所述復(fù)制起點在輔助噬菌體的存在下，允許由所述質(zhì)粒載體合成單鏈DNA。
一般而言，通過首先獲得單鏈載體或?qū)⒃谛蛄兄邪ㄍ蛔儼形稽c的雙鏈載體的兩條鏈解鏈，進(jìn)行按照本文的定點誘變。一般合成制備帶有所需突變序列的誘變寡核苷酸引物。然后讓該誘變引物在所述突變靶位點與單鏈載體一起退火，并經(jīng)過DNA聚合酶例如大腸桿菌聚合酶IKlenow片段處理，以便完成含突變鏈的合成。因此，形成其中一條鏈編碼原始非突變序列而第二條鏈帶有所需突變的雜雙鏈體。然后用這種雜雙鏈體載體轉(zhuǎn)化合適的細(xì)胞例如大腸桿菌細(xì)胞，并選擇包括含所述誘變引物序列代表的突變的重組載體的克隆。
作為產(chǎn)生潛在有用的種類的方法，提供采用定點誘變制備編碼選定肽的DNA區(qū)段的序列變體，所述制備不是限制性的，因為有可以獲得肽序列變體及編碼其的DNA序列的其它方法。例如，編碼所需肽序列的重組載體可以用誘變劑例如羥胺處理，以獲得序列變體。這樣的方法可以順利地改變所述蛋白的生物化學(xué)和生物物理特性或其作用方式。這些包括但不限于1)增加AMPA轉(zhuǎn)?；傅男纬桑?)提高蛋白穩(wěn)定性或減少蛋白酶降解，3)增加對底物的識別和結(jié)合，4)改善酶動力學(xué)，和5)由于上述任何原因或所有原因而增加N-?；?AMPA的形成。
可以在本發(fā)明肽的結(jié)構(gòu)和編碼它們的DNA區(qū)段中進(jìn)行修飾和變化，并且仍獲得編碼具有所需特性的蛋白或肽的功能分子。本文設(shè)想的生物功能等同的肽、多肽和蛋白應(yīng)該與本文公開的AMPA轉(zhuǎn)?；赴被嵝蛄械男蛄谢蚱渲邢鄳?yīng)的部分具有至少約40％至約65％序列相似性，優(yōu)選具有約66％至約75％的序列相似性，更優(yōu)選具有約76％至約85％相似性，最優(yōu)選具有約86％至約90％或更高的序列相似性。
以下的討論基于改變蛋白的氨基酸，以產(chǎn)生等同的或甚至改進(jìn)的第二代分子。在本發(fā)明的具體實施方案中，設(shè)想突變的AMPA轉(zhuǎn)?；傅鞍卓捎糜诟纳苹蛟鰪?qiáng)所述蛋白在植物中的表達(dá)，并因此在植物細(xì)胞中提高或改善所述AMPA轉(zhuǎn)?；富钚院?或所述重組轉(zhuǎn)基因的表達(dá)。根據(jù)表1中給出的密碼子，通過在雙子葉植物、更優(yōu)選在單子葉植物中改變所述DNA序列的密碼子，可以完成所述氨基酸改變。
表1氨基酸 密碼子丙氨酸AlaAGCA GCC GCG GCU半胱氨酸 CysCUGC UGU天冬氨酸 AspDGAC GAU谷氨酸GluEGAA GAG苯丙氨酸 PheFUUC UUU甘氨酸GlyGGGA GGC GGG GGU組氨酸HisHCAC CAU異亮氨酸 IleIAUA AUC AUU賴氨酸LysKAAA AAG亮氨酸LeuLUUA UUG CUA CUC CUG CUU甲硫氨酸 MetMAUG天冬酰胺 AsnNAAC AAU脯氨酸ProPCCA CCC CCG CCU谷氨酰胺 GlnQCAA CAG精氨酸ArgRAGA AGG CGA CGC CGG CGU絲氨酸SerSAGC AGU UCA UCC UCG UCU蘇氨酸ThrTACA ACC ACG ACU纈氨酸ValVGUA GUC GUG GUU色氨酸TrpWUGG酪氨酸TyrYUAC UAU例如，在蛋白結(jié)構(gòu)中的某些氨基酸可以用其它氨基酸取代，而不明顯損失與例如抗體的抗原結(jié)合區(qū)或底物分子上的結(jié)合位點的結(jié)構(gòu)的相互作用結(jié)合能力。由于正是蛋白的相互作用能力和特性限定了該蛋白的生物學(xué)功能活性，因此在蛋白序列中，當(dāng)然還有其作為基礎(chǔ)的DNA編碼序列中，可以進(jìn)行某些氨基酸序列取代，依然獲得具有相似特性的蛋白。因此本發(fā)明人考慮到，在所公開的組合物的肽序列或編碼所述肽的相應(yīng)的DNA序列中，可以進(jìn)行各種改變，而不明顯損失其生物利用性或生物活性。
在制備這種改變時，可以考慮氨基酸的親水指數(shù)。親水氨基酸指數(shù)在賦予蛋白相互作用性生物功能方面的重要性是本領(lǐng)域普通了解的(Kyte和Doolittle，1982，通過引用結(jié)合到本文中)。普遍認(rèn)為，所述氨基酸的相對親水特性對所產(chǎn)生的蛋白的二級結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響，所述二級結(jié)構(gòu)進(jìn)而又限定了該蛋白與其它分子的相互作用，所述其它分子例如為酶、底物、受體、DNA、抗體、抗原等。
根據(jù)氨基酸的疏水性和電荷特性，已經(jīng)確定了每種氨基酸的親水指數(shù)(Kyte和Doolittle，1982)，它們是異亮氨酸(+4.5)；纈氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；蘇氨酸(-0.7)；絲氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；組氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；賴氨酸(-3.9)；和精氨酸(-4.5)。
本領(lǐng)域已知某些氨基酸可以被具有相似親水指數(shù)或計分的其它氨基酸取代，仍產(chǎn)生具有相似生物活性的蛋白，即仍獲得生物功能等同的蛋白。在制備這樣的改變時，優(yōu)選親水指數(shù)在±2以內(nèi)的氨基酸取代，特別優(yōu)選親水指數(shù)在±1以內(nèi)的氨基酸的取代，甚至更特別優(yōu)選親水指數(shù)在±0.5以內(nèi)的氨基酸的取代。
本領(lǐng)域也知道，根據(jù)親水性可以有效地進(jìn)行相似氨基酸的取代。美國專利4,554,101(其通過引用結(jié)合到本文中)敘述了取決于其相鄰氨基酸親水性的蛋白的最大局部平均親水性與所述蛋白的生物特性相關(guān)。
如美國專利4,554,101中詳細(xì)描述的，已經(jīng)確定了氨基酸殘基的以下親水性值精氨酸(+3.0)；賴氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0±1)；谷氨酸(+3.0±1)；絲氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；蘇氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5±1)；丙氨酸(-0.5)；組氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；纈氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；異亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)。
人們理解，一種氨基酸可以被具有相似親水性值的另一氨基酸取代，并且仍獲得生物學(xué)等同的、特別是免疫學(xué)等同的蛋白。在這樣的改變中，優(yōu)選親水性值在±2以內(nèi)的氨基酸取代，特別優(yōu)選親水性值在±1以內(nèi)的氨基酸的取代，甚至更特別優(yōu)選親水性值在±0.5以內(nèi)的氨基酸的取代。
如上概述的，因此氨基酸取代一般基于氨基酸側(cè)鏈取代基的相對相似性，例如其疏水性、親水性、電荷、大小等?？紤]各種上述特征的典型取代基是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，并且包括精氨酸和賴氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；絲氨酸和蘇氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸。
本領(lǐng)域技術(shù)人員知道，編碼異源蛋白的多核苷酸當(dāng)加入轉(zhuǎn)基因植物的核DNA中時表達(dá)通常較差(Diehn等的綜述，1996)。最好是，基本上如美國專利5,500,365和5,689,052(其具體通過引用結(jié)合到本文中)中所述，設(shè)計編碼目的異源蛋白的核苷酸序列?？捎糜诒磉_(dá)的核苷酸序列的實例包括但不限于SEQ ID NO3、SEQ ID NO7、SEQ IDNO11和SEQ ID NO19。
在所述基礎(chǔ)多肽序列中的氨基酸取代基可以選自所述天然存在的氨基酸所屬類別的其它成員?？梢詫被岱譃橐韵?組(1)酸性氨基酸；(2)堿性氨基酸；(3)中性極性氨基酸；和(4)中性非極性氨基酸。這些不同組中的代表性氨基酸包括但不限于(1)酸性(帶負(fù)電)氨基酸，例如天冬氨酸和谷氨酸；(2)堿性(帶正電)氨基酸，例如精氨酸、組氨酸和賴氨酸；(3)中性極性氨基酸，例如甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺；(4)中性非極性(疏水性)氨基酸，例如丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。
通過用這些組中的一種氨基酸取代同一組中的另一種氨基酸，可以進(jìn)行基礎(chǔ)多肽序列中的保守氨基酸改變。所述編碼核苷酸序列(基因、質(zhì)粒DNA、cDNA或合成DNA)因此將具有相應(yīng)的堿基置換，使得它編碼AMPA轉(zhuǎn)?；傅纳锕δ艿韧问?。
以下實施例描述本發(fā)明的優(yōu)選實施方案。此中的權(quán)利要求書范圍內(nèi)的其它實施方案對于通過考慮本文公開的說明書或本發(fā)明的實施的本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。本說明書和實施例僅打算考慮為示例性的，本發(fā)明的范圍和精神由在實施例之后的權(quán)利要求書指明。在實施例中，所有百分比均以重量為基礎(chǔ)給出，除非另有說明。
實施例實施例1該實施例描述N-氨甲基膦酸(AMPA)對植物愈傷組織的生長抑制效應(yīng)，而N-乙酰-氨甲基膦酸在體外培養(yǎng)條件下對植物愈傷組織沒有抑制作用。
表達(dá)細(xì)菌GOX基因并且也暴露于草甘膦的某些重組植物物種，可以表現(xiàn)出通過諸如褪綠、花蕾脫落和育性降低的癥狀表現(xiàn)出的植物毒性效應(yīng)。先前沒有確定這些癥狀的基礎(chǔ)。先前的研究已經(jīng)表明，表達(dá)GOX的植物將草甘膦代謝為AMPA和乙醛酸(美國專利第5,463,175號)。乙醛酸容易被植物代謝，然而，AMPA在植物組織中持續(xù)存在，可能是例如褪綠、矮化或其它不希望有的效應(yīng)的植物毒性效應(yīng)的原因。先前已經(jīng)表明，無色桿菌屬(Achromobacter)菌種LBAA能夠?qū)MPA酶促修飾為N-乙酰AMPA(美國專利第5,463,175號)。所述無色桿菌屬數(shù)據(jù)結(jié)合植物毒性數(shù)據(jù)表明，AMPA在植物中的N-?；梢蕴峁ν示G和其它不希望有的效應(yīng)的有效解除。因此，將煙草愈傷組織暴露于AMPA和暴露于N-乙酰AMPA，以便確定這些化合物中任一種是否表現(xiàn)出與在表達(dá)GOX并暴露于草甘膦的植物中觀察到的相似的細(xì)胞毒性效應(yīng)。
由MS104平板(MS鹽4.3g/l、蔗糖30g/l、B5維生素500X2ml/l、NAA 0.1mg/l和細(xì)菌培養(yǎng)用瓊脂1.0mg/l)上的野生型煙草“Samsun”煙草栽培品種(Nicotiana tabacum cv.“Samsun”)的葉片小片，產(chǎn)生煙草愈傷組織。將愈傷組織加樣到具有或不具有AMPA以及具有或不具有N-乙酰AMPA的平板上。平板含有濃度為0.1mM或0.4mM的AMPA或N-乙酰AMPA。將平板溫育至多3周，并定期進(jìn)行監(jiān)測。
不含AMPA或N-乙酰AMPA的對照平板上的愈傷組織，如預(yù)期的以正常速率生長、再生根和苗。在AMPA存在下的愈傷組織嚴(yán)重受抑制。沒有觀察到生長，顯示在這些濃度下AMPA的植物毒性效應(yīng)。在含N-乙酰AMPA的平板上的愈傷組織不受抑制，并且形成與對照愈傷組織生長相似的根和苗。該結(jié)果表明，作為GOX介導(dǎo)的草甘膦代謝副產(chǎn)物的AMPA可能導(dǎo)致植物中所觀察到植物毒性。該結(jié)果也表明從遺傳轉(zhuǎn)化愈傷組織中選擇植物的改進(jìn)方法的可能性以及增強(qiáng)草甘膦除草劑抗性的可能方法。實施例2該實施例描述在細(xì)菌無色桿菌(Achromobacter sp.)菌株LBAA中通過GOX酶水解進(jìn)行的草甘膦的降解，導(dǎo)致AMPA和N-乙酰-AMPA的產(chǎn)生。
先前已經(jīng)表明，GOX介導(dǎo)的草甘膦降解產(chǎn)生乙醛酸和AMPA(Barry等，US5,463,175)。也表明無色桿菌菌株LBAA由于草甘膦降解而產(chǎn)生AMPA和乙醛酸。按照以下方法，在草甘膦上生長的無色桿菌菌株LBAA的靜息細(xì)胞中表征了草甘膦降解途徑。在含有葡萄糖、葡糖酸和檸檬酸作為碳源、并且含有硫胺和酵母提取物(0.01％)以供應(yīng)微量需求、而且含有0.2mM草甘膦作為磷源的DF3S培養(yǎng)基中生長的100ml LBAA培養(yǎng)物的細(xì)胞，以200Klett單位的細(xì)胞密度收獲，用20ml DF3S培養(yǎng)基洗滌2次，并將20ml細(xì)胞的等同物再懸浮于100l含有[14C]草甘膦(2.5ml 52mCi/mmol，Amersham；CFA.745)的相同培養(yǎng)基中。將細(xì)胞混合物于30℃在震搖下溫育，并且以不同的間隔取出20ml樣品。將樣品離心，以從肉湯上清液中分離所述細(xì)胞。上清液和細(xì)胞沉淀均通過HPLC進(jìn)行分析。
通過配有放射性同位素標(biāo)記檢測的強(qiáng)陰離子交換(SAX)HPLC分析以這種方式制備的樣品，以測定其[14C]-AMPA和N-乙酰-[14C]-AMPA的水平。用Waters WISP自動注射器注射樣品。用MACS2-Monsanto自動色譜數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)收集色譜圖形和定量數(shù)據(jù)。Spherisorb S5 SAX，250mm X10mm柱或Altech5微米，250mmX10mmSAX柱用于該分析。所用的溶劑命名為溶液A和溶液B。溶液A含有4％甲醇中的用H3PO4調(diào)至pH2.0的0.005M KH2PO4。溶液B含有4％甲醇中的用H3PO4調(diào)至pH2.0的0.10M KH2PO4。每種樣品的運(yùn)轉(zhuǎn)時間由分級梯度程序組成，洗脫液流速為3ml/分鐘，而閃爍液(商標(biāo)為ATOMFLOW，No.NEN-995，得自Packard Instruments)的流速為9ml/分鐘。鑒別所分析的每種樣品中的[14C]-AMPA與N-乙酰-[14C]-AMPA的HPLC溶劑分布型表示為時間0至5分鐘100％溶劑A，然后5分鐘至15分鐘時100％溶劑B，然后至20分鐘100％溶劑A，此時準(zhǔn)備柱子以接受另一樣品。
將細(xì)胞沉淀首先再懸浮于通過加入0.65N HCl制成酸性的DF3S培養(yǎng)基中，煮沸5分鐘，然后短暫離心以提供用于HPLC分析的溶液相。上清液在HPLC分析之前進(jìn)行相似的處理。一個酸化的草甘膦對照也進(jìn)行HPLC分析，草甘膦的保留時間(RT)測定為10.8分鐘。溫育2小時后保留在上清液中的草甘膦峰中的放射性量已經(jīng)降低至原始水平的約33％，表明草甘膦被大量代謝。發(fā)現(xiàn)約3％的所述草甘膦在細(xì)胞內(nèi)。與甲胺標(biāo)準(zhǔn)共洗脫、RT為6分鐘的物質(zhì)占上清液中原始放射性量的約5％，占細(xì)胞內(nèi)容物中鑒定的原始放射性量的約1.5％。
在隨后一個實驗中進(jìn)一步闡述GOX介導(dǎo)的草甘膦降解途徑，其中將[14C]AMPA的代謝與如上所述在靜息細(xì)胞中[14C]草甘膦的代謝進(jìn)行比較，所述靜息細(xì)胞以165Klett單位收獲，并且以每100ml DF3S培養(yǎng)基15ml細(xì)胞的相當(dāng)量再懸浮。通過HPLC分析樣品，樣品由如上所述酸化且處理的全培養(yǎng)物組成。發(fā)現(xiàn)暴露于[14C]草甘膦2小時的培養(yǎng)物在保留時間為14.7分鐘的甲胺/N-乙酰-甲胺峰中有25％的所述標(biāo)記，12.5％為保留時間為6分鐘的AMPA，有30％在保留時間為13.2分鐘的峰中，30％為保留時間為10.8分鐘的草甘膦。對暴露于[14C]-AMPA2小時的培養(yǎng)物的分析表明，發(fā)現(xiàn)15％的所述標(biāo)記為N-乙酰-甲胺/甲胺，59％為AMPA，而18％在13.2分鐘的峰中。于13.2分鐘洗脫出的物質(zhì)通過負(fù)離子電噴霧質(zhì)譜被鑒定為N-乙酰-AMPA。該結(jié)果表明強(qiáng)離子在m/e152和m/e154，正如對于分子量為153道爾頓的該化合物所預(yù)期的。m/e154離子是由同位素14C原子產(chǎn)生的。N-乙酰-甲基-[14C]-AMPA由N-甲基-[14C]-AMPA產(chǎn)生，后者是[14C]-AMPA制劑中的一種已知的雜質(zhì)。
這些數(shù)據(jù)表明，無色桿菌屬菌株LBAA中的草甘膦降解途徑由草甘膦水解進(jìn)行至AMPA，然后AMPA假定通過去磷酸化步驟轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物甲胺，假定通過某些先前未知的酰基轉(zhuǎn)移步驟轉(zhuǎn)化為N-乙酰-AMPA。然后少量的N-乙酰-AMPA轉(zhuǎn)化為N-乙酰-甲胺。根據(jù)當(dāng)用氨甲基膦酸作為唯一磷酸源時在大腸桿菌中鑒定的產(chǎn)物，已經(jīng)推導(dǎo)出一個相似的?；襟E(Avila等，1987)。實施例3該實施例描述了大腸桿菌中AMPA酰基轉(zhuǎn)移酶活性的鑒定。
Avila等(1987)在研究C-P鍵裂開時，鑒定出在大腸桿菌體內(nèi)用作唯一磷酸源的多種氨基膦酸底物的代謝的去磷酸化的生物降解產(chǎn)物。他們的研究表明，AMPA在大腸桿菌K-12中不是?；牡孜铩Ａ硗?，Avila等關(guān)心在大腸桿菌中膦酸的C-P鍵裂開時N-聯(lián)化學(xué)取代的效應(yīng)，并鑒定出衍生自某些氨基膦酸代謝的N-乙?；a(chǎn)物。Avila等也證明，“野生型”大腸桿菌K12菌株與野生型大腸桿菌B菌株不同，不能用膦酸作為磷酸源。因此，考慮到如實施例1中表明的AMPA對愈傷組織的植物毒性效應(yīng)和如實施例2中表明的GOX介導(dǎo)的草甘膦降解產(chǎn)生AMPA，Avila等中的大腸桿菌數(shù)據(jù)表明，在能夠?qū)奔谆⑺?AMPA)轉(zhuǎn)化為N-乙酰-AMPA的某些細(xì)菌菌種中可能存在一種酶或途徑。具有那些特性的酶或途徑如果在植物中表達(dá)，可能在用草甘膦處理時賦予表達(dá)GOX的植物相當(dāng)大的優(yōu)勢。
為了測試這一點，在含低磷酸培養(yǎng)基上培養(yǎng)適于在AMPA上生長的大腸桿菌K-12菌株，以便獲得用于分析能夠就AMPA N-酰化的酶存在的細(xì)胞裂解液。phn(mpu)操縱子在大腸桿菌K-12中是隱蔽的，因為它有8個堿基對的插入，引起phnE基因中的移碼突變。這種移碼使PhnE失活，并且對該操縱子內(nèi)phnE下游的其它基因的翻譯產(chǎn)生極性效應(yīng)，導(dǎo)致這種突變體不能利用膦酸作為磷酸源(Makino等，J.Bacteriol.1732665-2672，1991)。對自發(fā)衍生的突變的選擇恢復(fù)phn操縱子的功能(phn+或mpu+)。因此，適于在AMPA、甲基膦酸或乙基膦酸上生長的K-12菌株含有這樣的有效自發(fā)衍生的突變。
簡而言之，將一等份的大腸桿菌K-12菌株JM101(mpu-)的新鮮L液體培養(yǎng)物平板接種MOPS(Neidhardt等，1974)完全瓊脂培養(yǎng)基上，該培養(yǎng)基含有25mg/ml氨基酸、10mg/ml維生素B1[硫胺]、0.2％葡萄糖和1.5％DIFCO“純化的”瓊脂與作為唯一磷酸源的氨甲基膦酸(AMPA；0.2mM；Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)，并于37℃培養(yǎng)3天。挑出在該培養(yǎng)基上產(chǎn)生的菌落，并且在含有或者AMPA或者甲基膦酸(Alfa)作為唯一磷酸源的MOPS完全瓊脂上劃線接種。從在含有兩種膦酸的培養(yǎng)基上等同均一生長的那些菌落中選擇一個菌落，命名為大腸桿菌JM101mpu+，并且進(jìn)一步命名為大腸桿菌菌株GB993。
當(dāng)大腸桿菌在磷酸源缺乏或有限的培養(yǎng)基中生長時，誘導(dǎo)phn操縱子。因此，當(dāng)在MOPS基本培養(yǎng)基上生長時，將大腸桿菌GB993與親代JM101菌株進(jìn)行比較。在相同的條件下，培養(yǎng)GB993及其mpu-親代菌株JM101，只是可得到的磷酸量不同或補(bǔ)充有AMPA的磷酸量不同。于37℃連續(xù)震搖下，在250ml側(cè)臂錐形瓶中的含有0.1mM或5mM磷酸或補(bǔ)充約0.2mM AMPA的0.1mM磷酸的pH7.0MOPS培養(yǎng)基(5ml 10X MOPS鹽、0.5ml 1mg/ml硫胺、0.5ml 20％葡萄糖，用dH2O調(diào)至50ml)中，以雙份培養(yǎng)50ml培養(yǎng)物。一般讓培養(yǎng)物生長至約220Klett單位，通過離心沉淀細(xì)胞，將細(xì)胞再懸浮于1.5ml 10mMTris/1mM DTT中，并且以1,000psi通過2次弗氏壓碎器進(jìn)行裂解。將裂解液離心以除去碎片，使上清液通過用50mM Tris pH7.0平衡的G-50柱。表2表明以該方式生長的細(xì)胞培養(yǎng)物的結(jié)果。表2.
磷酸底物對細(xì)胞生長的影響菌株JM101 JM101 JM101 GB993 GB993 GB9930.1mM5mM 0.2mM 0.1mM5mM 0.2mM磷酸 磷酸 AMPA磷酸磷酸 AMPA生長期(hrs) 48 29 54 48 29 54收獲密度155 240 - 140 244185(Klett單位)-表明沒有可測量的生長用HPLC分析測定培養(yǎng)基和細(xì)胞裂解液中是否存在任何AMPA酰基轉(zhuǎn)移酶活性。該分析監(jiān)測[14C]AMPA向N-乙酰-[14C]AMPA的轉(zhuǎn)化。一般而言，將由16.5mg乙酰-CoA、250μl2M Tris pH7.5、4.5mldH2O和[14C]AMPA(30mM)組成的100μl 2X測定溶液與25-75μl裂解液和0.5M MgCl2和MnCl2各1μl混合，并用dH2O調(diào)至200μl。將分析物于37℃溫育30分鐘，并用200μl 90-100mM NaOAc(乙酸鈉)pH4.4的乙醇溶液猝滅，然后立即如上所述通過HPLC分析或貯存于-20℃。僅由在AMPA或0.1mM磷酸補(bǔ)充的培養(yǎng)基存在下生長的培養(yǎng)物得到的GB993裂解液樣品表現(xiàn)出明顯的AMPA?；D(zhuǎn)移酶活性。該結(jié)果表明，編碼能夠?qū)MPA N-?；孽；D(zhuǎn)移酶的基因存在于GB993中，并且在低磷酸條件下生長時其表達(dá)受調(diào)節(jié)。因此，該酶活性的編碼序列看來是pho調(diào)節(jié)子的部分，并且可能存在于phn操縱子中。實施例4該實施例描述編碼能夠?qū)MPA N-?；拿傅拇竽c桿菌phn操縱子基因的鑒定。
實施例3表明，在大腸桿菌裂解液中觀察到的AMPA酰基轉(zhuǎn)移酶活性可能由phn操縱子中的基因編碼。先前已經(jīng)克隆了大腸桿菌B和大腸桿菌K-12中的完整的phn操縱子，并且已經(jīng)對大腸桿菌B中的所述操縱子進(jìn)行測序(Wanner等，Chen等)。已經(jīng)表明，大腸桿菌K-12phn操縱子的DNA序列與公布的大腸桿菌B的phn操縱子的DNA序列相同，只是在phnE基因有8個堿基對的插入(Wanner等)。含不同量的來自兩種細(xì)菌中任一種的遺傳背景的phn操縱子基因的克隆是容易得到(Wanner等，Chen等，Dr.J.W.Frost Purdue University)。用含不同量JM101phn操縱子DNA的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化JM101(mpu-)，以便測試質(zhì)粒定位的phn基因，該基因當(dāng)表達(dá)時，賦予JM101利用AMPA作為唯一磷酸源的能力。
從J.Frost(Dr.J.W.Frost，Department of Chemistry，PurdueUniversity，West Lafayette，Indiana47907)獲得的、在本文中命名為pF的質(zhì)粒含有一個大腸桿菌K-128kb EcoRI片段，該片段編碼phn操縱子基因phnG至phnQ。在phnG編碼區(qū)的5’端存在一個NcoI位點。用EcoRI和NcoI消化質(zhì)粒pF，釋放含有基因phnG至phnI的2kbNcoI-EcoRI片段、和一個長度約6kb的第二NcoI-EcoRI片段，后一片段含有基因phnJ至phnQ。凝膠純化每種片段，并將其連接到一個克隆表達(dá)載體中，其連接方式將允許從質(zhì)粒載(plasmid borne)誘導(dǎo)型啟動子表達(dá)存在于每種NcoI-EcoRI片段中的phn操縱子基因。將所述2kb片段插入載體pMON7258內(nèi)的NcoI-EcoRI位點中，所產(chǎn)生的質(zhì)粒命名為p58-1，載體pMON7258是除了多接頭區(qū)外與pUC118相同的一種正選擇克隆載體(Viera等，Methods Enzymo1.1533，1987)。所述2kb片段在p58-1中的方向允許從該載體內(nèi)的lac啟動子表達(dá)phnG-phnI基因。將所述6kb EcoRI-NcoI片段插入相似的正選擇載體pMON7259的NcoI和EcoRI位點中，產(chǎn)生命名為pMON17195的質(zhì)粒。pMON7259除多接頭區(qū)外與pUC119相同，它含有一個方向與pMON7258中的多克隆位點相反的多克隆位點，并且也允許從lac啟動子表達(dá)phnJ-phnQ基因。將p58-1和pMON7259轉(zhuǎn)化到大腸桿菌K12(mpu-)菌株JM101中，并以氨芐青霉素抗生素抗性選擇維持。也將pMON7259和pF轉(zhuǎn)化到JM101中分別作為陰性對照和陽性對照。
每種轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)物在補(bǔ)充有2％酪蛋白氨基酸、硫胺和0.2％葡萄糖的M9液體肉湯培養(yǎng)基中于37℃震搖生長過夜，然后以1∶50稀釋到250ml側(cè)臂錐形瓶中的50ml新鮮預(yù)溫?zé)岬耐唤M成的培養(yǎng)基中。將培養(yǎng)物于37℃震搖培養(yǎng)，直至在Klett-Summerson分光光度計上通過#2綠色濾光片測定細(xì)胞密度達(dá)到約80-100Klett單位。通過加入100微升500mM IPTG，使得IPTG的終濃度約為1mM，誘導(dǎo)來自質(zhì)粒lac啟動子的表達(dá)。讓誘導(dǎo)期生長期進(jìn)行2小時。表3表明來自1∶50稀釋液通過2小時誘導(dǎo)期的每種培養(yǎng)物的細(xì)胞密度分布型。表3.
含不同phn質(zhì)粒的JM101培養(yǎng)物的誘導(dǎo)分布型
通過在Beckman J2離心機(jī)中以10,000rpm于4℃離心10分鐘，收獲每種培養(yǎng)物中的細(xì)胞。細(xì)胞沉淀在冰冷的154mMNaCl溶液中洗滌1次，然后再懸浮于1.5ml提取緩沖液(50mM Tris-HCl pH7.5，1mMDTT，50mM Tris-HCl pH7.5)中。以1000psi通過2次弗氏壓碎器將細(xì)胞懸浮液破碎。產(chǎn)生的裂解液在EPPENDORFTM5402型微量離心機(jī)中以14,000rpm于4℃離心15分鐘，以除去碎片。將每種澄清的裂解液轉(zhuǎn)移到新鮮的預(yù)冷管中，用50mM Tris-HCl pH7.5將提取物的體積調(diào)至2.5ml。用25ml50mM Tris-HCl pH7.5平衡PD10柱子，然后將每種樣品加樣到脫鹽柱上。用50mM Tris-HCl pH7.5將每種洗脫出的樣品調(diào)至3.5ml。將每種樣品分配到分析管中，與試劑混合，以便如表4中所示分析AMPA?；D(zhuǎn)移酶活性的存在。表4.
表達(dá)phn基因的細(xì)菌裂解液的分析條件
*所有體積均以微升計每種樣品的混合物的組成，以質(zhì)粒內(nèi)容物命名，如用于AMPA酰基轉(zhuǎn)移酶分析法制備。
每種混合物于37℃溫育30分鐘，用等體積(200微升)90-100mMNaOAC(乙酸鈉)pH4.4的乙醇溶液猝滅，如果不立即通過如上所述的HPLC分析，則于-20℃貯存過夜。每種裂解液的未使用部分或者貯存于4℃，或者與甘油混合至10％(體積)且于-20℃貯存。
經(jīng)過AMPA轉(zhuǎn)?；阜治龅拿糠N裂解液樣品，如上所述通過HPLC分析其[14C]APMA和?；痆14C]AMPA的存在。結(jié)果示于表5中。表5.
細(xì)菌裂解液AMPA轉(zhuǎn)化為乙酰-AMPA的HPLC分析
該數(shù)據(jù)表明，含分離自pMON17195中pF的61kb NcoI-EcoRI片段的質(zhì)粒含有一個或多個基因，所述基因在IPTG誘導(dǎo)大腸桿菌的mpu-菌株中的lac啟動子時，引發(fā)能夠?qū)⑺龇治龌旌衔镏锌衫玫乃衃14C]AMPA轉(zhuǎn)化為乙酰-[14C]AMPA的?；D(zhuǎn)移酶活性的產(chǎn)生。通過限制缺失分析，進(jìn)一步限定AMPAN-?；璧囊粋€或多個基因。
構(gòu)建含有或者來自大腸桿菌B或者來自大腸桿菌K-12的phn操縱子的不同區(qū)段的質(zhì)粒，以進(jìn)一步描繪涉及在mpu-大腸桿菌JM101中表達(dá)時賦予AMPA?；D(zhuǎn)移酶活性的一個或多個phn操縱子基因的性質(zhì)。pMON7333含有pMON17195等同的大腸桿菌DNA插入，但卻是在pUC119中，并且是一個含有野生型phn操縱子基因phnG至phnQ的單一的大腸桿菌B菌株HindIII片段。通過將來自pMON7333的5,713個堿基對的NcoI至EcoRI大腸桿菌B DNA片段克隆到pMON7259中，構(gòu)建pMON15020，pMON15020含有基因phnJ至phnQ。通過將來自pMON17195的1,686個堿基對的EcoRI至SalI片段插入含有大腸桿菌K-12基因phnO、phnP和phnQ的正選擇克隆表達(dá)載體pBlueScriptSP(Invitrogen)中，構(gòu)建pMON15022。通過將來自pMON17195的1,820個堿基對的SalI片段缺失，留下大腸桿菌K-12phn操縱子基因phnJ和phnK、phnL的5’端以及全部的phnO、phnP和phnQ，構(gòu)建pMON15023。
將質(zhì)粒pMON17195、pMON15020、pMON15022、pMON15023和pMON7259轉(zhuǎn)化到mpu-大腸桿菌K-12菌株JM101中，并通過氨芐青霉素抗生素選擇來維持。這些轉(zhuǎn)化體中的每種轉(zhuǎn)化體的過夜培養(yǎng)物在抗生素選擇下培養(yǎng)，并以1∶50稀釋到新鮮的如上所述的M9培養(yǎng)基中，并且在震搖下于37℃在250ml側(cè)臂錐形瓶中溫育至細(xì)胞密度約為100Klett單位。如實施例3所述，用IPTG誘導(dǎo)每種培養(yǎng)物，將培養(yǎng)物在震搖下再溫育2小時。通過在Beckman J2離心機(jī)中以4,000RPM于4℃離心10分鐘，收獲細(xì)胞。細(xì)胞沉淀用50ml154mMNaCl洗滌1次，并于-20℃貯存。
將細(xì)胞沉淀再懸浮于如實施例3所述的1.5ml提取緩沖液中，并通過以1000psi通過弗氏壓碎器2次破碎細(xì)胞。破碎的細(xì)胞懸浮液在Eppindorf微量離心機(jī)5402型中以14,000rpm于4℃離心5分鐘。將澄清的連接于傾至在冰上預(yù)冷的新管中，加入提取緩沖液將總體積調(diào)至2.5ml。這些樣品在用25ml50mM Tris-HCl pH7.5預(yù)平衡的PD10柱上脫鹽，并用3.5ml50mM Tris-HCl pH7.5洗脫。然后將樣品如上所述進(jìn)行AMPA酰化分析，于37℃溫育30分鐘，然后用200微升90.9mM NaOAc pH4.4猝滅。用于該分析中的每種樣品的體積記錄在表6中。所有體積均代表所用的每種溶液的微升數(shù)。表6.
表達(dá)來自質(zhì)粒的phn基因的細(xì)菌裂解液的分析條件
猝滅的樣品如上所述經(jīng)過HPLC分析。表7描述了每種樣品的HPLC分析結(jié)果，表明作為兩個峰中[14C]混合總量的百分比的[14C]AMPA或乙酰-[14C]AMPA相對量。表7.
細(xì)菌裂解液[14C]-AMPA轉(zhuǎn)化為乙酰-[14C]-AMPA的HPLC分析
表7中的數(shù)據(jù)表明，AMPA酰化活性得自由phnO、phnP和phnQ組成的phn操縱子可讀框，phnO、phnP和phnQ是pMON15022中僅存的phn基因。誘導(dǎo)時提供AMPA酰化活性的其它質(zhì)粒也至少含有phnO、phnP和phnQ基因，這提供了強(qiáng)有力的證據(jù)，表明觀察到的活性是這些基因產(chǎn)物中的一種或多種的結(jié)果。因此，基于phnO、phnP和phnQ基因序列構(gòu)建了另外的質(zhì)粒，以便確定哪個或哪些基因是?；δ芩璧摹?br> 有時在文獻(xiàn)中已知細(xì)菌?；D(zhuǎn)移酶(acylase)、轉(zhuǎn)?；?transacylase)和酰基轉(zhuǎn)移酶(acyltransferase)基因。大多數(shù)為小的15-25kDa蛋白。因此，在大小比較的基礎(chǔ)上，僅phnO和phnQ基因產(chǎn)物屬于該類別。然而，基于與GENBANK、SWISSPROT和EMBL數(shù)據(jù)庫中的其它蛋白的相似性比較，預(yù)測的phnO基因產(chǎn)物看來最接近地類似具有酰基轉(zhuǎn)移酶活性的其它蛋白。例如，大腸桿菌PhnO蛋白與Wohlleben等(Mol.Gen.Genet.217202-208，1989)中描述的慶大霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶-3-I很好地匹配。含有單一6.0kb NcoI-EcoRI片段上的大腸桿菌B phn操縱子基因phnJ至phnP的pMON15020用SalI和EcoRI消化，釋放含有phnO、phnP和phnQ基因的2.0kb片段。將該2kb片段切下，并從0.7％TAE瓊脂糖凝膠中純化，用T4DNA聚合酶處理，以切下3’突出端，然后用Klenow和脫氧核苷酸三磷酸酶(dXTP)處理，以提供平端，然后連接到pBlueScriptSP的EcoRV位點中，產(chǎn)生質(zhì)粒pMON15024。pMON15024用NdeI和EcoRI消化，缺失含有phnP大部分和所有phnQ編碼序列的1200個堿基對的片段。仍含有phnO基因的剩余的pMON15024質(zhì)粒片段，在二脫氧核苷酸存在下用Klenow片段DNA聚合酶、按照生產(chǎn)商的說明進(jìn)行處理，以便補(bǔ)平暴露于限制酶消化產(chǎn)生的3’端，然后將其連接在一起，產(chǎn)生質(zhì)粒pMON15027。pMON15027僅含有3’側(cè)翼為小部分phnP的phnO基因。將得自pMON15024的1200個堿基對的NdeI至EcoRI片段克隆到pMON2123中，產(chǎn)生pMON15026，后者含有3’側(cè)翼為phnQ的phnP基因3’的2/3。將質(zhì)粒pMON15024、15026和15027導(dǎo)入mpu-JM101中，在生長并誘導(dǎo)后如上所述分析轉(zhuǎn)化體細(xì)胞裂解液中AMPA酰基轉(zhuǎn)移酶活性的存在。僅pMON15024和pMON15027表現(xiàn)出?；D(zhuǎn)移酶活性，表明phnO基因產(chǎn)物負(fù)責(zé)AMPA的?；?br> 用熱循環(huán)法，產(chǎn)生僅含phnO基因且?guī)в蟹奖愕膫?cè)翼限制性內(nèi)切核酸酶位點以用于進(jìn)一步克隆操作的DNA片段。根據(jù)公布的phnO基因和側(cè)翼序列，由Midland Certified Reagents Co.(Midland Texas)合成合成寡核苷酸引物，以便擴(kuò)增phnO基因(Chen等，J.Biol.Chem.2564461-4471，1990)。命名為AATPCR6的序列AAACACCATGGCTGCTTGTG(SEQ ID NO5)代表與phnO基因模板鏈同源的合成寡核苷酸。SEQ ID NO5的5’腺苷殘基對應(yīng)于公布的phn操縱子序列的堿基對13,955，緊接位置13,962-13964的phnO ATG起始密碼子的5’(Chen等，J.Bio1.Chem.2564461-4471，1990)。根據(jù)公布的phnO序列，SEQ ID NO5在位置13,965摻入了一個單堿基對錯配，表示為C至G的轉(zhuǎn)換，這在位置2產(chǎn)生一個丙氨酸密碼子，取代了脯氨酸密碼子，也產(chǎn)生了一個跨越ATG起始密碼子的唯一的NcoI限制位點。命名為AATPCR7的序列GTGACGAATTCGAGCTCATTACAGCGCCTTGGTGA(SEQ ID NO6)代表與phnO基因的編碼鏈同源的合成寡核苷酸。SEQ ID NO6的3’腺苷殘基對應(yīng)于公布的phn操縱子的堿基對14,380(Chen等，J.Bio1.Chem.2564461-4471，1990)。SEQ ID NO6中位置編號19的胸苷對應(yīng)于公布的phnO序列的位置14,396的腺苷(Chen等)。SEQ ID NO6的一部分重疊天然phnO終止密碼子，在緊接該天然終止密碼子的3’和鄰近引入一個符合讀框的第二終止密碼子，也在這些終止密碼子的3’引入一個唯一的EcoRI和SacI限制位點。
pMON15024用作在標(biāo)準(zhǔn)熱擴(kuò)增反應(yīng)中擴(kuò)增phnO基因的模板。簡而言之，制備100微升反應(yīng)樣品，它含有0.1ng模板DNA、反應(yīng)緩沖液、200pM每種引物、200mM dNTP、1.25U Taq DNA聚合酶，并且用礦物油覆蓋。該反應(yīng)樣品經(jīng)過35個循環(huán)94℃1分鐘、50℃2分鐘和72℃3分鐘，通過在溴化乙錠染色的0.7％TAE瓊脂糖凝膠上分析5微升反應(yīng)樣品測定，這導(dǎo)致擴(kuò)增459個堿基對的DNA產(chǎn)物。用標(biāo)準(zhǔn)方法，在用NcoI和EcoRI限制性內(nèi)切核酸酶消化所述459個堿基對的擴(kuò)增產(chǎn)物樣品后，從1％TAE瓊脂糖凝膠上純化出444個堿基對的產(chǎn)物。將所述444個堿基對的產(chǎn)物連接到pMON7259中匹配位點中，產(chǎn)生pMON15028。分析從含pMON15028的JM101的IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)物如上所述制備的細(xì)胞裂解液中AMPA?；D(zhuǎn)移酶活性的存在，并將其與含pMON15027的培養(yǎng)物進(jìn)行比較。結(jié)果是不可區(qū)分的，因此證實，phnO編碼能夠?qū)MPA?；拿?。另外，該結(jié)果表明，由于用AATPCR6寡核苷酸引物(SEQ ID NO5)熱擴(kuò)增而引入所述基因編碼序列中的該蛋白中的P2A突變，當(dāng)在大腸桿菌中表達(dá)時對所產(chǎn)生的PhnO蛋白的?；D(zhuǎn)移酶活性沒有影響。實施例5該實施例描述了針對PhnO肽的多克隆抗體的產(chǎn)生。
對phnO基因產(chǎn)物的進(jìn)一步研究需要應(yīng)用針對PhnO蛋白的抗體。因此，在大腸桿菌JM101中超量產(chǎn)生PhnO，以用作免疫原，以在注射到山羊中時刺激產(chǎn)生抗體。將含有質(zhì)粒pMON15028中的P2A突變的phnO基因在NcoI至EcoRI DNA片段上引入質(zhì)粒pMON17061中，產(chǎn)生pMON15032。pMON15032中的phnO表達(dá)在鄰近噬菌體T7基因10L核糖體結(jié)合序列的大腸桿菌recA啟動子的控制之下。使細(xì)胞生長至對數(shù)中期，并通過用50mg萘啶酮酸粉溶于1ml0.1N NaOH中的儲液將萘啶酮酸加入所述培養(yǎng)物中至約50ppm，進(jìn)行誘導(dǎo)。培養(yǎng)物在誘導(dǎo)條件下于37℃維持12小時。如實施例3中所述收獲細(xì)胞，并在磷酸緩沖鹽溶液中進(jìn)行超聲處理。測定經(jīng)誘導(dǎo)的大腸桿菌裂解液中約23％的總可溶性蛋白是PhnO，而通過SDS-PAGE和考馬斯藍(lán)染色判斷，約60％的總PhnO蛋白釋放到可溶相中。通過制備型SDS-PAGE進(jìn)一步純化該蛋白，提供足夠量的PhnO，以用于產(chǎn)生與PhnO或相關(guān)的AMPA轉(zhuǎn)酰基酶蛋白結(jié)合或免疫原性反應(yīng)的抗體。簡而言之，根據(jù)大小，在15％SDS-PAGE凝膠中將所述PhnO蛋白與其它蛋白分離。切下含有所述PhnO蛋白的凝膠條，稱重，并用po1ytron在體積等于凝膠條質(zhì)量的磷酸緩沖鹽溶液(PBS，pH7.0)中勻漿。將勻漿液與等體積完全弗氏培養(yǎng)基混合，直至獲得膠體混合物。用8ml該混合物的接種物，首次注射到山羊中。注射后2周，收集50ml放血樣品，通過離心從血液固體分離出血清。4周時，在50％不完全弗氏佐劑的膠體混合物中給予凝膠純化的PhnO蛋白的增強(qiáng)注射，在6周時獲得第二次放血樣品。
用來自第二次放血的血清，根據(jù)對PhnO蛋白特異性的足夠的抗體效價的存在進(jìn)行篩選。將含pMON15032的JM101細(xì)胞的提取物進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析。該提取物中的蛋白濃度通過Bradford分析測定為約55mg/ml，對采用這種同一提取物的先前的考馬斯染色的凝膠進(jìn)行光密度計掃描，表明約23％的總細(xì)胞蛋白是PhnO。將該提取物在PD10柱上脫鹽，用10mM Tris pH7.5洗脫，并用等體積2X SDS樣品緩沖液稀釋。用1X樣品緩沖液制備連續(xù)稀釋液，并加樣到15％SDS PAGE凝膠的各孔中。將除大腸桿菌PhnO提取物外的另外的樣品與含每泳道另外10微克蛋白的煙草樣品蛋白提取物混合。用煙草葉片蛋白提取物篩選抗植物蛋白的交叉反應(yīng)性抗體的存在。按照大小，通過以恒定的7.5mA于4℃電泳14小時，分離蛋白，并將該凝膠在0.5安培下，在Tirs-甘氨酸轉(zhuǎn)移緩沖液中電印跡1小時，電印跡到MSI0.45微米硝化纖維素濾膜上。然后用TBST(Tris，BSA，NaCl，Tween-20，ShortProtocols in Molecular Biology，第3版，Wiley and Sons，Pub.)于室溫下封閉膜2小時，于室溫下與第二次放血血清的1∶500稀釋液一起溫育45分鐘，在TBST中洗滌2次，再與堿性磷酸酶綴合的兔抗山羊IgG(Boehringer Mannheim Biochemicals，Inc.)一起溫育45分鐘，用TBST洗滌3次，然后用堿性磷酸酶緩沖液洗滌1次，最后與含有NBT和BCIP的標(biāo)準(zhǔn)顯色溶液溫育2.5分鐘。通過用大量蒸餾水洗滌膜，終止反應(yīng)。該抗體能夠在少至50納克大腸桿菌提取物中檢測到PhnO蛋白，而與一半的該樣品中另外的植物蛋白的存在無關(guān)。另外，在兩組樣品中檢測到非常少的交叉反應(yīng)性條帶，表明當(dāng)用這種蛋白質(zhì)印跡法測試時，該血清樣品含有非常少的與或者大腸桿菌或者煙草植物蛋白交叉反應(yīng)的IgG。
也利用用于產(chǎn)生能夠與PhnO蛋白特異性結(jié)合或免疫原性反應(yīng)的抗體的一種替代來源。將phnO基因置于含有金屬結(jié)合氨基酸編碼序列(His6)的市售載體(Invitrogen)中，使His6位于所述phnO編碼序列上游并與其符合讀框。將His6-phnO DNA序列在NcoI至EcoRI片段上插入大腸桿菌表達(dá)載體pMON6235中，并處于大腸桿菌阿拉伯糖操縱子araBAD啟動子的控制之下，產(chǎn)生質(zhì)粒pMON32909。當(dāng)用阿拉伯糖誘導(dǎo)含有pMON32909的大腸桿菌W3110時，產(chǎn)生His6-PhnO蛋白，按照生產(chǎn)商的說明，將該蛋白在金屬親和柱上純化。
用與上述用于山羊類似的免疫方法，將His標(biāo)記的純化His6-PhnO蛋白標(biāo)準(zhǔn)注射到6只新西蘭白兔中。也表明在這些兔中產(chǎn)生的抗血清特異性地結(jié)合PhnO蛋白，并且與其它大腸桿菌細(xì)菌蛋白或煙草植物蛋白沒有交叉反應(yīng)性。實施例6該實施例用氨甲基膦酸和乙酰-CoA作為酶分析中的底物、并且通過終點動力學(xué)分析測量，描述AMPA轉(zhuǎn)酰基酶的特性。
測定PhnO酶對于底物氨甲基膦酸和乙酰-CoA的表觀Km(Km)和Vmax(Vmax)。所述PhnO Km和Vmax的測定通過終點動力學(xué)分析來進(jìn)行，測定在不同底物濃度下消耗每種底物的酶速度，并且將酶速度的倒數(shù)對底物濃度的倒數(shù)作圖，產(chǎn)生酶促動力學(xué)的Lineweaver-Burk圖。如實施例2中所述，用如實施例4中產(chǎn)生的、從pMON15032表達(dá)phnO的大腸桿菌的脫鹽粗制裂解液中的酶，監(jiān)測[14C]-AMPA向N-乙酰-[14C]-AMPA的轉(zhuǎn)化。用Bradford的方法，測定每ml提取物的總蛋白，表明總蛋白約為22.5mg/ml。對從這些裂解液中分離PhnO蛋白的考馬斯染色的SDS-聚丙烯酰胺凝膠的光密度掃描，表明PhnO占總蛋白的約23％，因此，確定該細(xì)胞提取物每ml含有約5.2mg PhnO蛋白。在測定PhnO對于AMPA的表觀Km和Vmax的第一個分析中，[14C]-AMPA濃度范圍為2-38mM。將酶反應(yīng)物于37℃溫育5分鐘，用1體積的100mM乙酸鈉(NaOAc)pH4.4的乙醇溶液猝滅。通過HPLC分析樣品，測定轉(zhuǎn)化為N-乙酰-[14C]-AMPA的[14C]-AMPA的量。每組反應(yīng)物的分析條件和結(jié)果示于表8中。表8.
對于AMPA底物的PhnO酶促動力學(xué)
根據(jù)表8的1/V對1/S數(shù)據(jù)的Linweaver-Burk圖表明，PhnO對于作為底物的AMPA的表觀Km約為9mM，表觀Vmax約為824U/mg蛋白。
在相似的實驗中測定PhnO對于底物乙酰-CoA的表觀Km。在獲得終點動力學(xué)的幾次嘗試后，確定在約30mM的AMPA濃度和約1-10ng的酶量下，轉(zhuǎn)化數(shù)太低以致于不可靠。用氚標(biāo)記的乙酰-CoA嘗試一種替代的方法。所述標(biāo)記的比活比用[14C]約高40倍，達(dá)到靈敏度增加，允許測定PhnO對于乙酰-CoA的表觀Km。[3H]-乙酰-CoA(Amersham，Inc.)的比活是360mCi/mg或250μCi/ml。通過弱離子交換HPLC色譜，監(jiān)測由PhnO介導(dǎo)的從[3H]-乙酰-CoA至[3H]-乙酰-AMPA的?；D(zhuǎn)移作用，調(diào)節(jié)乙酰-CoA和乙酰-AMPA的保留時間，使得這些化合物間隔約3分鐘。通過將KH2PO4緩沖液(pH5.5)的濃度調(diào)至40mM，并且在AX100弱離子交換柱上的流速為1ml/分鐘，而達(dá)到這一點。使每種樣品與PhnO和30mM AMPA于37℃反應(yīng)5分鐘，用100mM NaOAc pH4.4的乙醇溶液猝滅，然后通過HPLC分析。在每個反應(yīng)中[3H]-乙酰-CoA底物范圍為25μM至1.3mM，每個反應(yīng)中還有約5ng PhnO、50mM Tris pH7.5、1mM MnCl2、1mM MgCl2和30mMAMPA 。通過HPLC分析樣品，以測定N-[3H]-乙酰-AMPA的產(chǎn)生量和[3H]-乙酰-CoA的剩余量。這些反應(yīng)的分析條件和結(jié)果示于表9中。表9.
乙酰-CoA供體底物的PhnO酶促動力學(xué)
根據(jù)表9的1/V對1/S數(shù)據(jù)的Linweaver-Burk圖表明，PhnO對于作為底物的乙酰-CoA的表觀Km在375-390μM之間，表觀Vmax約為824U/mg蛋白。
用從pMON15032表達(dá)phnO的大腸桿菌的粗制裂解液中的酶，測定所述PhnO酶活性的大致pH范圍。測定該酶在一定pH值范圍內(nèi)由含乙酰-CoA和AMPA的混合物產(chǎn)生N-乙酰AMPA的能力。反應(yīng)在MES/MOPS/Tricine緩沖液中進(jìn)行，該緩沖液平衡至4.5-9.0的pH值，實際pH值范圍為5.2-9.0。簡而言之，將95微升合適的緩沖液與100微升如實施例4中所述的2X分析混合物和5微升含約400ng/μl的PhnO蛋白的脫鹽大腸桿菌裂解液混合。反應(yīng)物于37℃溫育5分鐘，用100mM NaOAc pH4.4的乙醇溶液猝滅，然后如實施例4中所述通過HPLC進(jìn)行分析。結(jié)果示于表10中。表10.
PhnO酶pH分布型
結(jié)果表明，采用AMPA和乙酰-CoA作為底物的最佳PhnO轉(zhuǎn)酰基酶活性的pH約為pH8.0。然而，在約6.5至至少9.0的pH范圍內(nèi)PhnO利用乙酰-CoA作為乙酰供體，有效地將AMPA轉(zhuǎn)化為N-乙酰-AMPA。
用純化的PhnO蛋白進(jìn)行另外的實驗，以進(jìn)一步表征該酶對于?；?CoA?；w化合物的底物優(yōu)選范圍。本文已經(jīng)確定，至少一種底物?；w或離去基團(tuán)可以是二碳酸化合物，例如化合物乙酰-CoA中的乙酰部分。不知道當(dāng)與PhnO轉(zhuǎn)?；负妥鳛轷；荏w分子的AMPA反應(yīng)時，由不同碳鏈長度組成的什么樣范圍的?；肿幽軌蚧蚩赡茏鳛閬碜怎；?CoA?；w的離去基團(tuán)起作用。因此，開發(fā)了與實施例2中所述的分析類似的HPLC分析，以測定該酶將?；鶊F(tuán)從酰基-CoA?；w轉(zhuǎn)移至[14C]-AMPA的能力范圍。
在于37℃進(jìn)行萘啶酮酸誘導(dǎo)3小時后，從1升從pMON15032表達(dá)重組phnO基因的大腸桿菌JM101的Luria Bertani肉湯培養(yǎng)物中純化PhnO。通過離心收獲細(xì)胞，并將其再懸浮于40ml冷Tris緩沖液(0.1M Tris-HCl pH8)中并置于冰上。使細(xì)胞懸浮液成為1mM DTT和0.5mM PMSF。以1,100psi通過預(yù)冷的弗氏壓碎器2次，將懸浮液裂解，于4℃以12,000g(在Sorvall SA600轉(zhuǎn)子中10,000rpm)離心40分鐘，然后置于冰上。將澄清的上清液傾至新的15ml聚丙烯管中。將樣品再次分為2個等份，并于-80℃維持直至進(jìn)一步用于PhnO蛋白的純化。用以上實施例2中所述的HPLC法，分析20微升所述可溶性部分的酶活性，只是在加入酸終止分析后，將樣品貯存于-80℃。按照生產(chǎn)商的說明制備Sephacryl S200柱，并用含20mM Tris pH8.0和0.5mMMgCl2的溶液平衡。在冰上解凍后，將全部總可溶性提取物鋪在柱床頂部。從柱流出液收集40個9ml的流分，在15％SDS-PAGE凝膠上分離后，采用抗PhnO抗血清通過蛋白質(zhì)印跡法分析30微升的每個流分。此外，用實施例2中所述的方法，分析30微升的每個流分的AMPA?；D(zhuǎn)移酶活性。合并表現(xiàn)出酰基轉(zhuǎn)移酶活性并且對應(yīng)于陽性蛋白質(zhì)印跡數(shù)據(jù)的樣品。這些樣品由該實施例中的流分7至流分19代表，將其混合到100ml體積中，分配到各含有10ml體積的10個管(ten10tubes)中，并貯存于-80℃以備進(jìn)一步的使用。
用陰離子交換色譜測定離開在Sephacryl S200分離期間共洗脫的其它污染蛋白的PhnO的洗脫分布圖。將來自混合PhnO活性流分的一個管在冰上解凍，并注射到用緩沖液A(1升的20mM Tris-HCl pH8.0Mili-Q蒸餾去離子水)和B(1升20mM Tris-HCl pH8.0，1M NaCl)預(yù)平衡的5/5 Mono-Q柱中。將含有PhnO活性蛋白的樣品注射到該柱中，并收集1毫升的流分。將含PhnO樣品加樣后，該柱以1.8ml/分鐘緩沖液A的流速洗滌5分鐘。5分鐘時，將緩沖液B以0.5ml/min加入流動體積中達(dá)4分鐘。緩沖液B在10分鐘時直線上升至流動體積的22％，在12分鐘時上升至30％，于13分鐘時上升至36％，于14分鐘時上升至41％，于15分鐘時上升至46％，于16分鐘時上升至74％，于16-22分鐘時上升至100％，此時終止緩沖液B流動，緩沖液A以100％再起始，以平衡該柱。對來自從Mono-Q柱收集的各個流分的10微升體積，如實施例2中所述通過蛋白質(zhì)印跡法分析轉(zhuǎn)?；富钚?。合并表現(xiàn)出陽性AMPA?；D(zhuǎn)移酶活性并與蛋白質(zhì)印跡數(shù)據(jù)相關(guān)的流分，并將其作為純化的蛋白樣品維持。用該純化的PhnO蛋白的樣品，測定酶的?；w底物的專一性。
如下制備酶反應(yīng)物。100微升反應(yīng)物由50mM Tris-HCl pH8.0、1mM MgCl2、3微升1.3mM[14C]-AMPA(115,392dpm/μl)、0.1mM或1mM?；?CoA酰基供體和2.5微升純化的酶樣品組成。制備分析預(yù)混合物，在每個100微升的反應(yīng)物中使用來自所述預(yù)混合物的45微升。該45微升預(yù)混合物樣品由40微升蒸餾去離子水、2微升50mMMgCl2和3微升1.3mM[14C]-AMPA(115,392dpm/μl)組成。通過在微量離心管中將40微升125mM Tris-HCl pH8.0、2.5微升蛋白樣品和10微升酰基-CoA?；w化合物于室溫下混合，起始反應(yīng)。每種?；?CoA?；w化合物作為1mM、5mM或10mM原料儲液制備。然后將每個管與45微升含有[14C]-AMPA受體底物的分析預(yù)混合物混合，輕輕混合，然后轉(zhuǎn)移至30℃水浴中達(dá)5分鐘。加入4微升1M HCl終止每個反應(yīng)，進(jìn)行渦旋混合，并置于冰上或貯藏于-20℃直至通過HPLC分析[14C]-AMPA或相關(guān)化合物的存在。
進(jìn)行HPLC分析采用配有481波長最大值UV檢測器和閃爍泵、Phenomenex PHENOSPHERE5微升80埃SAX-二氧化硅HPLC柱(250X4.6mm，3500PSI最大壓力)的Waters510雙泵HPLC系統(tǒng)；緩沖液A，由5mM KH2PO4、2％甲醇組成，并用H3PO4調(diào)至pH2.0；緩沖液B，由200mM KH2PO4、2％甲醇組成，并用H3PO4調(diào)至pH2.0；和HAZARD Atomflow(Packard)，含有64％1,2，4-三甲基苯、7.5％磺基琥珀酸dicotyl鈉、3.5％磺基琥珀酸二戊酯鈉和6％聚氧乙烯(4)十二烷基醚。用于每種樣品分析的HPLC梯度條件與實施例2中描述的條件相似，有微小的變化。表11中提供了流速。
表11.
1-閃爍液流速，以ml/min計如上所述制備酰基-CoA?；w化合物的儲液，將它們列于如下乙酰-CoA鈉、正丙酰-CoA鋰、戊二酰-CoA鋰、甲基丙二酸單酰CoA鋰、巴豆酰-CoA鋰、異丁酰-CoA鋰、琥珀酰-CoA鈉、甲基巴豆酰-CoA鋰、正戊酰-CoA鋰和去磺基-CoA鋰。所有化合物均得自SigmaChemical Company，St.Louis，MO。通過測定轉(zhuǎn)化為某些其它[14C]-化合物(例如N-乙酰-[14C]-AMPA)的[14C]-AMPA HPLC色譜峰面積的百分比、與反應(yīng)期間產(chǎn)生的N-乙酰-[14C]-AMPA的量，測定所述純化的酶將CoA連接的酰基部分轉(zhuǎn)移至[14C]-AMPA的活性百分比，其中[14C]-AMPA與1mM乙酰-CoA是確定為100％參比的PhnO的底物。結(jié)果示于表12中。
表12.
AMPA轉(zhuǎn)酰基酶對于?；?CoA酰基供體底物的酶促效率
這些結(jié)果表明，PhnO酶能夠有效地利用酰基-CoA連接的化合物，所述化合物具有一個?；?，并且碳鏈長度不超過3個以進(jìn)行對AMPA進(jìn)行?；D(zhuǎn)移。碳鏈長度比丙酰長并且不寬或龐大的其它化合物，例如甲基丙二酸單酰-CoA、異丁酰-CoA和琥珀酰-CoA化合物也是有效的?；?CoA酰基供體，但酶促效率較低。實施例7該實施例描述了AMPA酰基轉(zhuǎn)移酶蛋白的體外表達(dá)以及將其定向到分離的葉綠體中。
許多葉綠體定位蛋白由核基因作為前體表達(dá)，并由葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽(CTP)導(dǎo)向葉綠體。CTP在涉及定向蛋白輸入到葉綠體中的步驟期間被除去。這樣的葉綠體蛋白的實例包括核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶(RUBISCO)的小亞基(SSU)、5-烯醇-丙酮酰莽草酸-3-磷酸(EPSPS)、鐵氧還蛋白、鐵氧還蛋白氧化還原酶、集光復(fù)合體蛋白I和蛋白II以及硫氧還蛋白F。已經(jīng)在體內(nèi)和體外證明，利用具有CTP的融合體可以將非葉綠體蛋白導(dǎo)向葉綠體，并且CTP序列足以將蛋白導(dǎo)向葉綠體(Della-Cioppa等，1987)。5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)定位在葉綠體中，并且在植物中是草甘膦的靶。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，將草甘膦氧化還原酶導(dǎo)向葉綠體，為植物提供對草甘膦的耐性，盡管定位至胞質(zhì)的GOX也能夠提供這種耐性。一般而言，重組GOX酶定位至葉綠體。GOX介導(dǎo)的草甘膦代謝產(chǎn)生AMPA，已經(jīng)表明AMPA具有植物毒性。本文中已經(jīng)表明，PhnO能夠?qū)MPA N-?；⑶襈-乙酰-AMPA沒有植物毒性。因此，可能有必要將植物中的AMPA失活。這假定AMPA?；D(zhuǎn)移酶可以在植物中作為活性酶表達(dá)，并且這樣的?；D(zhuǎn)移酶能夠被輸入到葉綠體中并保留酶活性。鑒于實施例1中描述的AMPA的植物毒性，將AMPA?；D(zhuǎn)移酶基因?qū)胫参锉磉_(dá)載體中，以測試在植物中的表達(dá)。另外，也對?；D(zhuǎn)移酶輸入葉綠體進(jìn)行了測試。
將編碼葉綠體引導(dǎo)肽的DNA序列連接至編碼AMPA?；D(zhuǎn)移酶的DNA序列的5’，并且與其符合讀框地連接。用BglII和NcoI限制性內(nèi)切核酸酶，從pMON17058切下編碼擬南芥核酮糖-1-二磷酸羧化酶小亞基葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽(CTP，SEQ ID NO9)的DNA序列，并將其插入pMON15028中的互補(bǔ)限制位點，產(chǎn)生pMON15029，使得所述CTP編碼序列連接pMON15028中的phnO編碼序列的5’并與其符合讀框地連接。所產(chǎn)生的pMON15029中的嵌合phnO基因能夠產(chǎn)生葉綠體定向PhnO蛋白。將含有得自pMON15029的所述CTP-PhnO編碼序列的EcoRI-BglII DNA盒SEQ ID NO11插入pBlueScript KS(-)中的EcoRI和BamHI位點中，產(chǎn)生pMON15036。pMON15036中的CTP-PhnO編碼序列可以在體外轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)中從噬菌體T3啟動子表達(dá)。構(gòu)建一個相似的植物瞬時表達(dá)質(zhì)粒pMON15035，但沒有葉綠體引導(dǎo)序列。從pMON15028切下僅含有phnO編碼序列的EcoRI-BglII DNA片段，并將其插入pBlueScript KS(+)中的EcoRI和BamHI位點中，使得PhnO在體外轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)中可以從噬菌體T7啟動子產(chǎn)生。從pMON15028切下編碼PhnO的NcoI-EcoRI DNA序列，并將其插入pMON17061，產(chǎn)生pMON15032。pMON15032可供用于從大腸桿菌recA啟動子表達(dá)phnO。從pMON15028切下編碼PhnO的BglII-EcoRI DNA片段，并將其插入pBlueScript KS(-)，產(chǎn)生pMON15033。pMON15033可供用于從大腸桿菌lac啟動子表達(dá)phnO。從pMON15029切下編碼CTP-PhnO的BglII-EcoRI DNA片段，并將其插入pBlueScript KS(-)中的匹配位點，可供用于從pMON15034的大腸桿菌lac啟動子表達(dá)葉綠體定向PhnO蛋白。
將pMON15032、pMON15033和pMON15034導(dǎo)入大腸桿菌JM101中。如上所述將培養(yǎng)物培養(yǎng)和誘導(dǎo)，只是通過加入0.1M NaOH中的50ppm萘啶酮酸誘導(dǎo)來自含pMON15032的細(xì)胞的表達(dá)。由每種培養(yǎng)物制備澄清的裂解液，并如上所述進(jìn)行AMPA?；D(zhuǎn)移酶分析，以便測定AMPA?；D(zhuǎn)移酶活性的存在。所有裂解液均含有相當(dāng)大量的高于對照水平的?；D(zhuǎn)移酶活性。更為重要的是，從pMON15034表達(dá)的CTP-PhnO肽(SEQ ID NO12)看來保留了全部?；D(zhuǎn)移酶酶活性。
pMON15035(PhnO)和pMON15036(CTP-PhnO)在體外用來產(chǎn)生[35S]-甲硫氨酸標(biāo)記的PhO蛋白，以用于葉綠體輸入分析。簡而言之，在Short Protocols In Molecular Biology，第3版，(Ausubel等編輯，Wiley& Sons Pub.，(1995)，其通過引用結(jié)合到本文中)中描述了用于體外轉(zhuǎn)錄和翻譯的方法。在100微升反應(yīng)中，用HindIII限制性內(nèi)切核酸酶將約20微克質(zhì)粒DNA完全消化。在體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中用20微升所述質(zhì)粒消化物或約4微克線性化質(zhì)粒DNA產(chǎn)生mRNA，用于在后來的翻譯反應(yīng)中產(chǎn)生PhnO或CTP-PhnO蛋白產(chǎn)物。轉(zhuǎn)錄反應(yīng)物由以下物質(zhì)組成20微升線性化質(zhì)粒DNA、20微升5X轉(zhuǎn)錄緩沖液(200mMTris HCl pH8.0，40mM MgCl2，10mM亞精胺和250mM NaCl)、20微升5X核糖核苷三磷酸混合物(ATP、CTP、UTP各5mm，5mM二鳥苷三磷酸(G-5’ppp5’-G)TP，5mM GTP)、10微升0.1M二硫蘇糖醇(DTT)、10微升RNasinTM(一種胰腺核糖核酸酶抑制劑混合物，得自Promega)、4微升RNA聚合酶(T7或T3，New England Biolabs，Inc.)和蒸餾去離子水，至100微升。每種反應(yīng)物于37℃溫育1小時。在1.4％瓊脂糖甲醛凝膠上分析4.5微升每種反應(yīng)物，以確保每種反應(yīng)物產(chǎn)生合適的RNA模板用于以后的翻譯步驟。
用20微升所述轉(zhuǎn)錄反應(yīng)物，產(chǎn)生[35S]-甲硫氨酸標(biāo)記的PhnO蛋白，以用于葉綠體輸入分析。簡而言之，將RNA與6微升無甲硫氨酸的氨基酸混合物水溶液、15微升[35S]-甲硫氨酸(1400Ci/mmol，Amersham)和200微升兔網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解液混合。將這些反應(yīng)物于37℃溫育2小時，并置于干冰上進(jìn)行貯存。在15％SDS-PAGE凝膠上分析10微升每種反應(yīng)的樣品。將凝膠真空干燥，并直接置于KODAKTMX-O-MATTM膠片的乳膠一側(cè)上，進(jìn)行放射自顯影。結(jié)果表明，每種質(zhì)粒產(chǎn)生足夠量的PhnO(pMON15035)和CTP-PhnO(pMON15036)預(yù)測分子量的相應(yīng)的肽，其產(chǎn)生量足以在輸入分析中測試葉綠體中的攝入。
按照Edelman等，Methods in Chloroplast Molecular Biology，Elsevier Biomedical Press，第86章(1982)所述，從一個去脈紋的(deveined)直立萵苣的葉球(head)分離完整的葉綠體。制備1升研磨緩沖液(GR緩沖液)儲液(2mM NaEDTA，1mM MgCl2，1mMMnCl2，50mM Hepes-KOH pH7.5和0.33mM山梨醇)。恰好在使用之前，將890mg抗壞血酸加入900ml GR緩沖液儲液中。將一個撕開的去脈紋直立萵苣葉球與900ml GR緩沖液混合，并且通過在韋林氏攪切器中以高速混合3次，每次3秒，將其搗碎(emacerate)。漿液通過4層Miracloth過濾，濾液在SORVALLTMGS-3轉(zhuǎn)子中于4℃以5,000RPM離心10分鐘。傾去上清液，用玻璃棒將沉淀再懸浮于4毫升GR緩沖液中。通過Percoll梯度離心，分離葉綠體。通過將16ml PBF-Percoll與4ml5X緩沖液(10mM EDTA，5mM MgCl2，5mM MnCl2，250mM Hepes-KOH，30克山梨醇，490mg抗壞血酸鈉，85.5mg谷胱甘肽，用ddH2O調(diào)至100ml)混合，制備80％Percoll。通過將8ml PBF-Percoll與4ml5X緩沖液和8ml ddH2O混合，制備40％Percoll溶液。通過將10m140％Percoll鋪在10ml80％Percoll上，在30ml Corex管中制備Percoll梯度。通過將再懸浮的葉綠體鋪在percoll梯度上，并打開制動器，在SS-34SORVALLTM懸掛式轉(zhuǎn)子中以9,500RPM于4℃離心10分鐘，分離葉綠體。破裂的葉綠體保持在上層中，將其吸去。完整的葉綠體位于40/80％Percoll梯度的界面，將其取出到新的30ml COREXTM管中。分離的葉綠體用GR緩沖液洗滌2次，并且在每次洗滌后，關(guān)閉制動器，在SS-34轉(zhuǎn)子中于4℃以6,000RPM離心10分鐘，收集葉綠體。通過用玻璃棒輕輕攪拌，將經(jīng)分離、洗滌的葉綠體再懸浮于1ml無菌50mMHepes-KOH pH7.7、330mM山梨醇中，然后測定漿液的葉綠素濃度。將5ml80％丙酮溶液加入20微升所述葉綠體漿液中，輕輕地進(jìn)行渦旋混合。所產(chǎn)生的混合物通過WhatmanTM#1濾紙過濾到培養(yǎng)管中。于645nm和663nm對80％的丙酮空白測定濾液的吸光度。按照公式#1[葉綠素μg/ml]＝[A645+[A663*(8.02)]，通過測量以μg/ml計的葉綠素的量并乘以再懸浮葉綠體的體積(公式#2)，該體積在該實施例中為5m1。計算以微克計的葉綠素濃度。因此在所測定的樣品中以μg/ml計的葉綠素濃度等于在公式#2中測定的數(shù)值除以樣品測量體積，該體積在該實施例中為20μl。在該實施例中，A645測定為0.496，而A663測定為1.0814。因此，在所測量的樣品中葉綠素的濃度是4.67μg/μl。用Hepes-KOH pH7.7、330mM山梨醇溶液將葉綠體漿液中葉綠素的濃度調(diào)至4.0μg/μl，并且將所產(chǎn)生的葉綠體懸浮液貯存在黑暗冰上。
典型的300微升攝入實驗含有5mM ATP、8.3mM未標(biāo)記的甲硫氨酸、322mM山梨醇、58.3mM Hepes-KOH(pH8.0)、50微升網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解液翻譯產(chǎn)物和完整的葉綠體(約200微克葉綠素)。將攝入混合物于室溫下，在直接置于采用150瓦燈泡、設(shè)定在最大光度的光纖發(fā)光體前面的10X75mm玻璃試管中輕輕震搖。在0、5、10和15分鐘時取出2個獨立的70微升每種攝入混合物樣品。用離心法，一個樣品在150微升聚乙烯管中的100微升硅酮油梯度上，以11,000Xg離心30秒，然后立即在干冰中冷凍。在這些條件下，完整的葉綠體在硅酮油層下形成沉淀，而含有網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解液的溫育介質(zhì)仍飄浮在界面表面上。另一樣品用蛋白酶(1/10體積或0.25mg/ml胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶混合物各7微升)在冰上處理30分鐘，然后進(jìn)行硅酮油分離并在干冰上冷凍。然后將葉綠體沉淀再懸浮于50-100微升裂解緩沖液(10mM Hepes-KOH pH7.5，1mM PMSF，1mM苯甲脒，5mMε-氨基-正己酸和30微克/ml抑酶肽)，并以15,000Xg離心20分鐘，以沉淀類囊體膜。來自該離心的澄清的上清液(基質(zhì)蛋白)和1等份來自每種攝入實驗的網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解液溫育介質(zhì)與等體積的2X SDS-PAGE樣品緩沖液混合，并在15％SDS-PAGE凝膠上分析，干燥并如上所述曝光于膠片。暴露于[35S]-甲硫氨酸標(biāo)記的CTP-PhnO的葉綠體含有[35S]-標(biāo)記的蛋白，其大小與預(yù)測的CTP-加工型式的PhnO一致，而暴露于甲硫氨酸標(biāo)記的PhnO的葉綠體缺乏標(biāo)記蛋白。輸入到葉綠體中的標(biāo)記蛋白也抗蛋白酶。這些結(jié)果表明，PhnO當(dāng)與質(zhì)體引導(dǎo)肽序列融合時，可以被導(dǎo)向葉綠體。實施例8該實施例描述用AMPA?；D(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)化的植物的鑒定和表征。
采用本領(lǐng)域眾所周知的多種植物轉(zhuǎn)化方法中的任一種，已經(jīng)成功地轉(zhuǎn)化了種類繁多的植物種。特別是，根癌土壤桿菌介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)化是目前使用的優(yōu)選方法，然而，基因槍法(ballistic methods)通過微粒轟擊增加裸露DNA直接至植物細(xì)胞的傳遞，基因槍法在產(chǎn)生重組轉(zhuǎn)化植物方面也是非常有效的。另外，涉及應(yīng)用脂質(zhì)體、電穿孔、增加游離DNA攝入的化學(xué)藥品以及應(yīng)用病毒或花粉轉(zhuǎn)化的方法是可以用來將本發(fā)明的DNA構(gòu)建體插入植物細(xì)胞中的替代方法?？梢酝ㄟ^實施本發(fā)明轉(zhuǎn)化的植物包括但不限于玉米、小麥、棉花、水稻、大豆、甜菜、canola、亞麻、大麥、油料種子油菜、向日葵、馬鈴薯、煙草、番茄、苜蓿、萵苣、蘋果、楊樹、松樹、桉樹、金合歡、楊樹、美國楓香、radiata pine、火炬松、云杉、柚木、苜蓿、三葉草和其它飼料作物、草坪草、油棕、甘蔗、香蕉、咖啡、茶樹、可可、蘋果、胡桃、杏仁、葡萄、花生、pulses、矮牽牛、萬壽菊、長春花、秋海棠、天竺葵、三色堇、鳳仙花、燕麥、高粱和小米。用于本發(fā)明的DNA分子可以是天然或天然存在的基因，或者是由有用的多核苷酸序列構(gòu)建的嵌合基因，所述有用的多核苷酸序列包括啟動子、增強(qiáng)子、翻譯或非翻譯前導(dǎo)序列、編碼信號肽的序列、編碼轉(zhuǎn)運(yùn)肽的序列、結(jié)構(gòu)基因、結(jié)構(gòu)基因的融合體、終止子、內(nèi)含子、反向重復(fù)序列或同向重復(fù)序列、接頭和聚腺苷酸化序列。在本發(fā)明中設(shè)想的DNA序列包括單鏈和雙鏈多核苷酸序列、線性序列和共價閉環(huán)多核苷酸序列、質(zhì)粒、桿粒、粘粒、細(xì)菌人工染色體(BAC)、酵母人工染色體(YAC)以及病毒DNA和RNA序列。土壤桿菌介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)化的考慮中，合適的植物轉(zhuǎn)化載體包括衍生自根癌土壤桿菌的Ti質(zhì)粒的那些載體以及例如Herrera-Estrella(1983)，Bevan(1984)，Klee(1985)和EPO公布號125,516(Schilperoort等)中公開的那些載體。除衍生自土壤桿菌的Ti質(zhì)粒或毛根誘導(dǎo)(Ri)質(zhì)粒的植物轉(zhuǎn)化載體外，如上所述的替代方法可以用來將本發(fā)明的DNA構(gòu)建體插入植物細(xì)胞中。
用于植物轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒一般由在別處、特別是在美國專利第5,463,175號(Barry等，1995)(其通過引用結(jié)合到本文中)中已經(jīng)描述的載體進(jìn)行構(gòu)建。構(gòu)建質(zhì)粒，并采用Tn7氨基糖苷腺苷?；D(zhuǎn)移酶抗性(aad基因，通常稱為鏈霉素/壯觀霉素或Spc/Str抗性)在大腸桿菌中維持，Tn7氨基糖苷腺苷?；D(zhuǎn)移酶抗性也是在土壤桿菌中選擇并維持的決定因子。本領(lǐng)域熟知用于大腸桿菌中的其它質(zhì)粒的維持和選擇標(biāo)記也可以使用，它們基本上由新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶、慶大霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶和β內(nèi)酰胺酶基因組成，它們可以單獨使用或組合存在于單一復(fù)制子或載體上。質(zhì)粒一般含有衍生自廣宿主范圍質(zhì)粒RK2的復(fù)制起點oriV以及衍生自質(zhì)粒pBR322的ori322和bom(分別是用于在大腸桿菌中維持的復(fù)制起點以及接合轉(zhuǎn)移的流動性(mobility)的基礎(chǔ))序列。
將編碼AMPA?；D(zhuǎn)移酶的phnO基因插入植物轉(zhuǎn)化載體的表達(dá)盒中。這些盒以5’至3’的順序一般順序含有以下元件包含一個植物有效(operable)啟動子的序列、一個編碼葉綠體或質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的序列、包含在多接頭內(nèi)的一個或多個克隆位點和一個植物功能性3’非翻譯區(qū)。表達(dá)盒通常被構(gòu)建為含有鄰接所述盒結(jié)構(gòu)域的特有的限制位點，使得可以從一個質(zhì)粒切下所述完整的盒，并將其置于其它相似構(gòu)建的質(zhì)粒載體中。優(yōu)選由8個堿基對識別序列組成的限制位點，本發(fā)明中的大多數(shù)盒至少在一端鄰接一個NotI限制性內(nèi)切核酸酶識別位點。優(yōu)選的啟動子是玄參花葉病毒啟動子P-FMV(Gowda等，1989)、花椰菜花葉病毒35S啟動子CaMV35S(Odell等，1985)或增強(qiáng)的CaMV35S啟動子(美國專利第5,196,525；Kay等，1987)。在文獻(xiàn)中已經(jīng)描述了在植物細(xì)胞中有活性的許多其它啟動子。這樣的啟動子可以得自植物或植物病毒，包括但不限于胭脂堿合酶(NOS)和章魚堿合酶(OCS)啟動子(它們載于一般在根癌土壤桿菌毒性或無毒性菌株中發(fā)現(xiàn)的腫瘤誘導(dǎo)質(zhì)粒上)、花椰菜花葉病毒(CaMV)19S啟動子、鴨趾草黃斑駁病毒(comalina yellow mottle virus)啟動子、甘蔗桿狀DNA病毒啟動子、花生褪綠條死病病毒啟動子、水稻肌動蛋白啟動子和光誘導(dǎo)型核酮糖1，5-二磷酸羧化酶小亞基啟動子(ssRUBISCO)。這些啟動子可以用來產(chǎn)生各種類型的DNA構(gòu)建體，所述DNA構(gòu)建體可用于在植物中的基因表達(dá)(參見例如Barry等，美國專利第5,463,175號)。由于其組成型性質(zhì)而設(shè)想的特別理想的啟動子是花椰菜花葉病毒35S(CaMV35S)啟動子和玄參花葉病毒35S(FMV35S)啟動子，先前已經(jīng)表明，它們在大多數(shù)植物器官中產(chǎn)生高水平的表達(dá)。也設(shè)想了可以指導(dǎo)組織特異性表達(dá)或定向表達(dá)的其它啟動子，例如在組織如葉片、分生組織、花、果實和有生殖特性的器官中表達(dá)。另外，也設(shè)計了嵌合啟動子。也使用了胭脂堿合酶基因(NOS 3’)和豌豆核酮糖二磷酸羧化酶合酶E9基因(E9 3’)3’非翻譯終止和聚腺苷酸化序列。
由AMPA?；D(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)基因插入啟動子下游并位于編碼葉綠體引導(dǎo)肽的序列和3’非翻譯序列之間構(gòu)成的表達(dá)盒，一般存在于植物轉(zhuǎn)化載體上。表達(dá)盒一般在所述盒的兩端一端鄰接胭脂堿型T-DNA右邊界區(qū)，另一端鄰接左邊界區(qū)，這兩種邊界區(qū)衍生自pTiT37(Fraley等，1985)。某些植物轉(zhuǎn)化載體僅含有右邊界區(qū)，這是起始從土壤桿菌至宿主細(xì)胞的T-DNA轉(zhuǎn)移所需要的。大多數(shù)植物轉(zhuǎn)化載體也含有一個如上所述以及在美國專利第5,463,175號中描述的GOX(草甘膦氧化還原酶)基因。當(dāng)插入植物基因組中時，由這些載體表達(dá)的GOX酶一般被定向至葉綠體。
將植物轉(zhuǎn)化載體帶動轉(zhuǎn)移到攜帶非致瘤性(disarmed)Ti質(zhì)粒pTiC58(pMP90RK)(Koncz和Schell，1986)的ABI土壤桿菌屬菌株A208中。該Ti質(zhì)粒不攜帶誘導(dǎo)冠癭形成的T-DNA植物激素基因。采用輔助質(zhì)粒pRK2013(Ditta等，1980)，通過三親本接合系統(tǒng)，將該植物載體交配到ABI中。另一方面，通過如Mattanovich等描述的電穿孔(Efficient transformation of Agrobacterium spp.by electroporation.，Nucleic Acids Res.(1989)，17(16)，6747，其通過引用結(jié)合到本文中)，可以將所述植物轉(zhuǎn)化質(zhì)粒導(dǎo)入ABI菌株中。當(dāng)植物組織與ABI∷植物載體接合體(conjugate)一起溫育時，該重組載體通過非致瘤性pTiC58質(zhì)粒編碼的vir功能轉(zhuǎn)移至植物細(xì)胞。理想的是，該重組載體在T-DNA右邊界區(qū)打開，右邊界序列和左邊界序列之間的DNA被定向轉(zhuǎn)移并且插入宿主植物基因組中，盡管可以轉(zhuǎn)移并插入完整的重組植物轉(zhuǎn)化載體序列。pTiC58 Ti質(zhì)粒不轉(zhuǎn)移至植物細(xì)胞，但保留在土壤桿菌供體中。
可以從已經(jīng)用功能性AMPA酰基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞或植物組織再生重組植株。再生步驟方法的選擇不是關(guān)鍵，可得到用于豆科(Leguminosae)(苜蓿、大豆、三葉草等)、傘形科(Umbelliferae)(胡蘿卜、芹菜、歐洲防風(fēng))、十字花科(Cruciferae)(甘藍(lán)、蘿卜、油菜籽(rapeseed)等)、葫蘆科(Cucurbitaceae)(甜瓜和黃瓜)、禾本科(Gramineae)(小麥、水稻、玉米等)、茄科(Solanaceae)(馬鈴薯、煙草、番茄、胡椒)和各種花卉作物(floral crops)宿主的合適的方案。參見例如Ammirato，1984；Shimamoto，1989；Fromm，1990；和Vasil，1990。也可以在含AMPA的培養(yǎng)基上選擇已經(jīng)用AMPA?；D(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)化的重組植物。通過如實施例1所述根據(jù)AMPA毒性進(jìn)行篩選，本領(lǐng)域一般技術(shù)人員可以容易地確定用于任何特定宿主的AMPA的合適抑制濃度。另一方面，當(dāng)將AMPA酰基轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)化到先前用GOX轉(zhuǎn)化并且根據(jù)在草甘膦上的生長經(jīng)過選擇的植物中時，可以用或者AMPA或者草甘膦作為選擇組分，以選擇表達(dá)足夠水平的AMPA?；D(zhuǎn)移酶的轉(zhuǎn)化事件。草甘膦必須以在其它情況下對表達(dá)GOX并且根據(jù)在草甘膦上的生長經(jīng)過選擇的重組植物有抑制作用的水平來應(yīng)用，因為AMPA水平的增加可能是由于GOX介導(dǎo)的草甘膦降解而產(chǎn)生的。在表達(dá)重組GOX酶的植物中，已經(jīng)表明暴露于增加水平的草甘膦誘導(dǎo)葉片的黃化或褪綠、生長停滯特征和不育。與GOX表達(dá)協(xié)同表達(dá)或結(jié)合表達(dá)的AMPA?；D(zhuǎn)移酶可以克服這些有害效應(yīng)。用AMPA作為植物轉(zhuǎn)化選擇標(biāo)記來作為草甘膦選擇的替代方法也是可能的。
煙草煙草植株用phnO基因轉(zhuǎn)化。煙草葉圓盤轉(zhuǎn)化法利用來自約1月齡的葉片的健康組織。用10％CLOROXTM加上表面活性劑將表面消毒15-20分鐘后，將葉片在無菌水中沖洗3次。用無菌紙張鉆孔器在葉圓盤上鉆孔，將其面向上置于MS104培養(yǎng)基(4.3g/l MS鹽，30g/l蔗糖，2ml/l500X B5維生素，0.1mg/l NAA和1.0mg/l BA)上，預(yù)培養(yǎng)1天。然后用1∶5稀釋的含有主題載體的非致瘤性土壤桿菌屬ABI的過夜培養(yǎng)物(最終培養(yǎng)物密度于550nm下測定約為0.6OD)接種葉圓盤。通過將葉圓盤與培養(yǎng)基一起置于無菌離心管中，進(jìn)行接種。30-60秒后，將液體排干，并且在無菌濾紙之間將葉圓盤吸干。然后將葉圓盤面向上置于MS104飼養(yǎng)平板上的圓濾紙上，培養(yǎng)2-3天。在該共培養(yǎng)期后，將葉圓盤轉(zhuǎn)移，仍面向上轉(zhuǎn)移至含有MS104培養(yǎng)基的選擇平板。2-3周后，愈傷組織形成，從葉圓盤分離出各個愈傷組織塊。當(dāng)苗大到足以與莖區(qū)別時，將苗干凈地從愈傷組織上切下。將苗置于具有選擇的無激素生根培養(yǎng)基(MSO4.3g/l MS鹽，30g/l蔗糖和2ml/1500X B5維生素)。根在1-2周內(nèi)形成。最好在在生根的苗進(jìn)行任何葉片愈傷組織分析，同時仍保持無菌。將生根的苗置于土壤中，維持在高濕度環(huán)境(即塑料容器或塑料袋)中。通過逐漸將苗暴露于周圍濕度條件下來鍛煉(harden off)苗。
選擇三個煙草轉(zhuǎn)化事件用于進(jìn)一步分析，這些事件命名為系33476、36779和37235。用pMON17226(Barry等，美國專利第5,463,175號，1995)產(chǎn)生含有FMV-CTP-GOX基因構(gòu)建體的植物系33476。系36779和37235用pMON17261產(chǎn)生，后者是衍生自pMON17226的質(zhì)粒，它除含有FMV-CTP-GOX外，還含有一個含F(xiàn)MV-CTP-PhnO基因序列(SEQ ID NO11)的NotI盒。所述NotI盒如下構(gòu)建。將由SEQ ID NO9代表的編碼CTP的序列作為BglII-NcoI片段從pMON17058切下，將其插入pMON15028中，形成由SEQ ID NO11代表的序列，在該序列中CTP編碼序列位于SEQ ID NO7內(nèi)代表的PhnO編碼序列的上游并且符合其讀框。所產(chǎn)生的構(gòu)建體命名為pMON15029。將CTP-PhnO編碼序列在BglII-SacI片段上從pMON15029切下，并與pMON17063片段結(jié)合，產(chǎn)生pMON15038。用限制性消化拆開pMON17063，產(chǎn)生構(gòu)建pMON15038必需的部分。用SacI和HindIII消化pMON17063，產(chǎn)生其中插入一個啟動子片段和CTP-PhnO序列的載體骨架。在單獨的反應(yīng)中也用HindIII和BglII消化pMON17063，產(chǎn)生含有FMV啟動子序列的一個片段。將該啟動子片段和CTP-PhnO片段在一個反應(yīng)中與所述載體骨架片段連接在一起，產(chǎn)生pMON15038，后者含有一個帶有由FMV啟動子表達(dá)并且下游側(cè)翼為一個NOS E93’轉(zhuǎn)錄終止和聚腺苷酸化序列的葉綠體定向PhO肽的編碼序列的NotI盒。將該NotI序列從pMON15038切下，并插入pMON17241的唯一NotI位點中，產(chǎn)生pMON17261，pMON17261含有從FMV啟動子表達(dá)并且下游側(cè)翼為E93’序列的葉綠體定向GOX編碼序列、與CTP-PhnO編碼序列和表達(dá)盒。預(yù)期得自該載體的轉(zhuǎn)化事件不僅抗草甘膦，而且也提供對AMPA植物毒性的抗性。對衍生自pMON17261的系36779和37235通過PCR分析其草甘膦氧化還原酶和AMPA?；D(zhuǎn)移酶的編碼基因的存在，通過蛋白質(zhì)印跡分析其GOX酶和PhnO酶的存在，以及通過HPLC分析其由于GOX介導(dǎo)的[14C]-草甘膦降解產(chǎn)生的代謝物的存在。
系33476作為衍生自pMON17226的轉(zhuǎn)化事件獲得，選擇其作為“僅GOX”對照。系36779和37235在暴露于草甘膦后表現(xiàn)出不同的表型，選擇其作為在用pMON17261轉(zhuǎn)化后產(chǎn)生的草甘膦抗性事件。系37235在暴露于草甘膦后變?yōu)橥噬螯S化，表型相似于僅GOX的系33476。然而，系36779沒有表現(xiàn)出這種褪色效應(yīng)。從每種這些事件的葉片組織以及wt Samsun煙草葉片提取DNA，進(jìn)行PCR以測定轉(zhuǎn)化phnO基因是否存在。
從轉(zhuǎn)化的煙草系分離的基因組DNA用作PCR反應(yīng)中的模板DNA，將反應(yīng)產(chǎn)物與野生型Samsum煙草進(jìn)行比較。PCR反應(yīng)由50微升的總體積組成，含有10X擴(kuò)增緩沖液、1.5mM MgCl2、各為1mM的脫氧核苷酸混合物、50-100 ng基因組DNA、終濃度各為16.8pM的引物和1.5單位AmpliTaq DNA聚合酶(Cetus/Perkin Elmer)。引物(按定單由GENOSYS合成)由SEQ ID NO21和SEQ ID NO22中敘述的序列組成。SEQ ID NO21是20個堿基對的序列，它能夠引發(fā)P2AphnO基因序列(SEQ ID NO7)的合成，并與該基因中編碼序列的前20個核苷酸雜交。SEQ ID NO22也是20個堿基對的序列，但它能夠引發(fā)從末端編碼序列到所述結(jié)構(gòu)編碼區(qū)內(nèi)的phnO基因的合成，并且能夠與PhnO編碼序列的末端20個核苷酸雜交。擴(kuò)增條件的組成是97℃1分鐘、60℃2分鐘和72℃2分鐘的3個循環(huán)，然后是94℃1分鐘、60℃2分鐘和72℃2分鐘的37個循環(huán)，然后一般是4℃的浸泡。一般通過1％TAE瓊脂糖凝膠電泳分析10微升樣品，以將相關(guān)條帶與殘留的引物分離。當(dāng)用溴化乙錠染色所述產(chǎn)物凝膠時，通過相對于HindIII消化的λ分子量標(biāo)記的遷移位置判斷約為432個堿基對的phnO基因擴(kuò)增產(chǎn)物，僅在系33779提取物中出現(xiàn)，表明在該系中存在phnO基因。
在生長室條件下自交后，獲得來自Ro轉(zhuǎn)化事件的種子。將Ro種子曬干并種植以產(chǎn)生R1后代。通過在每個葉脈上點上2微升樣品(50微升[14C]-草甘膦Na鹽，517,000dpm/μg，0.42μg/μl與10微升甘油混合)，將5葉期R1后代的源葉片(source leaves)暴露于[14C]-草甘膦。根據(jù)葉片上葉脈數(shù)，每個葉片接受幾個點。3天后，將另外15個2微升的點加樣到每個葉片上。2周后，將5個2微升的點加樣到每株植株上兩個葉片中的每個葉片上。這些葉片是新葉片，而不是最初應(yīng)用草甘膦的老葉片。在這最后一次加樣后5天后，從每株植株的兩個浸透(sink)葉片取300毫克組織樣品。將每株植株的樣品在單獨的1ml體積的去離子水中勻漿，在微量離心機(jī)中以9,000RPM離心，收集水性體積，并貯存在冰上。如實施例2中所述，通過HPLC分析提取物中[14C]標(biāo)記的代謝物的存在。得自系33476(GOX)的提取物僅含[14C]-AMPA。得自系37235的提取物含有非代謝的[14C]-草甘膦以及微量但可測量量的[14C]-AMPA。在得自系36779的提取物中僅觀察到N-乙酰-[14C]-AMPA。這些結(jié)果與PCR的數(shù)據(jù)一致，這表明系36779含有至少一個拷貝的phnO基因。另外，在暴露于草甘膦后在系36779中沒有褪色效應(yīng)，這與存在功能性GOX和PhnO酶并且缺乏可檢測的[14C]-AMPA一致。
棉花將重組phnO基因轉(zhuǎn)化到Coker 312品種的棉花(Gossypiumhirsutum L.)中。用雙邊界雙元質(zhì)粒載體，通過土壤桿菌介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)化產(chǎn)生草甘膦耐性棉花系，所述雙邊界雙元質(zhì)粒載體含有以下之一(1)gox，無色桿菌菌株LBAA基因，編碼草甘膦代謝酶草甘膦氧化還原酶(GOX)，(2)gox基因和編碼PhnO的大腸桿菌phnO基因，或(3)gox/phnO雙基因構(gòu)建體與編碼5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)的土壤桿菌屬菌株CP4基因。所有載體均能夠在根癌土壤桿菌和大腸桿菌兩種宿主中復(fù)制，并且含有一個氨基糖苷腺苷酰轉(zhuǎn)移酶基因(aad)，該基因賦予對氨基糖苷例如壯觀霉素或鏈霉素的抗性，并且為質(zhì)粒維持提供一種方法。
pMON17241含有一個重組基因，該基因由連接于擬南芥(Arabidopsis thaliana)核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶小亞基(SSU1A)基因序列5’的35S FMV啟動子組成，所述SSU1A基因序列編碼質(zhì)體或葉綠體引導(dǎo)肽(Timko等，1988)，它與gox基因編碼序列在翻譯上融合，并且連接至來自豌豆核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶基因的命名為E9的3’非翻譯區(qū)的3’。
pMON17213是一種雙基因植物轉(zhuǎn)化載體，含有包含以下元件的表達(dá)盒(1)一個35S FMV啟動子，連接于擬南芥EPSPS葉綠體引導(dǎo)肽的編碼序列，后者與菌株CP4EPSPS編碼序列符合讀框地連接，CP4EPSPS編碼序列連接于E93’非翻譯區(qū)的3’；和(2)一個35S FMV啟動子，連接于一個編碼質(zhì)體引導(dǎo)肽的SSU1A基因序列，所述SSU1A基因序列與GOX編碼序列符合讀框地連接，而GOX編碼序列連接于一個NOS3’終止序列的3’。
上述的pMON17261是一種雙基因植物轉(zhuǎn)化載體，含有包含以下元件的表達(dá)盒(1)一個FMV35S啟動子，連接于一個SSU1A葉綠體引導(dǎo)肽編碼序列，所述葉綠體引導(dǎo)肽編碼序列與GOX編碼序列符合讀框地連接，而GOX編碼序列的下游側(cè)翼為E93’非翻譯區(qū)；和(2)一個增強(qiáng)的35S啟動子，連接于一個SSU1A葉綠體引導(dǎo)肽編碼序列(SEQID NO9)，后者與PhnO編碼序列(SEQ ID NO7)符合讀框地連接，PhnO編碼序列連接于一個NOS 3’序列的3’。
pMON10151是一種雙基因植物轉(zhuǎn)化載體，含有包含以下元件的表達(dá)盒(1)一個FMV35S啟動子，連接于一個SSU1A葉綠體引導(dǎo)肽編碼序列(SEQ ID NO9)，所述葉綠體引導(dǎo)肽編碼序列與PhnO編碼序列(SEQ ID NO7)符合讀框地連接，而PhnO編碼序列的下游側(cè)翼為一個NOS3’序列；和(2)一個FMV35S啟動子，連接于一個SSU1A葉綠體引導(dǎo)肽編碼序列，后者與GOX編碼序列符合讀框地連接，GOX編碼序列的下游側(cè)翼為一個NOS3’序列。
pMON10149是一種三基因植物轉(zhuǎn)化載體，含有包含以下元件的表達(dá)盒(1)一個FMV35S啟動子和一個矮牽牛HSP705’非翻譯前導(dǎo)序列，連接于一個SSU1A葉綠體引導(dǎo)肽編碼序列，所述葉綠體引導(dǎo)肽編碼序列與EPSPS編碼序列符合讀框地連接，而EPSPS編碼序列的下游側(cè)翼為E93’終止和聚腺苷酸化序列；(2)一個FMV35S啟動子，連接于一個SSU1A葉綠體引導(dǎo)肽編碼序列(SEQ ID NO9)，所述葉綠體引導(dǎo)肽編碼序列與PhnO編碼序列(SEQ ID NO7)符合讀框地連接，PhnO編碼序列的下游側(cè)翼為NOS3’序列；和(3)一個增強(qiáng)的35S CaMV啟動子，連接于一個SSU1A葉綠體引導(dǎo)肽編碼序列，后者與GOX編碼序列符合讀框地連接，而GOX編碼序列的下游側(cè)翼為一個胭脂堿合酶3’聚腺苷酸化序列(NOS3’)。
在大腸桿菌K12菌株中裝配質(zhì)粒載體，并將其交配到非致瘤性ABI土壤桿菌菌株中。按照Umbeck等(1987)和Umbeck(美國專利第5,159,135號(1992)，其通過引用結(jié)合到本文中)描述的改進(jìn)方法，用氨基糖苷抗性的土壤桿菌菌株轉(zhuǎn)化Coker312衍生的下胚軸區(qū)段(section)，只是按照Trolinder和Goodin(1987)描述的改進(jìn)方法進(jìn)行植株再生。對草甘膦抗性的選擇產(chǎn)生幾個棉花愈傷組織系，隨后通過對基因組DNA進(jìn)行PCR，測定它們含有從土壤桿菌轉(zhuǎn)移的編碼EPSPS、GOX或PhnO的相應(yīng)基因。另外，通過蛋白質(zhì)印跡分析，確定這些相同的愈傷組織系表達(dá)所述所需基因。在植株再生后，回收含有指定編碼序列的全株棉花植株。
當(dāng)每英畝應(yīng)用48盎司草甘膦至6-7葉期時，先前鑒定的、用包含EPSPS和GOX編碼基因的雙基因草甘膦抗性盒轉(zhuǎn)化的植株，被確定為抗草甘膦，然而觀察到葉片嚴(yán)重褪色。這種植物毒性效應(yīng)推定是因為GOX介導(dǎo)的草甘膦降解而形成AMPA引起的。為了測試這一點，將AMPA以三種不同的比率噴灑到野生型Coker312植株上。以每英畝640盎司應(yīng)用草甘膦后4天時以及每英畝應(yīng)用64盎司后8天時，在植株中觀察到葉片褪色和生長停滯。這些結(jié)果表明，在EPSPS/GOX轉(zhuǎn)化棉花植物系中觀察到的植物毒性效應(yīng)是植物中GOX介導(dǎo)的AMPA產(chǎn)生的結(jié)果，并且這種植物毒性效應(yīng)可以通過將AMPA?；D(zhuǎn)移酶與GOX共表達(dá)而得到消除。為了測試這一點，將僅表達(dá)GOX或GOX+EPSPS或者結(jié)合PhnO表達(dá)的棉花植株用[14C]-草甘膦處理，在施藥后7天在葉片組織中監(jiān)測同位素標(biāo)記的草甘膦的代謝。
在用pMON10149轉(zhuǎn)化后，選擇Coker312草甘膦抗性重組棉花系4416作為草甘膦抗性棉花系，pMON10149是一種三基因根癌土壤桿菌介導(dǎo)的雙邊界植物轉(zhuǎn)化載體，含有葉綠體定向的EPSPS、GOX和PhnO，每種獨立地從獨立的35S啟動子表達(dá)。由R2種子產(chǎn)生幾株4416R3植株。3葉期或4葉期的每株小植株的一個葉片用已經(jīng)用[14C]-草甘膦(代號C-2251)強(qiáng)化的ROUNDUP ULTRATM市售除草劑混合物(Lot No.GLP-9701-7428-F)的混合物處理。表明ROUNDUPULTRATM是30.25％(重量)草甘膦酸(glyphosate acid)，而[14C]-草甘膦的放射化學(xué)純度為97.3％，比活為36.36mCi/mmol。處理溶液由約38μl組成，含有1.60×106dpm與比活為1.713×103dpm/μg草甘膦酸的[14C]-草甘膦。局部應(yīng)用后3天或7天，用水沖洗經(jīng)處理的葉片，將其在液氮中冷凍，由用刮勺將其破碎，然后用TEKMARTMtissuemizer，在10ml水中研磨。用1N HCl將葉片提取物調(diào)至pH3.5-4.0，如實施例2中所述，通過帶有液體閃爍管形瓶收集和檢測的HPLC(HPLC/LSC)，分析約4-8000dpm中[14C]-代謝物的存在。也提取在局部應(yīng)用后出現(xiàn)的包括分生組織和新葉片在內(nèi)的新生長物，并分析[14C]-代謝物。結(jié)果示于表13中。
表13.草甘膦抗性棉花中的[14C]-草甘膦代謝
*按每種樣品中通過HPLC/LSC觀察到的總[14C]同位素的百分比計的[14C]-草甘膦、[14C]-AMPA和N-乙酰-[14C]-AMPA。**nd表示通過HPLC/LSC沒有檢測到所述代謝物。
對水沖洗的經(jīng)草甘膦處理的葉片的分析表明，在所測試的10株植株中的8株中存在顯著水平的N-乙酰-[14C]-AMPA。這些水平代表從經(jīng)處理的葉片提取的同位素的27-74％。其余的活性幾乎全部是[14C]-草甘膦。非常少的[14C]同位素以[14C]-AMPA存在。其余2株植株代謝草甘膦的能力非常有限，表現(xiàn)為所述葉片上或葉片中剩余高水平的[14C]-草甘膦。這些植株中的一株在處理后7天在也表現(xiàn)出矮化跡象，顯示出草甘膦的植物毒性。
對所測試的10株植株中的新生長物的分析表明，所存在的主要形式的[14C]標(biāo)記代謝物是N-乙酰-[14C]-AMPA，N-乙酰-[14C]-AMPA高于所述樣品中總放射性同位素的90％。相反，在其余2株植株中的高于90％的所述同位素是[14C]-草甘膦形式，這與對來自這2株植株處理葉片的提取物的分析一致。
也研究了重組棉花系4268(GOX/PhnO)和3753(EPSPS/GOX)中[14C]-草甘膦的代謝。該項研究中的植株如以上關(guān)于棉花系4416所述，通過將數(shù)小滴以[14C]-草甘膦強(qiáng)化的ROUNDUP ULTRA應(yīng)用至3-4葉期每株植株的一片葉片上，進(jìn)行處理。收獲處理的葉片，用水沖洗，然后研磨和提取，如上所述通過HPLC分析提取物中[14C]-草甘膦、[14C]-AMPA和N-乙酰-[14C]-AMPA的存在。也提取并分析了在施藥后出現(xiàn)的新生長物，包括分生組織和新葉片。結(jié)果示于表14中。
表14.草甘膦抗性棉花中的[14C]-草甘膦代謝
在所有4個系4268植株(GOX/PhnO；B01-B04)的處理葉片中存在顯著水平的N-乙酰-[14C]-AMPA。相反，在得自系3753植株(EPSPS/GOX；C01-04)的提取物中沒有可檢測的N-乙酰-[14C]-AMPA。這些植株中的3株在處理的葉片提取物中含有顯著水平的[14C]-AMPA，其范圍為6-27％。一個系3753的植株缺乏[14C]-草甘膦至N-乙酰-[14C]-AMPA的轉(zhuǎn)化，該植株也表現(xiàn)出矮化。
來自系4268植株的新生長物提取物中的90-95％的所述[14C]同位素測定為N-乙酰-[14C]-AMPA形式。然而，來自系3753植株中的3株的新生長物提取物中的72-86％的所述[14C]同位素測定是[14C]-AMPA，[14C]-草甘膦構(gòu)成這些組織中剩余的所述同位素。得自系3753植株編號C02的93％的所述同位素測定是[14C]-草甘膦，這與在施藥葉片中缺乏草甘膦代謝以及所觀察到的矮化一致。另外，在處理后所有系3753的植株的生長區(qū)均變色并且黃化，但隨時間的推移得到改善。到收獲時，新生長葉片變?yōu)榛ò摺?br> 這些結(jié)果與所示植物中存在活性gox和phnO基因產(chǎn)物一致。GOX和PhnO蛋白以預(yù)測的方式將草甘膦代謝為AMPA和N-乙酰-AMPA，通過HPLC和表型觀察判斷，系4268植物提取物提供一種與系4416植物提取物觀察到的相似的代謝模式。在這兩個系中，應(yīng)用[14C]-草甘膦后在新生長組織提取物中的主要[14C]產(chǎn)物是N-乙酰-[14C]-AMPA。通過應(yīng)用草甘膦后在系3753中的植物葉片的變色而觀察到的植物毒性，與缺乏AMPA N-酰基轉(zhuǎn)移酶活性相關(guān)。相反，在4416和4268植物系中存在AMPA N-?；D(zhuǎn)移酶活性導(dǎo)致在系3753植物中沒有觀察到的植物毒性效應(yīng)。
canola用載體pMON17138和pMON17261轉(zhuǎn)化canola植株，獲得了表現(xiàn)出草甘膦耐性的許多轉(zhuǎn)化canola植物系。按照Barry等描述的方法(美國專利第5,633,435號)轉(zhuǎn)化植物。簡而言之，如已描述的方法，在控制的生長室條件下培育歐洲油菜Westar栽培品種(Brassica napus cvWestar)植株。取下恰好在抽薹之前植株的4個末端節(jié)間或抽薹過程中但在開花之前的植株，在70％v/v乙醇中表面消毒1分鐘，然后在2％w/v次氯酸鈉表面消毒20分鐘，然后用無菌蒸餾去離子水沖洗3次。連有葉片的莖可以在潮濕的塑料袋中冷藏直至消毒之前3天。用Redco切菜機(jī)200，維持基部末端的方向，將6-7個莖節(jié)切成5mm圓盤。用1毫升ABI根癌土壤桿菌菌株A208接種莖圓盤(外植體)，該菌株含有如上所述制備的重組植物轉(zhuǎn)化質(zhì)粒。將外植體基部一側(cè)向下置于含有0.1X標(biāo)準(zhǔn)MS鹽、B5維生素、3％蔗糖、0.8％瓊脂pH5.7、1mg/lBA(6-芐基腺嘌呤)的培養(yǎng)皿中。在平板上鋪上1.5ml含有MS鹽、B5維生素、3％蔗糖pH5.7、4mg/l對氯苯氧乙酸、0.005mg/l細(xì)胞分裂素的培養(yǎng)基，并用無菌濾紙覆蓋。
共培養(yǎng)2.3天后，將外植體轉(zhuǎn)移至深培養(yǎng)皿平板(7個外植體/平板)，所述平板含有MS鹽、B5維生素、3％蔗糖、0.8％瓊脂pH5.7、1mg/l BA、500mg/l羧芐青霉素、50mg/l頭孢噻肟、200mg/l卡那霉素或175mg/l慶大霉素用于選擇，3周后將其轉(zhuǎn)移至新鮮培養(yǎng)基上，每個平板5個外植體。在25℃、具有連續(xù)光照(冷白光)的生長室中培養(yǎng)外植體。再過3周后，從外植體上切下苗，開始葉片愈傷組織再形成測定(recallusing assay)，以證實Ro苗的改進(jìn)。將3個微小片的葉片組織置于愈傷組織再形成培養(yǎng)基上，該培養(yǎng)基含有MS鹽、B5維生素、3％蔗糖、0.8％瓊脂pH5.7、5mg/l BA、0.5mg/l萘乙酸(NAA)、500mg/l羧芐青霉素、50mg/l頭孢噻肟、200mg/l卡那霉素或慶大霉素或0.5mM草甘膦。葉片分析物在生長室中與外植體培養(yǎng)的相同條件下培養(yǎng)。再過3周后，記錄葉片愈傷組織再形成測定的除草劑耐性(愈傷組織或綠色葉片組織)或感病性(sensitivity)(褪色)。
將每個苗莖在切下時浸入ROOTONE，置于2英寸含有Metro-MIX350的花盆中，并在約3周的鍛煉期期間維持在24℃、16/8小時光周期、400uE/平方米/秒(HID燈)下生長室封閉的潮濕環(huán)境中。
質(zhì)粒pMON17138是土壤桿菌介導(dǎo)的單邊界植物轉(zhuǎn)化載體，它通過在鏈霉素或壯觀霉素上選擇而維持在該細(xì)菌中。pMON17138含有一個Ti右邊界，該右邊界鄰接需要轉(zhuǎn)移到植物基因組中的遺傳元件的3’端。該載體含有兩個植物有效的表達(dá)盒。一個表達(dá)盒由以下元件組成一個驅(qū)動新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(nptII)的花椰菜花葉病毒35S啟動子和該啟動子下游側(cè)翼的一個胭脂堿合酶3’轉(zhuǎn)錄終止和聚腺苷酸化序列(NOS3’)。另一表達(dá)盒由位于豌豆核酮糖二磷酸羧化酶小亞基轉(zhuǎn)錄終止和聚腺苷酸化序列上游的玄參花葉病毒啟動子(描述于Rogers，美國專利第5,678,319號)組成。一個葉綠體定向的草甘膦氧化還原酶(GOX)編碼序列插入該啟動子和豌豆3’序列之間。
質(zhì)粒pMON17261是一種與pMON17138相似的土壤桿菌介導(dǎo)的雙邊界植物轉(zhuǎn)化載體。與pMON17138中相同的一個葉綠體定向的GOX編碼盒存在于Ti右邊界下游和另一植物有效表達(dá)盒的上游，所述另一植物表達(dá)盒由連接于NOS3’序列的玄參花葉病毒啟動子(P-FMV)組成。一個葉綠體定向的PhnO編碼序列插入所述第二P-FMV和NOS3’序列之間。
用Barry等(美國專利第5,633,435號)中描述的草甘膦噴灑試驗，評估得自采用pMON17261和pMON17138的轉(zhuǎn)化事件的R1植株。
玉米也已經(jīng)將AMPA?；D(zhuǎn)移酶基因插入黑墨西哥甜玉米細(xì)胞中，在愈傷組織中檢測到該基因的表達(dá)和草甘膦抗性。按照Barry等(美國專利5,463,175號)中描述的方法轉(zhuǎn)化愈傷組織。用各種質(zhì)粒將編碼GOX和EPSPS的草甘膦抗性基因結(jié)合AMPA?；D(zhuǎn)移酶基因?qū)胗衩准?xì)胞中。這些質(zhì)粒在所用的啟動子、所用的葉綠體或質(zhì)體引導(dǎo)肽序列、所用的非翻譯前導(dǎo)序列、內(nèi)含子的存在與否以及所用的3’終止子類型方面相互不同，然而，所有質(zhì)粒都含有合成衍生的編碼含P2A突變的PhnO的AMPA?；D(zhuǎn)移酶基因。該合成基因由Monsanto合成的3個較小的多核苷酸序列構(gòu)建，并且由Stratagene，Inc.La Jolla，CA鑒定存在所需的DNA編碼序列和氨基酸序列翻譯。該非天然存在的基因由3個較小的序列裝配，這三個序列由SEQ ID NO16、SEO ID NO17和SEQ ID NO18組成，其中所述全裝配的基因由SEQ ID NO19表示，存在于用于玉米愈傷組織轉(zhuǎn)化的每種所述質(zhì)粒中。所述非天然存在的基因編碼序列基于美國專利第5,500,365號中Fishhoff等描述的方法建立的，其中用單子葉植物優(yōu)選密碼子取代大腸桿菌優(yōu)選的密碼子。所述全裝配的基因編碼全長PhnO蛋白，該蛋白除用SEQ ID NO5和SEQID NO6通過PCR引入的P2A突變外與所述天然蛋白序列相同，所述突變將合適的限制性內(nèi)切核酸酶識別位點工程到該編碼序列的側(cè)翼末端。用于產(chǎn)生玉米愈傷組織數(shù)據(jù)的質(zhì)粒以及在鄰接所述AMPA?；D(zhuǎn)移酶編碼序列的遺傳元件方面的差異示于表15中。
表15.玉米愈傷組織轉(zhuǎn)化質(zhì)粒和相關(guān)的遺傳元件
使用的啟動子包括CaMV e35S啟動子和水稻肌動蛋白啟動子(P-OsActl)。使用的內(nèi)含子包括得自植物基因例如玉米Hsp70(I-Zm.Hsp70)和水稻肌動蛋白(I-Os.Actl)的那些內(nèi)含子。使用的非翻譯前導(dǎo)序列包括小麥葉綠素a/b結(jié)合蛋白(L-Ta.Cab)和玉米Hsp70(L-Zm.Hsp70)。使用的終止和聚腺苷酸化序列包括根癌土壤桿菌NOS3’(T-At.Nos)和小麥Hsp70(T-Ta.Hsp70)。在所有PhnO表達(dá)盒中使用同一葉綠體引導(dǎo)序列，用SEQ ID NO9表示。
用[14C]-草甘膦代謝測定，來確定轉(zhuǎn)化的玉米愈傷組織是否含有這些酶的功能形式。該測定開發(fā)用來篩選大量的玉米愈傷組織樣品。愈傷組織得自Monsanto Company和Dekalb Seed Company玉米轉(zhuǎn)化小組。在表16中單獨命名為愈傷組織系“19nn-nn-nn”的Monsanto愈傷組織樣品由HI II X B73玉米胚產(chǎn)生。用完全共價閉環(huán)的重組植物轉(zhuǎn)化載體質(zhì)粒DNA，或用在胚分離后25-50天從這樣的質(zhì)粒分離的線性DNA片段，轟擊愈傷組織樣品。轟擊后8-14周鑒定轉(zhuǎn)化系。將這些系每2周在新鮮培養(yǎng)基上傳代培養(yǎng)，當(dāng)用于所述代謝測定中為5-7月齡。Dekalb愈傷組織系OO、OR、OW、OX和OY得自HI IIxAW胚。所有系的命名均對應(yīng)于用來如表16的說明注釋的方法對愈傷組織進(jìn)行基因槍轉(zhuǎn)化的重組質(zhì)粒或線性片段。
從Monsanto Radiosynthesis小組獲得1.5mM水溶液中的4.5mCiN-膦?；?[14C]-甲基甘氨酸([14C]-草甘膦)，其比放射性為39.4mCi/mM(5.2×105dpm/μg)。該樣品以代號C-2182.2鑒別。通過將2.5ml[14C]-草甘膦(3.3×108dpm)與2.5ml玉米愈傷組織生長培養(yǎng)基(N6培養(yǎng)基)和5.0mg Mon0818表面活性劑混合，制備通過0.2微米Acrodisk(Gelman no.4192)過濾除菌的儲液。在所述產(chǎn)生的施藥溶液(dosesolution)中[14C]-草甘膦是0.75mM。N6培養(yǎng)基由Chu等(1975)描述，并且采用得自Sigma Chemical Company，St.Louis，MO的鹽和維生素制備。Mon0818表面活性劑是一種乙氧基化牛油脂肪胺，這是用于Roundup除草劑中的表面活性劑。將該施藥溶液如實施例2中所述經(jīng)過HPLC分析。結(jié)果示于圖1描述的色譜圖中。分辨出3個放射性峰，最大的峰對應(yīng)于草甘膦(11.3min，98.8％)。在該施藥溶液中也存在對應(yīng)于[14C]-AMPA(5.8min，0.16％)和未鑒定的物質(zhì)(10.2min，1.0％)的雜質(zhì)峰。在該施藥溶液中不存在對應(yīng)于N-乙酰-[14C]-AMPA的峰。用這些試劑制備另外兩種施藥溶液，每種施藥溶液根據(jù)上述制備方法，按比率放大3倍至15ml體積。
合成N-乙酰-[14C]-AMPA，用作保留時間HPLC標(biāo)準(zhǔn)。將1ml吡啶和2ml乙酸酐加入20ml螺口培養(yǎng)管中，并且在冰上冷卻。將0.1ml[14C]-AMPA(6.2×106dpm，代碼C-2127.2)的水溶液加入該冷卻的溶液中。然后從冰浴中取出培養(yǎng)管，將其溫至約50-60℃。在約30分鐘后取出10μl樣品，將其與0.5ml水混合，并且按照上述HPLC方法進(jìn)行分析。沒有檢測到[14C]-AMPA，然而鑒定出兩個新放射性峰；一個峰在13.9分鐘(68％)，另一個峰在15.4分鐘(32％)。分離在13.9分鐘洗脫出的物質(zhì)樣品，并且通過負(fù)離子電噴霧質(zhì)譜分析。結(jié)果顯示于m/e152和154的強(qiáng)離子，正如對分子量為153道爾頓的該化合物所預(yù)期的；m/z154離子是由同位素[14C]原子產(chǎn)生的。沒有分離出在15.4分鐘洗脫出動放射性峰。然而，在一個獨立的HPLC實驗中，表明它與合成的N-乙酰-N-甲基-AMPA共洗脫。先前已經(jīng)表明，N-甲基-[14C]-AMPA是起始[14C]-AMPA物質(zhì)中的一種雜質(zhì)。
在無菌條件下，將玉米愈傷組織樣品轉(zhuǎn)移至無菌48孔COSTARTM細(xì)胞培養(yǎng)組件(clusters)(cat.No.3548)的各孔中。沒有稱量各個愈傷組織樣品。然而，在幾種情況下，測定了48孔板中愈傷組織樣品的總重量。各個愈傷組織樣品的平均重量通常約為200-250mg。在每個測定中，包括一個非轉(zhuǎn)化的愈傷組織樣品HI II X B73作為對照。向每個愈傷組織樣品加入50μl含有3.3×106dpm[14C]-草甘膦的施藥溶液。48孔板用封口膜密封，并置于含有一張?zhí)峁┏睗穹諊臐窦埥淼乃芰洗?。封閉塑料袋，將其置于25℃的黑暗抽屜中達(dá)10天。隨后將每個愈傷組織樣品轉(zhuǎn)移至貼標(biāo)簽的微量離心管(VWR，1.7-ml，cat.No.20170-620)。每管加入1.0ml去離子水，將所述試管封閉并置于圓形20管浮動式微量離心機(jī)機(jī)架(Nalge cat.no.5974-1015)中。讓這些微量離心管浮在沸水中30分鐘，用渦旋混合器震搖，然后用Fisher牌微量離心機(jī)離心5分鐘。取出120μl上清液樣品，用于如下所述通過HPLC分析。用Waters WISP自動注射器注射樣品。獲得所分析的每種樣品的色譜圖形，通過將每種樣品中放射性洗脫峰下的面積外推至總[14C]，獲得定量信息。圖2顯示在觀察的放射性代謝物[14C]AMPA、[14C]草甘膦和N-乙酰-[14C]-AMPA和鑒定為N-乙酰-N-甲基-[14C]-AMPA雜質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)的混合物的HPLC圖形。
對于大多數(shù)分析，通常用SPHERISORBTMS5SAX250mm x10mm柱完成HPLC分析。某些樣品在提供相似性能的ALLTECHTM5微米250x10mm SAX柱上分析。制備兩種溶劑，溶劑A由用H3PO4調(diào)至pH2.0的0.005M KH2PO4組成，并含有4％甲醇。溶劑B由用H3PO4調(diào)至pH2.0的0.10M KH2PO4組成，也含有4％甲醇。洗脫劑流速設(shè)定在3ml/min，閃爍液的流速設(shè)定在9ml/min，使用ATOMFLOWTM閃爍液(No.NEN-995，得自Packard Instruments)。所有柱子溶劑步驟(solvent step)都是線性的，注射和柱子溶劑流速如實施例2中所示。在20分鐘時制備柱子用于另一次注射。
將得自359個轉(zhuǎn)化玉米系的愈傷組織樣品與50μl等份的[14C]-草甘膦施藥溶液混合，并且在黑暗中溫育10天。每種溫育后的愈傷組織樣品與其附著的施藥物質(zhì)以及1ml水一起轉(zhuǎn)移至1.7ml微量離心管中，將每個離心管置于沸水中。該步驟使得細(xì)胞裂解，釋放出可溶性胞內(nèi)化合物，包括任何同位素標(biāo)記化合物，例如草甘膦、AMPA和N-乙酰-AMPA。在方法開發(fā)期間確定了，如果溫育后愈傷組織用水徹底沖洗，則沖洗掉85-95％的所述放射性，HPLC分析表明，在沖洗液中實際上所有的所述放射性都是由[14C]-草甘膦產(chǎn)生的，沒有由[14C]-代謝物所致的。在這些實驗中，經(jīng)沖洗的愈傷組織得到含除[14C]-草甘膦外的[14C]-代謝物的提取物。這表明，沖洗液中的放射性如果不是僅由未吸收的表面[14C]-草甘膦產(chǎn)生的話，也主要是由其產(chǎn)生的。重要的是，當(dāng)考慮到轉(zhuǎn)化為代謝物的劑量的百分比相當(dāng)?shù)蜁r，將其考慮在內(nèi)，因為百分比的計算包括大量的未吸收表面放射性。方法開發(fā)研究也表明，僅僅在水中將溫育的愈傷組織煮沸釋放出的放射性活性與通過常規(guī)研磨/提取方法所釋放的放射性活性一樣多。進(jìn)行多個實驗，表明煮沸(oiling)沒有改變所述代謝物分布型。合理化方法使得有可能一次分析大量的樣品(例如96個)。表16顯示了在HPLC分析后獲得的產(chǎn)生最高水平的N-乙酰-[14C]-AMPA或[14C]-AMPA的愈傷組織樣品的代表性數(shù)據(jù)。GOX加上AMPA?；D(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)化的、草甘膦處理的愈傷組織提取物樣品的代表性色譜圖示于圖3中。表16.
產(chǎn)生各種量的AMPA或N-乙酰-AMPA的轉(zhuǎn)化玉米愈傷組織系
所測試的359個愈傷組織樣品中的19個樣品產(chǎn)生含有水平明顯高于其它愈傷組織樣品的N-乙酰-[14C]-AMPA的提取物。愈傷組織OR516在這一方面最強(qiáng)，在2個月期間對其分析5次，提供的數(shù)值范圍為0.50-4.54％(平均1.91％)。尚不了解在不同時間形成的N-乙酰-[14C]-AMPA的百分比分布相對廣的基礎(chǔ)。在OR516的5次分析中的4次中，存在的N-乙酰-[14C]-AMPA百分比高于[14C]-AMPA的百分比，表明有效地將[14C]-AMPA轉(zhuǎn)化為N-乙酰-[14C]-AMPA。產(chǎn)生N-乙酰-[14C]-AMPA第二最有效的愈傷組織是1978-24-02，它是除OR516外唯一的在其提取物中所含有的N-乙酰-[14C]-AMPA高于[14C]-AMPA的其它愈傷組織。所測試的359個愈傷組織樣品中的100個產(chǎn)生所含有的[14C]-AMPA水平明顯高于其它愈傷組織樣品的提取物。OX556是[14C]-AMPA的最高程度的產(chǎn)生者，產(chǎn)生的[14C]-AMPA是該項研究中任何其它愈傷組織的所述代謝物的兩倍以上。對照愈傷組織HI II XB73不含插入基因，沒有產(chǎn)生可檢測水平的N-乙酰-[14C]-AMPA，并且僅產(chǎn)生背景水平的[14C]-AMPA。該結(jié)果表明，AMPA?；D(zhuǎn)移酶在玉米中的表達(dá)有效地將由于GOX介導(dǎo)的草甘膦降解而產(chǎn)生的AMPA轉(zhuǎn)化為N-乙酰-AMPA。
小麥已經(jīng)表明，GOX介導(dǎo)的草甘膦降解產(chǎn)生AMPA，而且先前已經(jīng)表明AMPA是植物毒性效應(yīng)的來源。因此，如實施例2中所述，測定小麥植株暴露于化合物AMPA或N-乙酰-AMPA的效應(yīng)，以便觀察小麥對這些化合物中任一種的任何敏感性或不敏感性。任何植物毒性效應(yīng)的觀察可能表明，GOX介導(dǎo)的草甘膦代謝可能對小麥屬(Triticum)物種有害。
在小麥胚萌發(fā)測定中，將小麥未成熟胚暴露于不同濃度的AMPA或N-乙酰-AMPA。制備MMSO基礎(chǔ)培養(yǎng)基(base media)，該培養(yǎng)基含有40克/升麥芽糖、2克/升GELRITETM、MS鹽和維生素。將鹽、維生素和麥芽糖溶于3500ml水中，將pH調(diào)至5.8。將500ml和1克GELRITETM一起分裝到一個獨立的瓶中，并且高壓滅菌17分鐘。在培養(yǎng)基冷卻至約45℃后，將AMPA或N-乙酰-AMPA加至限定的濃度。將該混合物在無菌條件下注入6個方形Sundae杯中，并且讓其固化。
從20天大的幼苗(在花藥形成后)分離未成熟小麥胚，將其接種到各個MMSO培養(yǎng)基中。每個Sundae杯含有9個未成熟胚。AMPA(0、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3和1.0mM)或N-乙酰-AMPA(0、0.1、0.3、1.0和3.0mM)的每個濃度使用3個獨立的平板。將Sundae杯溫育10天，測定根和苗的長度并將其進(jìn)行比較。結(jié)果示于表17中。表17.
AMPA和N-乙酰AMPA對萌發(fā)中的苗和根長度影響的比較
AMPA在0.2mM的濃度下對于未成熟胚的生長和伸長基本上沒有抑制。然而，高于0.2mM的濃度對于苗和根的伸長有嚴(yán)重的抑制作用，表明AMPA也可能對小麥有植物毒性，將單子葉作物物種的性質(zhì)作為一個整體考慮，可能對其它單子葉作物以及草坪草有植物毒性。當(dāng)AMPA水平高于0.20mM時，未成熟胚的萌發(fā)顯著受影響。1.00mM AMPA消除了小麥未成熟胚的萌發(fā)。相反，N-乙酰-AMPA不抑制苗，在該實驗中測試的任何濃度下僅對根的伸長有輕度抑制作用。測試的最高N-乙酰-AMPA濃度高于所測定的AMPA的最低非抑制性濃度的10倍。當(dāng)N-乙酰-AMPA濃度低于3.0mM時，對于未成熟胚的萌發(fā)沒有顯著影響。該結(jié)果表明，在小麥中AMPA的N-?；赡芊乐褂捎贕OX介導(dǎo)的草甘膦除草劑代謝而產(chǎn)生的AMPA的植物毒性。
按照Zhou等的方法(P1ant Cell Reports15159-163，1995)，產(chǎn)生重組草甘膦耐性小麥植株。簡而言之，將春小麥-普通小麥Bobwhite栽培品種(Triticum aestivum cv Bobwhite)用作靶轉(zhuǎn)化系。將原種植株種植在由高強(qiáng)度放電燈(Sylvania，GTE Products Corp.，Manchester，NH)提供的800微焦耳/平方米/秒、16小時光周期的環(huán)境控制的生長室中。晝/夜溫度為18/16℃。從開花后14天的植株收集未成熟潁果。無菌解剖出未成熟胚，將其培養(yǎng)在MMS2培養(yǎng)基上，這是一種Murashige和Skoog(Physio.Plant 15473-497，1962)基本培養(yǎng)基，補(bǔ)充有40克/升麥芽糖和2毫克/升2，4-D。在某些實驗中，使用CM4培養(yǎng)基。CM4培養(yǎng)基含有是MMS2培養(yǎng)基，但僅含0.5毫克/升2，4-D，并且包括2.2毫克/升氨氯吡啶酸。未成熟胚于26℃黑暗中培養(yǎng)。
培養(yǎng)開始后5天，在按照Russell等的方法(In Vitro Cell Devel.Biol.，28P97-105，1992)，在轟擊前4小時，將未成熟胚轉(zhuǎn)移至含有0.35M甘露醇的滲透處理CM4培養(yǎng)基。將30-40個胚置于每個平板的中心，在DuPont PDS1000裝置中進(jìn)行轟擊。按照Sanford等的方法(Particle Sci.Technol.，527-37，1987)將質(zhì)粒DNA吸附到1μm鎢粒子上。對距離阻擋板(stopping plate)13mm處的胚轟擊2次。將100μm不銹鋼篩網(wǎng)緊靠阻擋板下面放置。
對滲透培養(yǎng)基轟擊處理后16小時后，將胚轉(zhuǎn)移至MMS2或CM4培養(yǎng)基。在1周延遲期后，將所述胚轉(zhuǎn)移至含有2mM草甘膦的MMS2或CM4培養(yǎng)基。在選擇培養(yǎng)基上9-12周的愈傷組織增殖后，將愈傷組織轉(zhuǎn)移至含有0.2mg/l 2，4-D和0.1mM草甘膦的MMS0.2再生培養(yǎng)基上。將得自再生培養(yǎng)基的苗轉(zhuǎn)移至無2，4-D、但含有0.02mM草甘膦的MMS0上。
將草甘膦耐性R0植株以及R1后代轉(zhuǎn)移至15厘米直徑的花盆中，并且在如上所述的環(huán)境控制的室中培育。2周后，在噴灑室中用3ml/升ROUNDUP(41％有效成分，Mansanto Company)噴散植株，噴灑室設(shè)計用于模擬0.6公斤草甘膦/公頃的大田劑量施藥。在噴灑后不同階段，觀察并記錄損傷癥狀。
按照Shure等的方法(Cell 35225-233，1983)，從R0和R1后代的葉片組織分離基因組DNA。15微克基因組DNA用BglII限制性內(nèi)切核酸酶消化，并且在0.8％瓊脂糖凝膠上分離。按照Sambrook等描述的標(biāo)準(zhǔn)方法(Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989)，將所述DNA轉(zhuǎn)移至Hybond N膜(Amersham)上。獨立地探測所述膜中編碼EPSPS和GOX的基因的存在。通過BglII限制性內(nèi)切核酸酶消化，從pMON19574中釋放出含有EPSPS基因的3.4kb DNA片段和含有GOX基因的4.8kb DNA片段，通過0.7％瓊脂糖凝膠電泳將其分離，并用Stratagene PRIME-IT II隨機(jī)引物標(biāo)記試劑盒，用[32P]dCTP標(biāo)記。將探針分別標(biāo)記至比活為3×109計數(shù)/分鐘/微克和1.3×109計數(shù)/分鐘/微克。在含50％甲酰胺、5X SSC、5XDenhardt’s、0.5％SDS和100微克/毫升tRNA的溶液中將膜于42℃雜交14小時。最終的洗滌條件是0.1％SSC和0.1％SDS，于60℃15分鐘。
用來自R0植株葉片組織的粗制蛋白提取物進(jìn)行EPSPS和GOX蛋白分析，按照Bradford的方法(Anal.Biochem.72248-256，1976)定量測定總蛋白。用ELISA法定量測定所述提取物中存在的EPSPS和GOX蛋白的百分比，并以可提取的總蛋白的百分比來計算。
在開花后20天，分離R0轉(zhuǎn)基因植株和Bobwhite對照植物的未成熟胚，將其在含有0.02mM草甘膦的MMS0培養(yǎng)基上培養(yǎng)，用于萌發(fā)試驗。10天后記錄萌發(fā)的和未萌發(fā)的胚，并且通過3∶1分離的X2檢定分析數(shù)據(jù)。將來自萌發(fā)試驗的耐性植株轉(zhuǎn)移至土壤中，如上所述用3毫升/升ROUNDUP噴灑。
用帶有草甘膦抗性基因的5種質(zhì)粒如上所述轉(zhuǎn)化小麥未成熟胚。pMON19338含有一個核苷酸盒，該核苷酸盒編碼與土壤桿菌菌株CP4EPSPS酶序列符合讀框的矮牽牛EPSPS葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽。將該核苷酸盒插入連接于玉米HPS70內(nèi)含子序列3’的花椰菜花葉病毒增強(qiáng)的35S啟動子的下游和胭脂堿合酶3’轉(zhuǎn)錄終止和聚腺苷酸化序列的上游。便利的限制位點位于所述內(nèi)含子序列和3’終止序列之間，用于遺傳元件的插入。pMON19643與pMON19338相同，只是用GOX酶編碼序列取代土壤桿菌EPSPS酶編碼序列。pMON19574與pMON19338相同，但另外含有一個與pMON19643中相同的葉綠體定向的草甘膦氧化還原酶表達(dá)盒，該表達(dá)盒位于EPSPS表達(dá)盒下游并且緊接所述EPSPS表達(dá)盒。pMON32570與pMON19574的相似之處在于存在編碼葉綠體定向的EPSPS和葉綠體定向的GOX的表達(dá)盒，然而，pMON32570在所述EPSPS和GOX表達(dá)盒之間也存在一個編碼葉綠體定向的AMPA酰基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)盒。在pMON19574中存在而在其它質(zhì)粒中不存在的其它元件也值得提及。例如，小麥主要葉綠素a/b結(jié)合蛋白基因5’非翻譯前導(dǎo)序列存在于EPSPS表達(dá)盒和AMPA?；D(zhuǎn)移酶表達(dá)盒兩者中的所述增強(qiáng)的35S啟動子和內(nèi)含子之間(McElroy等，Plant Cell2163-171，1990)。此外，存在小麥hspl7基因3’轉(zhuǎn)錄終止和聚腺苷酸化序列，以取代EPSPS和AMPA?；D(zhuǎn)移酶兩個表達(dá)盒的胭脂堿合酶3’序列。用以上描述的基因槍轉(zhuǎn)化法，所有質(zhì)粒均產(chǎn)生重組草甘膦耐性小麥植株。然而，僅能夠表達(dá)GOX或能夠表達(dá)GOX和AMPA?；D(zhuǎn)移酶的質(zhì)粒都不產(chǎn)生重組草甘膦耐性小麥植株，或產(chǎn)生經(jīng)歷生長停滯、表型分離異常和不育的問題的植物，對其不作進(jìn)一步的分析。用所述質(zhì)粒進(jìn)行基因槍轉(zhuǎn)化后獲得的數(shù)據(jù)示于表18中。
表18.小麥基因槍轉(zhuǎn)化數(shù)據(jù)
使由這些轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化的草甘膦耐性植株自交，讓其產(chǎn)生R1種子，用R1種子產(chǎn)生R1植株。通過在3葉期噴灑草甘膦后R1植株的敏感性判斷，在R1植株中草甘膦耐性一般以3∶1的預(yù)測比率分離。讓草甘膦耐性R1植株自交，并讓其產(chǎn)生R2種子。從多種不同的草甘膦耐性系萌發(fā)R2種子，以產(chǎn)生R2草甘膦耐性植株，對所述植株如上所述施用[14C]-草甘膦。施用草甘膦后48小時，收獲植物葉片和莖組織，如上所述提取水溶性化合物，并且如實施例2中所述通過HPLC分析[14C]-草甘膦代謝物的存在。從該柱洗脫出的[14C]同位素標(biāo)記峰下的總面積相加，以提供所分析的每種樣品的100％[14C]-化合物鑒定的基線。結(jié)果示于表19中。
表19.小麥植株提取物中的草甘膦代謝1
標(biāo)準(zhǔn)溶液含有大約等摩爾比的化合物草甘膦、AMPA和N-乙酰-AMPA中的每種以及由于這些同位素標(biāo)記化合物的化學(xué)合成而存在的多種雜質(zhì)。加入[14C]-草甘膦的生長培養(yǎng)基經(jīng)過與小麥植株經(jīng)受的相同條件的處理，即將所述培養(yǎng)基暴露于植物接受的入射光強(qiáng)。正如所預(yù)期的，觀察到草甘膦光降解為AMPA，看來小百分比的AMPA轉(zhuǎn)化為酰基-AMPA，這可能是由于在生長培養(yǎng)基中暴露于其它酰化化合物的結(jié)果。先前已經(jīng)觀察到通過暴露于可見光草甘膦光降解為作為主要降解產(chǎn)物的AMPA(Lund-Hoeie等，Photodegradation of the herbicideglyphosate in water.Bull.Environ.Contam.Toxicol.36723-729，1986)。用僅EPSPS(EPSPS-only)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的重組小麥植株沒有由[14C]草甘膦產(chǎn)生[14C]-AMPA或乙酰-[14C]-AMPA。觀察到的[14C]-AMPA和微量的乙酰-[14C]-AMPA是在生長培養(yǎng)基對照中由于光降解而觀察到的范圍內(nèi)。用[14C]-草甘膦處理的非重組Bobwhite對照植物也沒有產(chǎn)生AMPA或乙酰-AMPA。用含有能夠表達(dá)EPSPS、PhnO和GOX的基因的所述三基因構(gòu)建體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的植物產(chǎn)生可變的結(jié)果。約1/3的這些植株看來有效地將草甘膦轉(zhuǎn)化為乙酰-AMPA，表明所述GOX和PhnO酶存在并且有功能。DNA印跡分析證明，所述轉(zhuǎn)基因整合到小麥基因組中，并且傳遞給以后的后代。用抗EPSPS、抗GOX或抗PhnO抗血清以檢測所述三基因轉(zhuǎn)化的植物提取物中的這些蛋白的蛋白質(zhì)印跡分析，提供了關(guān)于所述可變的[14C]-草甘膦代謝觀察的基礎(chǔ)的進(jìn)一步的深入了解。蛋白質(zhì)印跡分析表明，所有所述系均產(chǎn)生EPSPS，然而僅系27249產(chǎn)生GOX蛋白和PhnO蛋白。這一結(jié)果與表19中的數(shù)據(jù)一致，表明系27249有效地將[14C]-草甘膦代謝為乙酰-[14C]-AMPA。該植株系也沒有表現(xiàn)出與其它系相關(guān)的矮化、部分可育或改變的分離表型。這些結(jié)果表明，GOX和AMPA?；D(zhuǎn)移酶在表達(dá)重組EPSPS的小麥植株中共表達(dá)提供了提高的除草劑耐性。實施例9該實施例描述了用phnO基因轉(zhuǎn)化煙草葉綠體。
可以產(chǎn)生其中僅線粒體或葉綠體DNA改變以摻入本申請設(shè)想的分子的重組植物。在葉綠體中有功能的啟動子是本領(lǐng)域已知的(Hanley-Bowden等，Trends in Biochemical Sciences1267-70，1987)。獲得含有已經(jīng)插入異源DNA的葉綠體的細(xì)胞的方法和組合物例如已經(jīng)由Daniell等(美國專利第5,693,507號；1997)和Maliga等(美國專利第5,451,513號；1995)描述?？梢詷?gòu)建含有一個可以從中產(chǎn)生?；D(zhuǎn)移酶蛋白的表達(dá)盒的載體。表達(dá)盒可以含有一個葉綠體有效啟動子序列，該啟動子序列驅(qū)動例如phnO基因的表達(dá)，所述phnO基因的構(gòu)建方式與本文的其它多核苷酸大致相同，采用PCR方法、限制性內(nèi)切核酸酶消化和連接等構(gòu)建。葉綠體可表達(dá)基因?qū)⑻峁┮粋€啟動子和一個5’非翻譯區(qū)，來自異源基因或葉綠體基因例如psbA，這將保證編碼酰基轉(zhuǎn)移酶蛋白的DNA序列在葉綠體中轉(zhuǎn)錄和翻譯；一個編碼酰基轉(zhuǎn)移酶蛋白的DNA序列；和一個轉(zhuǎn)錄和翻譯終止區(qū)，例如葉綠體基因的3’反向重復(fù)區(qū)，能夠穩(wěn)定所表達(dá)的編碼?；D(zhuǎn)移酶蛋白的mRNA。在葉綠體中表達(dá)可能增強(qiáng)基因產(chǎn)物的積累。含有葉綠體或質(zhì)體的宿主細(xì)胞可以用所述表達(dá)盒轉(zhuǎn)化，然后可以培養(yǎng)所產(chǎn)生的含有所述轉(zhuǎn)化葉綠體的細(xì)胞，以表達(dá)所述?；D(zhuǎn)移酶蛋白。表達(dá)盒除含有所述?；D(zhuǎn)移酶基因外，也可以包括抗生素、除草劑耐性或其它選擇標(biāo)記基因。所述表達(dá)盒可以鄰接可以促進(jìn)所述表達(dá)盒穩(wěn)定整合、特別是通過同源重組整合到葉綠體基因組的得自葉綠體DNA的DNA序列。另一方面，所述表達(dá)盒可以不整合，但由于包括一個得自葉綠體DNA的復(fù)制起點，將能夠保證例如異源phnO或其它?；D(zhuǎn)移酶基因在葉綠體中復(fù)制。
可以由含有轉(zhuǎn)化葉綠體的細(xì)胞產(chǎn)生植株，然后可以讓植株生長以產(chǎn)生種子，由所述種子可以產(chǎn)生另外的植株。這樣的轉(zhuǎn)化法優(yōu)于核基因組轉(zhuǎn)化，特別是當(dāng)通過整合到葉綠體基因組而實現(xiàn)葉綠體轉(zhuǎn)化時，因為葉綠體基因一般是母性遺傳的。這提供了環(huán)境“更安全的”轉(zhuǎn)基因植物，實際上消除了逃逸到環(huán)境中的可能性。此外，可以對葉綠體轉(zhuǎn)化多次，以產(chǎn)生表達(dá)多種所需重組蛋白的功能性葉綠體基因組，而已經(jīng)表明，當(dāng)需要多種基因時，核基因組轉(zhuǎn)化相當(dāng)有限。采用葉綠體或質(zhì)體轉(zhuǎn)化因此避免了分離事件。與植物核基因組表達(dá)不同，葉綠體或質(zhì)體中的表達(dá)可以僅由一個啟動子起始，并且繼續(xù)通過多順反子區(qū)，由單一mRNA產(chǎn)生多種肽。
可以以構(gòu)建其它植物轉(zhuǎn)化載體的大致相同的方式產(chǎn)生所述表達(dá)盒?？梢詫⒅参锶~綠體有效DNA序列插入細(xì)菌質(zhì)粒中，并連接于表達(dá)所需基因產(chǎn)物(例如PhnO蛋白或其它相似的?；D(zhuǎn)移酶)的DNA序列，使得所述?；D(zhuǎn)移酶蛋白在葉綠體中產(chǎn)生，消除了核調(diào)節(jié)基因的核基因調(diào)節(jié)、加帽、剪接或聚腺苷酸化、或者葉綠體或質(zhì)體引導(dǎo)肽序列的需要。對于包含或者合成構(gòu)建或者為直接衍生自大腸桿菌基因組的天然基因的phnO或相似的?；D(zhuǎn)移酶基因的表達(dá)盒，可以將其插入構(gòu)建用于葉綠體或質(zhì)體轉(zhuǎn)化的載體的限制位點中。所述盒在上游可以鄰接葉綠體或質(zhì)體功能啟動子，在下游可以鄰接葉綠體或質(zhì)體功能轉(zhuǎn)錄和翻譯終止序列?？梢杂帽娝苤耐粗亟M法，將所產(chǎn)生的盒摻入葉綠體或質(zhì)體基因組中。
另一方面，可以通過采用自主復(fù)制型質(zhì)粒或能夠在葉綠體或質(zhì)體中繁殖的其它載體，獲得葉綠體或質(zhì)體轉(zhuǎn)化。實現(xiàn)該方法的一種方法是利用葉綠體或質(zhì)體復(fù)制起始所需的葉綠體或質(zhì)體基因組的部分，作為在轉(zhuǎn)化葉綠體或質(zhì)體中維持所述質(zhì)粒或載體的手段。通過將葉綠體或質(zhì)體基因組隨機(jī)克隆到也含有一個葉綠體或質(zhì)體選擇標(biāo)記基因的標(biāo)準(zhǔn)細(xì)菌載體中，然后轉(zhuǎn)化葉綠體或質(zhì)體，并且在合適的選擇培養(yǎng)基上選擇轉(zhuǎn)化細(xì)胞，可以容易地鑒定能夠穩(wěn)定復(fù)制葉綠體或質(zhì)體外遺傳元件的序列。將如本文所述的表達(dá)盒導(dǎo)入葉綠體或質(zhì)體可復(fù)制外遺傳元件中，將提供一種有效的方法，用于將酰基轉(zhuǎn)移酶基因和蛋白定位至葉綠體或質(zhì)體。
鑒于以上所述，人們會明白達(dá)到了本發(fā)明的幾個優(yōu)點，并且獲得了其它有利的結(jié)果。因為可以在不偏離本發(fā)明的精神和范圍的情況下在上述方法和組合物中進(jìn)行各種改變，所以上述描述中包含的、和附圖和序列中顯示的所有要點將解釋為是說明性的，而不是限制性的。
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權(quán)利要求
1.用多核苷酸序列轉(zhuǎn)化的重組植物，所述多核苷酸序列包含a)一個植物功能性啟動子序列，其有效連接于；b)一個編碼?；D(zhuǎn)移酶的結(jié)構(gòu)DNA序列，其有效連接于；c)一個3’序列，其在植物中起作用，引起轉(zhuǎn)錄終止；其中所述啟動子序列引起所述酶在植物組織中足夠表達(dá)，以增強(qiáng)用所述多核苷酸序列轉(zhuǎn)化的植物的膦酸除草劑(phosphonateherbicide)耐性，并且其中所述酶將?；鶑孽；w化合物轉(zhuǎn)移至膦酸除草劑的末端胺。
2.權(quán)利要求1的植物，其中所述酰基轉(zhuǎn)移酶被定位至所述植物的質(zhì)體。
3.權(quán)利要求2的植物，其中所述質(zhì)體包括葉綠體。
4.權(quán)利要求3的植物，其中所述結(jié)構(gòu)DNA序列包含一個編碼氨基末端葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的5’序列，所述5’序列有效連接于所述結(jié)構(gòu)DNA序列的5’，其中所述酶被定位至所述植物的葉綠體或質(zhì)體。
5.權(quán)利要求2的植物，其中所述?；w是酰基輔酶A。
6.權(quán)利要求5的植物，其中所述?；o酶A選自乙酰輔酶A、丙酰輔酶A、丙二酸單酰輔酶A、琥珀酰輔酶A和甲基丙二酸單酰輔酶A。
7.權(quán)利要求6的植物，其中所述?；o酶A是乙酰輔酶A。
8.權(quán)利要求6的植物，選自玉米、小麥、棉花、水稻、大豆、甜菜、canola、亞麻、大麥、油料種子油菜、向日葵、馬鈴薯、煙草、番茄、苜蓿、萵苣、蘋果、楊樹、松樹、桉樹、金合歡、楊樹、美國楓香、radiata pine、火炬松樹、云杉、柚木、苜蓿、三葉草和其它飼料作物、草坪草、油棕、甘蔗、香蕉、咖啡、茶樹、可可、蘋果、胡桃、杏仁、葡萄、花生、pulses、矮牽牛、萬壽菊、長春花、秋海棠、天竺葵、三色堇、鳳仙花、燕麥、高粱和小米。
9.權(quán)利要求2的植物，其中所述啟動子序列衍生自植物DNA病毒啟動子序列。
10.權(quán)利要求9的植物，其中所述啟動子序列選自CaMV35S、FMV35S、增強(qiáng)的CaMV35S、增強(qiáng)的FMV35S、comalina黃斑駁病毒啟動子和甘蔗桿狀DNA病毒啟動子。
11.權(quán)利要求10的植物，其中所述結(jié)構(gòu)DNA序列是SEQ ID NO3中敘述的大腸桿菌phnO基因序列或與其互補(bǔ)。
12.權(quán)利要求11的植物，其中所述結(jié)構(gòu)DNA序列編碼選自SEQQID NO4和SEQ ID NO8的肽。
13.權(quán)利要求12的植物，其中所述結(jié)構(gòu)DNA序列衍生自微生物，其中所述序列是選自以下的序列或與能夠與選自以下的序列雜交的多核苷酸序列互補(bǔ)SEQ ID NO3、SEQ ID NO7、SEQ ID NO11、SEQ ID NO16、SEQ ID NO17、SEQ ID NO18和SEQ ID NO19。
14.權(quán)利要求13的植物，其中所述?；D(zhuǎn)移酶基本上與大腸桿菌PhnO肽相似，它在植物中起作用，以將?；鶑孽；w化合物轉(zhuǎn)移至膦酸除草劑的末端胺。
15.權(quán)利要求14的植物，其中所述膦酸除草劑選自草甘膦和AMPA。
16.權(quán)利要求4的植物，其中編碼氨基末端葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的所述5’序列選自SEQ ID NO9、SEQ ID NO11、SEQ ID NO13和SEQID NO14。
17.按照權(quán)利要求3的植物，其表現(xiàn)出對一種或更多種膦酸除草劑的增強(qiáng)的耐性，所述除草劑選自草甘膦和AMPA。
18.由權(quán)利要求17的植物產(chǎn)生的種子，其中所述種子包含所述多核苷酸序列。
19.由權(quán)利要求18的種子生長的植物。
20.穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的膦酸除草劑耐性重組植物，其含有一種多核苷酸序列，所述多核苷酸序列包含a)一個植物功能性啟動子序列，其有效連接于；b)一個編碼酰基轉(zhuǎn)移酶的結(jié)構(gòu)DNA序列，其有效連接于；c)一個3’序列，其在植物中起作用，引起轉(zhuǎn)錄終止；其中所述啟動子序列相對于所述結(jié)構(gòu)DNA序列是異源的，并且引起所述酶在植物組織中足夠表達(dá)，以增強(qiáng)用所述多核苷酸序列轉(zhuǎn)化的植物的所述膦酸除草劑耐性，其中所述酶將?；鶑孽；w轉(zhuǎn)移至膦酸除草劑的末端胺，而且其中所述植物表達(dá)編碼植物功能性草甘膦氧化還原酶的GOX基因。
21.在重組植物中選擇性增強(qiáng)膦酸除草劑耐性的方法，所述方法包括以下步驟a)用多核苷酸序列轉(zhuǎn)化所述植物，所述多核苷酸序列包含i)一個啟動子序列，其在植物中起作用，以引起RNA序列產(chǎn)生，其有效連接于；ii)一個結(jié)構(gòu)DNA序列，其能夠產(chǎn)生編碼?；D(zhuǎn)移酶的RNA序列，其有效連接于；iii)一個3’非翻譯序列，其在植物中起作用，引起聚腺苷酸化核苷酸序列添加至所述RNA序列的3’端；其中所述啟動子序列相對于所述結(jié)構(gòu)DNA序列是異源的，并且引起所述酶在植物組織中充分表達(dá)，以增強(qiáng)用所述多核苷酸序列轉(zhuǎn)化的植物的膦酸除草劑耐性，其中所述酶將酰基從?；w底物轉(zhuǎn)移至膦酸除草劑底物的末端胺，而且其中所述植物表達(dá)編碼植物功能性草甘膦氧化還原酶的GOX基因；和b)在所述植物中表達(dá)除草劑耐性有效量的所述?；D(zhuǎn)移酶。
22.按照權(quán)利要求21的方法，其中所述酰基轉(zhuǎn)移酶由選自以下的DNA序列表達(dá)SEQ ID NO3、SEQ ID NO7、SEQ ID NO11和SEQ ID NO19。
23.產(chǎn)生遺傳轉(zhuǎn)化的膦酸除草劑耐性植物的方法，所述方法包括以下步驟a)將多核苷酸序列插入植物細(xì)胞的基因組中，所述多核苷酸序列包含i)一個啟動子序列，其在植物細(xì)胞中起作用，以引起RNA序列產(chǎn)生，其有效連接于；ii)一個結(jié)構(gòu)DNA序列，其能夠產(chǎn)生編碼?；D(zhuǎn)移酶的RNA序列，所述?；D(zhuǎn)移酶將?；鶑孽；w轉(zhuǎn)移至膦酸除草劑底物的末端胺，其有效連接于；iii)一個3’非翻譯序列，其在植物細(xì)胞中起作用，引起聚腺苷酸化核苷酸序列添加至所述RNA序列的3’端；其中所述啟動子序列相對于所述結(jié)構(gòu)DNA序列是異源的，并且引起所述酶在植物細(xì)胞中足夠表達(dá)，以增強(qiáng)用所述多核苷酸序列轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞的膦酸除草劑耐性；b)選擇轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞；和c)由所述轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞再生表現(xiàn)出膦酸除草劑耐性提高的遺傳轉(zhuǎn)化植株。
24.產(chǎn)生遺傳轉(zhuǎn)化的膦酸除草劑耐性植物的方法，所述方法包括以下步驟a)將多核苷酸序列插入植物細(xì)胞的基因組中，所述多核苷酸序列包含i)一個啟動子序列，其在植物細(xì)胞中起作用，以引起RNA序列產(chǎn)生，其有效連接于；ii)一個結(jié)構(gòu)DNA序列，其能夠產(chǎn)生編碼?；D(zhuǎn)移酶的RNA序列，所述?；D(zhuǎn)移酶將酰基從?；w轉(zhuǎn)移至膦酸除草劑底物的末端胺，其有效連接于；iii)一個3’非翻譯序列，其在植物細(xì)胞中起作用，引起聚腺苷酸化核苷酸序列添加至所述RNA序列的3’端；其中所述啟動子序列相對于所述結(jié)構(gòu)DNA序列是異源的，并且引起所述酶在植物細(xì)胞中足夠表達(dá)，以增強(qiáng)用所述多核苷酸序列轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞的所述膦酸除草劑耐性，并且其中所述植物細(xì)胞表達(dá)編碼草甘膦氧化還原酶的GOX基因；b)選擇轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞；和c)由所述轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞再生表現(xiàn)出膦酸除草劑耐性提高的遺傳轉(zhuǎn)化植株。
25.按照權(quán)利要求24的方法，其中轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞根據(jù)在選擇劑存在下生長的能力來選擇，其中所述選擇劑選自草甘膦和AMPA。
26.包含?；D(zhuǎn)移酶的肽，所述?；D(zhuǎn)移酶催化將酰基從酰化供體轉(zhuǎn)移至膦酸除草劑的末端胺。
27.按照權(quán)利要求26的肽，其中所述酰基轉(zhuǎn)移酶由選自SEQ IDNO4、SEQ ID NO8、SEQ ID NO12和SEQ ID NO20的序列組成。
28.按照權(quán)利要求26的肽，其中所述膦酸除草劑選自草甘膦和AMPA。
29.按照權(quán)利要求26的肽，其中所述酰基轉(zhuǎn)移酶在細(xì)胞中由是選自以下的多核苷酸序列或與選自以下的多核苷酸序列雜交的DNA序列表達(dá)SEQ ID NO3、SEQ ID NO7、SEQ ID NO11和SEQ IDNO19。
30.按照權(quán)利要求27的肽，其中所述DNA序列衍生自微生物，所述微生物是選自以下屬的成員腸桿菌科(Enterobacteriaceae)、鏈霉菌屬、芽孢桿菌屬、放線桿菌屬、Ascomycota和Basidiomycota。
31.選擇用載體轉(zhuǎn)化的一種或多種細(xì)胞的方法，所述載體含有編碼起作用以將膦酸除草劑化合物N-乙酰化的酶的?；D(zhuǎn)移酶基因，所述方法包括以下步驟a)用所述載體轉(zhuǎn)化細(xì)胞群體；b)在抑制量的膦酸除草劑化合物存在下溫育所述轉(zhuǎn)化的細(xì)胞；c)鑒定在所述抑制量的所述化合物存在下生長的一種或多種細(xì)胞；和d)分離并純化在所述抑制量的所述化合物存在下生長的所述一種或多種細(xì)胞。
32.包含?；D(zhuǎn)移酶基因的按照權(quán)利要求31的載體，所述?；D(zhuǎn)移酶基因編碼在所述一種或多種細(xì)胞中起作用以將?；鶑孽；w底物轉(zhuǎn)移至膦酸除草劑化合物的末端胺的酶。
33.按照權(quán)利要求31的載體，其中所述基因在宿主細(xì)胞中表達(dá)。
34.按照權(quán)利要求33的載體，其中所述宿主細(xì)胞不受抑制量的膦酸除草劑存在的抑制，所述抑制量是對于缺乏編碼所述酶的功能性?；D(zhuǎn)移酶基因的宿主細(xì)胞有抑制作用的量。
35.按照權(quán)利要求34的宿主細(xì)胞，選自細(xì)菌細(xì)胞、真菌細(xì)胞、動物細(xì)胞和植物細(xì)胞。
36.按照權(quán)利要求35的宿主細(xì)胞，其中所述細(xì)菌細(xì)胞選自包括腸桿菌科、分枝桿菌科(Mycobacteriaceae)、土壤桿菌科(Agrobacteriaceae)、放線桿菌科(Actinobacteriaceae)、鏈霉菌屬和芽孢桿菌屬。
37.按照權(quán)利要求35的宿主細(xì)胞，其中所述真菌細(xì)胞選自包括Ascomycota、Basidiomycota和Deuteromycota的真菌菌種。
38.按照權(quán)利要求35的宿主細(xì)胞，其中所述植物細(xì)胞選自包括大豆(Glycine max)、玉蜀黍(Zea mays)、煙草(Nicotania tabacum)、陸地棉(Gossypium gossypia)、普通小麥(Triticum aestivum)和歐洲油菜的植物物種。
39.與?；D(zhuǎn)移酶蛋白序列結(jié)合的抗體，其中所述?；D(zhuǎn)移酶選自SEQ ID NO4、SEQ ID NO8、SEQ ID NO12和SEQ ID NO20。
40.鑒定樣品中重組?；D(zhuǎn)移酶基因的方法，所述方法包括a)提供能夠與所述基因雜交的一種或多種不同的多核苷酸序列；b)提供包含互補(bǔ)于所述不同的多核苷酸序列的一種或多種多核苷酸序列的參比樣品；和c)提供用于將所述不同的序列、所述參比樣品和樣品中所述重組?；D(zhuǎn)移酶基因混合的說明，和d)檢測所述樣品中的所述重組基因。
41.用于檢測樣品中重組?；D(zhuǎn)移酶基因存在的試劑盒，包括a)提供能夠與所述基因雜交的一種或多種不同的多核苷酸序列；b)提供包含互補(bǔ)于所述不同的多核苷酸序列的一種或多種多核苷酸序列的參比樣品；和c)提供用于將所述不同的序列、所述參比樣品和樣品中所述重組?；D(zhuǎn)移酶基因混合的說明，將以上物質(zhì)和說明一起包裝在試劑盒中。
42.包含一種多核苷酸序列的植物，所述多核苷酸序列含有一種編碼乙?；D(zhuǎn)移酶蛋白的基因，其中所述基因在所述植物中的表達(dá)刺激所述植物的生長。
全文摘要
本發(fā)明總的來講涉及植物的除草劑抗性,更具體地講涉及一類新的膦酸代謝基因,以及涉及應(yīng)用這些基因改進(jìn)植物對膦酸除草劑耐性的方法。
文檔編號C12N15/31GK1333835SQ99815641
公開日2002年1月30日 申請日期1999年11月16日 優(yōu)先權(quán)日1998年11月17日
發(fā)明者G·F·貝里 申請人:孟山都技術(shù)有限公司